CN102559921A - 用于检测转基因玉米mir162的特异性引物及荧光标记探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5′端连接一个荧光报告集团FAM，3′端连接有一个荧光淬灭集团Eclipse。本发明还公开了该引物及探针用于基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的检测方法，该检测方法经实验验证，灵敏、准确、简单、可靠，具有广阔的应用价值与市场前景。

Description

用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及荧光标记探针及其应用

技术领域

本发明涉及用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及荧光标记探针，及其在基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的应用，属于分子生物学领域。

背景技术

将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术(Transgene technology)。

转基因食品有转基因植物，如：玉米、西红柿、土豆等，还有转基因动物，如：鱼、牛、羊等。据统计，美国食品和药物管理局确定的转基因品种已有43种。美国是转基因食品最多的国家，60％以上的加工食品含有转基因成分，90％以上的大豆、50％以上的玉米、小麦是转基因的。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，相继有40多个国家和地区建立和实施了转基因标识制度。随着这些制度的建立与不断完善，人们对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格的要求，各种转基因产品的检测技术也成为了研究热点。

根据不同转基因产品的检测目的不同，鉴定转基因产品的主要方式有筛查法、基因特异性检测方法、转化体特异性检测方法和构建特异性检测方法。

转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫品种。申请人经过对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因玉米MIR162基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及荧光标记探针，以及其在基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，其序列为：

MIR162GS-F：5′-GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3′；

MIR162GS-R：5′-GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3′；

如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物可以用于定性检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20，具体应用时，步骤为：

(1)提取待检测样品的基因组DNA，并以此为模板，利用特异性引物MIR162GS-F和MIR162GS-R进行PCR扩增；

(2)PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品中含有MIR162目的基因Vip3Aa20；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有MIR162目的基因Vip3Aa20。

所述步骤(1)中，PCR程序为：95℃5min预变性；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。

所述用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物可以用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20，具体应用时，步骤为：

(1)建立MIR162基因特异性引物的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线：

①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162目的基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；

②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线；

(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162目的基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。

所述步骤(1)①和(2)中，zSSIIb引物序列(国家标准)如下：

zSSIIb-F：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′；

zSSIIb-R：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′。

所述步骤(1)①和(2)中，扩增的参数如下：扩增反应体积为20uL，2×Premix Ex Taq(Rox)10uL，浓度为10umol/L的Forward primer 0.4uL，浓度为10umol/L的Reverse primer0.4uL，ddH2O 8.2uL，DNA模板1uL；

扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，58℃30s，72℃30s，在72℃收集荧光信号，共计40个循环。

一种用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，所述探针的序列为：MIR162GS-P：FAM-5′-CTACACCAACAACATCGT-3′-Eclipse，如SEQ ID NO.3所示，探针的5′端连接一个荧光报告集团FAM，3′端连接有一个荧光淬灭集团Eclipse。

上述用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，可以用于TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20，具体应用时，步骤为：

(1)建立MIR162基因特异性引物的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线：

①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162目的基因Vip3Aa20的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；

②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线；

(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。

所述步骤(1)①和(2)中，zSSIIb引物和探针序列(国家标准)如下：

zSSIIb-F：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′；

zSSIIb-R：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′；

zSSIIb-P：FAM-5′-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3′-TAMRA。

所述步骤(1)①和(2)中，扩增的参数如下：扩增反应体积为20uL，2×Premix Ex Taq(Rox)12.5uL，浓度为10umol/L的Forward primer 1uL，浓度为10umol/L的Reverse primer 1uL，浓度为10umol/L的TaqMan probe0.5uL，ddH2O 4uL，DNA模板1uL；

扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，58℃30s，72℃30s，在72℃收集荧光信号，共计45个循环。

本发明设计了针对转基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20的特异性引物与探针序列，并建立了转基因玉米MIR162基因特异性定性PCR检测方法、SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法经实验验证，灵敏、准确、简单、可靠，具有广阔的应用价值与市场前景。

附图说明

图1为实施例1中转基因玉米MIR162基因特异性定性PCR扩增结果电泳示意图。

图2为实施例2中内标准基因zSSIIb的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。

图3为实施例2中转基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。

图4为实施例3中内标准基因zSSIIb的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。

图5为实施例3中转基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1转基因玉米MIR162转化体特异性定性PCR检测方法

引物由大连Takara公司合成，稀释成10umol/L备用，合成的引物序列如下：

MIR162GS-F：5′-GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3′；

MIR162GS-R：5′-GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3′。

分别提取转基因玉米MIR162、GA21、NK603、MON810、MON88017、TC1507、MIR604、Bt176、Bt11，非转基因大豆1138-2，转基因大豆GTS40-3-2、MON87701，转基因棉花MON88913、LLcotton25、MON531、MON1445，转基因水稻TT51、科丰6号，非转基因玉米郑单958基因DNA为模板，分别用MIR162GS-F和MIR162GS-R引物组合进行PCR扩增。PCR程序为：95℃5min预变性；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。

结果：利用所设计的引物以提取的基因组为模板进行PCR扩增，结果如图1所示，由图可见，只有转基因玉米MIR162基因组成功扩增出98bp特异性产物，而其他转基因和非转基因样品模板都没有可观察到的扩增产物。由此证明，该引物具有良好的特异性，适合于转基因玉米MIR162基因特异性的定性检测。

实施例2转基因玉米MIR162基因特异性SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法

提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA，按5倍倍比分别稀释至5⁰，5^-1，5^-2，5^-3，5^-4；相应的拷贝数设为100000，20000，4000，800，160，每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。

引物由大连Takara公司合成，稀释成10umol/L备用。合成的MIR162引物序列如下：

MIR162GS-F：5′-GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3′；

MIR162GS-R：5′-GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3′。

玉米内标引物(zSSIIb)采用国家标准引物，其序列如下：

zSSIIb-F：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′；

zSSIIb-R：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′。

扩增反应体积为20uL，2×Premix Ex Taq(Rox)10uL，浓度为10umol/L的Forward primer0.4uL，浓度为10umol/L的Reverse primer 0.4uL，ddH2O 8.2uL，DNA模板1uL。扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，58℃30s，72℃30s，在72℃收集荧光信号，共计40个循环。每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水(ddH₂O，空白)和非转基因样品(郑单958，阴性)对照。

结果：通过对不同MIR162标准品拷贝数为100000，20000，4000，800，160的DNA进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct，横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的转基因玉米MIR162标准品(1％，0.5％，0.1％，0.05％，0.01％)、阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。

对玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米MIR162的基因特异性引物对同一组标准品DNA和不同百分含量的转基因玉米DNA进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，分别得到PCR扩增曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线如图2所示，该曲线的斜率为-3.25，相关系数R²为0.999。转基因玉米MIR162的基因特异性引物的标准曲线如图3所示，该曲线的斜率为-3.557，相关系数R²为0.998。因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。根据公式：

样品中转基因玉米MIR162含量＝(外源基因MIR162拷贝数/内标基因zSSIIb拷贝数)×100％

可以计算出待测样品中转基因成分MIR162的百分含量。

实施例3转基因玉米MIR162转化体特异性TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA，按5倍倍比分别稀释至5⁰，5^-1，5^-2，5^-3，5^-4；相应的拷贝数设为100000，20000，4000，800，160，每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。

引物和探针由大连Takara公司合成，稀释成10umol/L备用。合成的MIR162引物与探针序列如下：

MIR162GS-F：5′-GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3′；

MIR162GS-R：5′-GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3′；

MIR162GS-P：FAM-5′-CTACACCAACAACATCGT-3′-Eclipse。

玉米内标引物与探针(zSSIIb)采用国家标准引物与探针，其序列如下：

zSSIIb-F：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′；

zSSIIb-R：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′；

zSSIIb-P：FAM-5′-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3′-TAMRA。

扩增反应体积为20uL，2×Premix Ex Taq(Rox)12.5uL，浓度为10umol/L的Forwardprimer 1uL，浓度为10umol/L的Reverse primer 1uL，浓度为10umol/L的TaqMan probeluL，ddH2O 3.5uL，DNA模板1uL；扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，58℃30s，72℃30s，在72℃收集荧光信号，共计45个循环。每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水(ddH₂O，空白)和非转基因样品(郑单958，阴性)对照。

结果：通过对不同MIR162标准品拷贝数为100000，20000，4000，800，160的DNA进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct，横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的转基因玉米MIR162标准品(1％，0.5％，0.1％，0.05％，0.01％)、阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。

对玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米MIR162的基因特异性引物对同一组标准品DNA和不同百分含量的转基因玉米DNA进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，分别得到PCR扩增曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线如图4所示，该曲线的斜率为-3.557，相关系数R²为0.999。转基因玉米MIR162的基因特异性引物的标准曲线如图5所示，该曲线的斜率为-3.546，相关系数R²为0.997.因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。根据公式：

样品中转基因玉米MIR162含量＝(外源基因MIR162拷贝数/内标基因zSSIIb拷贝数)×100％

可以计算出待测样品中转基因成分MIR162的百分含量。

以上结果可以证明，本发明为转基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20的定性PCR、SYBRGreen I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测提供了简单、可靠的测定方法，可以用于转基因玉米MIR162的检测。本发明为转基因标识提供了一种强有力的技术支撑，为转基因产品的控制提供了必要的手段。

Claims (10)

1.一种用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物，其特征在于：所述引物由上游引物和下游引物组成，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物在定性检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的应用。

3.权利要求1所述的用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物在SYBR Green I实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的应用。

4.一种用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，其特征在于：所述探针的序列如SEQID NO.3所示，探针的5′端连接一个荧光报告集团FAM，3′端连接有一个荧光淬灭集团Eclipse。

5.权利要求1所述的用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及权利要求4所述的用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针在TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的应用。

6.一种定性检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的方法，其特征在于：步骤为：

(1)提取待检测样品的基因组DNA，并以此为模板，利用特异性引物MIR162GS-F和MIR162GS-R进行PCR扩增；

(2)PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品中含有MIR162目的基因Vip3Aa20；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有MIR162目的基因Vip3Aa20。

7.一种SYBR Green I实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的方法，其特征在于：步骤为：

(1)建立MIR162基因特异性引物的SYBRGreen I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBRGreen I实时荧光定量PCR标准曲线：

①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162目的基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；

②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线；

(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162目的基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)①和(2)中，扩增的参数如下：扩增反应体积为20uL，2×Premix Ex Taq(Rox)10uL，浓度为10umol/L的Forwardprimer 0.4uL，浓度为10umol/L的Reverse primer 0.4uL，ddH2O 8.2uL，DNA模板1uL；扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，58℃30s，72℃30s，在72℃收集荧光信号，共计40个循环。

9.一种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的方法，其特征在于：步骤为：

(1)建立MIR162基因特异性引物的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线：

①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162目的基因Vip3Aa20的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；

②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线；

(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)①和(2)中，扩增的参数如下：扩增反应体积为20uL，2×Premix Ex Taq(Rox)12.5uL，浓度为10umol/L的Forwardprimer 1uL，浓度为10umol/L的Reverse primer 1uL，浓度为10umol/L的TaqManprobe0.5uL，ddH2O 4uL，DNA模板1uL；

扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，58℃30s，72℃30s，在72℃收集荧光信号，共计45个循环。

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