JP2014511700A

JP2014511700A - 光合成微生物のための一本鎖抗体とその使用

Info

Publication number: JP2014511700A
Application number: JP2014504061A
Authority: JP
Inventors: ジョージ・エイ・オイラー; ジュリアン・エヌ・ローゼンバーグ; ドナルド・ピー・ウィークス
Original assignee: University of Nebraska; Synaptic Research LLC
Current assignee: University of Nebraska; Synaptic Research LLC
Priority date: 2011-04-07
Filing date: 2012-04-07
Publication date: 2014-05-19
Also published as: WO2012139086A2; US20120277411A1; WO2012139086A3; CA2835606A1; EP2694543A2

Abstract

藻類に結合する一本鎖抗体が記載される。藻類のための一本鎖抗体は生理活性フィルム上に藻類を捕獲するために用いられる。一本鎖抗体はまた、基質結合ドメインおよび一本鎖抗体ドメインを有するキメラ構築物においても用いられる。二量体、三量体、および多量体構築物もまた、藻類細胞の凝集を引き起こすことによる液体混合物からの藻類の回収において助けになることが記載される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）の下、２０１１年４月７日出願の、名称を「光合成微生物のための一本鎖抗体とその使用」とする米国仮出願第６１／４７２，７５０号に基づく優先権を主張し、該仮出願の明細書はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

政府利益についての陳述
本発明は米国エネルギー省より認められた承認番号ＤＥ−ＥＥ０００３３７３の下、政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。

技術分野
本発明は、光合成微生物のための一本鎖抗体に関する。

背景技術
大規模な微細藻類の培養の最も困難な態様のいくつかは、種の管理、汚染のコントロール、莫大な水の使用、および比較的希薄な溶液（例えば、水１Ｌあたり２ｇの藻）からバイオマスを取り入れるというエネルギー要求を含む。これらの事項に対処するため、新規な微細藻類培養系は水要求量減少、次いで収穫を促進するメカニズムを必要とする。特定の所望の微細藻類種の結合を標的化する能力は、汚染生物の少ないか全くない高価値の藻類バイオマスの生育および収穫のための特別な利点を提供する新規なアプローチを示す。

発明の開示
本発明の目的の一つは、光合成微生物細胞を認識する、単離一本鎖抗体（ＶＨＨドメイン）を提供することである。単離一本鎖抗体は、藻類などの光合成微生物との結合能を有する。本発明の第二の目的は、藻類に特異的な一本鎖抗体を単離する方法を提供することであり、この方法は、藻類株でラクダ科ファミリーの動物を免疫し、動物から血液試料を回収し；血液試料からｃＤＮＡライブラリーを調製し；ファージ上でｃＤＮＡライブラリーを発現し；生存藻類株に特異的に結合するためにファージをパニングし；およびパニング段階で同定された抗体を単離する工程を含む。この方法のパニング段階は、生存藻類のペレットを得る；ペレットに遮断薬を添加する；ペレットにファージを暴露する；およびファージを溶出させる、段階を含む。

本発明のさらなる目的は、様々な用途に使用され得る一本鎖抗体を提供することである。一の実施形態において、藻類細胞に結合できる単離一本鎖抗体ドメインおよび基板結合ドメイン（ｓｕｂｓｔｒａｔｅｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ）を含むキメラ融合ペプチド構築物が提供される。ペプチド構築物は、クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、クロレラ・バリアビリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、コッコミクサ属（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａｓｐ．）、ナノクロロプシス・オセアニカ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｏｃｅａｎｉｃａ）およびタラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）などの藻類細胞に結合できる。

一例において、キメラ融合構築物は一本鎖抗体および基板結合ドメインを有する。キメラ融合構築物は、セルロースなどの基板結合ドメインの基板である基板に付着し、機能化された基板を生成する。機能化された基板は次いでキメラ融合構築物の一本鎖抗体部分（ＶＨＨドメイン）と結合する光合成微生物を捕獲するために利用される。

本発明の一態様において、単離一本鎖抗体は、液体懸濁物中の、例えば藻類などの微生物の凝集を誘導するために用いられる。藻類培養物からの藻類の回収の方法は、藻類の凝集をもたらす、藻類に特異的な一本鎖抗体を藻類培養物に導入し、凝集後に藻類を回収することを含む。さらに他の実施形態において、一本鎖抗体は、一本鎖抗体の少なくとも２個のコピーを含むキメラ融合ペプチド構築物により導入される。他の実施形態において、キメラ融合ペプチド構築物は、第一の藻類種に特異的な第一の一本鎖抗体および第二の藻類種に特異的な第二の一本鎖抗体を含む。このような方法において第一の藻類種は第二の藻類種の溶解をもたらすウイルスのウイルス宿主であり得る。

図面の簡単な説明
本発明の多くの利点は添付の図面を参照することにより当業者によりよく理解され得る。

図１は、Ｄｅｓｉ抗血清から単離されたクラミドモナス・ラインハーディＵＴＥＸ２２４４に特異的な一本鎖抗体の配列比較のグラフ表示である。

図２は、一本鎖抗体を用いる様々なキメラ構築物の略図である。

図３は、一本鎖抗体ＶＨＨドメインおよび結合ドメインを有する付着した構築物で機能化した基板の略図である。この略図は、一本鎖抗体構築物により基板に付着した藻類もまた示す。さらに、この略図は一本鎖抗体二量体の存在により引き起こされる藻類の凝集を示す。

図４は、一本鎖抗体により引き起こされた凝集の略図である。

図５は、微生物の細胞表面での一本鎖抗体の表層提示により促進された藻類凝集の略図である。

図６は、二価の一本鎖抗体融合物で促進された、クロレラ・バリアビリスＮＣ６４Ａ（ＣｈｌｏｒｅｌｌａｖａｒｉａｂｉｌｉｓＮＣ６４Ａ）ウイルス感染の近接による同時の標的藻類の凝集および溶解の略図である。

図７は、クラミドモナス・ラインハーディＵＴＥＸ２２４４に特異性を示す血清力価のサンプルグラフである。

図８は、本発明の実施形態による、抗ナノクロロプシス・オセアニカＯＺ−１、クロレラ・バリアビリスＮＣ６４Ａ、コッコミクサ属Ｃ−１６９、タラシオシラ・シュードナナＣＭＭＰ１３３５およびクラミドモナス・ラインハーディＵＴＥＸ２２４４抗血清を用いたウエスタンブロットのペアである。

図９は、クロレラｓｐｐに特異的な精製一本鎖抗体のクマシーブルー染色ゲルである。

図１０は、蛍光マーカーｍＣｈｅｒｒｙを有する構築物で処理されたクラミドモナス・ラインハーディ（ｃｃ１２４）の共焦点画像である。

図１１は、ｍＣｈｅｒｒｙタグおよびＧＦＰを含む構築物で処理されたクラミドモナス・ラインハーディ（ｃｃ１２４）の共焦点画像である。

図１２は、基板結合ドメインおよび藻類のための一本鎖抗体を含む、本発明の一の実施形態による構築物の概要を示す。

図１３は、ａ）培養物がＣＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＶＨＨ（ＪＧＪ−Ｂ１１）たんぱく質で予備処理されたＷｈａｔｍａｎ紙片に接種され、次いで生存クラミドモナス・ラインハーディ細胞と培養される、およびｂ）同様の処理だが、ＣＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙ対照蛋白質で予備処理される、場合のクラミドモナス・ラインハーディ細胞の異なる細胞濃度を示す画像である。

発明を実施するための最良の形態
上記で要約された発明は、以下の記載、添付図面および請求の範囲を参照することにより、よりよく理解され得る。本発明の実現を実施することを可能にする、以下に明確に示された実施形態のこの記載は、好ましい実施形態を限定する意図ではなく、それらの特定の例として機能することが意図される。当業者は、彼らが本発明と同じ目的を実施するために、他の方法および系を改変または設計するための基礎として、開示された特定の実施形態および概念を容易に利用できるであろうことが理解されるべきである。当業者はまた、そのような同等なアセンブリが最も広い形態において本発明の精神および範囲から逸脱しないことを理解すべきである。

本出願で記載される、「一本鎖抗体」、「ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」または「ＶＨＨ」は、特異的な基板に結合できるペプチドである。これらのペプチドはまた、ラクダ科ファミリー（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ）のメンバーから一般に得られるため、「カメリド（ｃａｍｅｌｉｄ）」抗体とも呼ばれ、またそれらは軟骨魚類（例えば、サメ）にも見つけられる。典型的には、ＶＨＨは１０ｋＤａから１４ｋＤａ、多くは１２ｋＤａの範囲の大きさである。しかしながら、一本鎖抗体の大きさはそれらの機能にとって重要でなく、一本鎖抗体はそれらの基板への結合能を有する限りにおいて、より大きくまたは小さくなり得ると考えられる。本明細書に開示される一本鎖抗体は、藻類、珪藻、シアノバクテリアなどの光合成微生物に特異的である。一本鎖抗体は、カメリドファミリー重鎖抗体の可変抗原結合領域に相当する。一本鎖抗体は、ほとんど全ての蛋白質発現プラットフォーム（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））における、サブナノモルレベルの親和性、変性後の急速なリフォールディング、高い信頼性、強固性、可溶性発現、および高出力方法（Ｓａｅｒｅｎｓｅｔａｌ．２００８；Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉｅｔａｌ．２００５；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓｅｔａｌ．２００１）におけるファージディスプレイによる所望の一本鎖抗体を選別できる能力を有する。本明細書に記載される抗体ドメインは、興味のある微細藻類種の表面に露出した細胞壁蛋白質および他の分子に高い親和性を有する。

本出願で使用される、「アミノ酸配列同一性」は、２個の配列の間のアミノ酸残基の同一性の百分率を意味する。例えば、別の配列に対して８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列は、それが比較されているアミノ酸配列の同じアミノ酸残基の８５％が問題のアミノ酸配列にあることを意味する。２個のアミノ酸配列が、互いを並べたときに、ギャップ、置換、挿入または欠失が全くない場合、２個の配列は「同一」と呼ばれる。２個のアミノ酸配列が互いに並べられたときに、（ｉ）２個の配列の間のアミノ酸残基の同一性の変化が３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％または１０％以下；（ｉｉ）２個の並べられた配列の最も短い長さにおいて起こるアミノ酸の数に対して、配列間のギャップ、挿入、欠失および置換が１０％以下、好ましくは５％以下；（ｉｉｉ）ポリペプチドの活性またはフォールディングに有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換のみが（他のものと比較した１のポリペプチドにおいて）観察される、場合に、２個のアミノ酸配列は、「実質的に同一」と定義される。２個の蛋白質の全体のアミノ酸配列が互いに実質的に同じであり得、または同様の長さの配列が他の蛋白質にある状態で、蛋白質の中の配列は同一または実質的に同一であり得る。いずれの場合でも、そのような蛋白質は互いに実質的に同一である。典型的には、同一または実質的に同一の配列の伸展は、５から２５、好ましくは６から１５、および最も好ましくは７から１０ヌクレオチドまたはアミノ酸で起こる。例えば、米国特許公開番号第２００３／０１６１８０９を参照のこと。

本明細書において提供されたヌクレオチド配列は、特定のペプチド配列をコードする代表的な配列のいくつかの例示にすぎない。当業者は、特定のアミノ酸鎖、ペプチドまたはポリペプチドを与えるヌクレオチド配列を決定するために標準のコンピュータ手法を利用できることを理解しているであろう。従って、本明細書に含まれるヌクレオチド配列は、本発明の一本鎖抗体のコーディング配列および本発明の範囲内の同じペプチドをコードする他のヌクレオチド配列の例示である。

本出願で用いられる「藻」なる用語は、真核緑藻類、珪藻、およびシアノバクテリアを含む、様々な光合成微生物のことをいう。藻類の属の例として、クロレラ、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、アウキセノクロレラ（Ａｕｘｅｎｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クラミドモナス、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コッコミクサ、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、クリプセコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）およびテトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）が挙げられる。珪藻類の属の例として、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、タラシオシラ、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、ナヴィクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）が挙げられる。シアノバクテリアの属の例として、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、シネココックス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）が挙げられる。

本出願で示される「基板」なる用語は、一本鎖抗体が付着できる膜または他の固体または準固体物を意味する。基板のいくつかの例として、セルロース膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ヒドロゲル、アルギン酸塩、カラゲナンが挙げられる。また、基板はある場合に「フィルム」または「バイオフィルム」とも呼ばれる。ＬａｕＰＳ，ＴａｍＮＦＹ，ＷｏｎｇＹＳ（１９９７）Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒｎｕｔｒｉｅｎｔｓ（ＮａｎｄＰ）ｒｅｍｏｖａｌｂｙｃａｒｒａｇｅｅｎａｎａｎｄａｌｇｉｎａｔｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｈｌｏｒｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓ．ＥｎｖｉｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌ１８：９４５−９５１；ＬａｕＰＳ，ＴａｍＮＦＹ，ＷｏｎｇＹＳ（１９９８）ＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｂａｔｃｈｗｉｓｅｎｕｔｒｉｅｎｔｒｅｍｏｖａｌｆｒｏｍｗａｓｔｅｗａｔｅｒｂｙｃａｒｒａｇｅｅｎａｎｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｈｌｏｒｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓ．ＷａｔｅｒＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ３８：１８５−１９２；ＭａｌｌｉｃｋＮ（２００２）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄａｌｇａｅｆｏｒｗａｓｔｅｗａｔｅｒＮ，Ｐａｎｄｍｅｔａｌｒｅｍｏｖａｌ：ａｒｅｖｉｅｗ．Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ１５：３７７−３９０；ＭｅｈｔａＳＫ，ＧａｕｒＪＰ（２００５）Ｕｓｅｏｆａｌｇａｅｆｏｒｒｅｍｏｖｉｎｇｈｅａｖｙｍｅｔａｌｉｏｎｓｆｒｏｍｗａｓｔｅｗａｔｅｒ：ｐｒｏｇｒｅｓｓａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．ＣＲＣＲｅｖＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２５：１１３−１５２；ＳｈｉＪ，ＰｏｄｏｌａＢ，＆ＭｅｌｋｏｎｉａｎＭ（２００７）Ｒｅｍｏｖａｌｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｆｒｏｍｗａｓｔｅｗａｔｅｒｕｓｉｎｇｍｉｃｒｏａｌｇａｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｏｎｔｗｉｎｌａｙｅｒｓ：ａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙＪＡｐｐｌＰｈｙｃｏｌ１９：４１７−４２３；ＭｕｎｏｚＲ，ＫｏｌｌｎｅｒＣ，ＧｕｉｅｙｓｓｅＢ（２００９）Ｂｉｏｆｉｌｍｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｗａｓｔｅｗａｔｅｒｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨａｚａｒｄｏｕｓＭａｔｅｒｉａｌｓ１６１：２９−３４．

藻類に特異的な一本鎖抗体
本発明の一の実施形態において、藻類細胞に結合できる単離一本鎖抗体が提供される。本発明の一の実施形態による単離一本鎖抗体は、とりわけクラミドモナス・ラインハーディＵＴＥＸ２２４４、クロレラ・バリアビリスＮＣ６４Ａ、クロレラ・ソロキニアナＣＣＴＣＣＭ２０９２２０（ＣｈｌｏｒｅｌｌａｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａＣＣＴＣＣＭ２０９２２０）、コッコミクサｓｐ．Ｃ−１６９、ナノクロロプシス・オセアニカＯＺ−１およびタラシオシラ・シュードナナＣＭＭＰ１３３５に結合できる。単離一本鎖抗体は、上記に例示された種の１以上と結合し得る。本発明の一の実施形態において、クラミドモナス・ラインハーディに結合できる一本鎖抗体のいくつかの例は、配列番号１から９のアミノ酸配列および配列番号１０から１８のヌクレオチド配列を有するものとして与えられる。本発明のさらなる実施形態において、クロレラ・バリアビリスに結合できる一本鎖抗体のいくつかの例は、配列番号１９から２７のアミノ酸配列および配列番号２８から３６のヌクレオチド配列を有するものとして与えられる。本発明の他の実施形態において、ナノクロロプシス・オセアニカに結合できる一本鎖抗体のいくつかの例は、配列番号３７から５１のアミノ酸配列および配列番号５２から６６のヌクレオチド配列を有するものとして与えられる。本発明の他の実施形態において、タラシオシラ・シュードナナに結合できる一本鎖抗体のいくつかの例は、配列番号６７から６９のアミノ酸配列および配列番号７０から７２のヌクレオチド配列を有するものとして与えられる。上記の多数の種は、一本鎖抗体が全ての型の藻類と結合できることを示す。

図１に示されるように、本出願で記載される他の単離一本鎖抗体と少なくとも４０％の配列同一性を有する一本鎖抗体は藻類と結合できる。本発明のいくつかの実施形態において、本明細書で提供された配列と、少なくとも８５％、好ましくは８５％から９０％、より好ましくは９０％から９５％のアミノ酸配列同一性を有するかまたは「実質的に同一」の一本鎖抗体は藻類と結合できる。

藻類のための一本鎖抗体を単離する方法
本発明の一の実施形態において、以下に示すように一本鎖抗体を単離する方法が提供される。

１．免疫：ラクダ科の動物は対象となる藻類種で免疫される。動物は、生存藻類、死滅藻類、または藻類膜、蛋白質および他の分子で免疫できる。動物は免疫系応答を引き出すことが当業者に知られている注射またはいかなる他の手段で藻類に曝される。以下で説明された例では、２頭のアルパカが６回の免疫まで２週間か３週間毎に必要に応じて４つの異なる種類の死滅藻類で免疫され、血清中で抗藻類の表面抗体の許容できる力価を達成した。

２．検証：藻類免疫の開始に先立ち、各動物からの１０ｍｌまで血清（すなわち免疫前血清）を回収し、各免疫をその後約１週間継続する。ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ分析で免疫応答を検証する。

３．ｃＤＮＡライブラリーの調製：免疫応答が検証された後、動物からリンパ球を回収し、ｃＤＮＡライブラリーを調製する。一の実施形態により、ｃＤＮＡライブラリーは各動物の最終免疫から約１週間で得られた末梢血液細胞ｍＲＮＡから調製された。ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーは、Ｍａａｓｓｅｔａｌ．，２００７に記載された方法を用いて調製された。

４．ファージディスプレイ：そして、ｃＤＮＡライブラリーは、藻類に特異的な一本鎖抗体をさらに単離するために用いられる。一の例示的な実施形態において、は、段階３で得られたｃＤＮＡから調製されたアルパカＶＨＨコーディングＤＮＡを含む少なくとも１００万の独立している形質転換細胞から成るＭ１３ファージディスプレイライブラリーが調製された。ファージディスプレイライブラリーは、Ｍａａｓｓｅｔａｌ．，２００７に記載された方法を用いて調製された。

５．パニングによる各々の藻類種に特異的なＶＨＨの同定：免疫において用いられる４種の異なる藻類種の各々の表面に結合できるＶＨＨ蛋白質の同定のため、少なくとも３回のパニングサイクルの選択の後に、１のファージプールが得られた。各々のファージプールは各々４種の藻類種のために別々に選択される。（Ｍａａｓｓｅｔａｌ．，２００７）に記載される改変パニング法が用いられる。改変パニング法は以下の段階を含む：第一に、遠心分離で生存微細藻類細胞のペレットを集め、パニング材料として用いられる〜７５μｌペレットをもたらす。次いで０．１％Ｔｗｅｅｎ添加リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）中の４％無脂肪乳溶液を用いて、細胞を１ｍｌ乳−ＰＢＳＴ（ブロッキング溶液）で洗浄し、ボルテックスおよび遠心分離（３分、２２℃、３０００×ｇ）することにより細胞表面を遮断する。これを３回繰り返す。次いで、１ｍｌの新鮮なブロッキング溶液を添加し、室温で回転しながら３０分間培養する。最後に、遠心分離（４分、２２℃、３０００×ｇ）して、ブロッキング溶液を除去する。最初の１°のパニングを、この材料に５００μｌのブロッキング溶液および５００μｌのマスターファージライブラリーを添加し、微量遠心管内で１時間室温にて回転することにより開始する。次いで、１ｍｌＰＢＳＴで６回洗浄し、最終洗浄時に１０分間室温で回転し、下記の通りファージプールを溶出する。二次パニング（２°）では、６００μｌのブロッキング溶液および４００μｌの１°溶出からのファージを用い、１時間室温で回転させる、類似の手順が続く。次いで、１ｍｌＰＢＳＴで１０回洗浄し、最終洗浄時に１０分間室温で回転し、下記の通りファージプールを溶出する。第三のパニング（３°）は、最も激しく、５０ｍｌのブロッキング溶液および５μｌのみの２°溶出からのファージで、室温で１０分間回転して、進行する。洗浄段階は、以下の容量を用いるＰＳＢＴ中での全１０回を含む：５０ｍｌで１回、１４ｍｌで４回、および１ｍｌで５回。最終洗浄時に１０分間室温で回転し、下記の通りファージプールを溶出する。

６．ファージの溶出：パニング段階の最終洗浄の後、遠心分離（３分、２２℃、３０００×ｇ）し、；上清を１°、２°または３°洗浄として残し、残りの藻類ペレットは細胞表面に接着したファージを含む。５００μｌの０．２ＭグリシンｐＨ２．２をこの藻類ペレットに添加し、ボルテックスにより再懸濁する。室温で１０分間回転し、遠心分離により藻類ペレットを回収する。上清を７５μｌの１ＭＴｒｉｓｐＨ９．１を含む新しい微量遠心管に移す。上下に素早くピペッティングし、溶出物を中和する。１ｍｌＰＢＳ中で藻類ペレットを２回洗浄（ボルテックス、回転３分、２２℃、３０００×ｇ）し、洗浄液を除去する。５００μｌの一晩おいたＥ．ｃｏｌｉＥＲ２７３８培養物を加え、ボルテックスし、３７℃で１５分間培養する。その後、簡単に遠心分離し、キャップに付着した全ての液体を回収する。藻類およびＥ．ｃｏｌｉＥＲ２７３８混合物を最初の（すでに中和した）溶出物に添加する。この組み合わせ物、および最終溶出物を連続希釈により１０^２から１０^８の範囲の力価として用いる。

７．「最良」で特徴的なＶＨＨクローンの同定：本発明の一の実施形態において、「最良の」ＶＨＨクローンが、興味のある各々の藻類種からの藻類抽出物でコートされたマイクロタイタープレート上のファージＥＬＩＳＡを用いて、異なるＢｓｔＮ１およびＨａｅＩＩＩフィンガープリントおよび最も強いシグナルを有するものとして定められる。これらのクローンの各々が、特定の藻類株に特異的な一本鎖抗体を生産する。

８．「最良」で特徴的なＶＨＨクローンの同定：本発明の一の実施形態において、「最良の」ＶＨＨクローンが、興味のある各々の藻類種からの藻類抽出物でコートされたマイクロタイタープレート上のファージＥＬＩＳＡを用いて、異なるＢｓｔＮ１およびＨａｅＩＩＩフィンガープリントおよび最も強いシグナルを有するものとして定められる。これらのクローンの各々が、特定の藻類株に特異的な一本鎖抗体を生産する。

一本鎖抗体を用いる方法
上記の方法により単離された一本鎖抗体は、以下により詳細に記載されるように、実用的な用途を有する。図２に示されるように、一本鎖抗体は、基板結合ドメインと組み合わせられ、基板結合ドメインに付着する基板上の藻類を捕捉する（図２Ａ）。一の藻類種に特異的な一本鎖抗体二量体、三量体、および多量体は、凝集を通じた藻類の培養および回収に用いられる（図２Ｂ）。他の種からの一本鎖抗体と組み合わせられた一つの種のための一本鎖抗体は、藻類の凝集および回収にも用いられる（図２Ｃおよび２Ｄ）。

ａ．固体または準固体基板の藻類固定化のためのキメラ融合ペプチド
一の実施形態において、図２Ａに示されるように、一本鎖抗体はキメラ融合ペプチド構築物の一部である。キメラ融合蛋白質構築物は基板結合ドメインと融合された単離一本鎖抗体を有する。基板結合ドメインは、キメラ融合蛋白質が、様々な目的で用いられる材料と結合することを可能にする。本発明の更なる実施形態において、キメラ融合蛋白質構築物は一本鎖抗体および基板結合ドメイン間にリンカーを有する。リンカーは５から５０アミノ酸、好ましくは１０から４０アミノ酸、より好ましくは２０から３０アミノ酸の長さを有する。一例は、（ＥＡＡＡＲ）_ｎリンカードメイン（例えば、Ｙａｎｅｔａｌ．，２００７）、ここでｎはｎ＝１から５０反復の範囲のＥＡＡＡＲ配列の繰り返し数を示す、である。一の実施形態によるリンカーは、少なくとも１回のＥＡＡＡＲ配列の繰り返しを有する。本発明の範囲内と考えられる他のリンカーは、リンカー配列の多重繰り返しを含むであろう。他のリンカー配列は、シトシン残基がセリンで改変されたヒトＳＮＡＰ２５ａの１から２０６アミノ酸またはリンカーとしてのＳＮＡＰ２５の１４０から２０６アミノ酸である。より一般的に、非構造性構成（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｃｏｎｆｉｃｕｒａｔｉｏｎ）および／または伸長ロッド構成（ｅｘｔｅｎｄｅｄｒｏｄｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）と予想される５から５００アミノ酸のリンカー配列が使用され得る。

一の構築物の基板ドメインは、キメラ融合蛋白質がセルロースに結合することを可能にするセルロース結合ドメインであり、一方で一本鎖抗体は藻類細胞、藻類細胞断片、または特異性を有する他の抗原を捕捉するために利用される。基板結合ドメインの他の例として：グルテニン結合ドメイン、レクチン結合ドメインおよびフィブロネクチン結合ドメイン、が挙げられる。例えば、ＰａｎｋｏｖＲ，ＹａｍａｄａＫＭ（２００２）Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎａｔａｇｌａｎｃｅ．ＪＣｅｌｌＳｃｉ．１１５：３８６１−３８６３；ＷｅｅｇｅｌｓＰＬ，ＨａｍｅｒＲＪ，ＳｃｈｏｆｉｅｌｄＩＤＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｗｈｅａｔｇｌｕｔｅｎｉｎ．（１９９６）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｒｅａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２３：１−１８；ＫｏｍａｔｈＳＳ，ＫａｖｉｔｈａＭ，ＳｗａｍｙＭＪ（２００６）Ｂｅｙｏｎｄｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｂｉｎｄｉｎｇ：ｎｅｗｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓｉｎｐｌａｎｔｌｅｃｔｉｎｒｅｓｅａｒｃｈＯｒｇＢｉｏｍｏｌＣｈｅｍ．４：９７３−９８８；ＬｙｎｄＬＲ，ＷｅｉｍｅｒＰＪ，ｖａｎＺｙｌＷＨ，ａｎｄＰｒｅｔｏｒｉｕｓＩＳ（２００２）ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌｕｌｏｓｅＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６６：５０６−５７７；ＬｉｎｄｅｒＭ，ＳａｌｏｖｕｏｒｉＩ，ＲｕｏｈｏｎｅｎＬ，ＴｅｅｒｉＴＴ（１９９６）ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａＤｏｕｂｌｅＣｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇＤｏｍａｉｎＪＢＣ２７１：２１２６８−２１２７２を参照のこと。バイオテクノロジー、特にセルロソーム研究からよく定義されたそのような要素が多くあり、それらは約８ｋＤａのペプチドの組換え型として表される。それらは機能的であり、よくフォールディングされ、容易に発現され、そしてそれらの配列は周知である（Ｓｈｏｈａｍｅｔａｌ．１９９９；Ｆｉｅｒｏｂｅｅｔａｌ．２００１；Ｋａｋｉｕｃｈｉｅｔａｌ．１９９８；Ｌａｍｅｄｅｔａｌ．１９８３）。セルロース結合ドメインは、豊富で、安価で、生物分解性であり、利用しやすいセルロースを基にした基板に結合できるため、好ましいドメインの一つである。本発明のまたさらなる実施形態において、一本鎖抗体は基板または膜に共有結合で結合している。

本発明のさらなる実施形態において、基板は、液体培地中の藻類細胞バイオマスの生育後のバイオ燃料生産のための藻類の固定化のための、選択的な膜バイオフィルムである。選択基板またはバイオフィルムは０．１ｍｍから１．０ｃｍの範囲、より好ましくは約１ｍｍの厚さを有する。

微細藻類は、医薬品、栄養食品、生活必需品、およびバイオ燃料のための多能な光合成製造プラットフォームとして持続可能な生物学的処理の主力となるよう準備されている。本発明の一本鎖抗体はバイオマス組成物の規制に適合し、培養物の完全性を維持し、回収効率を向上させる藻類の栽培のための方法を提供する。方法の第一段階では、藻類は基板に固定化される。この固定化段階は上述のキメラ融合蛋白質を用いて、一本鎖抗体を基板に付着して一本鎖抗体が藻類を捕捉することにより達成される。工程の第二段階では、藻類が必要な栄養および藻類の導入された基板上を継続的に動く水を提供することにより、基板上で生育する。

ｂ．固体基板上の藻類栽培システム
上述の方法は、図３に示すような藻類栽培システムを通して促進される。システムは、藻類および基板結合ドメインと結合する一本鎖抗体を有するキメラペプチド構築物と結合する能力を有する基板を含む。本発明の一の実施形態において、基板はその表面に基板結合ドメインによって認識される官能基を有する。システムの第二の成分は上述のような藻類に結合できるキメラペプチド構築物である。

本発明のいくつかの実施形態において、システムの第三の要素は栽培のための藻類株である。代替的な実施形態においてシステムの追加の要素は特定の藻類種に特異的な一本鎖抗体の二量体、三量体、または多量体を含むキメラペプチド基板である。少なくとも２個の一本鎖抗体を含むキメラペプチドは、固体または準固体基板に結合した藻類に藻類を沈殿／凝集することを可能にする。システムの他の要素は貯水池などの水の供給源、および基板に水を向けるチャネルである。システムのまたさらなる要素は、栄養分が添加できる水の供給源ともなり得る栄養源である。またさらなる実施形態において、システムは、少なくとも２個のシステムの要素を含むパッケージからなるキットを提供する。結合ドメインを通して構築物が結合する基板を有するシステムは、一本鎖抗体が認識し、結合する生物を捕捉するために利用される。

解放系の池または閉鎖系のフォトバイオリアクター内で常に循環させなければならない、大容量の液体培地中で懸濁物として藻類バイオマスを栽培する従来の方法と異なり、基板を基にした本発明の一の実施形態によるシステムは、生物分解可能基板の表面上で、その表面を継続的に通過する最小限の量の水で、固定化された藻類細胞を生育させるという利点を有する。このシステムでは、生産される藻類は基板につながれ、液体の薄い膜で覆われる。システムは既存のフォトバイオリアクターシステムより有意な利点を提供する。既存のバイオリアクターシステムでは、希薄溶液から藻類を回収することは困難である。本明細書に開示されたシステムでは、藻類は既に基板の表面に付着しており、その結果、生物の回収は液体培地中の低濃度の藻類により複雑にならない。本明細書に記載のシステムは、より少ない水を利用し、薄い基板への二酸化炭素送達は大いに改良される。さらに、システム内の液体が浅く存在することにより、内部生物の遮光および攪拌の問題は最小にされる。

現在のシステムは既存のシステムより、最適な藻類生育が改良されている。２５から３０ｇ／ｍ^２／日の気体の生産性（ａｅｒｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）は、何ヶ月もの期間にわたって最適の生育で操作された水路池での現在の生産性の限度に近い。本明細書に記載されるシステムは、７５から１００ｇ／ｍ^２／日の気体の生産性−いかなる既存の工業規模の藻類生育システムの範囲外となるほど良い−が、７５から１００μｍの厚さの藻類層で、１ｍ^２セルロース基板上での生育で達成できる。

この新規な生育システムの一の応用は、周囲の複数菌の集団または汚染物質の存在にかかわらず、固体生育基板上での所望の藻類生物を維持することである。本発明の一の実施形態において、基板結合藻類は、都市のまたは農業の廃水源からの栄養豊富な流出物から窒素とリンを回収するために利用できる（Ｍｕｎｏｚａｅｔａｌ．２００９）。そうすることで、これらの必須の栄養素は有害な環境放出から隔離されるだけではなく、システムの運用経費を下げながら、藻類からの有用品の生合成を支持するであろう。

さらなる実施形態において、固定化藻類はバイオ燃料および他の製品の生産に用いられる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．２００８）。一の例示的な実施形態において、所望の製品は、所望の副産物を生産するように設計された藻類で覆われた基板を除去し、標準的な方法を通じて製品を抽出することによって得られ得る。一例において、藻類細胞は溶解され、製品がその後集められる。他の例示的な実施形態において、中鎖脂肪酸などのバイオ燃料または他の製品を分泌するよう設計された藻類が利用できる（Ｌｉｕａｅｔａｌ．２０１０；Ｒｅｐｐａｓ＆Ｒｉｄｌｅｙ２０１０）。他の例では、藻類種はイソプレンおよびモノテルペンを含む揮発性代謝物などの所望の製品を分泌する。イソプレン分泌クラミドモナスが現在利用可能である（ＢｅｎｔｌｅｙａｎｄＭｅｌｉｓ，２０１１ａｎｄＬｉｎｄｂｅｒｇｅｔａｌ，２０１０）。基板上の藻類は日光を脂質などの分泌された製品に変換する。他の藻類はグルコース、スクロースおよびマルトースなどの糖類を分泌する。これらの分子の輸送はＳＷＥＥＴ遺伝子によりコードされるものおよびＡＢＣ型トランスポーターなどのトランスポーターによって促進される。水流への製品の分泌は、そのような製品を回収することをより簡単にする。

上述のシステムの他の利点は、興味のある藻類が選択的な基板に吸着され、他の全ての汚染可能生物が液体の流れと共に洗い流されることである。同じ原則に基づいて、他の形態が確実に予想できる。基板は表面域、水が通過し得る目開き、または繊維の多様性を増加させるため、微細メッシュであり得る。本発明の一態様において、メッシュまたは繊維の多様性は上述の一本鎖抗体で機能化される。本質的にいかなる形態の一本鎖抗体が機能化された基板（例えば、木片、屑紙）は、藻類でコートされた材料が沈殿するかまたは他の方法で溶液から回収されるように、藻類を回収するために用いられる。

一の好ましい実施形態において、システムは非常に薄い（〜１ｍｍ）膜、小さい気層（〜１ｃｍ）、および閉じ込めるための上下の透明なフィルム膜からなる。バイオフィルム膜または基板は、蒸発損失を防ぐ自給式である。大規模で使用されるとき、バイオフィルムまたは膜の気体循環が地熱ポンプ冷却システム（１０℃）を通過して水蒸気を凝縮し、適切なバイオフィルム／基板温度を維持する。また、海洋の近くの領域は、深層をヒートシンクとしてバイオフィルムからのガス循環および水の凝縮のために使用し得る。

ｃ．凝集を通じた藻類の栽培に用いられる一本鎖抗体
凝集は、藻類細胞が集まり、貯水池の底に沈むことをもたらす能力のことをいう。本発明の一の実施形態において、一本鎖抗体は藻類の表面に発現し、図４、５および６に示すように、簡単な回収のための細胞の凝集をもたらす。一本鎖抗体の表層提示は、例えばＢｏｒｄｅｒａｎｄＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７）の方法を使用して達成され得る。またさらなる実施形態において、藻類の凝集は上述された、一本鎖抗体が他の藻類細胞を認識する基板結合ドメインと結合する、キメラペプチド構築物の使用を通じて達成される。これらの型の構築物における基板結合ドメインは同種の藻類または異種と結合できる他の一本鎖抗体を含み得る。そのような基板結合ドメインは、一本鎖抗体を、順番に一本鎖抗体で認識される藻類または他の標的微生物を回収するために用いられる特異的基質に固定する。これらおよび他の応用は下記に詳細に説明される。

一本鎖抗体、二量体、三量体または一本鎖抗体の多重コピー構築物は、構築物を生物が増殖している液体溶液に添加することにより、微生物の凝集を誘導するために用いられる。１種以上の藻類のためのＶＨＨドメインの二量体または三量体を含む構築物は、図４に示されるように、凝集を引き起こすために藻類培養物に添加され得る。藻類塊は低速遠心分離により回収できる。さらなる実施形態において、ＶＨＨドメインは、図５に示されるように、酵母、珪藻または興味のある藻類生産株の表面に提示される。一本鎖抗体をその表面に提示する生物は、上述のように藻類を集めるであろう。

ｄ．特定の目的のために異なる藻類種を凝集するために用いられる一本鎖抗体
またさらなる実施形態において、２種の生産株が回収のために連結される。微細藻類−１がその表面に微細藻類−２のためのＶＨＨドメインを提示するように設計され、微細藻類−２がＶＨＨ提示により微細藻類−１に類似の親和性を示す場合、２個の藻類は別々に増殖し、その後両方の生物を迅速に回収するために共に混合される。一の追加の例において、これらの藻類一本鎖抗体は、図６に示すように、微細藻類細胞の回収および溶解を促進し得る他の特徴的な近接関係の利点のために用いられる。

他の実施形態において他の藻類株の溶解を引き起こすウイルスに感染している藻類株は生産藻類株の副産物の回収を容易にするために使用される。一の例では、溶解株は生産株に特異的な一本鎖抗体を発現するように設計される。２個の株が混合されたときに、溶解株の表面に発現した一本鎖抗体は、生産株と溶解株の凝集を引き起こす。溶解株のウイルスは生産株の生産物を放出する生産株の分解を引き起こす。あるいは、生産株および一本鎖抗体を発現しない溶解株は、上述したように両方の株を結合する能力を有するキメラペプチド構築物と共に混合される。

例えば、藻類クロレラ・バリアビリスＮＣ６４Ａは様々なクロレラウイルスの宿主である（Ｓｕｇｉｍｏｔｏｅｔａｌ．２０００）。ウイルス感染の際、溶解酵素が発現され、ウイルスのライフサイクルの間、藻類の細胞壁の分解を引き起こす。これらの溶解酵素は、他の微細藻類の細胞壁構成成分を分解するための重要なツールとして機能し、その結果、促進された回収のために細胞内の油および他の副産物を放出させる。ウイルス感染の間の、クロレラ・バリアビリスと直接接触する藻類株の生産をもたらす一本鎖抗体の使用は、藻類バイオマスの効率的な溶解を促進する。

ｅ．生物共同体を容易にする一本鎖抗体
本発明のさらなる一の実施形態において、一本鎖抗体は、栄養物と生物学的産品分子を交換するバイオフィルムに合成生物共同体（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｏｒｇａｎｉｓｍｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）を作り出すために使用される。生物共同体の使用は処理と効率を促進する。本発明の一の実施形態において、バイオフィルムまたは基板は、一面において、上述のように、第一の生物、例えば糖などの代謝物質を生産および分泌することができる藻類を捕捉する。バイオフィルムの他方の面は、所望の産物を合成する異なる型の生物を捕捉する。第二の生物は第一の生物により分泌された栄養物を利用する。

実施例
一本鎖抗体ライブラリーを生成するため、２体のアルパカ研究動物（ＴｕｆｔｓＣｕｍｍｉｎｇｓＳｃｈｏｏｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅにおいてＤｅｓｉおよびＳｅｄｏｎａと名付けられた）を、５個の異なる微細藻類種：クラミドモナス・ラインハーディＵＴＥＸ２２４４、クロレラ・バリアビリスＮＣ６４Ａ、コッコミクサｓｐ．Ｃ−１６９、ナノクロロプシス・オセアニカＯＺ−１およびタラシオシラ・シュードナナＣＭＭＰ１３３５、からの全蛋白抽出物で免役した。使用されたそれぞれの生物について、完全なゲノムが存在し、密接に関連づけられたか、同じ種はバイオ燃料生産に潜在的に利用可能である。Ｄｅｓｉはクラミドモナス・ラインハーディのみを受け、Ｓｅｄｏｎａは他の４種の藻類を受けた。５００ｍｇの藻類を、凍結、解凍、超音波処理およびその後の１ｍｌの無菌生理食塩水での希釈の後、注入した。

免疫を、動物への悪影響なしで２週間の間隔で４回の注射サイクルで続けた。最終注射の２週間後に、血清抗体のＥＬＩＳＡにより免疫応答を確立するため、血清を各々の動物から採取した。以下のプロトコルをＥＬＩＳＡ試験のために続けた。健康なクラミドモナス・ラインハーディまたはクロレラ・バリアビリス細胞をＳＤＳ有りまたは無しで超音波処理し、全細胞溶解液をＰＢＳバッファー中で調製した。２．５μＬの溶解物を各々のウェルに１０００μＬのカップリングバッファー（０．１ＭＮａＨＣＯ_３ｐＨ８．６＋０．４ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．６）と共にロードし、良く混ぜた。溶解物を室温にて２時間、および４℃で５時間置いた。以下の段階は全て室温にてシェーカー上で処理した。溶解物を１ｍＬＰＢＳと２．５％乳で４時間処理して遮断し、各回で１．５ｍＬのＰＢＳＴにより２回洗浄した。各々のＶＨＨ（１μＭから１ｐＭ）の１：２０００の希釈物をＰＢＳバッファーとともにウェルにロードし、４時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄した。混合物を、各々のウェルでＰＢＳバッファーとともに、ＨＲＰ（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｓ）が結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）したヤギ抗−ｅ−タグ二次抗体の１：２０００希釈物と１時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄し；２００μＬのＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を各々のウェルに青色が安定するまで１０分間で添加し、次いで２００μＬの１ＮＨＣｌを１０分間添加して比色反応を中断した。反応混合物を遠心分離し、上清をＯＤ４５０ｎｍで測定した。

この手順を、ウェルがクラミドモナス・ラインハーディ、ナノクロロプシス・オセアニカ、クロレラ・バリアビリスＮＣ６４Ａ、またはクロレラ・ソロキニアナＣＣＴＣＣＭ２０９２２０からの無傷の藻類でコーティングされている状態で、ポリスチレンマイクロタイタープレートで実行した。クラミドモナス・ラインハーディのみが注入されたＤｅｓｉは、ＥＬＩＳＡにより、予想通り、ナノクロロプシス・オセアニカ、クロレラ、コッコミクサ、およびタラシオシラ・シュードナナではなく（データは示さず）、クラミドモナス・ラインハーディにのみ強い免疫反応を示した（図７）。同様に、Ｓｅｄｏｎａ（ナノクロロプシス・オセアニカ、クロレラＮＣ６４Ａ、コッコミクサＣ−１６９およびタラシオシラ・シュードナナＣＭＭＰ１３３５が注入された）は、クラミドモナスではなく、クロレラ、ナノクロロプシス・オセアニカ、コッコミクサおよびタラシオシラ・シュードナナへの良好な反応を示した（データは示さず）。これらの動物の血清応答もまた、予備（前）免疫ならびにそれに続く出血後免疫（ｂｌｅｅｄｓｐｏｓｔ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を伴うウエスタンブロット分析により分析され、図８に示すように、それぞれの藻類で特定の免疫反応を示す。

これらの良好な結果に基づき、抹消リンパ球を採取し、重鎖のみの抗体のＶＨＨドメインをコードするファージディスプレイライブラリーを生成した。藻類結合一本鎖抗体を生成するという目的のため、ファージライブラリーを、少数の種に特異的で、藻類表面と高い親和性を有する一本鎖抗体の同定のため、生成藻類微生物に対してパニングした。これらの一本鎖抗体ｃＤＮＡクローンを単離し、大腸菌内で融合蛋白質として発現した。他の適当な宿主が、さらなる得意化を可能とするために使用され得る。

上記の方法の一の例示的な実施形態において、クラミドモナス・ラインハーディに特異的な小鎖抗体を発現する９個のクローンを単離し、これらのクローンから単離された一本鎖抗体の配列を、その全体が本明細書に組み込まれる以下の配列表にて提供する。図７に示すとおり、上記の一本鎖抗体は、４０％のアミノ酸同一性を有し、クラミドモナス・ラインハーディに結合する能力を維持する。

一本鎖抗体は、一旦単離されると、酵母Ａｇａ２蛋白質との融合として発現し、酵母の表面に提示される。蛋白質もまた、藻類種、珪藻、シアノバクテリアおよび他の光合成微生物などの選択された微生物の表面への提示のための融合蛋白質で使用され得ることが検討されている。

本発明の他の例は、基板結合ドメイン、蛍光マーカー、一本鎖抗体およびエピトープタグを含む構築物である。２個の例示的な構築物の配列が配列番号７３および７４として提供される。配列番号７３の構築物は、以下の構成、Ｔｒｘ−６×Ｈｉｓ−ＧＦＰ−ＶＨＨ（配列番号９）−Ｅエピトープタグを含む。配列番号７４の構築物は、以下の構成、Ｔｒｘ−６×Ｈｉｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＶＨＨ（配列番号６）−Ｅエピトープタグを含む。構築物は、一本鎖抗体がそれらの藻類標的に有効に結合することを示すために用いられた。図１０に示されるとおり、配列番号７４の構築物はクラミドモナス・ラインハーディに結合する。左のパネルは構築物がない細胞を示す。右のパネルは構築物添加後の細胞を示す。図１１は、細胞壁内にＧＦＰシグナル（緑）およびｍＣｈｅｒｒｙシグナル（赤）を示す野生型クラミドモナス・ラインハーディ（ｃｃ１２４）の共焦点像を示す。細胞は、ＧＦＰタグ化ＪＧＪ−Ｂ１１ＶＨＨでまず処理され、次いで洗浄後にｍＣｈｅｒｒｙタグ化ＪＧＫ−Ｈ１０で処理された。青い部分は細胞の葉緑体からの葉緑素自発蛍光を表す。ＪＧＪ−Ｂ１１は細胞の鞭毛端に極性を示す。

図１２に示されるとおり、本発明の一の実施形態による構築物は、構築物のセルロース膜への結合を示す。図は基板結合ドメイン、すなわちセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）の受入番号を示す。図はまた基板への結合も示す。左側の基板は、対照が白であるのに対して、ｍＣｈｅｒｒｙマーカーの発現を示すピンクである。図１３は、ａ）培養物をＣＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＶＨＨ（ＪＧＪ−Ｂ１１）で予備処理されたＷｈａｔｍａｎ紙片により接種し、次いで生存クラミドモナス・ラインハーディ細胞と培養する、およびｂ）同様の処理であるが、ＣＢＤ−ｍＣｈｅｒｒｙ対照蛋白質で予備処理する、場合におけるクラミドモナス・ラインハーディ細胞の異なる細胞密度を示す。画像は接種後３日間経ったものである。

本発明の一本鎖抗体は藻類の異なる種を認識できることを示した。例えば、クロレラ・バリアビリスＮＣ６４Ａで免役されたアルパカは、（ＣＳ−０１）とのパニングの後、クロレラ・ソロキニアナＣＣＴＣＣＭ２０９２２０を認識できる一本鎖抗体を生産した。本明細書に記載された９個のクロレラＶＨＨは２サイクルのパニングでの、ＮＣ６４Ａでのパニングの結果である。第３のパニングの際、ファージは両方の種のためにＮＣ６４にてパニングされ、選択された。ＮＣ６４Ａからの１００のクローンがＮＣ６４Ａ抽出のＥＬＩＳＡのために選択され、約７５％が陽性であった。２００のクローンがＣＳ−０１抽出のＥＬＩＳＡのためにＣＳ−０１パニングから選択され、約５０％が陽性であった。１９のクローンが、上記の通りフィンガープリンティングされ、各々からの中程度から強い陽性群が回収された。いくつかのフィンガープリントが１種または他の種で濃縮されたが、両種の選択に続いて同じクローンが一般的に観測されたことが明らかであった。

本発明は好ましい実施形態に関して述べられてきた。特定の値、関係、物質、および段階が本発明の概念を述べることを目的として表明されてきた一方で、様々な改変、および／または修飾が、広く述べられた本発明の基本的な概念および動作原理の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態で示された本発明に対してなされ得ることが当業者によって理解されるであろう。上の教示の観点から、当業者は、本明細書で教示された発明から逸脱することなくそれらの細目を修飾することができると認識されるであろう。本発明の基礎となる概念の望ましい実施形態、およびある修飾を十分に明らかにしたので、当業者がその基礎となる構想に精通すると、さまざまなその他の実施形態、ならびに本明細書で示し、述べた実施形態のある改変および修飾は明らかに彼らによって起こされるであろう。そのような修飾、変法、およびその他の実施形態が添付される請求の範囲、またはその同等物の範囲にある限り、それらすべてを含むことが意図される。それゆえ、本発明は、本明細書で具体的に明らかにされた以外の態様で実行され得ることが理解されるべきであろう。結果として、本実施形態は、例示的なものであり制限的ではないとあらゆる点でみなされ得る。

本発明は藻類に特異的な抗体に利用できる。本発明は藻類に特異的な一本鎖抗体、およびその抗体を使用するための方法を開示する。バイオテクノロジーの分野の産業で本明細書に記載された抗体と方法を作成および実施できる。

参考文献
明細書で引用される以下の文献は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
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ＫａｋｉｕｃｈｉＭ，ＩｓｕｉＡ，ＳｕｚｕｋｉＫ，ＦｕｊｉｎｏＴ，ＦｕｊｉｎｏＥ，ＫｉｍｕｒａＴ，ＫａｒｉｔａＳ，ＳａｋｋａＫ，ＯｈｍｉｙａＫ．（１９９８）ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅＧｅｎｅｓＥｎｃｏｄｉｎｇＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｊｏｓｕｉＳｃａｆｆｏｌｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎＣｉｐＡａｎｄＣｅｌｌｕｌａｓｅＣｅｌＤａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴｈｅｉｒＧｅｎｅＰｒｏｄｕｃｔｓａｓＭａｊｏｒＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅＣｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１８０：４３０３−４３０８．

ＦｉｅｒｏｂｅＨ−ＰＭｅｃｈａｌｙＡ，ＴａｒｄｉｆＣ，ＢｅｌａｉｃｈＡ，ＬａｍｅｄＲ，ＳｈｏｈａｍＹ，ＢｅｌａｉｃｈＪ−Ｐ，ＢａｙｅｒＥＡ．（２００１）ＤｅｓｉｇｎａｎｄＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＡｃｔｉｖｅＣｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅＣｈｉｍｅｒａｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２７５（２４）：２１２５７２１２６１．

ＳｈｏｈａｍＹ，ＬａｍｅｄＲ，ＢａｙｅｒＥＡ．（１９９９）Ｔｈｅｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅｃｏｎｃｅｐｔａｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｏｌｕｂｌｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ７：２７５−２８１

ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＪＮ，ＯｙｌｅｒＧＡ，ＷｉｌｋｉｎｓｏｎＬ，ＢｅｔｅｎｂａｕｇｈＭＪ．（２００８）Ａｇｒｅｅｎｌｉｇｈｔｆｏｒｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄａｌｇａｅ：ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｔｏｆｕｅｌａｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１９：４３０−４３６．

ＢｅｎｔｌｅｙＨ．ＫａｎｄＭｅｌｉｓＡ．（２０１１）Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅｕｐｔａｋｅａｎｄｉｓｏｐｒｅｎｅｅｍｉｓｓｉｏｎｉｎｇａｓｅｏｕｓ／ａｑｕｅｏｕｓｔｗｏ−ｐｈａｓｅｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓｂｙｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：１０９：１００−１０９．

ＬｉｎｄｂｅｒｇＰ．，ＰａｒｋＳ．，ＭｅｌｉｓＡ．（２０１０）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｉｓｏｐｒｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，ｕｓｉｎｇＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓａｓｔｈｅｍｏｄｅｌｏｒｇａｎｉｓｍ．ＭｅｔａｂｏｌｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１２：７０−７９．

Claims

藻類細胞に結合する能力を有する単離一本鎖抗体。
藻類細胞が、クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、クロレラ・バリアビリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、コッコミクサ（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ）、ナノクロロプシス・オセアニカ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｏｃｅａｎｉｃａ）およびタラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）からなる群から選択される、請求項１に記載の単離一本鎖抗体。
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、６７、６８および６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離一本鎖抗体。
アミノ酸配列が配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、７０、７１および７２からなる群から選択される核酸によってコードされる、請求項３に記載の単離一本鎖抗体。
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、６７、６８および６９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の単離一本鎖抗体。
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、６７、６８および６９からなる群から選択される配列と少なくとも４０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の単離一本鎖抗体。
藻類に特異的な一本鎖抗体を単離する方法であって：
ラクダ科の動物を藻類株で免疫する；
動物から血液試料を集める；
血液試料からｃＤＮＡライブラリーを調製する；
ｃＤＮＡライブラリーをファージ上に発現させる；
生存藻類株に特異的な抗体のためにファージをパニングする；および
パニング段階で同定された抗体を単離する、
段階を含む、方法。
請求項７に記載の方法であって、パニング段階が：
生存藻類のペレットを得る；
遮断薬をペレットに加える；
ファージをペレットに曝す；および
ファージを溶出する、
ことを含む、方法。
請求項７に記載の方法であって、単離段階が：
特異的制限エンドヌクレアーゼフィンガープリントで一本鎖抗体を選択、および
ＥＬＩＳＡからの陽性シグナル、
からなる、方法。
藻類細胞と結合する能力を有する単離一本鎖抗体ドメイン、および基板結合ドメインを含む、キメラ融合ペプチド構築物。
藻類細胞が、クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、クロレラ・バリアビリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、コッコミクサｓｐ．（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａｓｐ．）、ナノクロロプシス・オセアニカ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｏｃｅａｎｉｃａ）およびタラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）からなる群から選択される、請求項１０に記載のキメラ融合ペプチド構築物。
単離一本鎖抗体ドメインが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、６７、６８および６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のキメラ融合ペプチド構築物。
アミノ酸配列が配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、７０、７１および７２からなる群から選択される核酸によってコードされる、請求項１２に記載のキメラ融合ペプチド構築物。
単離一本鎖抗体ドメインが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、６７、６８および６９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１１に記載のキメラ融合ペプチド構築物。
単離一本鎖抗体ドメインが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、６７、６８および６９からなる群から選択される配列と少なくとも４０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１１に記載のキメラ融合ペプチド構築物。
基板結合ドメインがセルロース結合ドメイン、グルテニン結合ドメイン、レクチン結合ドメインおよびフィブロネクチン結合ドメインからなる群から選択される、請求項１に記載のキメラ融合ペプチド構築物。
一本鎖抗体ドメインおよび基板結合ドメインの間にさらにリンカーを含む、請求項１に記載のキメラ融合ペプチド構築物。
リンカーが５から５０アミノ酸の長さを有する、請求項１７に記載のキメラ融合ペプチド構築物。
リンカーが１０から４０アミノ酸、より好ましくは２０から３０アミノ酸の長さを有する、請求項１７に記載のキメラ融合ペプチド構築物。
リンカーが、シトシン残基がセリンで改変されたヒトＳＮＡＰ２５ａの１から２０６アミノ酸またはＳＮＡＰ２５の１４０から２０６アミノ酸を含む、請求項１７に記載のキメラ融合ペプチド構築物。
リンカーが、少なくとも１回の配列（ＥＡＡＡＲ）_ｎの反復、ここでｎはｎ＝１から５０反復を示す、を含む、請求項１７に記載のキメラ融合ペプチド構築物。
藻類を栽培する方法であって：
藻類を、該藻類に結合できる能力を有する単離一本鎖抗体をさらに含む基板に固定化し；
藻類を該基板上で増殖させる、
ことを含む、方法。
該基板が生物分解性である、請求項２３に記載の方法。
該基板がセルロースである、請求項２３に記載の方法。
該一本鎖抗体が、基板結合ドメインをさらに含むキメラ融合ペプチド構築物の成分である、請求項２３に記載の方法。
藻類細胞が、クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、クロレラ・バリアビリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、コッコミクサｓｐ．（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａｓｐ．）、ナノクロロプシス・オセアニカ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｏｃｅａｎｉｃａ）およびタラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
単離一本鎖抗体ドメインが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、６７、６８および６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の方法。
アミノ酸配列が配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、７０、７１および７２からなる群から選択される核酸によってコードされる、請求項２７に記載の方法。
単離一本鎖抗体ドメインが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、６７、６８および６９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２７に記載の方法。
単離一本鎖抗体ドメインが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、６７、６８および６９からなる群から選択される配列と少なくとも４０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２７に記載の方法。
基板結合ドメインがセルロース結合ドメイン、グルテニン結合ドメイン、レクチン結合ドメインおよびフィブロネクチン結合ドメインからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
一本鎖抗体ドメインおよび基板結合ドメインの間にさらにリンカーを含む、請求項２５に記載の方法。
リンカーが５から５０アミノ酸の長さを有する、請求項２５に記載の方法。
リンカーが１０から４０アミノ酸、より好ましくは２０から３０アミノ酸の長さを有する、請求項３３に記載の方法。
リンカーが、シトシン残基がセリンで改変されたヒトＳＮＡＰ２５ａの１から２０６アミノ酸またはＳＮＡＰ２５の１４０から２０６アミノ酸を含む、請求項３３に記載の方法。
リンカーが、少なくとも１回の配列（ＥＡＡＡＲ）_ｎの反復、ここでｎはｎ＝１から５０反復を示す、を含む、請求項３３に記載の方法。
一本鎖抗体のコピーを少なくとも含む第二のキメラペプチド構築物を藻類細胞の培養物に添加する段階をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
キメラ融合ペプチド構築物が一本鎖抗体の少なくとも２コピーを含む、請求項３７に記載の方法。
該一本鎖抗体の少なくとも２コピーがリンカーによって連結する、請求項３８に記載の方法。
リンカーが５から５０アミノ酸の長さを有する、請求項３９に記載の方法。
リンカーが１０から４０アミノ酸、より好ましくは２０から３０アミノ酸の長さを有する、請求項３９に記載の方法。
リンカーが、シトシン残基がセリンで改変されたヒトＳＮＡＰ２５ａの１から２０６アミノ酸またはＳＮＡＰ２５の１４０から２０６アミノ酸を含む、請求項３９に記載の方法。
リンカーが、少なくとも１回の配列（ＥＡＡＡＲ）_ｎの反復、ここでｎはｎ＝１から５０反復を示す、を含む、請求項３９に記載の方法。
藻類細胞が、藻類細胞の膜表面上に一本鎖抗体を発現する、請求項３７に記載の方法。
藻類培養物から藻類を回収する方法であって、
藻類培養物に、藻類に特異的で藻類の凝集をもたらす一本鎖抗体を導入し；および
凝集後に藻類または藻類産物を回収する、
段階を含む、方法。
一本鎖抗体が培養物にキメラ融合ペプチド構築物を添加することにより導入される、請求項４５に記載の方法。
キメラ融合ペプチド構築物が、一本鎖抗体の少なくとも２コピーを含む、請求項４６に記載の方法。
該一本鎖抗体の少なくとも２コピーがリンカーによって連結する、請求項４７に記載の方法。
リンカーが５から５０アミノ酸の長さを有する、請求項４８に記載の方法。
リンカーが１０から４０アミノ酸、より好ましくは２０から３０アミノ酸の長さを有する、請求項４８に記載の方法。
リンカーが、シトシン残基がセリンで改変されたヒトＳＮＡＰ２５ａの１から２０６アミノ酸またはＳＮＡＰ２５の１４０から２０６アミノ酸を含む、請求項４８に記載の方法。
リンカーが、少なくとも１回の配列（ＥＡＡＡＲ）_ｎの反復、ここでｎはｎ＝１から５０反復を示す、を含む、請求項４８に記載の方法。
一本鎖抗体が藻類細胞膜または細胞壁の表面での発現により導入される、請求項４５に記載の方法。
キメラ融合ペプチド構築物が、第一の藻類種に特異的な第一の一本鎖抗体および第二の藻類種に特異的な第二の一本鎖抗体を含む、請求項４５に記載の方法。
第一の藻類種が第二の藻類種の溶解をもたらすウイルスのウイルス宿主である、請求項５４に記載の方法。
第二の藻類種がウイルスへの暴露を通じて産品を提供する、請求項５５に記載の方法。