CN108754000A - 耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐药基因mcr‑4/5/8荧光定量PCR检测方法。本发明保护引物组合，由序列表的序列1至序列6所示的单链DNA组成。本发明建立的一种针对这三种mcr基因的基于SYBR染料的荧光定量PCR方法。该检测方法具有快速，灵敏度高，特异性强的技术优点，适用于临床和畜牧养殖业多黏菌素耐药基因mcr‑4/5/8流行状况的监测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法，具体一种耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法。
背景技术
多黏菌素被认为是治疗多重耐药阴性菌感染的“最后一道防线”，其耐药率在一段时期内保持在比较低的水平。自2016年，我国首次报道了由质粒介导并可高频率水平转移的多黏菌素耐药基因mcr-1，目前世界上40多个国家和地区相继报道了mcr-1基因，引起了全世界的广泛关注。目前，7种新型黏菌素耐药基因mcr-2～8相继发现。这8种mcr基因均可通过质粒传播，不仅促进了临床上多黏菌素耐药性的发展，也导致多黏菌素耐药性在畜牧业和各种环境中广泛流行。多黏菌素耐药性的快速发展给公共卫生安全和畜牧业发展构成了严重威胁。
然而，传统的检测方法，如常规PCR和Sanger测序，耗时耗力。目前没有针对mcr-4/5/8的荧光定量PCR检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法。
本发明提供了一套引物组合甲，由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ组成；
所述引物对Ⅰ由引物F1和引物R1组成；
所述引物F1为如下(a1)或(a2):
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述R1为如下(a3)或(a4):
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅱ由引物F2和引物R2组成；
所述引物F2为如下(b1)或(b2):
(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物R2为如下(b3)或(b4):
(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅲ由引物F3和引物R3组成；
所述引物F3为如下(c1)或(c2):
(c1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物R3为如下(c3)或(c4):
(c3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合甲的用途为如下(1)或(2)：
(1)检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因；
(2)制备用于检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的试剂盒。
本发明还保护所述引物组合甲的应用，为如下(1)或(2)：
(1)检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因；
(2)制备用于检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的试剂盒。
本发明还保护含有所述引物组合甲的试剂盒；所述试剂盒的用途为检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的方法，包括如下步骤：以待测样本的核酸为模板，分别采用引物对I至引物对Ⅲ进行PCR扩增，如果采用引物对I可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带mcr-4基因；如果采用引物对Ⅱ可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带mcr-5基因；如果采用引物对Ⅲ可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带mcr-8基因。
本发明还保护一种检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的方法，包括如下步骤：检测待测样本的核酸中是否含有引物对I至引物对Ⅲ的靶序列，如果所述核酸中含有引物对I的靶序列，待测样本携带mcr-4耐药基因；如果所述核酸中含有引物对Ⅱ的靶序列，待测样本携带mcr-5耐药基因；如果所述核酸中含有引物对Ⅱ的靶序列，待测样本携带mcr-8耐药基因。
所述引物对I的靶序列具体可如序列表的序列7所示。
所述引物对Ⅱ的靶序列具体可如序列表的序列8所示。
所述引物对Ⅲ的靶序列具体可如序列表的序列9所示。
本发明还保护一种检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的方法，包括如下步骤：以待测样本的核酸为模板，分别采用权利要求1中的引物对I至引物对Ⅲ进行荧光定量PCR扩增，根据Ct值对待测样本中的mcr基因进行定量。
所述定量方法为将Ct值作为Y值代入标准曲线方程，得到的X值为目的基因的拷贝数。
mcr-4耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.4681logX+39.567。
mcr-5耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.4111logX+39.657。
mcr-8耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.4371logX+40.861。
以上任一所述PCR扩增的反应体系具体可为：上游引物0.8μl，下游引物0.8μl,2×Taq PCR MasterMix10μl,无核酸水6.4μl，DNA模版2μl。PCR扩增反应程序具体可为：预变性95℃，5min；30×(变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s)；延伸72℃，10min。上游引物和下游引物在体系中的浓度均为0.4pmol/μL。
以上任一所述荧光定量PCR扩增的反应体系具体可为：PowerUpTMSYBRTMGreenMaster Mix(2×)10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，Rnase-Free水6.4μL，模板2μL。荧光定量PCR扩增的反应反应程序具体可见表3。
本发明还保护引物组合乙，为如下(a)或(b)：
(a)所述引物对Ⅰ或所述引物对Ⅱ或所述引物对Ⅲ；
(b)所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ中的任意两个引物对的组合。
本发明还保护所述引物组合乙在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒的用途为检测待测样本中的多黏菌素耐药基因。
本发明还保护含有所述引物组合乙的试剂盒，所述试剂盒的用途为检测待测样本中的多黏菌素耐药基因。
以上任一所述mcr基因具体可为mcr-4耐药基因和/或mcr-5耐药基因和/或mcr-8耐药基因。
本发明建立的一种针对这三种mcr基因的基于SYBR染料的荧光定量PCR方法。该检测方法具有快速，灵敏度高，特异性强的技术优点，适用于临床和畜牧养殖业多黏菌素耐药基因mcr-4/5/8流行状况的监测。
附图说明
图1为耐药基因mcr-4/5/8引物对阳性菌DNA的扩增产物电泳图。
图2为荧光定量PCR检测的扩增曲线。
图3为荧光定量PCR检测的溶解曲线。
图4为标准曲线。
图5为菌株荧光定量PCR检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pDM19-T载体：Takara宝生物工程(大连)有限公司，货号：6013。
实施例1、引物的设计及制备
进行大量序列分析、比对获得了用于检测耐药基因mcr-4/5/8的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于检测耐药基因mcr-4/5/8的引物组，具体如表1所示。
表1 mcr-4/5/8基因的引物信息表
引物F1和引物R1组成引物对I；
引物F2和引物R2组成引物对Ⅱ；
引物F3和引物R3组成引物对Ⅲ。
实施例2、质粒标准品的构建
1、mcr-4质粒标准品：将序列表的序列7所示的双链DNA分子插入pDM19-T载体的EcoRⅤ位点，得到mcr-4质粒标准品。
2、mcr-5质粒标准品：将序列表的序列8所示的双链DNA分子插入pDM19-T载体的EcoRⅤ位点，得到mcr-5质粒标准品。
3、mcr-8质粒标准品：将序列表的序列9所示的双链DNA分子插入pDM19-T载体的EcoRⅤ位点，得到mcr-8质粒标准品。
实施例3、引物验证及特异性实验
一、质粒标准品验证引物
待测样本：实施例2制备的3个质粒标准品。
以待测样本为模板，分别采用实施例1中的引物对I至引物对Ⅲ进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系(20μl)：上游引物0.8μl，下游引物0.8μl,2×Taq PCRMasterMix(购于南京诺维赞生物科技有限公司,P111-01)10μl,无核酸水6.4μl，DNA模版2μl。
上游引物和下游引物在体系中的浓度均为0.4pmol/μL。
采用无核酸水作为阴性对照。
PCR扩增反应程序：预变性95℃，5min；30×(变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s)；延伸72℃，10min。
结果表明，引物对I可以实现对mcr-4质粒标准品的特异扩增，且对其余耐药基因质粒标准品不能实现扩增。引物对Ⅱ可以实现对mcr-5质粒标准品的特异扩增，且对其余耐药基因质粒标准品不能实现扩增。引物对Ⅲ可以实现对mcr-8质粒标准品的特异扩增，且对其余耐药基因质粒标准品不能实现扩增。
二、菌株验证引物
待测样本：见表2。
表2待测菌株信息
提取待测样本的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别采用实施例1中的引物对I至引物对Ⅲ进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系(20μl)：上游引物0.8μl，下游引物0.8μl,2×Taq PCRMasterMix(购于南京诺维赞生物科技有限公司,P111-01)10μl,无核酸水6.4μl，DNA模版2μl。
上游引物和下游引物在体系中的浓度均为0.4pmol/μL。
采用无核酸水作为阴性对照。
PCR扩增反应程序：预变性95℃，5min；30×(变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s)；延伸72℃，10min。
结果如图1所示。图1中，A为引物对I对模板扩增的结果，B为引物对Ⅱ对模板扩增的结果，C为引物对Ⅲ对模板扩增的结果。图1中，泳道1、2、3、4、5、8依次为mcr-1/2/3/4/5/8阳性菌的扩增结果，泳道-为阴性对照。
结果表明，引物对I可以实现对mcr-4基因的特异扩增，且对其余耐药基因不能实现扩增。引物对Ⅱ可以实现对mcr-5基因的特异扩增，且对其余耐药基因不能实现扩增。引物对Ⅲ可以实现对mcr-8基因的特异扩增，且对其余耐药基因不能实现扩增。
实施例4、标准曲线的建立
采用实施例2制备的3种质粒标准品分别建立标准曲线。
1、计算质粒标准品的拷贝数，计算方式如下：
Copies/mL＝(L×C)/(N×M×109)；
L:阿弗加德罗常数(6.02x1023/mol)；
C:质粒DNA的浓度；
N:重组质粒长度；
M:每对碱基的平均分了量(660/bp)。
2、将质粒标准品采用实时荧光定量PCR标曲专用的稀释液EASY Dilution(购于Takara宝生物工程(大连)有限公司，货号：H9160S)稀释为不同浓度梯度(10-1ng/μL、10- 2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL、10-6ng/μL、10-7ng/μL、10-8ng/μL、10-9ng/μL和10- 10ng/μL)。
3、采用引物对I对不同浓度的mcr-4质粒标准品进行荧光定量PCR；采用引物对Ⅱ对不同浓度的mcr-5质粒标准品进行荧光定量PCR采用引物对Ⅲ对不同浓度的mcr-8质粒标准品进行荧光定量PCR。
荧光定量PCR反应体系：PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(2×)(北京赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：4472908)10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，Rnase-Free水6.4μL，模板2μL。
上游引物和下游引物在体系中的浓度均为0.4pmol/μL。
荧光定量PCR反应程序如表3所示。
表3实时荧光定量PCR反应程序
以Ct值(Threshold Cycle:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)为横坐标,起始模板拷贝数的对数为纵坐标,这两者之间存在线性关系，利用PCR反应得到的Ct值和己知的起始模板拷贝数的对数制作标准曲线。
溶解曲线是指定量PCR反应绐束之后让样品继续升温直到PCR产物的双链全部打开，这时由于双链打开，荧光染料不发荧光，这样荧光值会有一个陡然的突降，借以检测PCR产物的特异性，相当于进行电泳检测。因为不同的PCR产物片段其TM值不同，单一的双链DNA其荧光陡降的温度一致，如果含有非特异性扩增产物，那么其荧光陡降的温度不止一个(两个或者更多),说明PCR引物特异性不够，需要重新设计引物进行标准曲线的制作。如溶解曲线出现单峰则说明引物特异性良好，可用于定量检测。
质粒标准品的荧光定量PCR检测的扩增曲线如图2所示。图2中，A为mcr-4质粒标准品，B为mcr-5质粒标准品，C为mcr-8质粒标准品。
质粒标准品的荧光定量PCR检测的溶解曲线如图3所示。图3中，A为mcr-4质粒标准品，B为mcr-5质粒标准品，C为mcr-8质粒标准品。
质粒标准品的荧光定量PCR检测的标准曲线如图4所示。图4中，A为mcr-4质粒标准品的标准曲线(标准曲线方程为：Y＝-3.4681logX+39.567)，B为mcr-5质粒标准品的标准曲线(标准曲线方程为：Y＝-3.4111logX+39.657)，C为mcr-8质粒标准品的标准曲线(标准曲线方程为：Y＝-3.4371logX+40.861)
mcr-4基因、mcr-5基因、mcr-8基因检测范围分别为:(1.53*100～1.53*109copies/ml)、(8.18*100～8.18*108copies/ml)、(4.33*100～4.33*108copies/ml)。
实施例5、样本的实际检测
待测样本：本实验室分离获得鸡来源源细菌(见表4)。
表4菌株信息
提取待测样本的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别采用引物对I至引物对Ⅲ对模板进行进行荧光定量PCR，荧光定量PCR的反应体系和反应程序同实施例4。
将得到的Ct值代入实施例4得到的标准曲线方程，计算样品中耐药基因的丰度。
检测结果显示待检菌株中未检测到mcr-4和mcr-5基因，菌株中mcr-8基因的拷贝数如图5所示。
上述结果表明，本发明设计的引物和建立的检测方法可以实现耐药基因mcr-4/5/8的检测，结果可靠。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccccttttc atcgcatc 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtgttttct atcatgccgt ag 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggttgttg ctccttctgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctccattgc aacagctcac 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggctaccgc aatatcacta c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgcttgcag attcccttac 20
<210> 7
<211> 184
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccccttttc atcgcatcta tgccgctatt tttaacattt gcgctgagtt ttttgttttc 60
aatttttacc gtcaaatacc tgctgaagcc cttttttatc gtattgacgt tactttcctc 120
aagtgtattt tttgcagcct atcaatacaa tgtcgtgttt gactacggca tgatagaaaa 180
cacg 184
<210> 8
<211> 184
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggttgttg ctccttctgg tggccacgcg ctggagtgtc aagccactac tgattctgct 60
tgctgtcatg acgcccgccg ccgtttattt catgcgcaac tacggggttt atctcgacaa 120
ggccatgctg cggaatctga tggagacgga cgtcagggaa gccagtgagc tgttgcaatg 180
gaga 184
<210> 9
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggctaccgc aatatcacta ccctgcatgt tctcgcgaat gtcacgtaac gaatacaatg 60
aagtccgtgc cgcatcagaa gaaaacttgc tggatatcct taaacgtaca ggtgttgagg 120
tgctatggcg caacaataac aatggtggtt gtaagggaat ctgcaagcga 170
Claims (10)
1.引物组合甲，由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ组成；
所述引物对Ⅰ由引物F1和引物R1组成；
所述引物F1为如下(a1)或(a2):
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述R1为如下(a3)或(a4):
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅱ由引物F2和引物R2组成；
所述引物F2为如下(b1)或(b2):
(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物R2为如下(b3)或(b4):
(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅲ由引物F3和引物R3组成；
所述引物F3为如下(c1)或(c2):
(c1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物R3为如下(c3)或(c4):
(c3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述引物组合甲的应用，为如下(1)或(2)：
(1)检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因；
(2)制备用于检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的试剂盒。
3.含有权利要求1所述引物组合甲的试剂盒；所述试剂盒的用途为检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的方法，包括如下步骤：以待测样本的核酸为模板，分别采用权利要求1中的引物对I至引物对Ⅲ进行PCR扩增，如果采用引物对I可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带mcr-4基因；如果采用引物对Ⅱ可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带mcr-5基因；如果采用引物对Ⅲ可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带mcr-8基因。
6.一种检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的方法，包括如下步骤：检测待测样本的核酸中是否含有权利要求1中的引物对I至引物对Ⅲ的靶序列，如果所述核酸中含有引物对I的靶序列，待测样本携带mcr-4耐药基因；如果所述核酸中含有引物对Ⅱ的靶序列，待测样本携带mcr-5耐药基因；如果所述核酸中含有引物对Ⅱ的靶序列，待测样本携带mcr-8耐药基因。
7.一种检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的方法，包括如下步骤：以待测样本的核酸为模板，分别采用权利要求1中的引物对I至引物对Ⅲ进行荧光定量PCR扩增，根据Ct值对待测样本中的mcr基因进行定量。
8.引物组合甲，为如下(a)或(b)：
(a)权利要求1中的所述引物对Ⅰ或所述引物对Ⅱ或所述引物对Ⅲ；
(b)权利要求1中的所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ中的任意两个引物对的组合。
9.权利要求8所述引物组合甲在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒的用途为检测待测样本中的多黏菌素耐药基因。
10.含有权利要求8所述引物组合甲的试剂盒，所述试剂盒的用途为检测待测样本中的多黏菌素耐药基因。
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