CN108004215B - 杂交瘤细胞株及其产生的抗体和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了杂交瘤细胞株及其产生的抗体和制备方法，杂交瘤细胞株1F9‑1F5和杂交瘤细胞株2G3‑1D7，已依次于2017年10月11日和2017年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号依次为CGMCC No.14725和CGMCC No.14733，所述杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：a)通过原核表达得到Vip3Aa20重组蛋白；b)免疫动物：将Vip3Aa20重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5‑7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存，所述杂交瘤细胞株分泌的单抗为实现抗虫蛋白Vip3Aa20在转基因玉米MIR162中的定性、定量检测奠定基础。

Description

杂交瘤细胞株及其产生的抗体和制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及到杂交瘤细胞株及其产生的抗体和 制备方法。
背景技术
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在于土壤中的革兰 氏阳性菌，在营养生长期分泌具有高抗虫活性的可溶蛋白(Vegetative InsecticidalProteins,Vip proteins)。在接种15个小时至产孢期，菌液上清均 可检测到Vip3蛋白的表达。抗虫蛋白Vip3对鳞翅类(Lepidoptera)昆虫有广 泛毒性，当昆虫取食Vip3蛋白后，该蛋白经中肠蛋白酶活化，活化的蛋白穿 透围食膜，与中肠细胞的上皮细胞顶膜特异蛋白结合并形成肠穿孔，从而破 坏细胞的渗透平衡，引起细胞肿胀裂解，最终导致死亡。因此Vip3基因已成 为植物基因工程及转基因育种应用中最具有潜力和应用前景的抗虫基因。其 中Vip3Aa基因已成功的被用于转基因棉花和玉米。
转基因作物的飞速发展在带来巨大经济利益的同时，人们也越来越关注 转基因作物可能带来的不可预期的食用安全及环境安全性问题，越来越多的 国家要求对转基因产品进行检测以实行标识制度。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理 解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术 人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供杂交瘤细胞株及其产生的抗体和制备方法，其分 泌的单抗为实现抗虫蛋白Vip3Aa20在转基因玉米MIR162中的定性、定量检 测奠定基础。
为实现上述目的，本发明提供了一种杂交瘤细胞株的制备方法，包括以 下步骤：
a)通过原核表达得到Vip3Aa20重组蛋白；
b)免疫动物：将Vip3Aa20重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；
c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；
d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行ELISA检 测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。
上述制备方法在另一种实施方式中，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比 例为1:5-1:10。
本发明还提供了上述制备方法所制备出的杂交瘤细胞株，包括生物保藏 编号为CGMCC No.14725的杂交瘤细胞株1F9-1F5以及生物保藏编号为 CGMCC No.14733的杂交瘤细胞株2G3-1D7。
本发明还提供了上述杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细 胞株1F9-1F5的生物保藏编号为CGMCC No.14725，所述杂交瘤细胞株 2G3-1D7的生物保藏编号为CGMCC No.14733。
上述单克隆抗体在另一种实施方式中，杂交瘤细胞株1F9-1F5以及杂交 瘤细胞株2G3-1D7所产生的单克隆抗体的类型依次为IgG1和IgG2a。
上述单克隆抗体在另一种实施方式中，杂交瘤细胞株1F9-1F5以及杂交 瘤细胞株2G3-1D7所产生的单克隆抗体通过间接ELISA检测所得到的效价 依次为1:4900000和1:8600000。
本发明还提供了上述单克隆抗体的制备方法，将杂交瘤细胞株接种到小 鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆 抗体。
本发明还提供了上述单克隆抗体在检测Vip3Aa20抗虫蛋白中的应用。
本发明还提供了上述单克隆抗体在制备ELISA法检测Vip3Aa20抗虫蛋 白的试剂中的应用。
本发明还提供了上述单克隆抗体在制备ELISA双抗体夹心法检测 Vip3Aa20抗虫蛋白的试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请利用工程菌株表达、 纯化得到的高纯度抗虫蛋白Vip3Aa20作为抗原，通过杂交瘤技术制备了2株 分泌抗Vip3Aa20的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株1F9-1F5以及杂交瘤细胞 株2G3-1D7，所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价分 别为1:4900000和1:8600000，抗体亚型依次为IgG1和IgG2a，所述单抗可以 特异识别原核表达的重组Vip3Aa20蛋白及转基因玉米MIR162标准品中的内 源Vip3Aa20蛋白，分泌抗Vip3Aa20抗虫蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建 为转基因作物中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。
保藏信息
本发明提供的杂交瘤细胞株1F9-1F5(即保藏证明上所体现的“Vip3单克 隆抗体杂交瘤细胞株”)和杂交瘤细胞株2G3-1D7(即保藏证明上所体现的 “Vip3单抗杂交瘤细胞株”)，已依次于2017年10月11日和2017年11月 06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号依次为CGMCC No.14725和CGMCC No.14733。
附图说明
图1是根据本发明的Vip3Aa20重组蛋白SDS-PAGE电泳结果图；
图2是根据本发明的Vip3Aa20重组蛋白单抗筛选western结果图，其中 一抗:Lane1-8：杂交瘤细胞培养上清，Lane10：阳性抗血清，二抗: IgG(H+L)-HRP(1:5000)；
图3是根据本发明的Vip3Aa20重组蛋白单抗复筛western结果图，其中， 一抗:Lane1-6：杂交瘤细胞培养上清，Lane8：阳性抗血清，二抗: IgG(H+L)-HRP(1:5000)；
图4是根据本发明的杂交瘤细胞株1F9-1F5纯化的单克隆抗体的 SDS-PAGE电泳结果图；
图5是根据本发明的杂交瘤细胞株2G3-1D7纯化的单克隆抗体的 SDS-PAGE电泳结果图；
图6是根据本发明的杂交瘤细胞株1F9-1F5所产生的单克隆抗体滴度；
图7是根据本发明的杂交瘤细胞株2G3-1D7所产生的单克隆抗体滴度；
图8是根据本发明的杂交瘤细胞株1F9-1F5所产生的单克隆抗体特异性 检测Vip3Aa20重组蛋白和转基因玉米MIR162中的Vip3Aa20Western结果图；
图9是根据本发明的杂交瘤细胞株2G3-1D7所产生的单克隆抗体特异性 检测Vip3Aa20重组蛋白和转基因玉米MIR162中的Vip3Aa20Western结果图；
其中，图2-图3以及图8-图9中的MIR162代表转基因玉米MIR162阳 性标准品，Neg.Contr.代表非转基因玉米阴性样品，His-Vip3Aa20代表原核表 达His-tag Vip3Aa20重组蛋白。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本 发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可 购得。
实施例1杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
1.免疫抗原的制备
1.1重组蛋白Vip3Aa20表达菌株构建、菌体培养及裂解
Vip3Aa20编码基因扩增：以转基因玉米MIR162基因组DNA为模板， vip3a20-NdeI-F:catatggctagcatgactggtggacagc(即SEQ ID NO.1)和 vip3a20-XhoI-R:ctcgagctacttgatgctcacgtc(即SEQ ID NO.2)为引物，用高保真 Fastpfu进行PCR扩增，扩增到的PCR产物经(1.0％)琼脂糖凝胶电泳鉴定 后，将目的条带切胶回收，用UniversalDNA纯化回收试剂盒(天根)回收， 回收产物经限制性内切酶Bam HI和Xho I酶切、经胶回收与进行同样酶切、 胶回收处理的pET28a质粒片段于4℃过夜连接，转化Trans10感受态细胞(北 京全式金)，挑取克隆，进行菌落PCR鉴定，阳性克隆由北京六合华大基因 公司进行测序。
将鉴定正确的重组表达载体pET28a-vip3Aa20转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培 养。次日在平板上挑取单克隆接种含相同浓度卡那霉素的液体LB培养基中， 于37℃过夜培养。所得的表达菌株菌液与50％的甘油溶液等体积混匀，于 -80℃冻藏。
将保存的重组蛋白Vip3Aa20表达菌株复苏培养，菌液涂布于含卡那霉素 (50μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养。挑取单克隆接种液体LB(含卡 那霉素50μg/mL)培养基中37℃过夜培养。第二天以1％接种量接种，于37℃ 培养至OD600为0.8左右，加入1mM IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白。诱导 结束将菌液冰浴，于4℃，4000rpm，10min离心收集菌体，弃上清，菌体经 PBS洗涤后用裂解液(50mM Tris pH7.5，300mM NaCl，5％Glycerol和20mM 咪唑)悬浮；超声破碎(2s on/4s off，Amp：45％，Time：3min)；4℃15000rpm 离心1hr，收集上清。
1.2重组蛋白纯化
菌体裂解液上清与经裂解液平衡的Ni Sepharose 6FF Beads(GE Healthcare)混合，于4℃结合2-3hrs，3000rpm离心3min弃上清；已结合蛋白 的Ni Sepharose 6FF beads经清洗液(50mM Tris pH7.5，300mM NaCL， 5％Glycerol和50mM咪唑)洗2-3次；再用洗脱液(50mM Tris pH7.5，300mM NaCL，5％Glycerol和200mM咪唑)洗脱。收集洗脱液即为蛋白粗纯溶液。
将亲和纯化得到的蛋白样品透析至蛋白储存溶液(50mM Tris pH7.5， 300mMNaCL，5％Glycerol)，并用经相同溶液平衡的Superdex 200Increase 10/30GL(GEHealthcare)进一步纯化，收集蛋白峰组分并经SDS-PAGE检测蛋 白样品的纯度，通过图1可得，经过凝胶过滤最后获得电泳纯的Vip3Aa20蛋 白，分子量约为90KD。
2.免疫动物
用步骤1.2质控合格的Vip3Aa20重组蛋白作为抗原免疫8只8周龄的SPF 级BALB/c雌性小鼠(购置于湖北省实验动物研究中心，许可证号： SCXK(鄂)2015-0018)，抗原与等体积完全弗氏佐剂(首免)和不完全弗氏佐 剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫， 2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期2周，之后进行效价检测，高于>1:10000 后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于250μL的PBS中，具 体免疫次数及免疫剂量如表1所示：
表1免疫次数及免疫剂量
Figure BDA0001506435630000071
免疫示例：一免中，将50ug的抗原溶于PBS，然后与佐剂按体积1:1混合。
3.细胞融合
末次冲击3天后，收集阳性对照血，取脾脏，制备成单细胞悬液；处于 对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合(1:5-1:10)， 50％PEG1450作用1min，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再 用含20％胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×107/板铺至预先 准备好的饲养层细胞板里，置于5％CO2，37℃下培养。
4.细胞建株
1)融合板检测：
待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测，在 ELISA质控合格(即阴性对照OD450<0.2，阳性对照OD450>1.0)后挑选阳性 孔(一般OD450≥0.5)作亚克隆。
2)亚克隆方法及检测：
挑出融合板中检测阳性值高(OD450>2.0)的孔进行有限稀释，以每板60％ 的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限 稀释，每次亚克隆5-7天即可进行ELISA检测，直到最终筛选出能稳定分 泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。
3)细胞株建立：
将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株，扩大培养于24孔 板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用ELISA梯度稀释及western-blotting 验证其稳定性，通过图2可知，Vip3Aa20单抗杂交瘤细胞株1F9-1F5和 2G3-1D7分泌的单抗能特异检测到内源样本和重组蛋白Vip3Aa20，收集细胞 扩大于10cm培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出 OD450>2.0的2株细胞株培养于细胞瓶中，进行冻存，即杂交瘤细胞株 1F9-1F5和杂交瘤细胞株2G3-1D7，已依次于2017年10月11日和2017年 11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC)，保藏编号依次为CGMCC No.14725和CGMCC No.14733。
4)细胞株冻存鉴定在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴 定，鉴定标准：
①复苏活细胞数≥100万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50万/株； ③复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细菌.真菌.支原体 等)出现；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺 板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清 也需作ELISA(OD450>2.0)，以确定是否分泌阳性抗体的同时做 western-blotting的鉴定，通过图3可知，Vip3Aa20单抗杂交瘤细胞株1F9-1F5 和2G3-1D7分泌的单抗能特异检测到内源样本和重组蛋白Vip3Aa20。
5制备腹水
先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后分别将杂交瘤细胞株 1F9-1F5和杂交瘤细胞株2G3-1D7接种到两只小鼠腹腔中，细胞定株后扩大 培养选用10％胎牛血清培养基，当细胞密度达到以1×106-2×106/mL时， 800rpm离心，收集沉淀，并用PBS重悬后，腹腔注入到小鼠(液体石蜡) 体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。
6抗体纯化
收集后的腹水经过预处理后选用Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，具体步 骤如下：
1)缓冲液：起始缓冲液为pH7.0，20mM磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为pH2.7 0.1mM甘氨酸盐酸。
2)准备收集管：取1.5mL离心管，每支离心管加70μL pH9.0 1M Tris-HCL。
3)样品准备：经50％SAS沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜， 并经0.22μm微孔滤膜滤过。
4)纯化过程：用足够的起始缓冲液(8-10mL)平衡Protein A-琼脂糖亲和层 析柱(HiTrap Protein A 1mL，Pharmacia Biotech)。取待纯化的样品(每毫升 样品含蛋白10.2-21.1mg)15-25mL上柱，流速为0.5mL/min，然后以同样的 流速依次用起始缓冲液7-8mL、洗脱缓冲液6-7mL、起始缓冲液5mL洗涤， 每管1mL收集洗脱液。
5)纯度及活性鉴定纯化的单克隆抗体(McAb)用SDS-PAGE鉴定其纯度， 详见图4和图5，通过图4可知，杂交瘤细胞株1F9-1F5单克隆抗体经纯化去 除几乎所有杂蛋白，有2条特异性主条带(55KD和30KD)；通过图5可知， 杂交瘤细胞株2G3-1D7单克隆抗体经纯化去除几乎所有杂蛋白，有2条特异 性主条带(55KD和30KD)。
7.单克隆抗体的亚类鉴定和效价测定
将纯化好的单抗与sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b， IgG3，IgM抗体进行ELISA检测，检测结果表明：单抗类型为IgG1，以重组 蛋白Vip3Aa20为抗原，用间接ELISA方法检测纯化单抗效价达到pg级，通 过图6可知，经ELISA测定，纯化得到的1F9-1F5单抗滴度为1:4900000；通 过图7可知，经ELISA测定，纯化得到的2G3-1D7单抗滴度为1:8600000。
表2杂交瘤细胞株1F9-1F5所产生的单克隆抗体的浓度及亚型
单抗杂交瘤细胞编号 抗体(IgG)浓度 抗体亚型
1F9-1F5 4.8mg/mL IgG1
表3杂交瘤细胞株2G3-1D7所产生的单克隆抗体的浓度及亚型
单抗杂交瘤细胞编号 抗体(IgG)浓度 抗体亚型
2G3-1D7 5.4mg/mL IgG2a
8.单克隆抗体特异性检测
分别提取转基因玉米MIR162标准品及其为转化亲本种子粉末的蛋白，跑SDS-PAGE胶，转膜用纯化单抗(1F9-1F5和2G3-1D7)作为一抗，Alexa FlurorTM 680goat anti-mouseIgG(H+L)(Invitrogen)为二抗，用Odyssey infrared740imager(9120,Li-CORBiosciences,Lincolin,NE)红外扫描仪western 检测结果，通过图8可知，纯化得到的1F9-1F5单抗能特异识别内源样本 MIR162中的Vip3Aa20和重组蛋白Vip3Aa20；通过图9可知，纯化得到的 2G3-1D7单抗能特异识别内源样本MIR162中的Vip3Aa20和重组蛋白 Vip3Aa20。
其中，转基因玉米MIR162标准品(AOCS 1208-A,USA)蛋白提取方法:
组织液氮速冻，磨碎，加1mL(按样品量，一般0.5g加1-2mL)蛋白提 取液，4℃混匀30分钟，(12,000rpm 4℃离心15min，取上清)，蛋白提取 液配方见表4：
表4蛋白提取液配方
Figure BDA0001506435630000111
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。 这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述 教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在 于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实 现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。 本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 杂交瘤细胞株及其产生的抗体和制备方法
<130> P172039DD1F
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID NO：1)
<400> 1
catatggcta gcatgactgg tggacagc 28
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID NO：2)
<400> 2
ctcgagctac ttgatgctca cgtc 24

Claims (6)

1.一种杂交瘤细胞株，其为生物保藏编号为CGMCC No.14725的杂交瘤细胞株1F9-1F5或生物保藏编号为CGMCC No.14733的杂交瘤细胞株2G3-1D7。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，其特征在于，所述杂交瘤细胞株1F9-1F5的生物保藏编号为CGMCC No.14725，所述杂交瘤细胞株2G3-1D7的生物保藏编号为CGMCC No.14733。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的单克隆抗体在检测Vip3Aa20抗虫蛋白中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述单克隆抗体在制备ELISA法检测Vip3Aa20抗虫蛋白的试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述单克隆抗体在制备ELISA双抗体夹心法检测Vip3Aa20抗虫蛋白的试剂中的应用。
CN201711329942.4A 2017-12-13 2017-12-13 杂交瘤细胞株及其产生的抗体和制备方法 Active CN108004215B (zh)

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