CN117143831B - 一种抗虫蛋白杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗虫蛋白Cry 1Ah杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45483。其制备方法包括：a)纯化原核表达的Cry 1Ah重组蛋白；b)将Cry 1Ah重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；c)收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；d)通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5‑7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单抗为实现转基因作物中抗虫蛋白Cry 1Ah的检测奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及到一种抗虫蛋白Cry 1Ah杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用。
背景技术
苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis，Bt) 是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药。该抗虫晶体蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：Cry蛋白和Cyt，其中Cry蛋白对多种有害昆虫（如鳞翅目、双翅目、鞘翅目昆虫）、线虫类和原生生物等的幼虫具有毒性。Cry蛋白已经被转入农作物使其具有抗虫性，目前转Cry 蛋白基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。Cry 1Ah 蛋白是 Cry蛋白中的一种。
转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性；转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性；食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。因此，为了对转基因作物及其衍生物中 Cry 1Ah 蛋白进行快速分析，研究并得到抗 Cry 1Ah 蛋白的单克隆抗体具有非常大的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗虫蛋白Cry 1Ah杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用，其分泌的单抗为实现转基因作物中抗虫蛋白Cry 1Ah的检测奠定基础。
为实现上述目的，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株3C4 2E6已于2023年2月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45483。
具体的，该杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：
a) 纯化原核表达得到Cry 1Ah重组蛋白；
b) 免疫动物：将Cry 1Ah重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；
c) 细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；
d) 细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。
其中，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比例为1:5-1:10。
本发明还提供一种前述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
具体的，杂交瘤细胞株3C4 2E6所产生的单克隆抗体通过间接 ELISA检测所得到的效价为1:3072000，抗体的类型为IgG1。
杂交瘤细胞株3C4 2E6所产生的单克隆抗体可变区重链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示序列，可变区轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示序列。具体序列为：
| 细胞株 | 重链可变区氨基酸序列 | 轻链可变区氨基酸序列 |
| 3C4 2E6 | QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSIRKDISKSQVFFKINSLRVNDTAIYYCATNHGGYDGAYFSYWGQGTLVTVSA | DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTTIHWYQQRTNGSPRLLIKYAFESVSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNNWPLTFGAGTKLELKR |
本发明还提供了上述单克隆抗体在Cry 1Ah抗虫蛋白定性检测中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请利用原核表达纯化得到的重组抗虫蛋白Cry 1Ah作为抗原，通过杂交瘤技术制备了分泌抗Cry 1Ah的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株3C4 2E6，所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接 ELISA 效价为1:3072000，抗体亚型为IgG1，所述单抗可以特异识别转基因玉米中Cry 1Ah蛋白，分泌抗Cry1Ah抗虫蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因作物中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。
保藏信息：
本发明提供的杂交瘤细胞株3C4 2E6，已于2023年2月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为Cry1Ah单抗杂交瘤细胞株，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.45483。
附图说明
图1是根据本发明的杂交瘤细胞株3C4 2E6纯化的单克隆抗体的SDS-PAGE 电泳结果图；
图2是根据本发明的杂交瘤细胞株3C4 2E6所产生的单克隆抗体滴度；
图3是根据本发明的杂交瘤细胞株3C4 2E6所产生的单克隆抗体特异性检测转基因玉米中的Cry 1Ah 的Western结果图；
图4 是根据本发明的杂交瘤细胞株3C4 2E6所产生的单克隆抗体特异性检测常用的Bt Cry抗虫蛋白的考染和Western结果图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
实施例1：杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
1. 免疫抗原的制备
从转基因玉米HGK60基因组DNA扩增cry 1Ah基因，构建表达载体pET28a-cry 1Ah，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经种子活化，扩大培养并于16℃经IPTG过夜诱导表达，经Ni亲和层析柱和凝胶过滤纯化得到较纯的His-Cry 1Ah蛋白。
2. 免疫动物
用His-Cry 1Ah蛋白作为抗原免疫8只8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠（购置于湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018），抗原与等体积完全弗氏佐剂（首免）或不完全弗氏佐剂（加强免疫）混合并进行乳化，充分混合至油包水状态后进行皮下多点免疫，2-3 次加强免疫，每次免疫间隔周期 2 周，之后进行效价检测，高于>1:10000 后 1 周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于250μL的 PBS 中。具体免疫程序及免疫剂量如表1所示。
表1 免疫程序及免疫剂量
免疫示例：一免中，将50ug的抗原溶于PBS，然后与佐剂按体积1:1混合。
3. 细胞融合
末次冲击 3 天后，收集阳性对照血，取脾脏，制备成单细胞悬液；处于对数期的SP2/0 细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合（1:5-1:10），50% PEG 1450 作用 1min，以基础培养基 DMEM 稀释终止，低速离心后，再用含 20%胎牛血清的 HAT 培养基轻轻悬浮并混匀，按照 2×107/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于 5% CO2，37℃下培养。
4. 细胞建株
1）融合板检测：
待融合板换液细胞长至中等大小约 1 万个细胞以上开始检测，在 ELISA 质控合格（即阴性对照OD450<0.2，阳性对照OD450>1.0）后挑选阳性孔（一般 OD450≥0.5）作亚克隆。
2）亚克隆方法及检测：
挑出融合板中检测阳性值高(OD450>2.0)的孔进行有限稀释，以每板 60%的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，每次亚克隆 5-7天即可进行 ELISA 检测，直到最终筛选出能稳定分泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。
3）细胞株建立：
将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株扩大培养于 24 孔板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用 ELISA 梯度稀释及western-blotting验证其稳定性，Cry1Ah单抗杂交瘤细胞株3C4 2E6分泌的单抗能特异检测到转基因玉米样本中的Cry 1Ah蛋白，收集细胞扩大于 10cm 培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出OD450>2.0的细胞株培养于细胞瓶中，进行冻存，即杂交瘤细胞株3C4 2E6，已于2023年2月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.45483。
4）细胞株冻存鉴定，在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定，鉴定标准：
①复苏活细胞数≥100 万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50 万/株；③复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细菌、真菌、支原体等)出现；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清也需作ELISA（OD450>2.0），以确定是否分泌阳性抗体的同时做 western-blotting的鉴定，通过图3可知，Cry 1Ah单抗杂交瘤细胞株3C4 2E6分泌的单抗能特异检测到转基因玉米中Cry 1Ah蛋白。
5. 制备腹水
先用降植烷或液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞株3C4 2E6接种到小鼠腹腔中，细胞定株后扩大培养选用 10%胎牛血清培养基，当细胞密度达到1×106-2×106/mL时，800 rpm离心，收集沉淀，并用 PBS 重悬后，腹腔注入到小鼠（液体石蜡）体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。
6. 抗体纯化
收集后的腹水经过预处理后选用 Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，具体步骤如下：
1）缓冲液：起始缓冲液为 pH7.0，20mM 磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为 pH2.7 0.1mM甘氨酸盐酸。
2）准备收集管：取 1.5mL 离心管，每支离心管加70μL pH9.0 1M Tris-HCL。
3）样品准备：经 50% SAS 沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜，并经0.22μm 微孔滤膜滤过。
4）纯化过程：用足够的起始缓冲液（8-10mLProtein A-琼脂糖亲和层析柱（HiTrap Protein A 1mL，Pharmacia Biotech）。取待纯化的样品（每毫升样品含蛋白10.2-21.1mg）15-25mL上柱，流速为 0.5mL/min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液 7-8mL、洗脱缓冲液 6-7mL、起始缓冲液 5mL 洗涤，每管 1mL 收集洗脱液。
5）纯度及活性鉴定：纯化的单克隆抗体（McAb）用 SDS-PAGE 鉴定其纯度，详见图1，杂交瘤细胞株3C4 2E6单克隆抗体经纯化去除几乎所有杂蛋白，有2条特异性主条带（55kDa和30kDa）。
7. 单克隆抗体的效价测定
以重组His-Cry 1Ah蛋白为抗原，用间接ELISA方法检测纯化单抗效价，通过图2可知，经ELISA测定，纯化得到的3C4 2E6单抗滴度为1:3072000。
表2 杂交瘤细胞株3C4 2E6所产生的单克隆抗体的浓度
| 单抗杂交瘤细胞编号 | 抗体（IgG）浓度 |
| 3C4 2E6 | 6.0 mg/mL |
8. 单克隆抗体特异性检测
8.1 转基因作物来源样本中Cry1Ah的特异性检测
分别提取转Cry1Ah基因玉米及其转化亲本内源蛋白，跑SDS-PAGE胶，转膜用纯化单抗（3C4 2E6）作为一抗，Alexa FlurorTM 680 goat anti-mouse IgG(H+L)(Invitrogen)为二抗，用Odyssey infrared740 imager（9120, Li-COR Biosciences,Lincolin, NE)红外扫描仪western检测结果，通过图3可知，纯化得到的3C4 2E6单抗能特异识别内源样本中的Cry 1Ah。
其中，转基因玉米蛋白提取方法:
组织液氮速冻，磨碎，加1mL（按样品量，一般0.5g加 1-2mL）蛋白提取液，4℃混匀30分钟， 12,000rpm 4℃离心15 min，取上清，蛋白提取液配方见表3：
表3蛋白提取液配方
| 成分 | 用量 |
| 1M Tris, pH 7.5 | 500 uL |
| 1M NaCL | 1.5 mL |
| 0.5M EDTA | 20 uL |
| 50%glycerol | 2 mL |
| 10% SDS | 1 mL |
| 双蒸水（DDH2O） | 配成10mL |
| 蛋白酶抑制剂(Roche) | 用时添加一片 |
| 1mM PMSF（苯甲基磺酰氟, Sigma） | 用时添加50uL |
8.2 转基因作物中常用Bt抗虫蛋白的特异性检测
除Cry1Ah外，转基因作物中常用Cry抗虫蛋白还有Cry1C、Cry2Aa、Cry2Ac等Bt蛋白。为了检测本发明的杂交瘤细胞株3C4 2E6所产生的单抗的特异性，用该单抗进行Western检测Cry1Ah（原核表达纯化获得）、Cry1C、Cry2Aa、Cry2Ac（购买于上海佑隆公司），检测结果见图4，结果表明纯化得到的3C4 2E6所产生的单抗能特异识别Cry 1Ah，但不能有效识别其他Cry抗虫蛋白。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。 本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (6)
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45483。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，其特征在于，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后对收集的腹水进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.45483的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体通过间接 ELISA检测所得到的效价为1:3072000。
4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.45483的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体的类型为IgG1。
5.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.45483的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
6.根据权利要求2-5任一项所述的单克隆抗体在Cry 1Ah抗虫蛋白定性或定量检测中的应用。
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