JP2017537609A - 多重キャプチャー反応のためのユニバーサルブロッキングオリゴシステム及び改良されたハイブリダイゼーションキャプチャー方法 - Google Patents

多重キャプチャー反応のためのユニバーサルブロッキングオリゴシステム及び改良されたハイブリダイゼーションキャプチャー方法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、一部の実施形態において、マルチプレックス核酸シーケンシングに適用することができる、核酸操作及び解析のための新規の組成物及び改良された方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提示される新規の組成物及び方法は、従来のアプローチよりも費用効果的であり、自動化に寄与し、且つ高速である。また、本明細書では、新規のブロッキング核酸も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、発明者名がＥｒｉｃ Ｏｌｉｖａｒｅｓであり、代理人整理番号０５５９１１−０４３２２３２により指定され、“ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ ＢＬＯＣＫＩＮＧ ＯＬＩＧＯ ＳＹＳＴＥＭ ＦＯＲ ＭＵＬＴＩＰＬＥＸＥＤ ＣＡＰＴＵＲＥ ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ”という名称の２０１４年１０月１０日出願の米国仮特許出願第６２／０６２６１２号、及び発明者名がＥｒｉｃ Ｏｌｉｖａｒｅｓであり、代理人整理番号０５５９１１−０４３２２３１により指定され、“ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＣＡＰＴＵＲＥ ＵＳＩＮＧ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＢＡＩＴＳ ＦＲＯＭ ＰＡＩＲＥＤ−ＥＮＤ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ”という名称の２０１４年１０月１０日出願の米国仮特許出願第６２／０６２６１６号の利益を主張する。
本技術は、部分的に、核酸操作、解析及びハイスループットシーケンシングの組成物及び方法に関する。
生存生物（例えば、動物、植物、微生物、ウイルス）の遺伝情報は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）にコードされている。遺伝情報は、核酸の一次構造を表す一連のヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドである。生物の核酸内容物（例えば、ＤＮＡ）は、多くの場合にゲノムと呼ばれる。ヒトの場合、完全なゲノムは、典型的に、２４個の染色体上に位置する約３０，０００遺伝子を含有する。ほとんどの遺伝子は、特定のタンパク質をコードし、このタンパク質が、転写及び翻訳を介した発現後に生存細胞内の特定の生化学的機能を果たす。
ゲノム内の１つ又は複数の遺伝的変異によって多くの病状が引き起こされる。いくつかの遺伝的変異は、個体を、例えば、糖尿病、動脈硬化症、肥満、様々な自己免疫疾患及び癌（例えば、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、肺癌）などのいくつかの疾患のいずれかに罹患しやすくするか、又はそれを引き起こし得る。こうした遺伝病は、ゲノム内の１つ又は複数のヌクレオチドの付加、置換、挿入又は欠失によって起こり得る。
遺伝的変異は、例えば、次世代シーケンシング技術の使用により、多くの場合に複数の供給源から得られる核酸の混合物のマルチプレックス解析によって見出すことができる。こうしたマルチプレックス解析は、多くの場合、解析前に相当量の核酸操作を必要とし、これは多くの様々なステップを含むため、ハイスループット処理につながらない。そのうえ、既存の核酸操作方法は、多くの場合にコストが高く、時間がかかり、サンプルの汚染をもたらし得る実質的なピットフォールをもたらすことが多い。本明細書の組成物及び方法は、既存の核酸操作及び分析技術に対して重要な改善を提供し、これらは、ハイスループット自動化をさらに促し、より費用効果的であり、時間を短縮し、且つ／又は汚染のリスク低下をもたらす。
本明細書では、一部の態様において、大規模並列核酸シーケンシングで使用するための組成物であって、ａ）複数のライブラリーインサートを含む核酸のライブラリーであって、ライブラリーの各核酸が、（ｉ）４つ以上のサンプルのうちの１つから得られる少なくとも１つのライブラリーインサート、（ｉｉ）第１の非ネイティブ核酸、及び（ｉｉｉ）第２の非ネイティブ核酸を含み、第１の非ネイティブ核酸及び第２の非ネイティブ核酸が少なくとも１つのライブラリーインサートの反対側に位置し、及び第１の非ネイティブ核酸が第１の識別可能な核酸バーコードを含み、且つ第２の非ネイティブ核酸が第２の識別可能な核酸バーコードを含み、第１及び第２の識別可能な核酸バーコードが４つ以上のサンプルのうちの１つにユニークである、核酸のライブラリー；及びｂ）４つのＵブロック核酸であって、（ｉ）第１及び第２のＵブロック核酸が、第１の識別可能な核酸バーコードの反対側の第１の非ネイティブ核酸とハイブリダイズするように立体配置されており、且つ（ｉｉ）第３及び第４のＵブロック核酸が、第２の識別可能な核酸バーコードの反対側の第２の非ネイティブ核酸とハイブリダイズするように立体配置されており、且つ（ｉｉｉ）Ｕブロック核酸の各々が、第１又は第２の識別可能な核酸バーコードの部分と実質的にハイブリダイズしない、４つのＵブロック核酸を含む、組成物が提示される。いくつかの態様では、核酸のライブラリーは、少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードを含む。
一部の態様では、組成物は、１つ又は複数のキャプチャー核酸を含み、（ｉ）キャプチャー核酸が結合ペアのメンバーを含み、及び（ｉｉ）キャプチャー核酸の各々が、１つ又は複数のライブラリーインサートのサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置されている。
本明細書ではまた、いくつかの実施形態において、核酸ライブラリーを解析する方法であって、ａ）複数のライブラリーインサートを含む核酸のライブラリーを得るステップであって、ライブラリーの各核酸が、（ｉ）４つ以上のサンプルのうちの１つから得られる少なくとも１つのライブラリーインサート、（ｉｉ）第１の非ネイティブ核酸、及び（ｉｉｉ）第２の非ネイティブ核酸を含み、第１の非ネイティブ核酸及び第２の非ネイティブ核酸が少なくとも１つのライブラリーインサートの反対側に位置し、及び第１の非ネイティブ核酸が第１の識別可能な核酸バーコードを含み、且つ第２の非ネイティブ核酸が第２の識別可能な核酸バーコードを含み、第１及び第２の識別可能な核酸バーコードが４つ以上のサンプルのうちの１つにユニークである、ステップ；ｂ）核酸のライブラリーを４つのＵブロック核酸と接触させるステップであって、（ｉ）第１及び第２のＵブロック核酸が、第１の識別可能な核酸バーコードの反対側の第１の非ネイティブ核酸とハイブリダイズするように立体配置されており、且つ（ｉｉ）第３及び第４のＵブロック核酸が、第２の識別可能な核酸バーコードの反対側の第２の非ネイティブ核酸とハイブリダイズするように立体配置されており、且つ（ｉｉｉ）Ｕブロック核酸の各々が、第１又は第２の識別可能な核酸バーコードの部分と実質的にハイブリダイズしない、ステップ；及びｃ）核酸のライブラリーを、各々が結合ペアの第１のメンバーを含む１つ又は複数のキャプチャー核酸と接触させるステップであって、１つ又は複数のキャプチャー核酸が、ライブラリーの核酸のサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、ステップ；ｄ）キャプチャー核酸をキャプチャーし、それにより、ライブラリーの核酸のサブセットを含むキャプチャーされた核酸を取得するステップ；ｅ）キャプチャーされた核酸を増幅条件下でプライマーのセットと接触させ、それにより、アンプリコンを取得するステップ；及びｆ）アンプリコンを解析するステップを含む、方法が提示される。
いくつかの態様では、解析するステップは、配列リードを取得するステップを含む。一部の態様では、シーケンシングリードは、大規模並列シーケンシング及び／又は両端対シーケンシングを含む方法によって得られ得る。
本明細書の組成物及び方法に関するいくつかの態様では、非ネイティブ核酸は、ユニバーサル核酸を含む。一部の態様では、ライブラリーの核酸は、４つ以上、又は１０以上のバーコード核酸を含む。一部の態様では、各ライブラリーインサートは、１つ又は２つのバーコード配列を含む。いくつかの態様では、Ｕブロック核酸は、１０〜４０ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの態様では、Ｕブロック核酸は、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含む。一部の態様では、Ｕブロック核酸は、ロックド核酸及び／又は架橋核酸を含む。いくつかの態様では、Ｕブロック核酸は、約６５℃〜約９０℃の融解温度を含む。いくつかの態様では、Ｕブロック核酸は、少なくとも６５℃又は少なくとも７５℃の融解温度を含む。一部の態様では、Ｕブロック核酸は、変性ヌクレオチド塩基を含まない。一部の態様では、Ｕブロック核酸は、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、イノシシ、２’−デオキシイノシン、その類似体、誘導体又は組合せを含まない。
一部の態様において、本明細書では、核酸ライブラリーを解析する方法であって、ａ）アンプリコンの第１のセットを含む核酸のライブラリーを得るステップであって、各アンプリコンが、第１の非ネイティブ核酸及び第２の非ネイティブ核酸、１つ又は複数の識別可能な識別子、並びに１つ又は複数のサンプルのうちの１つから得られるライブラリーインサートを含み、ライブラリーインサートが第１及び第２の非ネイティブ核酸の間に位置する、ステップ、ｂ）ライブラリーの核酸を１つ又は複数のブロック核酸及びキャプチャー核酸と接触させるステップを含む、混合物を調製するステップであって、（ｉ）１つ又は複数のブロック核酸が、第１及び第２の非ネイティブ核酸と特異的にハイブリダイズするように立体配置され、（ｉｉ）キャプチャー核酸が結合ペアの第１のメンバーを含み、且つ（ｉｉｉ）キャプチャー核酸が、第１のセットのアンプリコンのサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、ステップ、ｃ）混合物を精製し、それにより、精製済み核酸を取得するステップであって、精製済み核酸がライブラリーの核酸、１つ又は複数のブロック核酸、及びキャプチャー核酸を含む、ステップ、ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で精製済み核酸をハイブリダイズするステップ、ｅ）キャプチャー核酸をキャプチャーし、それにより、キャプチャーされた核酸を取得するステップ、ｆ）キャプチャーされた核酸を増幅条件下でプライマーのセットと接触させ、それにより、アンプリコンの第２のセットを取得するステップ、及びｇ）アンプリコンの第２のセットを解析するステップを含む、、方法が提供される。一部の態様では、増幅条件は、熱安定性ポリメラーゼ及び／又はポリメラーゼ連鎖反応を含む。いくつかの態様では、（ｂ）の調製するステップは、ライブラリーの核酸をコンペティター核酸と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、キャプチャー核酸は、ライブラリーインサートの部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のブロッキング核酸は、第１の非ネイティブ核酸及び／又は第２の非ネイティブ核酸の部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のブロッキング核酸は、ロックド核酸及び／又は架橋核酸を含む。
一部の態様では、結合ペアの第１のメンバーを含むキャプチャー核酸は、エキソン、イントロンの部分、選択した染色体の部分、及び／又は遺伝的変異（例えば、反復、多型）を含むＤＮＡの領域に特異的にハイブリダイズするように立体配置されている。一部の実施形態では、結合ペアの第１のメンバーは、ビオチン、抗原、ハプテン、抗体又はそれらの部分を含む。一部の態様では、（ｅ）のキャプチャーするステップは、混合物を結合ペアの第２のメンバーと接触させるステップを含む。一部の態様では、結合ペアの第２のメンバーは、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、又はその結合部分を含む。いくつかの実施形態では、結合ペアの第２のメンバーは支持体を含む。一部の実施形態では、支持体は磁気化合物を含む。一部の実施形態では、支持体はビーズを含む。一部の実施形態では、支持体は、ポリスチレン、ポリカーボネート、セファロース又はアガロースを含む。一部の実施形態では、支持体は金属を含む。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、変性させるステップを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、キャプチャーされた核酸を第１のセットの１つ又は複数のアンプリコンの部分とハイブリダイズするステップを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、キャプチャーされた核酸を約２５℃〜約７０℃の温度でインキュベートするステップを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、キャプチャーされた核酸を約３５℃〜約６０℃の温度でインキュベートするステップを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、約１時間〜約２４時間又は約１２時間〜約２０時間の時間にわたってインキュベートするステップを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、ポリメラーゼを含まない。一部の実施形態では、（ｄ）のハイブリダイズするステップは、混合物をハイブリダイゼーションバッファーと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、（ｄ）のハイブリダイズするステップは、（ｉ）混合物とハイブリダイゼーションバッファーとの接触、（ｉｉ）変性、及び（ｉｉｉ）ハイブリダイズの連続ステップを含む。
一部の態様では、解析するステップは、配列リードを取得するステップを含む。場合により、配列リードは、次世代シーケンシング（例えば、大規模並列シーケンシング）を含む方法により得られる。場合により、配列リードは、両端対シーケンシングを含む方法により得られる。
いくつかの実施形態では、第１の非ネイティブ核酸は、少なくとも１つの核酸バーコードを含む。いくつかの実施形態では、第２の非ネイティブ核酸は、少なくとも１つの核酸バーコードを含む。
いくつかの実施形態では、特許請求される方法は、乾燥するステップを含まない。一部の態様では、本方法は、（ｃ）の前に変性させるステップを含まない。一部の態様では、本方法は、（ｄ）の前に変性させるステップを含まない。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｄ）の前に８０℃を超える温度へ加熱するステップを含まない。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｄ）の前に９０℃を超える温度へ加熱するステップを含まない。一部の実施形態では、（ｅ）の前にフローセル又はアレイの支持体に混合物が固定化されない。一部の実施形態では、（ｃ）の精製するステップは、結合ペアの第１のメンバーに結合するように立体配置された結合ペアの第２のメンバーの添加を含まない。
一部の態様では、サンプルは、１つ若しくは複数の種、１つ若しくは複数の組織、１つ若しくは複数の哺乳動物、又は１人若しくは複数のヒト対象から得ることができる。
いくつかの実施形態を以下の説明、実施例、特許請求の範囲及び図面にさらに詳しく記載する。
図面は、本技術の実施形態を例示するものであり、限定的ではない。説明を明瞭且つ容易にするために、図面は、等縮尺で作成しておらず、場合により、特定の実施形態を理解しやすくするために様々な態様が強調又は拡大して示されることがある。
４つのＵブロック核酸（Ａ’、Ｃ’、Ｅ’及びＧ’）を含む、ブロック方法の実施形態を示す。図１は、ライブラリーインサート（Ｄ）及び識別可能な核酸バーコード（Ｂ及びＦ）を含むライブラリー（Ｚ）の代表的な核酸を示し、ライブラリーの多数の核酸には複数の異なるインサート及び異なる識別可能なバーコードが存在する。図１は、Ｕブロック核酸（Ａ’、Ｃ’、Ｅ’及びＧ’）を示し、その各々は、図示する通り、非ネイティブ核酸（Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧ）の部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されており、これらのＵブロック核酸は、核酸バーコード（Ｂ又はＦ）と隣接してハイブリダイズする。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、従来のシーケンシング方法より高速且つ安価な方法によってゲノム規模で核酸のシーケンシング及び解析を可能にする。本明細書の方法及び組成物は、遺伝的変異及び／又は関連疾患及び障害を検出及び同定するために用いることができる高度なシーケンシング技術の改善を達成する。一部の実施形態では、一部に、ＮＧＳのための核酸混合物の操作及び調製を含む方法が提供される。
標的材料としてゲノム核酸を含むシーケンシングアプリケーションは、多くの場合、極めて複雑な混合物から目的とする核酸標的を選択する必要がある。シーケンシング作業の品質は、多くの場合に選択プロセスの効率に応じて変動し、この効率は、非標的配列に対して、どの程度良好に核酸標的を濃縮することができるかに左右される。核酸ライブラリーの選択及び濃縮は、ハイブリッドキャプチャーアプローチによるアダプター連結インサート（例えば、ゲノムＤＮＡインサート）のキャプチャーを含む。
ほとんどの次世代シーケンシングライブラリー分子は、それらの後のシーケンシングを可能にする非ネイティブ配列（例えば、アダプター核酸、バーコード配列、プライマー結合部位、及びユニバーサル配列）を含む。ハイブリダイゼーションキャプチャー反応中、非ネイティブ配列は、互いにアニーリングすることができ、これにより、濃縮された核酸プールの汚染が生じる。これらの不要な配列の大きい画分は、ライブラリーインサートに連結された末端アダプター配列の部分間の不要なハイブリダイゼーション事象に起因することが多い。場合により、複数のライブラリーインサートは、それらの末端アダプターを介して、非特異的に互いにアニーリングし得、その結果、そうでなければ連結され且つ一緒に単離される不要なＤＮＡ断片の「デイジーチェーン」が形成される。
いわゆる「デイジーチェーン」効果を低減する一方法では、アダプター配列の大きい部分とハイブリダイズするように指令されたブロック核酸を使用する。従来のアプローチの場合、ブロック核酸は、アダプターの両側に必要であり、各ブロック核酸は、アダプターの各々に含まれるアダプター配列（バーコード配列（例えば、インデックス配列）を含む）に対する完全な相補的一致を含む。ハイスループットマルチプレックスシーケンシング法の場合、多くの場合に複数のライブラリーが混合され、各ライブラリーは、様々なアダプター配列及び様々なバーコード配列から構成される。このようなマルチプレックスアプローチの場合、従来のブロッキング核酸の複数のセットを合成する必要があり、これらは各々、各ライブラリーのアダプターに特異的である。このアプローチは、煩雑であり、コストがかかり、且つ多くの異なる比較的長いオリゴヌクレオチドの製造を必要とするため、ライブラリーの調製及びシーケンシングプロセスの効率的且つ費用効果的な自動化を妨げている。
本明細書では、一部の態様において、不要なキャプチャー事象を低減するための新規及び改良された組成物及び方法が提供される。一部の実施形態において、本明細書では、新規のＵブロック（すなわち、ユニバーサルブロッキング）核酸が提示される。本明細書に提示される新規のＵブロック核酸を含む組成物及び本明細書で提供されるＵブロック核酸を利用する方法は、従来のアプローチよりも安価であり、効率及びワークフローを高め、且つ自動化にとってより好ましい。
さらに、ハイブリッドキャプチャーアプローチの従来のアプリケーションは、多くの場合、アダプター連結ライブラリーインサート又はそのアンプリコンのプールをＣ０ｔ−１ＤＮＡ及びブロッキングオリゴヌクレオチドと組み合わせるステップと、これに続く乾燥ステップとを必要とする。乾燥ステップは、真空中で行われることが多く、これには時間がかかり、開放系で実施される場合にサンプル間の相互汚染の高いリスクをもたらす。乾燥した後、サンプルを変性させ、数日にわたってアニーリングする。次に、ビオチン化キャプチャーオリゴヌクレオチド（例えば、「ベイト（ｂａｉｔ）」）を付加し、典型的には、ハイブリダイズした核酸をアビジン被覆ビーズでプルダウンする。続いて、保持した核酸のプールをビーズから溶離し、自動化シーケンシングプロセスに導入することができる。前述した手順は、非効率的であり、時間がかかるため、自動化に寄与せず、また相互汚染をもたら得る。
本明細書では、一部の態様において、解析のための（例えば、ハイスループットシーケンシングのための）核酸ライブラリーを操作及び調製する改善された方法が提供され、これらの方法は、長いインキュベーション時間及び／又は乾燥ステップを必要としない。
対象
対象は、任意の生存又は非生存生物であってよく、例えば、限定はしないが、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌、ウイルス又は原生生物が挙げられる。対象は、いずれの年齢（例えば、胚、胎児、乳児、幼児、成人）であってもよい。対象は、いずれの性（例えば、男性、女性、又はその組合せ）であってもよい。対象は、妊娠していてもよい。対象は、患者（例えば、ヒト患者）であってよい。
サンプル
本明細書では、サンプルを解析するための方法及び組成物が提供される。サンプル（例えば、核酸を含むサンプル）は、好適な対象から得ることができる。サンプルは、対象又はその部分から直接単離するか又は得ることができる。一部の実施形態では、サンプルは、個体又は医療専門家から間接的に得られる。サンプルは、対象又はその部分から単離されるか又は得られた任意の試料であってもよい。サンプルは、複数の対象から単離されるか又は得られた任意の試料であってもよい。試料の非限定的例として、対象からの体液若しくは組織、例えば、限定はしないが、血液若しくは血液製剤（例えば、血清、血漿、血小板、バッフィーコートなど）、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、肺、胃、腹膜、管路、耳、関節鏡検査の）、生検サンプル、体腔穿刺（ｃｅｌｏｃｅｎｔｅｓｉｓ）サンプル、細胞（血液細胞、リンパ球、胎盤細胞、幹細胞、骨髄由来細胞、胚若しくは胎児細胞）若しくはそれらの部分（例えば、ミトコンドリア、核、抽出物など）、尿、糞便、喀痰、唾液、鼻粘膜、前立腺液、洗浄液、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳汁など、又はそれらの組合せが挙げられる。核酸が抽出される液体又は組織サンプルは、無細胞（例えば、細胞フリー）であってもよい。組織の非限定的例として、臓器組織（例えば、肝臓、腎臓、肺、胸腺、副腎、皮膚、膀胱、生殖器、腸、結腸、脾臓、脳など、若しくはそれらの部分）、上皮組織、毛髪、毛嚢、管路、管、骨、眼、鼻、口、喉、耳、爪など、それらの部分又はそれらの組合せが挙げられる。サンプルは、正常な、健康な、罹患した（例えば、感染した）、及び／又は癌性（例えば、癌細胞）細胞又は組織を含み得る。対象から得られるサンプルは、多様な生物の細胞又は細胞材料（例えば、核酸）（例えば、ウイルスの核酸、胎児の核酸、細菌の核酸、寄生体の核酸）を含んでもよい。
一部の実施形態では、サンプルは、核酸又はその断片を含む。サンプルは、１つ又は複数の対象から得られた核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、サンプルは、単一の対象から得られた核酸を含む。一部の実施形態では、サンプルは、核酸の混合物を含む。核酸の混合物は、異なるヌクレオチド配列、様々な断片長さ、異なる起源（例えば、ゲノム起源、細胞若しくは組織起源、対象起源など、又はそれらの組合せ）、又はそれらの組合せを有する２つ以上の核酸種を含み得る。サンプルは合成核酸であってもよい。
核酸
「核酸」という用語は、例えば、ＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、ＲＮＡ（例えば、メッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、並びに／又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体及び／若しくは非ネイティブ骨格などを含有するもの）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド及びポリアミド核酸（ＰＮＡ）などからの任意の組成物の１つ又は複数の核酸（例えば、核酸のセット若しくはサブセット）を指し、これらは全て、一本鎖若しくは二本鎖形態であってよく、別に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然のヌクレオチドの公知の類似体を包含し得る。特に限定されない限り、この用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。核酸は、その均等物、誘導体、又は変異体として、ヌクレオチド類似体から合成されたＲＮＡ若しくはＤＮＡの好適な類似体、一本鎖（「センス」若しくは「アンチセンス」、「プラス」鎖若しくは「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレーム若しくは「リバース」リーディングフレーム）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含み得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよい。核酸は、２以上、３以上、４以上、又は５以上の任意の長さの連続したヌクレオチドからなるものでもよい。核酸は、配列（例えば、核酸配列）として当技術分野で公知の特定の５’から３’方向のヌクレオチドを含み得る。
核酸は、天然に存在するものでもよく、及び／又は人の手によって合成、コピー又は改変することができる。例えば、核酸は、アンプリコンであってもよい。核酸は、例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡライブラリーなどの核酸ライブラリー由来のものであってもよい。核酸は、合成（例えば、化学合成）又は生成（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリメラーゼ伸長により、例えば、増幅により、例えば、ＰＣＲにより）することができる。いくつかの実施形態では、核酸は、プラスミド、ファージ、ウイルス、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくは宿主細胞、細胞、細胞核又は細胞の細胞質で複製するか、若しくは複製させることができる他の核酸であってもよく、又はこれらに由来するものであってもよい。核酸（例えば、核酸のライブラリー）は、１つのサンプル又は２つ以上のサンプル（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、又は２０以上のサンプル）に由来する核酸を含み得る。本明細書に記載するプロセス又は方法のために提供される核酸は、１〜１０００、１〜５００、１〜２００、１〜１００、１〜５０、１〜２０又は１〜１０のサンプルに由来する核酸を含み得る。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、遺伝子産物の転写／翻訳及び転写／翻訳の調節に関与するコード領域（リーダ及びトレイラ）の先行及び後続領域、並びに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。遺伝子は、必ずしもペプチドを産生するわけではなく、又は遺伝子配列中の遺伝的変異（例えば、遺伝子のコード及び非コード部分の突然変異）により短縮若しくは非機能性タンパク質を産生することもある。遺伝子は、機能性又は非機能性にかかわらず、多くの場合、参照ゲノム中の遺伝子に対する相同性によって同定することができる。
オリゴヌクレオチドは、比較的短い核酸である。オリゴヌクレオチドは、約２〜１５０、２〜１００、２〜５０、又は２〜約３５核酸の長さであってよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはプライマーである。プライマーは、多くの場合、選択された相補的核酸とハイブリダイズするように立体配置され、ハイブリダイズした後、ポリメラーゼにより伸長されるように立体配置される。
核酸の単離及び精製
核酸は、当技術分野で公知の好適な方法を用いて、１つ若しくは複数の対象、１つ若しくは複数のサンプル、又は１つ若しくは複数の供給源から誘導、単離、抽出、精製又は部分的に精製することができる。核酸を単離、抽出及び／又は精製するために、任意の好適な方法を用いることができる。
本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、その本来の環境（例えば、天然に存在する場合には天然の環境、又は外因的に発現した場合には宿主細胞）から取り出された核酸を指し、従って、これは、その本来の環境からヒトの介入により（例えば、「人の手により」）修飾されている。本明細書で使用されるとき、「単離された核酸」という用語は、対象（例えば、ヒト対象）から取り出された核酸を指し得る。単離された核酸は、供給源のサンプル中に存在する成分の量より少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質）を伴って提供され得る。単離された核酸を含む組成物は、非核酸成分の約５０％〜９９％超を含有しない可能性がある。単離された核酸を含む組成物は、非核酸成分の約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超を含有しない可能性がある。本明細書で使用されるとき、「精製された」という用語は、核酸を精製プロセスに付す前に存在した非核酸成分の量より少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物、塩、バッファー、デタージェントなど、又はそれらの組合せ）を含有する、記載の核酸を指す。精製済み核酸を含む組成物は、他の非核酸成分の少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超を含有しない可能性がある。精製済み核酸を含む組成物は、精製方法の適用前にサンプル中に存在する全核酸の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超を含有し得る。
一部の実施形態では、混合物の精製（例えば、混合物中の核酸の精製）により、精製済み核酸が得られる。いくつかの実施形態では、ライブラリーの核酸、ブロッキング核酸、キャプチャー核酸、コンペティター核酸及び／又はそれらの組合せを含む混合物を精製し、これにより精製済み核酸を取得する。核酸の精製は、ＤＮＡクリーンアップカラム又はＤＮＡクリーンアップビーズを含むこともある。様々な核酸クリーンアップカラム、樹脂、支持体及びキットが当技術分野で知られている。任意の好適な核酸精製方法、樹脂、ビーズ、支持体又はキットを本発明の方法と共に使用することができる。例えば、核酸の精製方法は、金属を含む好適なカチオン交換樹脂（例えば、カチオン性ビーズ）に核酸を結合（例えば、非共有結合）させるステップ、磁石を用いて、結合した核酸複合体をプルダウンするステップ、続いて、低塩濃度バッファーの添加により、結合した核酸を溶離するステップを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、核酸精製は、ＡＭＰｕｒｅＸＰ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ，（ＵＳＡ））などの使用を含む。本明細書で使用する核酸精製の方法は、短い核酸（例えば、ブロッキング核酸）、並びにライブラリーインサート（例えば、アダプター連結インサート及びそのアンプリコン）の最適な回収のために改変されることが多い。いくつかの実施形態では、本明細書の核酸の精製方法は、平均又は絶対長さが約５〜約１０００ヌクレオチド、５〜約８００ヌクレオチド、又は５〜約５００ヌクレオチドの核酸の最適な回収のために改変されている。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する核酸の精製方法は、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１又は３：１（体積：体積）の核酸結合樹脂（例えば、核酸結合ビーズ、核酸結合支持体、例えば、１００％スラリー）と核酸含有混合物との比を使用する。
一部の実施形態では、精製プロセスは、洗浄ステップを含む。一部の実施形態では、精製プロセスは、溶離ステップを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載する精製プロセスは、乾燥ステップ、真空（例えば、ｓｐｅｅｄ ｖａｃ）及び／又は凍結乾燥の使用を含まない。このような方法は、相互汚染の高いリスクをもたらす。一部の実施形態では、混合物のキャプチャー核酸は、多くの場合に結合ペアのメンバーを含むが、本明細書に記載する精製プロセスは、結合ペアの第２のメンバーの使用を含まない。一部の実施形態では、精製方法は、ハイブリダイゼーションバッファーの非存在下で実施する。一部の実施形態では、精製方法は、添加カルシウム又はマグネシウム塩の非存在下で実施する。一部の実施形態では、精製方法は、デタージェント（例えば、ＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＢＳＡ、及び／又はポリビニルピロリドンの非存在下で実施する。
ハイブリダイゼーション
実質的に相補的な一本鎖核酸は、ハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることにより、部分的又は完全に二本鎖の核酸を形成する。一部の実施形態では、核酸配列の全部又は一部は、別の核酸配列と実質的に相補的であってもよい。本明細書で述べるとき、「実質的に相補的な」は、好適なハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を指す。ハイブリダイゼーション条件は、実質的に相補的な相補的核酸内での配列ミスマッチの変動する量を許容するように改変することができる。互いにハイブリダイズすることができる核酸の実質的に相補的な部分は、互いに７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上相補的であり得る。一部の実施形態では、互いにハイブリダイズすることができる核酸の実質的に相補的な部分は、１００％相補的である。互いにハイブリダイズするように立体配置される核酸又はその部分は、多くの場合、互いに実質的に相補的な核酸配列を含む。
本明細書で使用されるとき、「特異的にハイブリダイズする」は、実質的に相補的な２つの核酸又はそれらの部分が互いにハイブリダイズするが、２つの核酸のいずれかに対して実質的に相補的でない別の核酸とはハイブリダイズしないハイブリダイゼーション条件下での優先的ハイブリダイゼーションを指す。例えば、特異的ハイブリダイゼーションは、キャプチャー核酸と、このキャプチャー核酸と実質的に相補的な標的アンプリコンの部分とのハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、特異的にハイブリダイズするように立体配置される核酸又はその部分は、多くの場合、核酸配列の連続部分にわたって互いに約８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％相補的である。特異的ハイブリダイゼーションは、非特異的ハイブリダイゼーション相互作用（例えば、特異的にハイブリダイズするように立体配置されていない２つの核酸、例えば、８０％以下、７０％以下、６０％以下又は５０％以下相補的な２つの核酸）に対して、約２倍以上、往々にして約１０倍以上、場合により約１００倍以上、１０００倍以上、１０，０００倍以上、１００，０００倍以上、又は１，０００，０００倍以上の差がある。
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法は、ハイブリダイゼーション条件下で核酸をハイブリダイズするステップを含む。実質的に相補的な核酸のハイブリダイゼーションを促進する条件は、本明細書ではハイブリダイゼーション条件と呼ばれる。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性を改変する方法は当技術分野で公知である。
ハイブリダイゼーション条件は、アッセイで使用する核酸の特性に応じて決定及び／又は調節することができる。ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は、当技術分野で公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６（１９８９）に見出すことができる。核酸配列含量（例えば、ＧＣ含量、ミスマッチの割合）及び／又は長さは、場合により、実質的に相補的な核酸のハイブリダイゼーションに影響を及ぼすことがある。ハイブリダイゼーション条件は、多くの場合、目的とする２つ以上の実質的に相補的な核酸の最適なアニーリングのために調節することができるパラメータを含む。このような調節可能なパラメータの非限定的例として、温度、一価若しくは二価イオン及び／又はカチオン濃度（例えば、Ｍｇ濃度）、バッファー濃度、リン酸塩濃度、グリセロール濃度、ＤＭＳＯ濃度、核酸濃度など、又はそれらの組合せが挙げられる。実質的に相補的な核酸間のミスマッチの割合に応じて、選択した核酸（例えば、既知若しくは予測融解温度を有するオリゴヌクレオチド又はプライマー）のアニーリングを実施するために、及び／又はその特異的ハイブリダイゼーションを選択するためにハイブリダイゼーション条件を調節することができる。
ハイブリダイゼーション条件は、多くの場合、核酸を含むサンプルを好適な温度に加熱又は冷却するステップを含む。ハイブリダイゼーションに好適な温度は、場合により、約０℃〜８０℃、約２５℃〜８０℃、約２５℃〜７０℃、約３０℃〜７０℃、約３５℃〜７０℃、約４０℃〜７０℃、約３５℃〜６５℃、約３５℃〜６０℃、約３５℃〜５５℃、又は約４０℃〜５０℃である。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、サンプルを約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、又は約５５℃の温度に冷却するステップを含む。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件下で精製済み核酸混合物をハイブリダイズするステップは、変性ステップと、これに続くハイブリダイゼーションステップ（例えば、ハイブリダイゼーションに好適な時間及び温度でインキュベートするステップ）とを含む。ハイブリダイゼーション条件は、場合により、核酸の混合物を変性させた直後に混合物を好適なハイブリダイゼーション温度に冷却する（例えば、温度を急速に傾斜させる）ステップを含む。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は変性プロセスを含む。変性は、多くの場合、核酸を含むサンプルの温度をサンプル中の１つ又は複数の二本鎖核酸の融点の温度又はそれを超える温度に（例えば、加熱により）上昇させるステップを含む。一部の実施形態では、変性は、サンプルの温度を約７０℃から約１２０℃に、約８５℃から約１０５℃に、約９０℃から約１０５℃に、又は約９５℃から約１０５℃に上昇させるステップを含む。一部の実施形態では、変性は、サンプルの温度を約７０℃以上、約７５℃以上、約８０℃以上、約８５℃以上、又は約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、約９５℃、約９６℃、約９７℃、約９８℃、約９９℃、約１００℃、約１０１℃、約１０２℃、約１０３℃、約１０４℃又は約１０５℃に上昇させるステップを含む。一部の実施形態では、核酸を所望の変性温度で約１秒〜約３０分以上、約１５秒〜約３０分、約３０秒〜約３０分、約１分〜約３０分、約１分〜約２０分、約１分〜約１５分、又は約５分〜約１０分間にわたって変性させる。
ハイブリダイゼーション条件は、多くの場合、サンプルを所望のハイブリダイゼーション温度で一定時間にわたって保持する、インキュベーション時間を含む。ライブラリーの核酸、ブロッキング及び／又はキャプチャー核酸をハイブリダイズする従来の方法は、４８時間を超えるハイブリダイゼーション時間を要する。ハイブリダイゼーションのために任意の好適な条件を用いることができるが、本明細書で提供されるいくつかの方法は、有意に短縮されたハイブリダイゼーション時間を提供する。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、混合物を所望のハイブリダイゼーション温度で約１分〜約２４時間、約５分〜約２４時間、約１０分〜約２４時間、約１５分〜約２４時間、約３０分〜約２４時間、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約２４時間、約８時間〜約２４時間、約１０時間〜約２４時間、約１０時間〜約２０時間、又は約１２時間〜約２０時間にわたってインキュベートするステップを含む。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、混合物を所望のハイブリダイゼーション温度で約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０時間にわたってインキュベートするステップを含む。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、サンプルを所望のハイブリダイゼーション温度で約４８時間以下、約２４時間以下又は約１８時間以下にわたってインキュベートするステップを含む。
一部の実施形態では、ハイブリダイズするステップは、核酸をハイブリダイゼーションバッファーと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、核酸と好適なハイブリダイゼーションバッファーとの混合物を含む。ハイブリダイゼーションバッファーは、当技術分野で公知であり、市販されている。ハイブリダイゼーションバッファーは、デタージェント（例えば、ＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、グリセロール、ＢＳＡ、ポリビニルピロリドン、デキストラングリセロール、二価カチオン（例えば、カルシウム及び／若しくはマグネシウム）、一価カチオン、リン酸塩など、又はそれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法は、ハイブリダイゼーション条件下で精製済み核酸をハイブリダイズするステップの前に変性ステップを含まない。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、ポリメラーゼを含まない。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、ポリメラーゼ連鎖反応を含まない。いくつかの実施形態では、混合物は、混合物の核酸がキャプチャーされるまでポリメラーゼを含まない。
増幅
核酸は、好適な方法によって増幅してもよい。本明細書で使用されるとき、「増幅された」という用語は、標的核酸又はそのセグメントと同じ又は実質的に同じ（例えば、実質的に同一の）ヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を線形又は指数関数的に生成するプロセスに、サンプル中の標的核酸を付すことを指す。一部の実施形態では、増幅反応は、好適な熱安定性ポリメラーゼを含む。熱安定性ポリメラーゼは、当技術分野で公知であり、ほとんどの哺乳動物に見出される一般的ポリメラーゼと比較すると、８０℃超の温度で長時間にわたり安定している。いくつかの実施形態では、「増幅された」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む方法を指す。増幅を促す条件（すなわち、増幅条件）は公知であり、多くの場合、少なくとも好適なポリメラーゼ、好適な鋳型、好適なプライマー若しくはプライマーのセット、好適なヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）、好適なバッファー、並びに好適なアニーリング、ハイブリダイゼーション及び／又は伸長時間及び温度の適用を含む。いくつかの実施形態では、増幅された産物（例えば、アンプリコン）は、１つ又は複数の追加ヌクレオチド及び／若しくはアンプリコンが生成される鋳型配列と異なるヌクレオチド、又はその部分を含有し得る（例えば、プライマーは「余剰の」ヌクレオチドを含有し得る）。
核酸は、サーモサイクル方法又は等温増幅方法によって増幅することができる。一部の実施形態では、ローリングサークル型増幅方法を使用する。一部の実施形態では、増幅は、核酸、核酸ライブラリー又はそれらの部分が固定化された固体支持体（例えば、フローセル内の）上で実施する。いくつかのシーケンシング方法では、核酸ライブラリーをフローセルに添加し、好適な条件下でアンカーとのハイブリダイゼーションにより固定化させる。このタイプの核酸増幅は、多くの場合に固相増幅と呼ばれる。固相増幅の一部の実施形態では、増幅した産物の全部又は一部が、固定化プライマーから開始する伸長によって合成される。固相増幅反応は、増幅オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の少なくとも１つが固体支持体に固定化される以外、標準的な液相増幅と類似している。
一部の実施形態では、固相増幅は、表面に固定化された単一種のオリゴヌクレオチドプライマーのみを含む核酸増幅反応を含む。いくつかの実施形態では、固相増幅は、複数の異なる固定化オリゴヌクレオチドプライマー種を含む。一部の実施形態では、固相増幅は、固体表面に固定化された単一種のオリゴヌクレオチドプライマーと、溶液中の第２の別のオリゴヌクレオチドプライマー種を含む核酸増幅反応とを含んでもよい。複数の異なる種の固定化又は溶液ベースのプライマーを使用することもできる。固相核酸増幅反応の非限定的例として、界面増幅、架橋増幅、エマルジョンＰＣＲ、ＷｉｌｄＦｉｒｅ増幅（例えば、米国特許出願公開第２０１３００１２３９９号明細書）など、又はそれらの組合せが挙げられる。
核酸ライブラリー
いくつかの実施形態では、核酸ライブラリー（例えば、核酸のライブラリー）は、１つ又は複数の対象から得られる全ｇＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの収集物又はサブセットである。核酸ライブラリーは、一本鎖及び／又は二本鎖核酸を含み得る。核酸ライブラリーは、多くの場合、１つ又は複数のサンプルから生成され、サンプルが得られた１つ又は複数の対象若しくは生物に対して内因性又はネイティブである核酸を含む。核酸ライブラリーは、多くの場合、サンプルが得られた１つ又は複数の生物に対して内因性又はネイティブである複数の核酸若しくは核酸断片を含む。このような内因性又はネイティブ核酸は、本明細書ではライブラリーインサートと呼ばれることもある。従って、複数の核酸は、１０３〜１０２０の核酸を指し得る。一部の実施形態では、複数の核酸は、１０３以上、１０４以上、１０５以上、１０６以上、１０７以上、１０８以上、１０９以上、１０１０以上、１０１２以上の核酸（又はインサート）を指す。ライブラリーインサートは、ゲノムＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡライブラリー）、ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡライブラリー）又はｃＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡライブラリー）の断片であってよい。ライブラリーインサートは、完全長遺伝子、ｃＤＮＡ、イントロン、エキソン、非翻訳領域（例えば、プロモータ、エンハンサー、調節配列など）遺伝子、それらの部分又はそれらの組合せを含み得る。任意の１供給源又は１対象から得られる核酸のライブラリーは、多くの場合、１０００以上、１０，０００以上、又は１００，０００以上のライブラリーインサートを含み、これらは異なっており、多くの場合に互いに識別可能である。一部の実施形態では、核酸ライブラリーは、複数のライブラリーインサートを含み、核酸は特定のプロセスのために調製、アセンブリング及び／又は修飾され、その非限定的例として、固相（例えば、固体支持体、例えば、フローセル、ビーズ）への固定化、濃縮、増幅、クローン化、検出及び／又は核酸シーケンシングが挙げられる。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、１つ又は複数のサンプル（例えば、１つ若しくは複数の対象、１つ若しくは複数の組織、１つ若しくは複数の種、又はそれらの組合せ）から得られる１つ又は複数のライブラリーインサートを含む。一部の実施形態では、ライブラリーの各核酸は、少なくとも１つのライブラリーインサート（例えば、１つ、２つ、３つ若しくはそれを超えるインサート）、１つ又は複数の核酸バーコードを含む１つ又は複数の非ネイティブ核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、シーケンシングプロセスの前又はシーケンシングプロセス中に調製される。核酸ライブラリー（例えば、シーケンシングライブラリー）は、当技術分野で公知の好適な方法により調製することができる。核酸ライブラリーは、標的化又は非標的化調製プロセスによって調製することができる。
一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、多くの場合、既知組成物（例えば、合成核酸、異種核酸）の１つ又は複数の非ネイティブ核酸を含むように修飾される。一部の実施形態では、ライブラリーの各核酸は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０又はそれを超える非ネイティブ核酸を含む。一部の実施形態では、ライブラリーの各核酸は、１つ又は２つの非ネイティブ核酸を含む。非ネイティブ核酸は、好適な位置、例えば、ライブラリーインサートの一端、他端、又は両端に付加することができる。一部の実施形態では、ライブラリーの核酸は、ライブラリーインサートの反対側の末端に非ネイティブ核酸を含む。例えば、ライブラリーの核酸は、ライブラリーインサートの５’末端、及び／又は３’末端に位置する非ネイティブ核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、非ネイティブ核酸は、例えば、好適なホスホジエステル結合により、ライブラリーインサートに共有結合される。一部の実施形態では、ライブラリーの核酸は、ライブラリーインサート、第１の非ネイティブ核酸、及び第２の非ネイティブ核酸を含み、第１及び第２の非ネイティブ核酸は、ライブラリーインサートの反対側（例えば、５’側及び３’側）に位置する。
いくつかの実施形態では、非ネイティブ核酸は、核酸ライブラリーが得られた１つ又は複数の対象若しくは生物に対してネイティブではない、及び／又は内因性ではない。核酸ライブラリーインサートが得られた対象若しくは生物に対してネイティブではない、及び／又は内因性ではない非ネイティブ核酸は、多くの場合、前記対象又は生物由来のゲノムＤＮＡ若しくはＲＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）を含まない。
いくつかの実施形態では、非ネイティブ核酸は、好適な外性核酸及び／又は好適な合成核酸を含む。合成核酸の非限定的例として、識別可能な識別子、核酸バーコード（例えば、識別可能な核酸バーコード）、キャプチャー核酸、配列タグ、ランダム核酸配列、アダプター核酸、制限酵素部位、突出部、プロモータ、エンハンサー、複製起点、ステムループ、プライマー結合部位、オリゴヌクレオチドアニーリング部位、好適な組込み部位（例えば、トランスポゾン、ウイルス組込み部位）、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドなど、それらの部分又はそれらの組合せが挙げられる。非ネイティブ核酸は、同じ又は異なる核酸配列を有してもよい。一部の実施形態では、非ネイティブ核酸は、１つ又は複数のキャプチャー核酸、ブロック核酸（例えば、Ｕ−ブロック核酸）又はプライマーとハイブリダイズするように立体配置される。
いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、連結によるライブラリー調製方法によって調製する。一部の実施形態では、連結によるライブラリー調製方法により、非ネイティブ核酸をライブラリーの核酸に付加する。連結によるライブラリー調製方法は、多くの場合に１つ又は複数のアダプターを利用する。アダプターは、多くの場合、ライブラリーが由来する生物に対して内因性ではないか、又はその生物に存在しない核酸配列を含む合成核酸（例えば、人の手で製造された）である。一部の実施形態では、非ネイティブ核酸は、アダプターを含む。いくつかの実施形態では、アダプターを用いて、解析（例えば、シングルリードシーケンシング、両端対シーケンシング及びマルチプレックスシーケンシング）のためのライブラリーインサートを調製することができる。一部の実施形態では、核酸ライブラリー調製は、１つ又は複数のアダプターを複数のライブラリーインサートに連結するステップを含む。アダプターは、比較的短い二本鎖又は一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、約２〜約１０、２〜約３０、２〜約５０、２〜約１００の核酸又はそれを超える）であってよく、これは、例えば、識別可能な識別子、識別可能な核酸バーコード及び／又は結合ペアの１つ又は複数のメンバーを含む。アダプターは、ライブラリーインサートの５’及び／又は３’側に位置することが多い。アダプターは、ライブラリーインサートにフランキングすることが多い。一部の実施形態では、二本鎖アダプターの１つの鎖のみをライブラリーの核酸に組み込む（例えば、ライブラリーインサートに連結させる）。二本鎖アダプターの両方の鎖をライブラリーに組み込むこともある。一部の実施形態では、ライブラリーの一本鎖核酸は、５’アダプター及び３’アダプターを含み、５’及び３’アダプターの配列は、実質的に異なり、及び／又は実質的に相補的ではない。
いくつかの実施形態では、アダプターは、フローセルアンカーと実質的に相補的な部分を含み、場合により、この部分を使用して、核酸ライブラリーを固体支持体、例えば、フローセルの内側面に固定化する。いくつかの実施形態では、アダプターは、増幅プライマー又はシーケンシングプライマーと実質的に相補的な部分を含み、これは、アダプターの同じ、異なる、又は重複部分であってもよい。一部の実施形態では、ライブラリーの核酸の少なくとも１つのアダプター（例えば、５’又は３’アダプター）は、識別可能な識別子（例えば、識別可能なバーコード配列）を含む。一部の実施形態では、二本鎖アダプターの両方の鎖が核酸バーコードを含み、その場合、アダプターの第１鎖の核酸バーコードは、アダプターの第２鎖の核酸バーコードと実質的に相補的である。
いくつかの実施形態では、２つ以上の非ネイティブ核酸は、実質的に同一の部分を含む。実質的に同一の非ネイティブ核酸の部分は、ユニバーサル核酸（例えば、ユニバーサル核酸配列）と呼ばれることもある。一部の実施形態では、非ネイティブ核酸は、１つ又は複数のユニバーサル核酸を含む。いくつかの実施形態では、非ネイティブ核酸は、第１のユニバーサル核酸、第２のユニバーサル核酸、及び核酸バーコードを含み、このバーコードは、第１及び第２のユニバーサル核酸の間に位置する。このような非ネイティブ核酸は、ライブラリーインサートの５’及び／又は３’側に位置することが可能である。例えば、一部の実施形態では、ライブラリーの核酸は、ライブラリーインサートの５’側に位置する第１のユニバーサル核酸、第１の核酸バーコード及び第２のユニバーサル核酸、並びにライブラリーインサートの３側に位置する第３のユニバーサル核酸、第２のバーコード及び第４のユニバーサル核酸を含み得る。一部の実施形態では、ライブラリーの核酸は、ライブラリーインサートの５’側に位置する第１の非ネイティブ核酸及び第１の核酸バーコード、並びにライブラリーインサートの３’側に位置する第２の非ネイティブ核酸及び第２のバーコードを含み得る。いくつかの実施形態では、非ネイティブ核酸は、識別可能なバーコードとフランキングするユニバーサル配列を含むように設計及び／又は立体配置される。一部の実施形態では、本発明のＵ−ブロック核酸は、ユニバーサル核酸配列と特異的にハイブリダイズするように設計及び／又は立体配置される。
一部の実施形態では、核酸ライブラリー又はその部分を増幅する（例えば、ＰＣＲ法により増幅する）。一部の実施形態では、シーケンシング方法は、核酸ライブラリーの増幅を含む。核酸ライブラリーは、固体支持体（例えば、フローセル内の固体支持体）への固定化の前又は後に増幅することができる。一部の実施形態では、核酸ライブラリーは、アンプリコンを含む。核酸ライブラリーのアンプリコンは、一本鎖又は二本鎖のいずれでもよい。一部の実施形態では、核酸ライブラリーのアンプリコンは、ライブラリーインサート及びアダプター配列（例えば、アダプター配列にフランキングされるライブラリーインサート）を含む。一部の実施形態では、核酸ライブラリーは、複数のアンプリコンを含み、これらは、本明細書においてアンプリコンのライブラリーと呼ばれることもある。
いくつかの実施形態では、アンプリコンのライブラリーの各アンプリコンは、ライブラリーインサート及び１つ又は複数の非ネイティブ核酸を含む。例えば、一部の実施形態では、アンプリコンは、ライブラリーインサートと、１つ、２つ、３つ、４つ、１０以上、又は５０以上の非ネイティブ核酸とを含む。アンプリコンは、多くの場合、１つ又は複数の５’非ネイティブ核酸と１つ又は複数の３’非ネイティブ核酸との間に位置するライブラリーインサートを含む。いくつかの実施形態では、アンプリコンは、ライブラリーインサートの５’側に位置する１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの非ネイティブ核酸と、ライブラリーインサートの３’側に位置する１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの非ネイティブ核酸とを含む。一部の実施形態では、アンプリコンは、ライブラリーインサートの５’側に位置する１つ又は複数の識別可能なバーコードと、ライブラリーインサートの３’側に位置する１つ又は複数の識別可能なバーコードとを含む。いくつかの実施形態では、アンプリコンは、ライブラリーインサートの５’側に位置する１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの識別可能なバーコードと、ライブラリーインサートの３’側に位置する１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの識別可能なバーコードとを含む。
一部の実施形態では、ライブラリーのアンプリコンは、実質的に同一の１つ又は複数の非ネイティブ核酸を含む。実質的に同一の核酸は、核酸配列が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一である。同様に、実質的に同一の２つ以上の核酸は、実質的に同一の核酸配列を含む２つ以上の核酸を指す。
実質的に異なる核酸は、核酸配列が５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、８５％未満同一である２つ以上の核酸配列を指す。実質的に異なる２つ以上の核酸は、実質的に異なる核酸配列を含む２つ以上の核酸を指す。
一部の実施形態では、本明細書の方法は、１つ又は複数のサンプルから得られた１つ又は複数のライブラリーインサートを含む核酸のライブラリーを得るステップを含む。一部の実施形態では、核酸ライブラリーは、本明細書に記載する通りにライブラリーを生成することにより、又は当技術分野で公知の方法により得ることができる。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは第三者から得られ、その場合、第三者が核酸ライブラリーを生成している。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、供給業者から購入する。一部の実施形態では、本発明の方法は、１つ又は複数のサンプルから得られた１つ又は複数のライブラリーインサートを含む核酸のライブラリーを得るステップを含み、ライブラリーの各核酸は、少なくとも１つのライブラリーインサート、第１の非ネイティブ核酸、第２の非ネイティブ核酸、及び１つ又は複数の核酸バーコードを含み、第１の非ネイティブ核酸は、少なくとも１つのライブラリーインサートの５’側に位置し、また第２の非ネイティブ核酸は、ライブラリーインサートの３’側に位置する。
識別可能な識別子
一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の識別可能な識別子を含む。識別可能な識別子は、核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に組み込むか、又は結合（例えば、共有、非共有、不可逆的若しくは可逆的結合）させることができ、これにより識別子を含む核酸の検出及び／又は同定が可能になる。一部の実施形態では、識別可能な識別子は、シーケンシング方法（例えば、ポリメラーゼによる）の前又はその最中に核酸に組み込むか、又は結合させる。本明細書に記載する組成物又は方法に、任意の好適な識別可能な識別子及び／若しくは検出可能な識別子を用いることができる。いくつかの実施形態では、識別可能な識別子は、核酸と直接又は間接的に会合（例えば、結合）させることができる。例えば、識別可能な識別子は、核酸と共有又は非共有結合させることができる。一部の実施形態では、識別可能な識別子は、核酸と共有若しくは非共有結合した結合剤若しくは結合ペアのメンバーと結合又は会合させる。一部の実施形態では、識別可能な識別子は、核酸と可逆的に会合させる。いくつかの実施形態では、核酸と可逆的に会合した識別可能な識別子は、好適な方法を用いて（例えば、塩濃度の増加、変性、洗浄、好適な溶媒の添加及び／又は加熱により）核酸から除去することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法（例えば、核酸検出、解析及び／又はシーケンシング方法）で、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、２０以上、３０以上又は５０以上の識別可能な識別子を使用する。
一部の実施形態では、識別可能な識別子は標識である。一部の実施形態では、核酸は検出可能な標識を含み、その非限定的例として、放射性標識（例えば、同位体）、金属標識、蛍光標識、発色団、化学発光標識、電気化学発光標識（例えば、Ｏｒｉｇｅｎ（商標））、燐光標識、消光剤（例えば、発蛍光団消光剤）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペア（例えば、ドナー及びアクセプター）、色素、タンパク質（例えば、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ）、抗体、抗原若しくはそれらの部分、リンカー、結合ペアのメンバー）、酵素基質、小分子（例えば、ビオチン、アビジン）、マスタグ、量子ドット、ナノ粒子など、又はそれらの組合せが挙げられる。任意の好適な発蛍光団を標識として使用することができる。発光標識は、多様な好適な技術、例えば、フローサイトメトリー、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、ジーン−チップ（ｇｅｎｅ−ｃｈｉｐ）解析、マイクロアレイ、質量分析、細胞蛍光分析、蛍光顕微鏡法、共焦点レーザ顕微鏡法、レーザ走査型サイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、手動バッチ方式分離、電界懸濁、シーケンシングなど及びそれらの組合せによって検出及び／又は定量することができる。
一部の実施形態では、識別可能な識別子は核酸バーコードである。
核酸バーコード
一部の実施形態では、非ネイティブ核酸は、１つ又は複数の識別可能な核酸バーコード（例えば、インデックスヌクレオチド、配列タグ又は「バーコード」ヌクレオチド）を含む。核酸バーコードは、多くの場合、サンプルの特定の核酸、若しくは核酸のサブセット内に組み込まれるか、又はそれに結合させて（例えば、それと会合させて）、核酸の混合物中の特定の核酸、若しくは核酸のサブセットを追跡及び／又は同定する、特定の配列の核酸である。いくつかの実施形態では、識別可能な核酸バーコードは、サンプル、方法又はアッセイにおける１つ又は複数の核酸（例えば、核酸のサブセット）の明白な同定を可能にする識別子として使用可能なヌクレオチドの識別可能な配列を含む。識別可能な核酸バーコードは、往々にして、バーコードが会合する核酸の起源又は識別の明白な同定を可能にするように立体配置されている。一部の実施形態では、識別可能な核酸バーコード（例えば、バーコード）は、様々な供給源から得られた核酸の混合物中の特定の核酸の供給源の同定を可能にし得る。一部の実施形態では、識別可能な核酸バーコードは、バーコードが会合する核酸の起源又は識別の明白な同定を可能にするように立体配置されている。例えば、いくつかの実施形態では、識別可能な核酸バーコードは、特定のサンプル、サンプル供給源、同じ対象若しくは組織から得られた核酸のライブラリー、特定の核酸属若しくはサブセット、特定の核酸種、同じ染色体由来の核酸など、又はそれらの組合せに対して特有及び／又はユニークである。一部の実施形態では、サンプル、対象又は組織に由来するインサートを含む核酸は、そのサンプル、対象又は組織に特有且つユニークであり、これにより、異なるサンプル、対象又は組織に由来する核酸から上記核酸及び／又はインサートの明白な同定を可能にする。従って、サンプル、対象又は組織にユニークな識別可能な核酸バーコードは、多くの場合に核酸の混合物中の他の核酸バーコードから識別可能であり、それらと異なる。一部の実施形態では、ユニークである識別可能な核酸バーコードは、１つ又は複数の供給源に由来する１つ又は複数のサンプルを含む組成物中の他のバーコード（例えば、異なるサンプル又は供給源に由来する核酸のライブラリー）と異なり、且つ／又は識別可能である。一部の実施形態では、サンプル、対象又は組織にユニークな識別可能な核酸バーコードは、同じサンプル、対象、組織、又はその特定のサブセットに由来する核酸と会合する（例えば、その中に含有される）。従って、一部の実施形態では、同じサンプル、対象又は組織に由来する核酸は、多くの場合、同じサンプル、対象又は組織の各核酸と会合する同一の配列の少なくとも１つの識別可能な核酸バーコードを含む。
一部の実施形態では、識別可能なバーコードは、４〜１０、４〜１５、４〜２０、４〜５０若しくは２０以上の連続したヌクレオチドの識別可能な及び／又はユニークな配列を含む。識別可能な２つの核酸バーコードは、１、２、３、４、５ヌクレオチド又はそれを超える配列が異なっていてもよい。従って、いくつかの実施形態では、異なる及び／又は識別可能な２つの核酸バーコードは、最大９９％同一であり、少なくとも１ヌクレオチド異なる核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、識別可能なバーコードは、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５以上の連続したヌクレオチドの識別可能な及び／又はユニークな配列を含む。一部の実施形態では、識別可能な核酸バーコードは、１０以下、１５以下、若しくは２０以下の連続したヌクレオチドの識別可能な及び／又はユニークな配列を含む。識別可能な核酸バーコードは、多くの場合、第１の末端及び第２の末端を含む。識別可能な核酸バーコードの末端は、識別可能な核酸バーコード配列の５’末端又は３’末端ヌクレオチド塩基として同定することができる。例えば、一部の実施形態では、第１の末端は、識別可能な核酸バーコード配列の５’末端ヌクレオチド塩基として同定することができ、また第２の末端は、３’末端ヌクレオチド塩基として同定することができる。第１の末端及び／又は第２の末端は、識別可能な核酸バーコードの反対側の末端に位置することが多い。一部の実施形態では、ライブラリー中の任意の２つ以上の識別可能な核酸バーコードを核酸シーケンシング法により識別及び／又は同定することができる。一部の実施形態では、２つ以上の識別可能な核酸バーコードは、ハイブリダイゼーション法によって識別及び／又は同定することができる。
一部の実施形態では、様々な供給源又はサンプルから得られた核酸のライブラリーは、様々な識別可能な核酸バーコードを含む。一部の実施形態では、ライブラリーの各識別可能な核酸バーコードを用いて、混合ライブラリーの各核酸の供給源を同定することができる。例えば、様々な供給源から得られた核酸のライブラリーは、第１及び／若しくは第２の識別可能な核酸バーコードを含む第１の対象から得られた核酸の第１のライブラリー、第３及び／若しくは第４の識別可能な核酸バーコードを含む第２の対象から得られた核酸の第２のライブラリー、第５及び／若しくは第６の識別可能な核酸バーコードを含む第３の対象から得られた核酸の第３のライブラリー、第７及び／若しくは第８の識別可能な核酸バーコードを含む第４の対象から得られた核酸の第４のライブラリーなどを含み得る。一部の実施形態では、単一の供給源から得られたライブラリーの各核酸は、１つ、２つ、３つ又は４つの識別可能な核酸バーコードを含み、各識別可能な核酸バーコードは、異なる配列を含み、各識別可能な核酸バーコードは、同じ供給源を重複して同定する。一部の実施形態では、様々なサンプルから得られた複数のライブラリーインサートを含む核酸ライブラリーは、少なくとも８つ、少なくとも１０、少なくとも１５、又は少なくとも２０の識別可能な核酸バーコードを含む。一部の実施形態では、核酸ライブラリー、例えば、様々なサンプル若しくは供給源から得られた複数のライブラリーインサートを含む核酸ライブラリーは、１０以上、２０以上、５０以上、又は１００以上の識別可能な核酸バーコードを含む。
一部の実施形態では、非ネイティブ核酸は、１つ又は複数の識別可能な核酸バーコードを含む。いくつかの実施形態では、非ネイティブ核酸は、１つ又は２つの識別可能な核酸バーコードを含む。いくつかの実施形態では、非ネイティブ核酸は、識別可能な核酸バーコードを含まない。一部の実施形態では、ライブラリーの各核酸は、（ｉ）ライブラリーインサート、（ｉｉ）第１の非ネイティブ核酸、（ｉｉｉ）第２の非ネイティブ核酸、及び（ｉｖ）識別可能な核酸バーコードを含み、第１の非ネイティブ核酸及び第２の非ネイティブ核酸は、ライブラリーインサートの反対側に位置し、第１の非ネイティブ核酸又は第２の非ネイティブ核酸は、識別可能な核酸バーコードを含む。一部の実施形態では、ライブラリーの各核酸は、（ｉ）ライブラリーインサート、（ｉｉ）第１の非ネイティブ核酸、（ｉｉｉ）第２の非ネイティブ核酸、（ｉｖ）第１の識別可能な核酸バーコード、及び（ｖ）第２の識別可能な核酸バーコードを含み、第１の非ネイティブ核酸及び第２の非ネイティブ核酸は、ライブラリーインサートの反対側に位置し、第１の非ネイティブ核酸は、第１の識別可能な核酸バーコードを含み、且つ第２の非ネイティブ核酸は、第２の識別可能な核酸バーコードを含む。
識別可能な核酸バーコードを含む非ネイティブ核酸は、多くの場合、識別可能な核酸バーコードの一端又は両端に隣接する１つ又は２つの部分を含む。一部の実施形態では、識別可能な核酸バーコードの一端に隣接する非ネイティブ核酸の部分は、識別可能な核酸バーコード配列のいずれのヌクレオチドも含まない。一部の実施形態では、識別可能な核酸バーコードの一端に隣接する非ネイティブ核酸の部分は、識別可能な核酸バーコード配列の１つ、２つ又は３つの連続したヌクレオチドを含み、それらの１つ、２つ又は３つの連続したヌクレオチドは、識別可能な核酸バーコード配列の上記末端に位置する。識別可能な核酸バーコードの一端に隣接する非ネイティブ核酸の部分は、多くの場合、識別可能な核酸バーコードの一端の５’又は３’側に位置する、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４５ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３５ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、５〜２５ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド又は５〜１５ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、識別可能な核酸バーコードの一端に隣接する非ネイティブ核酸の部分は、識別可能な核酸バーコードの一端から０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチドに位置する。一部の実施形態では、識別可能な核酸バーコードの一端に隣接する非ネイティブ核酸の部分は、識別可能な核酸バーコードの上記末端と１、２又は３ヌクレオチドだけ重複する。
結合ペア
一部の実施形態では、本明細書に記載する組成物又は方法は、１つ又は複数の結合ペアを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、結合ペアの１つ又は複数のメンバーを含む。一部の実施形態では、結合ペアは、互いに非共有結合する少なくとも２つのメンバー（例えば、分子）を含む。結合ペアのメンバーは、多くの場合、互いに特異的に結合する。結合ペアのメンバーは、多くの場合、互いに可逆的に結合し、例えば、結合ペアの２つのメンバーの会合は、好適な方法によって解離することができる。任意の好適な結合ペア、又はそのメンバーを本明細書に記載の組成物又は方法に使用することができる。結合ペアの非限定的例として、相補的核酸、抗体／抗原、抗体／抗体、抗体／抗体断片、抗体／抗体受容体、抗体／プロテインＡ若しくはプロテインＧ、ハプテン／抗ハプテン、スルフヒドリル／マレイミド、スルフヒドリル／ハロアセチル誘導体、アミン／イソトリオシアネート、アミン／スクシンイミジルエステル、アミン／スルホニルハロゲン化物、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、受容体／リガンド、ビタミンＢ１２／内因子、その類似体、その誘導体、その結合部分など、又はそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、結合ペアは、金属又は磁気材料及び磁石を含む。結合ペアのメンバーの非限定的例として、抗体、抗体断片、還元抗体、化学修飾抗体、抗体受容体、抗原、ハプテン、抗ハプテン、ペプチド、タンパク質、核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、若しくはＲＮＡ）、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体若しくは誘導体（例えば、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ））、アルキル部分（例えば、メチル化ＤＮＡ若しくはメチル化ヒストン上のメチル部分）、アルカノイル部分（例えば、アセチル化タンパク質のアセチル基（例えば、アセチル化ヒストン））、アルカン酸若しくはアルカン酸部分（例えば、脂肪酸）、グリセリル部分（例えば、脂質）、ホスホリル部分、グリコシル部分、ユビキチン部分、レクチン、アプタマー、受容体、リガンド、金属イオン、アビジン、ニュートラアビジン、ビオチン、Ｂ１２、内因子、その類似体、その誘導体、その結合部分など、又はそれらの組合せが挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、結合ペアの１メンバーは、ビオチン、又はその類似体若しくは誘導体を含み、ペアの他のメンバーは、アビジン、又はその類似体若しくは誘導体を含む。別の例において、いくつかの実施形態では、結合ペアの１メンバーは好適な金属（例えば、金属、金属ナノ粒子、鉄を含む支持体）を含み、他のメンバーは磁石を含む。
リンカー
一部の実施形態では、識別可能な識別子及び／又は結合ペアのメンバーは、リンカーにより、核酸と間接的に会合又は結合している。いくつかの実施形態では、識別可能な識別子は、リンカーにより、結合ペアのメンバーと間接的に会合又は結合している。リンカーは、識別可能な識別子及び／又は結合ペアのメンバーを核酸に又は互いに共有結合させるための機構を与えることができる。任意の好適なリンカーを本明細書に記載の組成物又は方法に使用することができる。好適なリンカーの非限定的例として、シラン、チオール、ホスホン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。リンカーを用いて、２つ以上の分子を結合する方法は、当技術分野で公知であり、「架橋結合」と呼ばれることもある。架橋結合の非限定的例として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ヒドロキシメチルホスフィン、オキシラン又は任意の他のカルボニル化合物と反応するアミン；カルボジイミドと反応するカルボキシル；マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、及び／又はビニルスルホンと反応するスルフヒドリル；ヒドラジンと反応するアルデヒド；ジアジリン及び／又はアジ化アリールと反応する任意の非選択性基；イソシアネートと反応するヒドロキシル；カルボニル化合物と反応するヒドロキシルアミンなど、並びにそれらの組合せが挙げられる。
核酸シーケンシング
いくつかの実施形態では、核酸シーケンシングを含むプロセスにより、核酸（例えば、アンプリコン；ライブラリーの核酸；単離、精製及び／又はキャプチャーされた核酸）を解析する。一部の実施形態では、核酸をシーケンシングしてもよい。一部の実施形態では、完全又は実質的に完全な配列が得られ、場合により部分的配列が得られる。
核酸をシーケンシングする任意の好適な方法を用いることができ、その非限定的例として、Ｍａｘｉｍ＆Ｇｉｌｂｅｒｔ、鎖終結法、合成によるシーケンシング、連結によるシーケンシング、質量分析によるシーケンシング、顕微鏡法による技術など、又はそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、第１世代の技術、例えば、マイクロ流体Ｓａｎｇｅｒシーケンシングなどの自動化Ｓａｎｇｅｒシーケンシング法を含むＳａｎｇｅｒシーケンシング法を本明細書で提供される方法で使用することができる。一部の実施形態では、核酸イメージング技術（例えば、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）及び原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ））の使用を含むシーケンシング技術を使用することができる。一部の実施形態では、ハイスループットシーケンシング法を使用する。ハイスループットシーケンシング法は、一般に、クローン増幅されたＤＮＡ鋳型又は単一ＤＮＡ分子を含み、これらは、場合により、フローセル内において大規模並列方式でシーケンシングされる。大規模並列方式でＤＮＡをシーケンシングすることができる次世代（例えば、第２及び第３世代）シーケンシング技術を本明細書に記載する方法に使用することができ、これらは、本明細書において、集合的に「大規模並列シーケンシング」（ＭＰＳ）又は「大規模並列核酸シーケンシング」と呼ばれる。一部の実施形態では、ＭＰＳシーケンシング法は、標的化アプローチを使用し、このアプローチでは、目的とする特定の染色体、遺伝子又は領域から配列リードを生成する。目的とする特定の染色体、遺伝子又は領域は、本明細書において標的ゲノム領域と呼ばれることもある。いくつかの実施形態では、非標的化アプローチが使用され、このアプローチでは、サンプル中の大部分又は全ての核酸断片をランダムにシーケンシングし、増幅し、及び／又はキャプチャーする。
ＭＰＳシーケンシング法は、合成及び特定のイメージングプロセスによるシーケンシングを使用する場合もある。本明細書に記載する方法に使用することができる核酸シーケンシング技術は、合成によるシーケンシング及び可逆的ターミネータシーケンシング（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ’ｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ；ＨＩＳＥＱ ２０００；ＨＩＳＥＱ ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ））である。この技術を用いて、数百万の核酸（例えば、ＤＮＡ）断片を並行してシーケンシングすることができる。このタイプのシーケンシング技術の一例では、８〜１６の個別のレーンを備える光透過性スライドを含み、これらスライドの表面にオリゴヌクレオチドアンカー（例えば、アダプタープライマー）が結合されている、フローセルを使用する。
合成によるシーケンシングは、一部の実施形態において、プライマー又は既存の核酸鎖に、ヌクレオチドを鋳型特異的に繰り返し付加する（例えば、共有結合的付加により）ステップを含む。ヌクレオチドの反復付加は毎回検出され、このプロセスは、核酸鎖の配列が得られるまで複数回繰り返される。得られる配列の長さは、部分的に、実施される付加及び検出ステップの数に応じて変動する。合成によるシーケンシングの一部の実施形態では、同じタイプの１つ、２つ、３つ又はそれを超えるヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ若しくはＴ）を付加し、ヌクレオチド付加の１ラウンド毎に検出する。ヌクレオチドは、任意の好適な方法により（例えば、酵素又は化学的に）付加することができる。例えば、一部の実施形態では、ポリメラーゼ又はリガーゼは、プライマー又は既存の核酸鎖に、ヌクレオチドを鋳型特異的に付加する。合成によるシーケンシングの一部の実施形態では、異なるタイプのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及び／又は識別子を使用する。一部の実施形態では、可逆的ターミネータ及び／又は除去可能な（例えば、切断可能な）識別子を使用する。一部の実施形態では、蛍光標識ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を使用する。いくつかの実施形態では、合成によるシーケンシングは、切断（例えば、識別子の切断及び除去）並びに／又は洗浄ステップを含む。一部の実施形態では、１つ又は複数のヌクレオチドの付加は、本明細書に記載されるか又は当技術分野で公知の好適な方法により検出し、その非限定的例として、任意の好適なイメージ装置若しくは機械、好適なカメラ、デジタルカメラ、ＣＣＤ（電荷結合素子）によるイメージング装置（例えば、ＣＣＤカメラ）、ＣＭＯＳ（相補金属酸化シリコン）によるイメージング装置（例えば、ＣＭＯＳカメラ）、フォトダイオード（例えば、光電子増倍管）、電子顕微鏡法、電界効果トランジスタ（例えば、ＤＮＡ電界効果トランジスタ）、ＩＳＦＥＴイオンセンサー（例えば、ＣＨＥＭＦＥＴセンサー）など、又はそれらの組合せが挙げられる。本明細書の方法を実施するために用いることができるその他のシーケンシング方法には、デジタルＰＣＲ及びハイブリダイゼーションによるシーケンシングがある。
本明細書に記載の方法を実施するための好適なＭＰＳ法、システム又は技術プラットフォームを用いて、核酸シーケンシングリードを取ることができる。ＭＰＳプラットフォームの非限定的例として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘ／ＨｉＳｅｑ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ’ｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ；ＨＩＳＥＱ ２０００；ＨＩＳＥＱ）、ＳＯＬｉＤ、Ｒｏｃｈｅ／４５４、ＰＡＣＢＩＯ及び／又はＳＭＲＴ、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ及びＩｏｎ半導体によるシーケンシング（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより開発されたものなど）、ＷｉｌｄＦｉｒｅ、５５００、５５００ｘｌ Ｗ及び／又は５５００ｘｌ Ｗ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒによる技術（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより開発及び販売されているものなど、米国特許出願公開第２０１３００１２３９９号明細書）；Ｐｏｌｏｎｙシーケンシング、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、大規模並列シグネチャーシーケンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）シーケンシング、ＬａｓｅｒＧｅｎシステム及び方法、Ｎａｎｏｐｏｒｅによるプラットフォーム、化学物質感受性電界効果トランジスタ（ＣＨＥＭＦＥＴ）アレイ、電子顕微鏡法によるシーケンシング（例えば、ＺＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈａｌｃｙｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒにより開発されているものなど）、ナノボールシーケンシングなどが挙げられる。
本明細書の方法を実施するために使用することができる他のシーケンシング法として、デジタルＰＣＲ及びハイブリダイゼーションによるシーケンシングが挙げられる。デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲ又はｄＰＣＲ）を用いて、サンプル中の核酸を直接同定及び定量することができる。デジタルＰＣＲは、一部の実施形態において、エマルジョン中で実施することができる。例えば、個別の核酸を、例えば、マイクロ流体チャンバ装置内で分離し、各核酸を個別にＰＣＲによって増幅する。ウェル毎に１つの核酸のみが存在するように、核酸を分離することができる。一部の実施形態では、異なるプローブを用いて様々な対立遺伝子（例えば、胎児対立遺伝子及び母性対立遺伝子）を識別することができる。対立遺伝子を数えることにより、コピー数を決定することができる。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションによるシーケンシングを用いることができる。この方法は、複数のポリヌクレオチド配列を複数のポリヌクレオチドプローブと接触させるステップを含み、その際、複数のポリヌクレオチドプローブの各々を任意選択で支持体に係留することができる。支持体は、一部の実施形態において、既知のヌクレオチド配列のアレイを含む平坦な表面であってよい。アレイとのハイブリダイゼーションのパターンを用いて、サンプル中に存在するポリヌクレオチドを決定することができる。一部の実施形態では、各プローブをビーズ、例えば、磁気ビーズなどに係留する。ビーズとのハイブリダイゼーションを同定し、これを用いてサンプル内の複数のポリヌクレオチド配列を同定することができる。
一部の実施形態では、染色体特異的シーケンシングを実施する。一部の実施形態では、染色体特異的シーケンシングは、ＤＡＮＳＲ（選択領域のデジタル解析）を用いて実施する。選択領域のデジタル解析は、ＰＣＲ鋳型を形成する介在「架橋」オリゴヌクレオチドを介した２つの遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドのＤＮＡ依存的連鎖化により、数百の遺伝子座の同時定量を可能にする。一部の実施形態では、染色体特異的シーケンシングは、染色体特異的配列が豊富なライブラリーを生成することによって実施する。一部の実施形態では、選択した染色体のセットのみについて配列リードが得られる。
コンペティター核酸
コンペティター核酸は、多くの場合、ハイブリダイゼーションプロセスの前に付加して、不要且つ非特異的なハイブリダイゼーション事象を低減する。コンペティター核酸は、反復核酸を含んでもよい。反復内因性核酸、例えば、Ａｌｕ配列又はＬＩＮＥ配列は、核酸ライブラリー中に存在することが多い。場合により、内因性反復核酸は、互いにハイブリダイズして、キャプチャーされたハイブリダイゼーション混合物の汚染をもたらす。このタイプの汚染は、ハイブリダイゼーションの前に、過剰量の外性コンペティター核酸を付加することにより、部分的に低減することができる。任意の好適なコンペティター核酸を本明細書に記載の組成物又は方法に使用することができる。一部の実施形態では、コンペティター核酸は、Ａｌｕ、ＬＩＮＥ、及び核酸ライブラリーに存在するその他の反復配列に結合することができるＣ０ｔ−１ＤＮＡを含む。Ｃ０ｔ−１ＤＮＡは、好適な生物から得ることができ、様々な生物由来の核酸の混合物を含んでもよい。Ｃ０ｔ−１ＤＮＡは、１生物の好適な組織から得ることができる。Ｃ０ｔ−１ＤＮＡは、胎盤から単離された核酸を含むこともある。
ブロッキング核酸
本明細書では、一部の態様において、改善されたブロッキング方法及び組成物が提示される。多くの場合、ハイブリダイゼーション事象により、ハイブリッドキャプチャー法の完了後の濃縮された核酸プールに不要な核酸が混入する。不要な配列の大きい画分は、アダプター連結ライブラリーインサートの末端アダプター配列の同一部分（例えば、バーコード、フローセルアンカー及び／又はプライマーと相補的な部分など）間の不要なハイブリダイゼーション事象に起因する場合がある。場合により、不要なライブラリーインサートは、その末端アダプターを介して互いにアニーリングすることができ、これにより、そうでなければ不要なＤＮＡ断片間が連結され、一緒に単離される「デイジーチェーン」を形成する。このようにして、単一の所望の断片のキャプチャーは、多数の不要な断片をもたらす恐れがあり、これにより濃縮方法の全体的効率が低下する。
一部の実施形態では、いわゆる「デイジーチェーン」効果及びその他の不要なハイブリダイゼーション事象は、ライブラリーの非ネイティブ核酸（例えば、アダプター配列）の部分とハイブリダイズするように指令されたブロッキング核酸を使用することにより低減することができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知であり、多くの場合、ライブラリーのバーコード配列に結合し、且つそれらのハイブリダイゼーションを阻止するように立体配置されている。従来のブロッキングオリゴヌクレオチドは、多くの場合に長さが５０核酸以上であり、バーコード配列と、さらに核酸バーコードの両側にフランキングする合成核酸部分ともハイブリダイズするように立体配置されている。このように、従来のブロッキングオリゴヌクレオチドは、相対的に長い（例えば、＞５０ヌクレオチド）ため、バーコード領域及びフランキングする非ネイティブ配列とアニーリングし得、且つブロッキングオリゴヌクレオチドとその標的配列間の高い融解温度を確実にし得る。一部の実施形態では、本明細書の方法は、１つ又は複数のブロッキング核酸（例えば、従来のブロッキング核酸）の使用を用いる。
一部の実施形態では、多数のアダプター連結ライブラリーが混合されるマルチプレックスシーケンシングアプローチのために、各々が各ライブラリーの多くの異なるアダプターに特異的であるブロッキング核酸の多数のセットを合成しなければならない。従って、ハイスループットマルチプレックスシーケンシング反応は、多くの場合、８つ、１０、１５、若しくは２０以上の異なるバーコード配列を必要とし、これには、ユニークなバーコード配列の各々とそれぞれ結合するように立体配置されている、８つ、１０、１５、若しくは２０以上のブロッキングオリゴヌクレオチドの合成が必要である。この戦略は、混合ライブラリーのマルチプレックスシーケンシングのために、比較的長い長さの多数の異なるブロッキングオリゴヌクレオチドを設計及び合成しなければならないため、費用及び時間がかかる。
一部の実施形態では、ブロッキング核酸は、Ｕ−ブロック核酸である。一部の実施形態では、本明細書の組成物又は方法は、Ｕ−ブロック核酸（例えば、ユニバーサルブロッキング）核酸を含む。組成物のＵ−ブロック核酸は、実質的に同じでも又は実質的に異なっていてもよい。Ｕ−ブロック核酸は、従来のブロッキングオリゴに対していくつかの利点を有する。第１に、Ｕ−ブロック核酸は、核酸バーコード配列に実質的にハイブリダイズせず、また、Ｕ−ブロック核酸は、核酸バーコード配列とハイブリダイズするように立体配置されてもいない。従って、８つ、１０、１５、若しくは２０以上の異なるバーコード配列を含む複合核酸ライブラリーの操作、キャプチャー及びマルチプレックスシーケンシングは、ユニークなバーコード配列の各々全てに特異的なＵ−ブロック核酸を必要としない。また、Ｕ−ブロック核酸は、従来のブロッキングオリゴヌクレオチドと比較して比較的短いため、Ｕ−ブロック核酸の核酸合成がさらに経済的になる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＵ−ブロック核酸は、４５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、又は１０ヌクレオチド以下の公称、平均、中間又は絶対長さを有する。一部の実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、８〜約４０、８〜約３５、８〜約３０、８〜約２５又は８〜約２０ヌクレオチドの公称、平均、中間又は絶対長さを有する。Ｕ−ブロック核酸は、任意の好適な核酸、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含んでもよい。一部の実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、合成（例えば、人の手で合成された）である。Ｕ−ブロック核酸は、オリゴヌクレオチドであってよい。
Ｕ−ブロック核酸は、多くの場合、不要なハイブリダイゼーション及び／又はそれに続く核酸ライブラリーの非ネイティブ部分の増幅を阻止するように立体配置されている。いくつかの実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、バーコード核酸とフランキングする合成核酸領域（非ネイティブ核酸領域）とハイブリダイズするように立体配置されている。従って、本明細書の組成物は、多くの場合、識別可能な核酸バーコードの反対側とハイブリダイズするように立体配置された少なくとも２つのＵ−ブロック核酸を含む。バーコード核酸配列とフランキングする合成核酸領域は、多くの場合に比較的短い（例えば、４５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、又は１０ヌクレオチド以下）ため、Ｕ−ブロック核酸がハイブリダイズするのに比較的短い核酸区間を提供する。本明細書において本発明者らにより開発されたＵ−ブロック核酸の初期プロトタイプは、標準ヌクレオチド塩基のみで構成されており、不要なハイブリダイゼーション事象を阻止するには非効率的であった。Ｕ−ブロック核酸の核酸塩基の一部又は全部を修飾することにより、効率及び阻止能力を実質的に増大することができた。従って、一部の実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、部分的に、Ｕ−ブロック核酸のＴｍを高める非標準又は修飾核酸塩基を含有することより、より高い融解温度を含むように立体配置されている。一部の実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、グアニン、シトシン、チミン、アデニン及びウラシルから選択される標準ヌクレオチドから構成される類似配列の非修飾Ｕ−ブロック核酸のＴｍより高いＴｍを含む。任意の好適な修飾を用いて、Ｕ−ブロック核酸のＴｍを高めることができる。一部の実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及び／又は修飾ヌクレオチド結合を含み、その非限定的例として、ロックド核酸（ＬＮＡ、例えば、二環式核酸）、架橋核酸（ＢＮＡ、例えば、拘束核酸）、Ｃ５−修飾ピリミジン塩基（例えば、中でも、５−メチル−ｄＣ、プロピニルピリミジン）並びに代替骨格化学、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノなど、又はそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、架橋核酸は、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。任意の好適なＢＮＡを本明細書に記載の組成物又は方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、ＢＮＡモノマーは、５員、６員、又は７員架橋構造を含み得る。新世代ＢＮＡモノマーの非限定的例として、２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＨ］、２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＭｅ］、及び２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＢｎ］が挙げられる。また、Ｔｍ（又は結合親和性）を高めるために、非塩基修飾因子をＵ−ブロック核酸に組み込むこともでき、その非限定的例として、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）、スペルミン、Ｇクランプ、Ｕａｑアントラキノンキャップなど、又はそれらの組合せが挙げられる。ＢＮＡヌクレオチドモノマーと末端ＭＧＢ基との組合せなど、２つ以上のタイプのＴｍ増加修飾をＵ−ブロック核酸に使用することができる。相補的核酸のＴｍを高める多くの方法が当業者には周知であり、全てのこのような修飾の使用は、本明細書において本発明の範囲に含まれるとみなされる。一部の実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、又は少なくとも８０℃の融解温度（Ｔｍ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、ライブラリーの１つ又は複数の非ネイティブ核酸と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている。非ネイティブ核酸は、多くの場合に合成核酸配列を含む。一部の実施形態では、非ネイティブ核酸は、ゲノムＤＮＡ、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はそれらの部分を含まない。一部の実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、ライブラリーの１つ又は複数のアンプリコンと特異的にハイブリダイズするように立体配置され、１つ又は複数のアンプリコンは、合成核酸（例えば、１つ又は複数のアダプター配列、キャプチャー配列又はプライマー結合部位）を含む。一部の実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、１つ若しくは複数のアダプター又はそれらの部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている。いくつかの実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、ライブラリーインサートとハイブリダイズするように立体配置されていない。いくつかの実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、ライブラリーインサートと実質的にハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、核酸バーコードとハイブリダイズするように立体配置されておらず、バーコード配列の実質的部分と相補的ではない。いくつかの実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、核酸バーコード又は核酸バーコードのいずれの部分とも実質的にハイブリダイズしない。
Ｕ−ブロック核酸は、多くの場合、非ネイティブ核酸と実質的に相補的な核酸配列を含むか、又はそれから構成される。Ｕ−ブロック核酸は、核酸ライブラリーの１つ又は複数の非ネイティブ核酸と特異的にハイブリダイズするように立体配置されていることもある。一部の実施形態では、ライブラリーの各核酸は、１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれを超える）の非ネイティブ核酸を含み、これらの非ネイティブ核酸は、ライブラリーの核酸の各々に共通である（例えば、共有されている）。例えば、核酸ライブラリーは、２つ以上のサンプルから生成することができ、各サンプルから得られた核酸は、アダプター配列に組み込まれたユニークな識別可能なバーコード配列を含み、及びアダプターは、１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれを超える）の同一の非ネイティブ核酸（例えば、合成核酸、ユニバーサル核酸配列）を含む。実質的に同一で、ライブラリーの核酸間で共有される非ネイティブ核酸は、ユニバーサル核酸と呼ばれることもある。Ｕ−ブロック核酸は、多くの場合、ユニバーサル核酸配列（例えば、アダプター又はその部分）と実質的に相補的であり、それらと特異的にハイブリダイズするように立体配置されている。
一部の実施形態では、Ｕブロック核酸は、ポリメラーゼにより伸長を阻止するように立体配置されている。一部の実施形態では、Ｕ−ブロック核酸は、ポリメラーゼによりＵブロック核酸の伸長を阻止するように立体配置されている。例えば、Ｕブロック核酸は、ポリメラーゼが、Ｕ−ブロック核酸の３’末端を伸長するのを妨げる（例えば、ホスホジエステル結合を形成することにより）好適な３’鎖ターミネータ（例えば、２’，３’ジデオキシヌクレオチド）又は好適な官能基を含んでもよい。従って、ポリメラーゼによる伸長を阻止するように立体配置されるＵブロック核酸は、多くの場合、ポリメラーゼがＵ−ブロック核酸の３’末端を伸長するのを妨げる好適な３’鎖ターミネータ（例えば、２’，３’ジデオキシヌクレオチド）又は好適な官能基を含む。従って、いくつかの実施形態では、Ｕブロック核酸は、ポリメラーゼによる増幅（例えば、ＰＣＲ）又は伸長に好適な核酸プライマーではない。
一部の実施形態では、本明細書の組成物は、様々なサンプルから得られる１つ又は複数の核酸ライブラリー（例えば、複数のライブラリーインサート）と、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、又は１０以上のユニークな識別可能なバーコードを含む。いくつかの実施形態では、このような組成物は、各々がライブラリーの各核酸の非ネイティブ核酸、又はその部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている４つ以下、場合により、８つ以下のＵブロック核酸を含む。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ若しくは８つのＵブロック核酸及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ若しくは８つ以下のＵ−ブロック核酸を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の組成物は、２〜４つ、２〜６つ、２〜８つ、又は４〜８つのブロック核酸を含む。一部の実施形態では、本明細書の組成物は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ若しくは８つのＵブロック核酸を含み、（ｉ）Ｕブロック核酸の各々は、第１及び／又は第２の非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的であり、（ｉｉ）Ｕブロック核酸の少なくとも１つは、識別可能な核酸バーコードの第１の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されており、（ｉｉｉ）Ｕブロック核酸の少なくとも１つは、識別可能な核酸バーコードの第２の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されており、且つ（ｉｖ）Ｕブロック核酸の各々は、識別可能な核酸バーコードのいずれの部分とも実質的にハイブリダイズしない。
一部の実施形態では、Ｕブロック核酸は、識別可能な核酸バーコードの一端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されている。一部の実施形態では、識別可能な核酸バーコードの一端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されているＵブロック核酸は、識別可能な核酸バーコードに隣接して位置する非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的であるＵブロック核酸を指す。Ｕブロック核酸は、往々にして、識別可能な核酸バーコードを含むライブラリーの非ネイティブ核酸とハイブリダイズするように立体配置されており、Ｕブロック核酸は、バーコード配列の反対側とハイブリダイズするように立体配置されている。従って、Ｕブロック核酸が、識別可能な核酸バーコードを含むライブラリーの非ネイティブ核酸とハイブリダイズするとき、ハイブリダイズしたＵブロック核酸は、バーコードの両側の識別可能な核酸バーコードとフランキングする。いくつかの実施形態では、Ｕブロック核酸は、バーコード配列のいずれの部分とも実質的にハイブリダイズしない。一部の実施形態では、ハイブリダイズしたＵブロック核酸は、バーコード配列と１、２、３、４、５又は６ヌクレオチドだけ重複し得る。従って、いくつかの実施形態では、バーコード配列と実質的にハイブリダイズしないＵブロック核酸は、バーコード配列の小さい部分（例えば、６ヌクレオチド以下）とハイブリダイズし得る。
一部の実施形態では、本明細書の組成物は、４つ以下のＵブロック核酸を含む。組成物のＵブロック核酸は同じであってよい。例えば、組成物がＵブロック核酸を含む場合、Ｕブロック核酸の各々の核酸配列は、実質的に同一（例えば、実質的に同じ）であってよい。一部の実施形態では、組成物は４つのＵブロック核酸を含み、Ｕブロック核酸の各々の核酸配列は実質的に異なる。
キャプチャー核酸
一部の実施形態では、本明細書の組成物又は方法は、キャプチャー核酸を含む。キャプチャー核酸は、多くの場合、核酸部分を含む。一部の実施形態では、キャプチャー核酸は、標的核酸と特異的にハイブリダイズするように立体配置されており、キャプチャー核酸及びそのハイブリダイズした標的は、好適な技術により（例えば、プルダウン法により）キャプチャーすることができる。本明細書の方法又は組成物に、任意の好適なキャプチャー核酸又はキャプチャー核酸のセットを用いることができる。一部の実施形態では、キャプチャー核酸はオリゴヌクレオチドである。
キャプチャー核酸は、往々にして、結合ペアの好適なメンバーと直接又は間接的に結合（例えば、共有若しくは非共有結合）している。いくつかの実施形態では、キャプチャー核酸は、結合ペアの好適なメンバーを含む。一部の実施形態では、結合ペアのメンバーは、キャプチャー核酸とリンカーにより結合している。
結合ペアのメンバーを含むキャプチャー核酸は、好適なキャプチャー方法を用いて、ハイブリダイズした核酸標的と一緒にキャプチャーする（例えば、キャプチャー法によりキャプチャーする）ことができる。核酸を（例えば、キャプチャー法により）キャプチャーするプロセスは、多くの場合、キャプチャーされた核酸（例えば、キャプチャーされた核酸）を提供する。本明細書で使用されるとき、「キャプチャーされた」及び「濃縮された」という用語は、キャプチャー方法実施前のサンプルに比べて少ない核酸種を含む、提供される核酸又は核酸のサブセットを指し得る。キャプチャーされた核酸を含む組成物は、他の（例えば、不要な）核酸種を約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％超含有しない可能性がある。一部の実施形態では、キャプチャーされた核酸は濃縮核酸を含む。濃縮核酸は、濃縮又はキャプチャー方法の適用前の１つ又は複数の核酸種の量と比較して少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍若しくは１０００倍濃縮された１つ又は複数の核酸種の量を含み得る。キャプチャー方法の非限定的例として、プルダウン法（例えば、重力プルダウン法、遠心分離プルダウン法、磁気プルダウン法）、免疫沈降及び様々なカラム精製方法が挙げられる。キャプチャーされた核酸の単離及び／又は精製は、往々にして、結合ペアの第１のメンバー（例えば、キャプチャー核酸と結合した）と結合ペアの第２のメンバー（例えば、支持体と結合した）との会合を必要とする。キャプチャー核酸は、場合により、第２のメンバーと強力に結合及び／又は会合するように立体配置される結合ペアの第１のメンバーと結合し、第２のメンバーは、場合により、好適な支持体と結合する。一部の実施形態では、キャプチャー核酸は、支持体を含む結合ペアの第１のメンバーと結合する。一部の実施形態では、キャプチャー核酸は、支持体と間接的に会合する（例えば、リンカー又は中間結合分子、例えば、抗体により）。一部の実施形態では、キャプチャー核酸は、磁気支持体（例えば、磁気ビーズ、鉄含有ビーズ）を含む結合ペアの第１のメンバーに結合し、結合ペアの第２のメンバーは磁石である。磁石及び磁気材料を用いて、キャプチャー核酸及びその結合標的をキャプチャー（例えば、プルダウン）することができる。
一部の実施形態では、核酸及び／又はアンプリコン（例えば、ライブラリーの核酸及び／又はアンプリコン）をキャプチャー核酸と接触させる。いくつかの実施形態では、方法は、ライブラリーの核酸、ブロッキング核酸及び任意の１つ又は複数のコンペティター核酸を含む混合物をキャプチャー核酸と接触させるステップを含む。キャプチャー核酸及びキャプチャー核酸を製造する方法は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、キャプチャー核酸を用いて、２つ以上、１０以上、５０以上、若しくは１００以上の対象、サンプル又は供給源から得られた複数のライブラリーインサートを含む核酸のライブラリーから目的とする核酸のサブセットをキャプチャーする。
キャプチャー核酸は、ライブラリーの１つ又は複数の核酸（例えば、選択された核酸、標的核酸、目的とする核酸）の部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置された核酸であってよい。一部の実施形態では、ライブラリーの１つ又は複数の核酸の一部と特異的にハイブリダイズするように立体配置されたキャプチャー核酸は、ライブラリーの核酸の好適な部分と実質的に相補的である。一部の実施形態では、キャプチャー核酸は、非ネイティブ核酸の部分又はその部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている。一部の実施形態では、キャプチャー核酸は、アダプターの部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている。一部の実施形態では、キャプチャー核酸は、１つ又は複数のライブラリーインサートの部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている。キャプチャー核酸は、プロモータ、エンハンサー、イントロン、エキソン、ポリＡセグメント、ポリＴセグメント、任意の好適な翻訳若しくは転写制御配列など、又はそれらの組合せとハイブリダイズするように立体配置することができる。キャプチャー核酸のセットは、遺伝子のサブセット（例えば、染色体の遺伝子のセット、例えば、酵素のファミリーを発現する遺伝子のセット）又はライブラリーの核酸の任意のサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置することができる。一部の実施形態では、キャプチャー核酸のセットは、遺伝的変異（例えば、欠失、挿入、ＳＮＰなど）を含むことが疑われる１つ又は複数のゲノム領域で、又はその付近でハイブリダイズするように立体配置されている。第２の核酸と特異的にハイブリダイズするように立体配置される核酸は、多くの場合、第２の核酸と実質的に相補的である。キャプチャー核酸は、多くの場合、１つ又は複数の核酸標的の部分（例えば、ライブラリーの核酸のサブセット）と実質的に相補的である。
一部の実施形態では、方法は、核酸のライブラリー、ブロッキング核酸、キャプチャー核酸及び任意選択でコンペティター核酸を含むか、又はそれから本質的に構成される混合物を調製するステップを含み、この混合物をキャプチャー法に付す。例えば、一部の実施形態では、ストレプトアビジンビーズを添加し、キャプチャー核酸と会合した（例えば、キャプチャー核酸とハイブリダイズした）混合物の核酸を回収する（例えば、遠心分離、濾過、免疫沈降及び／又は磁気沈降により）。一部の実施形態では、洗浄ステップ（例えば、エタノールでの洗浄により）を使用する。キャプチャーされた核酸（例えば、ハイブリダイズした標的）は、好適な方法を用いて、キャプチャー核酸から溶離することができる。
一部の実施形態では、いくつかの方法又は方法のステップは、結合ペア（例えば、結合ペアの両メンバー）の非存在下で実施する。例えば、混合物は、多くの場合、キャプチャー核酸と結合ペアの第１のメンバー（例えば、キャプチャー核酸に結合した）とを含み、混合物は、結合ペアの第２のメンバー（例えば、第１のメンバーと特異的に結合するように立体配置された第２のメンバー）を含まない。一部の実施形態では、ライブラリーの核酸をブロッキング核酸、結合ペアの第１のメンバーを含むキャプチャー核酸、及び／又はコンペティター核酸と、結合ペアの第２のメンバーの非存在下で接触させる。一部の実施形態では、ライブラリーの核酸、ブロッキング核酸、結合ペアの第１のメンバーを含むキャプチャー核酸、及び／又はコンペティター核酸を含む混合物は、結合ペアの第２のメンバーの非存在下で精製する。一部の実施形態では、ライブラリーの核酸、ブロッキング核酸、結合ペアの第１のメンバーを含むキャプチャー核酸、及び／又はコンペティター核酸を含む混合物は、結合ペアの第２のメンバーの非存在下、好適なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズされる。
一部の実施形態では、キャプチャー核酸を好適な支持体と直接又は間接的に結合（例えば、共有若しくは非共有結合）させる。いくつかの実施形態では、結合ペアのメンバーを好適な支持体と直接又は間接的に結合（例えば、共有若しくは非共有結合）させる。任意の好適な支持体を用いることができる。いくつかの実施形態では、支持体は、表面（例えば、フローセルの表面、チューブの表面、チップの表面）、例えば、金属表面（例えば、鋼、金、銀、アルミニウム、ケイ素及び銅）を含む。一部の実施形態では、支持体（例えば、支持体表面）は被覆され、並びに／又は官能基及び／若しくは不活性材料を含む。いくつかの実施形態では、支持体は、例えば、ビーズ、チップ、キャピラリー、プレート、膜、ウエハー（例えば、シリコンウエハー）、コーム、又はピンを含む。一部の実施形態では、支持体は、ビーズ及び／又はナノ粒子を含む。支持体は、好適な材料から製造することができ、その非限定的例として、プラスチック又は好適なポリマー（例えば、ポリカーボネート、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ジビニルベンゼン）、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエステル、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリプロピレンなど）、ホウケイ酸塩、ガラス、ナイロン、ワング（Ｗａｎｇ）樹脂、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂、金属（例えば、鉄、合金）、セファロース、アガロース、ポリアクリルアミド、デキストラン、セルロースなど、又はそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、支持体は、磁気材料（例えば、鉄、ニッケル、コバルト、白金、アルミニウムなど）を含む。いくつかの実施形態では、支持体は、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）、赤鉄鉱、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ）を含む。磁石を用いて、特定の支持体（例えば、金属又は磁気材料を含む支持体）に結合した核酸を精製及び／又はキャプチャーすることができる。
いくつかの実施形態では、キャプチャー核酸及びキャプチャー核酸と特異的にハイブリダイズする核酸（例えば、標的核酸）は、好適なキャプチャー法によってキャプチャーされ、それにより、キャプチャーされた核酸を取得する。キャプチャーするステップを含むプロセスは、多くの場合、濃縮された核酸（例えば、標的核酸について濃縮された核酸）を提供する。キャプチャーされた核酸は、多くの場合、１つ又は複数の種の核酸について濃縮されている。キャプチャーされた核酸は、１つ又は複数のキャプチャー核酸、キャプチャー核酸と特異的にハイブリダイズする核酸（例えば、ライブラリーのキャプチャーされた核酸、標的核酸、濃縮された核酸）、結合ペアのメンバー、及び／又は支持体を含み得る。キャプチャー核酸（標的核酸）と特異的にハイブリダイズする核酸は、好適な方法によって回収することができる。例えば、一部の実施形態では、キャプチャー法により濃縮された核酸は、変性（例えば、熱の適用）により、又はキャプチャーされた核酸を含む混合物の塩濃度を増減することにより、単離することができる。一部の実施形態では、キャプチャー法は、濃縮された核酸を回収するためのフィルタ、膜又はカラムの使用を含む。いくつかの実施形態では、重力及び／又は遠心分離を用いて核酸をキャプチャーし、及び／又は濃縮された核酸を回収する。いくつかの実施形態では、キャプチャー法は、遠心分離を使用しない。いくつかの実施形態では、磁石を用いて、濃縮された核酸をキャプチャー及び／又は回収する。支持体に結合した核酸は、多くの場合、非結合又は不要な材料を除去するために、好適な方法によって洗浄することができる。いくつかの実施形態では、洗浄液の緊縮性は、好適な方法によって調節することができる。
キャプチャーされた核酸、キャプチャー核酸と特異的にハイブリダイズする核酸、濃縮された核酸及び／又はそのアンプリコンは、好適な方法によって解析することができ、こうした方法は、例えば、核酸シーケンシング又は質量分析を含むプロセスを含み得る。
固定化
いくつかの実施形態では、核酸を固定化（例えば、支持体に固定化）する。任意の好適な方法により、核酸を固定化することができる。核酸は、直接又は間接的のいずれかで、好適な支持体若しくは材料に固定化することができる。支持体に固定化させる核酸は、支持体に共有又は非共有結合させてもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、支持体に可逆的に固定化し、好適な方法を用いて、支持体から解離又は除去することができる。一部の実施形態では、結合ペアの第１のメンバーを含む核酸は、支持体に結合又は会合した結合ペアの第２のメンバーと結合させることにより、支持体に固定化する。支持体に核酸を非特異的に固定化することができ、例えば、この支持体は、アニオン（例えば、アニオン交換基、例えば、正荷電官能基）を含む。いくつかの実施形態では、磁力によって核酸を支持体に固定化する。例えば、核酸は、磁気材料（例えば、金属）を含んでもよく、核酸は、磁石を用いて、支持体（例えば、チューブの部分、表面）に固定化することができる。いくつかの実施形態では、磁石は、溶液状ではなく、及び／又は磁気材料を含む核酸と直接接触していない。いくつかの実施形態では、磁石は、溶液状であり、核酸と会合した磁気材料と直接接触させる。一部の実施形態では、核酸は、共有結合の形成により、例えば、核酸の官能基（例えば、核酸類似体の官能基）を、反応基を含む支持体と架橋結合することにより固定化する。一部の実施形態では、支持体に結合（例えば、共有又は非共有結合）した別の核酸とハイブリダイズ（例えば、特異的にハイブリダイズ、アニーリング）させることにより、核酸（例えば、アンプリコン、ライブラリーの核酸、標的核酸）を支持体に固定化する。
核酸は、本明細書に記載する方法の任意の好適なステップで固定化することができる。一部の実施形態では、核酸をフローセル（例えば、フローセルの表面）又はアレイ（例えば、チップ）に固定化する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、核酸をフローセル又はチップに固定化するステップを含まない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、キャプチャー法が終了するまで、核酸をフローセル又はチップに固定化するステップを含まない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、例えば、核酸シーケンシングによる核酸の解析前に核酸をフローセル又はチップに固定化するステップを含まない。一部の実施形態では、ライブラリーの核酸（例えば、ライブラリーのアンプリコン）をアダプターと連結し、ブロッキング核酸と接触させ、キャプチャー核酸と接触させ、コンペティター核酸と接触させ、精製及び／又はハイブリダイズする（例えば、変性及びアニーリングプロセスに付す）が、前述したプロセスのいずれか若しくは全ての前又はその最中に、フローセル、アレイ若しくはチップに固定化しない。いくつかの実施形態では、ライブラリーの核酸（例えば、ライブラリーのアンプリコン）は、フローセル、アレイ若しくはチップの非存在下で、アダプターと連結し、ブロッキング核酸と接触させ、キャプチャー核酸と接触させ、コンペティター核酸と接触させ、精製及び／又はハイブリダイズする（例えば、変性及びアニーリングプロセスに付す）。
その他の核酸方法
一部の実施形態では、本明細書の方法は、後のハイブリダイゼーション及び／又はキャプチャーのために混合物を調製するステップを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の核酸ライブラリー（例えば、アンプリコン）の核酸を１つ若しくは複数のブロッキング核酸、１つ若しくは複数のキャプチャー核酸及び／又は１つ若しくは複数のコンペティター核酸と接触させるステップを含む方法で混合物を調製する。一部の実施形態では、変性させるステップ又はハイブリダイズするステップの前に混合物を調製する。本明細書に記載する方法により調製される混合物は、１つ若しくは複数の核酸ライブラリー（例えば、アンプリコン）、１つ若しくは複数のブロッキング核酸、１つ若しくは複数のキャプチャー核酸及び／又は１つ若しくは複数のコンペティター核酸を含み得る。本明細書に記載する方法により調製される混合物は、核酸のライブラリー、ブロッキング核酸及びキャプチャー核酸を含むか、又はそれから本質的に構成され得る。いくつかの実施形態では、調製混合物は、核酸のライブラリー、ブロッキング核酸、キャプチャー核酸及びコンペティター核酸を含むか、又はそれから本質的に構成される。核酸から本質的に構成される調製混合物は、水、ＥＤＴＡ、ＰＥＧ、ＮａＣｌ及び／又はバッファー（例えば、トリス若しくはＨＥＰＥＳ）を含有し得る。一部の実施形態では、核酸から本質的に構成される混合物は、ハイブリダイゼーションバッファーを含まない。いくつかの実施形態では、核酸の混合物を調製する方法は、ハイブリダイゼーションバッファーを添加するステップを含まない。いくつかの実施形態では、核酸から本質的に構成される調製混合物は、カルシウム又はマグネシウム塩を含有しない。一部の実施形態では、調製される核酸の混合物は、カルシウム又はマグネシウム塩、デタージェント（例えば、ＳＤＳ）、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、ＢＳＡ、又はポリビニルピロリドンを含有しない。一部の実施形態では、核酸から本質的に構成される混合物は、デタージェント（例えば、ＳＤＳ）、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、ＢＳＡ、又はポリビニルピロリドンを含有しない。
一部の実施形態では、本明細書に記載する通りに混合物を調製し、この混合物は、混合物の核酸を精製するまで加熱されない。例えば、混合物からの核酸の精製前及び／又は混合物の核酸を精製するまで、約７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃を超える温度、又は９５℃を超える温度に混合物を加熱しない。
遺伝的変異及び病状
本明細書に記載の組成物又は方法を用いて、遺伝的変異の存在又は非存在を決定することができる。遺伝的変異は、一般に、特定の個体に存在する特定の遺伝的表現型であり、多くの場合、遺伝的変異は、統計的に有意な個体の亜集団に存在する。一部の実施形態では、遺伝的変異は、染色体異常（例えば、異数性、１つ又は複数の染色体の重複、１つ又は複数の染色体の欠失）、部分的染色体異常又はモザイク現象（例えば、１染色体の１つ又は複数のセグメントの欠失又は獲得）、転位若しくは逆位である。遺伝的変異の非限定的例として、１つ又は複数の欠失、重複、挿入、突然変異、多型（例えば、一塩基多型）、融合、反復配列（例えば、短いタンデム反復配列）など、及びそれらの組合せが挙げられる。挿入、反復、欠失、重複、突然変異又は多型は、いずれの長さでもよく、一部の実施形態では、約１塩基又は塩基対（ｂｐ）〜約２５０メガ塩基対（Ｍｂ）の長さである。一部の実施形態では、挿入、反復、欠失、重複、突然変異又は多型は、約１塩基又は塩基対（ｂｐ）〜約５０，０００キロベース（ｋｂ）長（例えば、約１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、５００ｋｂ、１０００ｋｂ、５０００ｋｂ又は１０，０００ｋｂ長）である。
いくつかの実施形態では、ある対象について存在又は非存在が認められる遺伝的変異は、病状と関連する場合がある。病状の非限定的例として、知的障害に関連するもの（例えば、ダウン症候群）、異常な細胞増殖（例えば、癌）、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、ウィリアムズ症候群（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ランガー・ギデオン症候群（Ｌａｎｇｅｒ−Ｇｉｅｄｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アルフィ症候群（Ａｌｆｉ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ルトア症候群（Ｒｅｔｈｏｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ヤコブセン症候群（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、網膜芽細胞腫、スミス・マゲニス（Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ）症候群、エドワーズ症候群（Ｅｄｗａｒｄｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、乳頭状腎細胞癌、ディ・ジョージ症候群（ＤｉＧｅｏｒｇｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アンジェルマン症候群（Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、猫眼症候群（Ｃａｔ−Ｅｙｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、家族性大腸腺腫症、ミラー・ディカー症候群（Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、微生物核酸（例えば、ウイルス、細菌、真菌、酵母）の存在並びに子癇前症が挙げられる。
以下に記載する実施例は、いくつかの実施形態を例示するものであり、本技術を限定するわけではない。
実施例１：効率、費用低減、及びデータ品質向上のためのハイブリダイゼーションキャプチャーワークフローにおけるワークフローの進歩
本明細書に例示する新規の改良された方法は、下記の利点をもたらした。
１．磁気ビーズによるゼロ体積濃度を用いた、反応混合物の真空及び熱による濃縮の回避
２．反応速度増大のためのＤＮＡベイトの濃縮
３．ワークフロー改善のための短い核酸の濃縮
４．完了したハイブリダイゼーション反応物の変性
５．効率的且つ自動化可能なストレプトアビジンビーズ操作。
ハイブリダイゼーションキャプチャーアッセイの従来のプロトコル（例えば、Ｒｏｃｈｅ−ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ ＳｅｑＣａｐ ＥＺ Ｌｉｂｒａｒｙ ＳＲ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、２０１４年８月２０日、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｉｔ／０６５８８７８６００１＿ＳｅｑＣａｐＥＺＬｉｂｒａｒｙＳＲ＿ＵＧｕｉｄｅ＿ｖ４ｐ２．ｐｄｆでアクセスしたウェブサイトｐｄｆドキュメント）は、ハイスループット遺伝子試験方法と全く適合しない多くの操作を必要とした。本明細書で提供されるプロトコルは、費用を低減しながら、効率及びデータ品質の著しい向上を達成した。
従来のハイブリダイゼーション反応のセットアップは、３つの成分（ＤＮＡライブラリー、ブロッキングオリゴヌクレオチド、及びヒトＣｏｔ−１ＤＮＡ）を組み合わせた後、真空下で加熱しながら開放チューブの同時遠心分離により全液体を除去するための蒸発ステップ（当業者には、「Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ」として周知である）を必要とする。蒸発ステップは、部分的に、ハイブリダイゼーションバッファーを高濃度で添加しなければならず、初期３成分のさらなる希釈は許容できないことから必要であった。蒸発ステップは、とりわけ低速（＞１時間）であり、相互汚染を起こしやすいため、一般にハイスループット処理と適合性ではなかった。
新規のハイブリダイゼーション方法の説明については、以下の表１を参照されたい。
Figure 2017537609
本明細書に記載する新規方法の第１の態様は、核酸に非特異的に結合することができる磁気ビーズの使用を取り入れ、核酸材料を磁気ビーズ「ペレット」上で急速に濃縮し、これを適切な濃度のハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁させた。この改良されたプロセスは、少ない最終量中に同じ量のベイトを維持するため、全成分の濃度を維持しながら、反応速度を向上させた。
本明細書に記載する新規方法の第２の態様は、濃縮反応物中にビオチン化ＤＮＡキャプチャーベイトを含有させた。
新規方法の第３の態様は、短い一本鎖ＤＮＡベイト、及び短い一本鎖ブロッキングオリゴ（より長い二本鎖ライブラリー、及びＣｏｔ−１ＤＮＡに加えて）の効率的な精製を確実にするための精製条件の改変を含んだ。ビーズ２部：反応物１部の改変された比（製造者は１．８：１を推奨）で、濃縮のためにＡＭＰｕｒｅＸＰビーズを使用したところ、より効果的な短い核酸の結合が達成された（典型的には、１．８：１比により取り出した）。
新規方法の第４の態様は、全成分が存在するその完全なフォーマットでの反応混合物の変性を含んだ。従来のプロトコルは、ＤＮＡ、Ｃｏｔ−１及びブロッキングオリゴを９５℃で変性させた後、プレートの開封／開放により、ビオチン化ＤＮＡベイトのさらなる転移を可能にすることを推奨した。本明細書に提示される新規方法から得られた結果は、濃縮反応物中のベイトの含有（前述の第２の態様）以外に、ベイトを含む全反応混合物を９５℃で変性させることができることを示しており、その後、ハイブリダイゼーション温度（４７℃）への急傾斜を実施する。驚くことに、この方法は、ブロッキング効率全体の損失を引き起こさず、且つキャプチャーハイブリダイゼーションの効率の低下をもたらさなかった。それどころか、この方法は、キャプチャーされたライブラリー核酸の収率増加をもたらした。これは、効率的でないサーモサイクラによる様々な相互作用を排除すると共に、患者サンプルのプレートの開封によって生じる相互汚染の高いリスクを排除したことから、顕著なワークフローの向上をもたらした。
新規方法の第５の態様は、ストレプトアビジンキャプチャービーズ及びビオチン化ベイトを用いたライブラリーの核酸のキャプチャーをさらに改善した。従来のプロトコルは、ビーズのペレットを残して、ストレプトアビジンビーズから上清を除去する必要があり、このペレットは、ライブラリーの核酸を含むハイブリダイゼーション反応物（１０〜１５μｌ）を用いて再懸濁させなければならない。このプロセスは、多量のストレプトアビジンビーズを比較的少量に再懸濁させるため、問題があり、困難である。従来のプロセスに関連する問題を解決して、自動化を可能にするために、ストレプトアビジンビーズのペレットは、１０μｌのハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁させた（例えば、激しいボルテックス及びピペット操作により）後、１０〜１５μｌのハイブリダイゼーション反応物に添加した。これによって最終反応のバッファー組成物を維持し、完全な自動化が可能になった。
全体として、本明細書に提示される新規の方法は、従来のプロトコルに必要なものより短い（例えば、少なくとも２日短い）時間で完了し、必要なステップが低減され、且つサンプルの取り扱いが減少し、意外にも、より高い品質データ（従来のプロトコルを用いた７０〜８０％に対してパーセントで＞９０％の目標）をもたらし、完全且つ効率的な自動化を可能にすると共に、患者のＤＮＡサンプルのより安全な処理をもたらした。さらに、ＤＮＡライブラリーは、ライブラリーの核酸の分解をもたらし得る長時間にわたる熱（例えば、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ乾燥からの）並びに長いハイブリダイゼーション時間を被ることがなかった。
実施例２：実施形態の例
以下に記載する実施例は、いくつかの実施形態を例示するものであり、本技術を限定するものではない。
Ａ１． 大規模並列核酸シーケンシングで使用するための組成物において、
ａ）１つ又は複数のサンプルから得られる複数のライブラリーインサートと少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードとを含む核酸のライブラリーであって、各核酸バーコードが第１の末端及び第２の末端を含み、ライブラリーの各核酸が、（ｉ）ライブラリーインサートの少なくとも１つ、（ｉｉ）第１の非ネイティブ核酸、（ｉｉｉ）第２の非ネイティブ核酸、及び（ｉｖ）２つ以下の識別可能な核酸バーコードを含み、
第１の非ネイティブ核酸及び第２の非ネイティブ核酸が少なくとも１つのライブラリーインサートの反対側に位置し、且つ
第１の非ネイティブ核酸及び／又は第２の非ネイティブ核酸が２つ以下の識別可能な核酸バーコードを含む、核酸のライブラリー；及び
ｂ）４つ以下のＵブロック核酸であって、（ｉ）Ｕブロック核酸の各々が第１及び／又は第２の非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的であり、（ｉｉ）Ｕブロック核酸の少なくとも１つが、識別可能な核酸バーコードの各々の第１の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されており、（ｉｉｉ）Ｕブロック核酸の少なくとも１つが、識別可能な核酸バーコードの各々の第２の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されており、且つ（ｉｖ）Ｕブロック核酸の各々が、少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードの部分と実質的にハイブリダイズしない、４つ以下のＵブロック核酸
を含む、組成物。
Ａ２． １つ又は複数のキャプチャー核酸を含み、
（ｉ）キャプチャー核酸が結合ペアのメンバーを含み、及び
（ｉｉ）キャプチャー核酸の各々が、１つ又は複数のライブラリーインサートのサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ａ１に記載の組成物。
Ａ３． １つ又は複数のサンプルが１つ又は複数の種から得られる、実施形態Ａ１又はＡ２に記載の組成物。
Ａ３．１． ４つ以上のサンプルを含む、実施形態Ａ１〜Ａ３のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ３．２． ８つ以上のサンプルを含む、実施形態Ａ１〜Ａ３のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ４． 第１及び第２の非ネイティブ核酸が１つ又は複数の種のゲノムに対して内因性ではない、実施形態Ａ３〜Ａ３．２のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ５． １つ又は複数のサンプルが１つ又は複数の組織から得られる、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ６． １つ又は複数のサンプルが１つ又は複数の哺乳動物から得られる、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ７． １つ又は複数の哺乳動物がヒトである、実施形態Ａ６に記載の組成物。
Ａ８． 第１及び第２の非ネイティブ核酸が１つ又は複数の哺乳動物のゲノムに対して内因性ではない、実施形態Ａ６又はＡ７に記載の組成物。
Ａ９． １０以上の識別可能な核酸バーコードを含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ１０． １つ又は複数のライブラリーインサートが８つ以上のサンプルから得られる、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ１１． ライブラリーの各核酸が識別可能な核酸バーコードの２つを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ１２． 第１の非ネイティブ核酸が第１の識別可能な核酸バーコードを含み、且つ第２の非ネイティブ核酸が第２の識別可能な核酸バーコードを含む、実施形態Ａ１１に記載の組成物。
Ａ１３． Ｕブロック核酸の各々が、ポリメラーゼによる伸長を阻止するように立体配置されている、実施形態Ａ１２に記載の組成物。
Ａ１４． 第１及び第２の非ネイティブ核酸が合成核酸である、実施形態Ａ１〜Ａ１３のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ１５． 第１及び第２の非ネイティブ核酸が実質的に同一ではない、実施形態Ａ１〜Ａ１４のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ１６． 第１及び第２の非ネイティブ核酸がアダプター核酸を含む、実施形態Ａ１〜Ａ１５のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ１７． １〜４つのＵブロック核酸が１０〜４０ヌクレオチドの長さを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１６のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ１８． ４つ以下のＵブロック核酸が１０〜３０ヌクレオチドの長さを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ１９． ４つ以下のＵブロック核酸が１０〜２０ヌクレオチドの長さを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１８のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ２０． ４つ以下のＵブロック核酸がロックド核酸を含む、実施形態Ａ１〜Ａ１９のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ２１． ４つ以下のＵブロック核酸が架橋核酸を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２０のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ２２． ４つ以下のＵブロック核酸が約６５℃〜約９０℃の融解温度を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２１のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ２３． ４つ以下のＵブロック核酸が少なくとも６５℃の融解温度を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２２のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ２４． ４つ以下のＵブロック核酸が少なくとも７５℃の融解温度を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２２のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ２５． ４つのＵブロック核酸を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ２６． 第１の非ネイティブ核酸が、少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードの１つ、第１のＵブロック核酸と実質的に相補的な部分、及び第２のＵブロック核酸と実質的に相補的な部分を含み、第１のＵブロック核酸が、１つの識別可能な核酸バーコードの第１の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置され、且つ第２のＵブロック核酸が、１つの識別可能な核酸バーコードの第２の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ２７． 第２の非ネイティブ核酸が、少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードの１つ、第３のＵブロック核酸と実質的に相補的な部分、及び第４のＵブロック核酸と実質的に相補的な部分を含み、第３のＵブロック核酸が、１つの識別可能な核酸バーコードの第１の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置され、且つ第４のＵブロック核酸が、１つの識別可能な核酸バーコードの第２の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ａ１〜Ａ２６のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ２８． ４つ以下のＵブロック核酸が少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードと実質的に相補的ではない、実施形態Ａ１〜Ａ２７のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ２９． コンペティター核酸を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２８のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ２９．１． コンペティター核酸が胎盤由来の核酸を含む、実施形態Ａ２９に記載の組成物。
Ａ３０． コンペティター核酸が反復核酸を含む、実施形態Ａ２９に記載の組成物。
Ａ３１． 反復核酸がヒト由来である、実施形態Ａ３０に記載の組成物。
Ａ３２． コンペティター核酸が少なくとも６０％の反復核酸を含む、実施形態Ａ３０に記載の組成物。
Ａ３３． コンペティター核酸が合成反復核酸を含む、実施形態Ａ３０に記載の組成物。
Ａ３４． コンペティター核酸がＣ０ｔ−１核酸を含む、実施形態Ａ２９に記載の組成物。
Ａ３５． 結合ペアのメンバーがビオチン、抗原、ハプテン、抗体又はそれらの部分を含む、実施形態Ａ２〜３４のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ３６． 結合ペアのメンバーがビオチンを含む、実施形態Ａ３５に記載の組成物。
Ａ３７． 結合ペアのメンバーがＤＮＡ結合タンパク質認識配列又はその部分を含む、実施形態Ａ３５に記載の組成物。
Ａ３８． ４つ以下のＵブロック核酸が一本鎖である、実施形態Ａ１〜Ａ３７のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ３９． ４つ以下のＵブロック核酸が鎖ターミネータを含む、実施形態Ａ１〜Ａ３８のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ４０． ４つ以下のＵブロック核酸が逆向き反復配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ３９のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ４１． 核酸のライブラリーが一本鎖核酸を含む、実施形態Ａ１〜Ａ４０のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ４２． 核酸のライブラリーがアンプリコンを含む、実施形態Ａ１〜Ａ４１のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ４３． 複数のライブラリーインサートがゲノム核酸を含む、実施形態Ａ１〜Ａ４２のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ４４． ４つ以下のＵブロック核酸が変性ヌクレオチド塩基を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ４３のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ４５． 変性ヌクレオチド塩基が３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、その類似体又は誘導体である、実施形態Ａ４４に記載の組成物。
Ａ４６． 変性ヌクレオチド塩基がイノシン、２’−デオキシイノシン、その類似体又は誘導体である、実施形態Ａ４５に記載の組成物。
Ａ４７． 第１、第２、第３及び第４のＵブロック核酸を含み、第１及び第２のＵブロック核酸が第１の非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的であり、且つ第３及び第４のＵブロック核酸が第２の非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的である、実施形態Ａ１〜Ａ４６のいずれか１つに記載の組成物。
Ａ４８． ４つ以下のＵブロック核酸が実質的に異なる核酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ４７のいずれか１つに記載の組成物。
Ｂ１． 核酸ライブラリーを解析する方法であって、
ａ）１つ又は複数のサンプルから得た複数のライブラリーインサートと、少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードとを含む核酸のライブラリーを得るステップであって、各核酸バーコードが第１の末端及び第２の末端を含み、且つライブラリーの各核酸が、（ｉ）少なくとも１つのライブラリーインサート、（ｉｉ）第１の非ネイティブ核酸、（ｉｉｉ）第２の非ネイティブ核酸、及び（ｉｖ）２つ以下の識別可能な核酸バーコードを含み、
第１の非ネイティブ核酸及び第２の非ネイティブ核酸が少なくとも１つのライブラリーインサートの反対側に位置し、且つ
第１の非ネイティブ核酸及び／又は第２の非ネイティブ核酸が２つ以下の識別可能な核酸バーコードを含む、ステップ；
ｂ）核酸のライブラリーを４つ以下のＵブロック核酸と接触させるステップを含む、第１の混合物を調製するステップであって、Ｕブロック核酸の各々が、第１及び／又は第２の非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的であり、Ｕブロック核酸の少なくとも１つが、識別可能な核酸バーコードの各々の第１の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されており、且つＵブロック核酸の少なくとも１つが、識別可能な核酸バーコードの各々の第２の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されている、ステップ；
ｃ）第１の混合物を１つ又は複数のキャプチャー核酸と接触させることを含む、第２の混合物を調製するステップであって、
（ｉ）キャプチャー核酸が結合ペアの第１のメンバーを含み、及び
（ｉｉ）キャプチャー核酸の各々が、１つ又は複数のライブラリーインサートのサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、ステップ；
ｄ）第２の混合物を結合ペアの第２のメンバーと接触させ、それにより、単離された核酸を取得するステップ；
ｅ）単離された核酸を増幅条件下でプライマーのセットと接触させ、それにより、アンプリコンを取得するステップ；及び
ｆ）アンプリコンを解析するステップ
を含む、方法。
Ｂ２． １つ又は複数のサンプルが１つ又は複数の種から得られる、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３． ライブラリーインサートが４つ以上のサンプルから得られる、実施形態Ｂ２に記載の方法。
Ｂ４． ライブラリーインサートが８つ以上のサンプルから得られる、実施形態Ｂ２に記載の方法。
Ｂ５． １つ又は複数のサンプルが１つ又は複数の組織から得られる、実施形態Ｂ１〜Ｂ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６． １つ又は複数のサンプルが１つ又は複数の哺乳動物から得られる、実施形態Ｂ１〜Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７． １つ又は複数の哺乳動物がヒトである、実施形態Ｂ６に記載の方法。
Ｂ８． 第１及び第２の非ネイティブ核酸が１つ又は複数の哺乳動物のゲノムに対して内因性ではない、実施形態Ｂ６又はＢ７に記載の方法。
Ｂ９． インサートのライブラリーが１０以上の識別可能な核酸バーコードを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１０． 第１の非ネイティブ核酸が第１の識別可能な核酸バーコードを含み、且つ第２の非ネイティブ核酸が第２の識別可能な核酸バーコードを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１１． ライブラリーの各核酸が識別可能な核酸バーコードの２つを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１２． Ｕブロック核酸の各々が、ポリメラーゼによる伸長を阻止するように立体配置されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１３． 第１及び第２の非ネイティブ核酸が合成核酸である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１４． 第１及び第２の非ネイティブ核酸が実質的に同一ではない、実施形態Ｂ１〜Ｂ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１５． 第１及び第２の非ネイティブ核酸がアダプター核酸を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１６． １〜４つのＵブロック核酸が１０〜４０ヌクレオチドの長さを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１７． ４つ以下のＵブロック核酸が１０〜３０ヌクレオチドの長さを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１８． ４つ以下のＵブロック核酸が１０〜２０ヌクレオチド長さを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１９． ４つ以下のＵブロック核酸がロックド核酸を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２０． ４つ以下のＵブロック核酸が架橋核酸を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２１． ４つ以下のＵブロック核酸が少なくとも６５℃の融解温度を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２２． ４つ以下のＵブロック核酸が少なくとも７５℃の融解温度を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２３． ４つ以下のＵブロック核酸が約６５℃〜約９０℃の融解温度を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２４． 第１の非ネイティブ核酸が、少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードの１つ、第１のＵブロック核酸と実質的に相補的な部分、及び第２のＵブロック核酸と実質的に相補的な部分を含み、第１のＵブロック核酸が、１つの識別可能な核酸バーコードの第１の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されており、且つ第２のＵブロック核酸が、１つの識別可能な核酸バーコードの第２の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２５． 第２の非ネイティブ核酸が、少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードの１つ、第３のＵブロック核酸と実質的に相補的な部分、及び第４のＵブロック核酸と実質的に相補的な部分を含み、第３のＵブロック核酸が、１つの識別可能な核酸バーコードの第１の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されており、且つ第４のＵブロック核酸が、１つの識別可能な核酸バーコードの第２の末端に隣接してハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２６． ４つ以下のＵブロック核酸が少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードと実質的に相補的ではない、実施形態Ｂ１〜Ｂ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２７． ４つ以下のＵブロック核酸が少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードの部分と特異的にハイブリダイズしない、実施形態Ｂ２６に記載の方法。
Ｂ２８． ｃ）の前に第１の混合物をコンペティター核酸と接触させるステップを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２８．１． コンペティター核酸が胎盤由来の核酸を含む、実施形態Ｂ２８に記載の方法。
Ｂ２９． コンペティター核酸が反復核酸を含む、実施形態Ｂ２８又はＢ２８．１に記載の方法。
Ｂ３０． 反復核酸がヒト由来である、実施形態Ｂ２９に記載の方法。
Ｂ３１． コンペティター核酸が少なくとも６０％の反復核酸を含む、実施形態Ｂ２９に記載の方法。
Ｂ３２． コンペティター核酸が合成核酸を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３３． コンペティター核酸がＣ０ｔ−１核酸を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３４． 結合ペアの第１のメンバーがビオチン、抗原、ハプテン、抗体又はそれらの部分を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３５． 結合ペアの第１のメンバーがビオチンを含む、実施形態Ｂ３４に記載の方法。
Ｂ３６． 結合ペアの第１のメンバーがＤＮＡ結合タンパク質認識配列又はその部分を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３７． ４つ以下のＵブロック核酸が一本鎖である、実施形態Ｂ１〜Ｂ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３８． ４つ以下のＵブロック核酸が鎖ターミネータを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３９． ４つ以下のＵブロック核酸が逆向き反復配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４０． 核酸のライブラリーが一本鎖核酸を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４１． 核酸のライブラリーがアンプリコンを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４２． 複数のライブラリーインサートがゲノム核酸を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４３． ４つ以下のＵブロック核酸が変性ヌクレオチド塩基を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４４． 変性ヌクレオチド塩基が３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、その類似体又は誘導体である、実施形態Ｂ４３に記載の方法。
Ｂ４５． 変性ヌクレオチド塩基がイノシン、２’−デオキシイノシン、その類似体又は誘導体である、実施形態Ｂ４３に記載の方法。
Ｂ４６． 結合ペアの第１のメンバーがビオチン、抗原、ハプテン、抗体又はそれらの部分を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ４７． 結合ペアの第１のメンバーがビオチンを含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ４８． 結合ペアの第１のメンバーがＤＮＡ結合タンパク質認識配列又はその部分を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ４９． 単離された核酸をハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするステップを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５０． 増幅条件が熱安定性ポリメラーゼを含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ５１． 増幅条件がポリメラーゼ連鎖反応を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ５２． キャプチャー核酸が、エキソンの部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ５３． キャプチャー核酸が、染色体の部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ５４． 結合ペアの第２のメンバーがアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、又はその結合部分を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ５５． 結合ペアの第２のメンバーがアビジン又はその部分を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ５６． 結合ペアの第２のメンバーが支持体を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ５７． 支持体が磁気化合物を含む、実施形態Ｂ５６に記載の方法。
Ｂ５８． 支持体がビーズを含む、実施形態Ｂ５６に記載の方法。
Ｂ５９． 支持体がポリスチレン、ポリカーボネート又はアガロースを含む、実施形態Ｂ５６に記載の方法。
Ｂ６０． 支持体が磁気ビーズを含む、実施形態Ｂ５６に記載の方法。
Ｂ６１． （ｄ）の接触させるステップが遠心分離を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ６２． （ｄ）の接触させるステップが磁石の使用を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ６３． 解析するステップが、配列リードを取得するステップを含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ６４． 配列リードが、大規模並列シーケンシングを含む方法によって得られる、実施形態Ｂ６３に記載の方法。
Ｂ６５． 配列リードが、両端対シーケンシングを含む方法によって得られる、実施形態Ｂ６３に記載の方法。
Ｂ６６． ４つ以下のＵブロック核酸が第１、第２、第３及び第４のＵブロック核酸を含み、第１及び第２のＵブロック核酸が第１の非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的であり、且つ第３及び第４のＵブロック核酸が第２の非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的である、実施形態Ｂ１〜Ｂ６５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６７． ４つ以下のＵブロック核酸が実質的に異なる核酸配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ６６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１． 核酸ライブラリーを解析する方法であって、
ａ）アンプリコンの第１のセットを含む核酸のライブラリーを得るステップであって、各アンプリコンが、第１の非ネイティブ核酸及び第２の非ネイティブ核酸、１つ又は複数の識別可能な識別子、並びに１つ又は複数のサンプルのうちの１つから得られたライブラリーインサートを含み、ライブラリーインサートが第１及び第２の非ネイティブ核酸の間に位置する、ステップ；
ｂ）１つ又は複数のブロッキング核酸及びキャプチャー核酸と、核酸のライブラリーとを含有する混合物を調製するステップであって、
（ｉ）１つ又は複数のブロッキング核酸が、第１及び第２の非ネイティブ核酸の部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置され、
（ｉｉ）キャプチャー核酸が結合ペアの第１のメンバーを含み、及び
（ｉｉｉ）キャプチャー核酸が、第１のセットのアンプリコンのサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、ステップ；
ｃ）混合物を精製し、それにより、精製済み核酸を取得するステップであって、精製済み核酸が核酸のライブラリー、１つ又は複数のブロッキング核酸、及びキャプチャー核酸を含む、ステップ；
ｄ）精製済み核酸をハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするステップ；
ｅ）キャプチャー核酸をキャプチャーし、それにより、キャプチャーされた核酸を取得するステップ；
ｆ）キャプチャーされた核酸を増幅条件下でプライマーのセットと接触させ、それにより、アンプリコンの第２のセットを取得するステップ；及び
ｇ）アンプリコンの第２のセットを解析するステップ
を含む、方法。
Ｃ２． １つ又は複数のサンプルがヒトから得られる、実施形態Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３． 第１の核酸及び第２の核酸がヒトに対して内因性ではない、実施形態Ｃ２に記載の方法。
Ｃ４． １つ又は複数のサンプルが乳房組織、結腸組織、膵臓組織、胎盤、又は上皮組織から得られる、実施形態Ｃ１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５． １つ又は複数のサンプルが血液から得られる、実施形態Ｃ１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６． １つ又は複数のサンプルが循環血液細胞から得られる、実施形態Ｃ５に記載の方法。
Ｃ７． ヒトが胎児である、実施形態Ｃ２〜Ｃ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ８． １つ又は複数のサンプルが循環無細胞核酸を含む、実施形態Ｃ５に記載の方法。
Ｃ９． 増幅条件が熱安定性ポリメラーゼを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１０． 増幅条件がポリメラーゼ連鎖反応を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１１． （ｂ）の調製ステップが、ライブラリーの核酸をコンペティター核酸と接触させるステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１２． コンペティター核酸が胎盤由来の核酸を含む、実施形態Ｃ１１に記載の方法。
Ｃ１３． コンペティター核酸が反復核酸を含む、実施形態Ｃ１１に記載の方法。
Ｃ１４． 反復核酸がヒトに由来する、実施形態Ｃ１３に記載の方法。
Ｃ１５． コンペティター核酸が反復核酸の少なくとも６０％以上を含む、実施形態Ｃ１３に記載の方法。
Ｃ１６． コンペティター核酸が合成核酸を含む、実施形態Ｃ１１に記載の方法。
Ｃ１７． コンペティター核酸がＣ０ｔ−１核酸を含む、実施形態Ｃ１１に記載の方法。
Ｃ１８． キャプチャー核酸が、ライブラリーインサートの部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１９． １つ又は複数のブロッキング核酸が、第１の非ネイティブ核酸及び／又は第２の非ネイティブ核酸の部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ｃ１〜Ｃ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２０． １つ又は複数のブロッキング核酸が、ポリメラーゼによるブロッキング核酸の伸長を妨げるように立体配置されている、実施形態Ｃ１〜Ｃ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２１． １つ又は複数のブロッキング核酸が鎖ターミネータを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２２． １つ又は複数のブロッキング核酸が逆向き反復配列を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２３． キャプチャー核酸が、エキソンの部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ｃ１〜Ｃ２２のいずれか１つに方法。
Ｃ２４． キャプチャー核酸が、染色体の部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ｃ１〜Ｃ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２５． キャプチャー核酸が、遺伝的変異を含むライブラリーインサートの部分と特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、実施形態Ｃ２４に記載の方法。
Ｃ２６． 結合ペアの第１のメンバーがビオチン、抗原、ハプテン、抗体又はそれらの部分を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２７． 結合ペアの第１のメンバーがビオチンを含む、実施形態Ｃ２６に記載の方法。
Ｃ２８． 結合ペアの第１のメンバーがＣＮＣ結合タンパク質認識配列又はその部分を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２９． （ｅ）のキャプチャーするステップが、混合物を結合ペアの第２のメンバーと接触させるステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ２８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３０． 結合ペアの第２のメンバーがアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、又はその結合部分を含む、実施形態Ｃ２９に記載の方法。
Ｃ３１． 結合ペアの第２のメンバーがアビジン又はその部分を含む、実施形態Ｃ３０に記載の方法。
Ｃ３２． 結合ペアの第２のメンバーが支持体を含む、実施形態Ｃ２９〜Ｃ３１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３３． 支持体が磁気化合物を含む、実施形態Ｃ３２に記載の方法。
Ｃ３４． 支持体がビーズを含む、実施形態Ｃ３２に記載の方法。
Ｃ３５． 支持体がポリスチレン、ポリカーボネート又はアガロースを含む、実施形態Ｃ３２に記載の方法。
Ｃ３６． 支持体が金属を含む、実施形態Ｃ３２に記載の方法。
Ｃ３７． （ｅ）のキャプチャーするステップが、遠心分離を含む方法により、キャプチャーされた核酸を回収するステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３８． （ｅ）のキャプチャーするステップが、磁石の使用を含む方法により、キャプチャーされた核酸を回収するステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ３７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３９． ハイブリダイゼーション条件が変性させるステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４０． （ｄ）のハイブリダイズするステップが、キャプチャーされた核酸を第１のセットのアンプリコンの１つ又は複数の部分とハイブリダイズするステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４１． ハイブリダイゼーション条件が、キャプチャーされた核酸を約２５℃〜約７０℃の温度でインキュベートするステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ４０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４２． インキュベートするステップが約３５℃〜約６０℃の温度で行われる、実施形態Ｃ４１に記載の方法。
Ｃ４３． インキュベートするステップが約１時間〜約２４時間の時間にわたって行われる、実施形態Ｃ４１〜Ｃ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４４． インキュベートするステップが約１２時間〜約２０時間の時間にわたって行われる、実施形態Ｃ４１〜Ｃ４３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４５． （ｄ）のハイブリダイズするステップが、混合物をハイブリダイゼーションバッファーと接触させるステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ４４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４６． （ｄ）のハイブリダイズするステップが、（ｉ）混合物とハイブリダイゼーションバッファーとの接触、（ｉｉ）変性、及び（ｉｉｉ）ハイブリダイズの連続ステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ４５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４７． 乾燥ステップを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ４６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４８． ハイブリダイゼーション条件がポリメラーゼを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ４７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４９． 解析ステップが配列リードを取得するステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ４８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５０． 配列リードが、大規模並列シーケンシングを含む方法によって得られる、実施形態Ｃ４９に記載の方法。
Ｃ５１． 配列リードが、両端対シーケンシングを含む方法によって得られる、実施形態Ｃ４９に記載の方法。
Ｃ５２． 第１の非ネイティブ核酸が１つ又は複数の識別可能な識別子を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ５１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５３． 第２の非ネイティブ核酸が１つ又は複数の識別可能な識別子を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ５２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５４． １つ又は複数の識別可能な識別子が核酸バーコードを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ５３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５５． １つ又は複数のブロッキング核酸がロックド核酸を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ５４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５６． １つ又は複数のブロッキング核酸が架橋核酸を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ５５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５７． （ｃ）の前に変性ステップを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５８． （ｄ）の前に変性ステップを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５９． （ｄ）の前に８０℃を超える温度への加熱ステップを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６０． （ｄ）の前に９０℃を超える温度への加熱ステップを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６１． キャプチャーされた核酸がライブラリーの核酸のサブセットを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ６０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６２． １つ又は複数のサンプルが１０以上のサンプルを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ６１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６３． １つ又は複数の識別可能な識別子が１０以上の識別可能な識別子から構成される、実施形態Ｃ１〜Ｃ６２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６４． 第１の核酸及び第２の核酸が合成核酸を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ６３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６５． ライブラリーインサートがゲノム核酸の部分を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ６４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６６． （ｃ）の精製するステップが、結合ペアの第１のメンバーと結合するように立体配置された結合ペアの第２のメンバーの付加を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ６５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６７． （ｃ）の精製するステップが、核酸を支持体に非特異的に結合する方法を含む、実施形態Ｃ１に記載の方法。
Ｃ６８． （ｃ）の精製するステップがアニオン交換樹脂の使用を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ６７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６９． （ｅ）のキャプチャーするステップが、結合ペアの第１のメンバーと結合するように立体配置された結合ペアの第２のメンバーの付加を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ６８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７０． （ｅ）の前に混合物をフローセル又はアレイの支持体に固定化しない、実施形態Ｃ１〜Ｃ６９のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１． ゲノムＤＮＡライブラリーを解析する方法であって、
ａ）一本鎖アンプリコンの第１のセットを含むゲノムＤＮＡライブラリーを得るステップであって、各アンプリコンが、第１の非ネイティブ核酸及び第２の非ネイティブ核酸、１つ又は２つの核酸バーコード、並びに１０人以上のヒト対象のうちの１人のゲノムから得られたライブラリーインサートを含み、ライブラリーインサートが第１及び第２の非ネイティブ核酸の間に位置し、且つアンプリコンの第１のセットが１０人以上のヒト対象からの複数のライブラリーインサートを含む、ステップ；
ｂ）アンプリコンの第１のセットを１〜４つのブロッキング核酸、Ｃ０ｔ−１ＤＮＡ及びキャプチャー核酸と接触させるステップを含む、混合物を調製するステップであって、
（ｉ）１〜４つのブロック核酸が、第１及び／又は第２の非ネイティブ核酸と特異的にハイブリダイズするように立体配置され、
（ｉｉ）１〜４つのブロッキング核酸がロックド核酸を含み、且つ１０〜３０ヌクレオチドの長さを含み、
（ｉｉｉ）キャプチャー核酸がビオチンを含み、及び
（ｉｖ）キャプチャー核酸が、複数のライブラリーインサートのサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、ステップ；
ｃ）非特異的核酸と結合する支持体を含む磁気ビーズと混合物を接触させ、それにより、精製済み核酸を取得するステップであって、精製済み核酸がアンプリコンの第１のセット、１つ又は４つのブロッキング核酸、Ｃ０ｔ−１ＤＮＡ及びキャプチャー核酸を含む、ステップ；
ｄ）精製済み核酸をハイブリダイズするステップであって、（ｉ）混合物をハイブリダイゼーションバッファーと接触させ、（ｉｉ）精製済み核酸を少なくとも９５℃で約１０分間にわたって加熱し、且つ（ｉｉｉ）約４０℃〜５０℃で１２〜２０時間にわたってインキュベートすることにより、精製済み核酸をハイブリダイズする連続ステップを含む、ステップ；
ｅ）キャプチャー核酸をキャプチャーするステップであって、キャプチャー核酸と特異的に結合するように立体配置されたアビジンコート磁気ビーズと精製済み核酸を接触させ、且つ磁石を用いて、キャプチャーされた核酸を固定化し、それにより、キャプチャーされた核酸を取得するステップを含む、ステップ；
ｆ）キャプチャーされた核酸を増幅条件下でプライマーのセットと接触させ、それにより、アンプリコンの第２のセットを取得するステップ；及び
ｇ）乾燥ステップを含まない、両端対シーケンシングを含む方法により、アンプリコンの第２のセットから配列リードを得るステップ
を含む、方法。
本明細書で参照する各特許、特許出願、刊行物及び文献の全体は、参照により本明細書に組み込むものとする。上記の特許、特許出願、刊行物及び文献の引用は、前述したもののいずれかが従来技術に属することの承認ではなく、また、これらの刊行物又は文献の内容若しくは日付に関する何らの承認をなすものでもない。
本技術の基本的態様から逸脱することなく、前述のものに改変を加えることができる。１つ又は複数の具体的な実施形態を参照しながら、本技術をかなり詳細に説明してきたが、当業者であれば、本出願に具体的に開示される実施形態に対する変更形態がなされ得、これらの改変形態及び改善形態が、依然として本技術の範囲及び趣旨の範囲内であることは認識されよう。
本明細書に例示的に記載する技術は、本明細書に具体的に開示していない任意の要素の非存在下で実施することができる。従って、例えば、本明細書の事例の各々で、「含む」、「〜から本質的に構成される」、及び「〜から構成される」という用語の任意のものは、他の２つの用語のいずれとも置き換えることが可能である。使用してきた用語及び表現は、限定の用語ではなく、説明の用語として使用しており、こうした用語及び表現の使用は、図示及び記載する特徴又はその部分の任意の均等物を排除するものではなく、特許請求される技術の範囲内で多様な修正形態が可能である。「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という用語は、要素の１つ又は要素の２つ以上が記載されていることが文脈から明らかでない限り、それが修飾する要素の１つ又は複数を指し得る（例えば、「試薬」は、１つ又は複数の試薬を意味し得る）。本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、基本的なパラメータの１０％以内（すなわち、±１０％）の値を指し、一続きの値の始めに位置する用語「約」の使用は、これらの値の各々を修飾する（すなわち、「約１、２及び３」は、約１、約２、及び約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を包含し得る。さらに、値の列記（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％若しくは８６％）が本明細書に記載される場合、この列記は、その全ての中間値及び小数値（例えば、５４％、８５．４％）を含む。従って、本技術は、代表的実施形態及び任意選択の特徴として具体的に開示されるが、本明細書に開示される概念の改変形態及び変形形態が当業者により講じられ得、こうした改変形態及び変形形態は本技術の範囲内にあるものと考慮される。
本技術のいくつかの実施形態を以下の特許請求の範囲に記載する。

Claims (111)

  1. 大規模並列核酸シーケンシングで使用するための組成物において、
    ａ）複数のライブラリーインサートを含む核酸のライブラリーであって、前記ライブラリーの各核酸が、（ｉ）４つ以上のサンプルのうちの１つから得られる少なくとも１つのライブラリーインサート、（ｉｉ）第１の非ネイティブ核酸、及び（ｉｉｉ）第２の非ネイティブ核酸を含み、前記第１の非ネイティブ核酸及び前記第２の非ネイティブ核酸が前記少なくとも１つのライブラリーインサートの反対側に位置し、及び前記第１の非ネイティブ核酸が第１の識別可能な核酸バーコードを含み、且つ前記第２の非ネイティブ核酸が第２の識別可能な核酸バーコードを含み、前記第１及び第２の識別可能な核酸バーコードが前記４つ以上のサンプルのうちの前記１つにユニークである、核酸のライブラリー；及び
    ｂ）４つのＵブロック核酸であって、（ｉ）第１及び第２のＵブロック核酸が、前記第１の識別可能な核酸バーコードの反対側の前記第１の非ネイティブ核酸とハイブリダイズするように立体配置されており、且つ（ｉｉ）第３及び第４のＵブロック核酸が、前記第２の識別可能な核酸バーコードの反対側の前記第２の非ネイティブ核酸とハイブリダイズするように立体配置されており、且つ（ｉｉｉ）前記Ｕブロック核酸の各々が、前記第１又は第２の識別可能な核酸バーコードの部分と実質的にハイブリダイズしない、４つのＵブロック核酸
    を含むことを特徴とする、組成物。
  2. 前記核酸のライブラリーが少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードの各々が前記ライブラリーの異なる核酸に存在することを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記第１及び第２のＵブロック核酸が前記第１の非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的であり、且つ前記第３及び第４のＵブロック核酸が前記第２の非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. ４つ以下のＵブロック核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記４つのＵブロック核酸が実質的に同じ核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１又は５に記載の組成物。
  7. 前記４つのＵブロック核酸が実質的に異なる核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１又は５に記載の組成物。
  8. １つ又は複数のキャプチャー核酸を含み、
    （ｉ）前記キャプチャー核酸が結合ペアのメンバーを含み；及び
    （ｉｉ）前記キャプチャー核酸の各々が、前記ライブラリーの核酸のサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記キャプチャー核酸の各々が、前記複数のインサートのサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置されていることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記４つ以上のサンプルが１つ又は複数の種から得られることを特徴とする、請求項１又は９に記載の組成物。
  11. 前記４つ以上のサンプルが８つ以上のサンプルを含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸が前記１つ又は複数の種のゲノムに対して内因性ではないことを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の組成物。
  13. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸が前記１つ又は複数の種のゲノム中に存在しないことを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記４つ以上のサンプルが４つ以上の組織から得られることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記４つ以上のサンプルが４つ以上の異なる哺乳動物から得られることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記１つ又は複数の哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸が前記４つ以上の異なる哺乳動物のゲノムに対して内因性ではないことを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の組成物。
  18. 前記核酸のライブラリーが１０以上の識別可能な核酸バーコードを含むことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記第１及び第２の識別可能な核酸バーコードが、１００％同一である核酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記第１及び第２の識別可能な核酸バーコードが、異なり且つ識別可能である核酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記Ｕブロック核酸の各々が、ポリメラーゼによる伸長を阻止するように立体配置されていることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸が合成核酸であることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸が実質的に同一ではないことを特徴とする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸がアダプター核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記４つのＵブロック核酸の各々が１０〜４０ヌクレオチドの長さを含むことを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
  26. 前記４つのＵブロック核酸の各々が１０〜３０ヌクレオチドの長さを含むことを特徴とする、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記４つのＵブロック核酸の各々が１０〜２０ヌクレオチドの長さを含むことを特徴とする、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記４つのＵブロック核酸の各々がロックド核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記４つのＵブロック核酸の各々が架橋核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記４つのＵブロック核酸の各々が約６５℃〜約９０℃の融解温度を含むことを特徴とする、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
  31. 前記４つのＵブロック核酸の各々が少なくとも６５℃の融解温度を含むことを特徴とする、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記４つのＵブロック核酸の各々が少なくとも７５℃の融解温度を含むことを特徴とする、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記第１のＵブロック核酸及び前記第２のＵブロック核酸が実質的に同じであり、且つ前記第３及び前記第４のＵブロック核酸と異なることを特徴とする、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記第１、第２、第３及び第４のＵブロック核酸が実質的に同じであることを特徴とする、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記第１、第２、第３及び第４のＵブロック核酸が実質的に異なることを特徴とする、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 前記４つのＵブロック核酸が前記少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードと実質的に相補的ではないことを特徴とする、請求項２〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 前記４つのＵブロック核酸が識別可能な核酸バーコードと実質的にハイブリダイズしないことを特徴とする、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 前記４つのＵブロック核酸が識別可能な核酸バーコードのいずれの部分ともハイブリダイズしないことを特徴とする、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. コンペティター核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 前記結合ペアの前記メンバーがビオチン、抗原、ハプテン、抗体又はそれらの部分を含むことを特徴とする、請求項８〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 前記結合ペアの前記メンバーがビオチンを含むことを特徴とする、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記４つのＵブロック核酸が一本鎖であることを特徴とする、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 前記４つのＵブロック核酸が鎖ターミネータを含むことを特徴とする、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
  44. 前記４つのＵブロック核酸が逆向き反復配列を含むことを特徴とする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 前記核酸のライブラリーが一本鎖核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
  46. 前記核酸のライブラリーがアンプリコンを含むことを特徴とする、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
  47. 前記複数のライブラリーインサートがゲノム核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
  48. 前記４つのＵブロック核酸が変性ヌクレオチド塩基を含まないことを特徴とする、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
  49. 前記変性ヌクレオチド塩基が３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、その類似体又は誘導体を含むことを特徴とする、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記変性ヌクレオチド塩基がイノシン、２’−デオキシイノシン、その類似体又は誘導体を含むことを特徴とする、請求項４８に記載の組成物。
  51. 核酸ライブラリーを解析する方法において、
    ａ）複数のライブラリーインサートを含む核酸のライブラリーを得るステップであって、前記ライブラリーの各核酸が、（ｉ）４つ以上のサンプルのうちの１つから得られる少なくとも１つのライブラリーインサート、（ｉｉ）第１の非ネイティブ核酸、及び（ｉｉｉ）第２の非ネイティブ核酸を含み、前記第１の非ネイティブ核酸及び前記第２の非ネイティブ核酸が前記少なくとも１つのライブラリーインサートの反対側に位置し、及び前記第１の非ネイティブ核酸が第１の識別可能な核酸バーコードを含み、且つ前記第２の非ネイティブ核酸が第２の識別可能な核酸バーコードを含み、前記第１及び第２の識別可能な核酸バーコードが前記４つ以上のサンプルのうちの前記１つにユニークである、ステップ；
    ｂ）前記核酸のライブラリーを４つのＵブロック核酸と接触させるステップであって、（ｉ）第１及び第２のＵブロック核酸が、前記第１の識別可能な核酸バーコードの反対側の前記第１の非ネイティブ核酸とハイブリダイズするように立体配置されており、且つ（ｉｉ）第３及び第４のＵブロック核酸が、前記第２の識別可能な核酸バーコードの反対側の前記第２の非ネイティブ核酸とハイブリダイズするように立体配置されており、且つ（ｉｉｉ）前記Ｕブロック核酸の各々が、前記第１又は第２の識別可能な核酸バーコードの部分と実質的にハイブリダイズしない、ステップ；及び
    ｃ）前記核酸のライブラリーを、各々が結合ペアの第１のメンバーを含む１つ又は複数のキャプチャー核酸と接触させるステップであって、前記１つ又は複数のキャプチャー核酸が、前記ライブラリーの前記核酸のサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置されている、ステップ；
    ｄ）前記キャプチャー核酸をキャプチャーし、それにより、前記ライブラリーの核酸の前記サブセットを含むキャプチャーされた核酸を取得するステップ；
    ｅ）前記キャプチャーされた核酸を増幅条件下でプライマーのセットと接触させ、それにより、アンプリコンを取得するステップ；及び
    ｆ）前記アンプリコンを解析するステップ
    を含むことを特徴とする、方法。
  52. 前記増幅条件が熱安定性ポリメラーゼを含むことを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記増幅条件がポリメラーゼ連鎖反応を含むことを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ライブラリーの前記核酸をコンペティター核酸と接触させるステップを含むことを特徴とする、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記結合ペアの前記第１のメンバーがビオチン、抗原、ハプテン、抗体又はそれらの部分を含むことを特徴とする、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. （ｄ）の前記キャプチャーするステップが、混合物を結合ペアの第２のメンバーと接触させるステップを含むことを特徴とする、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記結合ペアの前記第２のメンバーがアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、又はその結合部分を含むことを特徴とする、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記結合ペアの前記第２のメンバーがアビジン又はその部分を含むことを特徴とする、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記結合ペアの前記第２のメンバーが支持体を含むことを特徴とする、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記支持体が磁気化合物を含むことを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記支持体がビーズを含むことを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記支持体がポリスチレン、ポリカーボネート又はアガロースを含むことを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
  63. 前記支持体が金属を含むことを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
  64. 前記解析するステップが、配列リードを取得するステップを含むことを特徴とする、請求項５１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記配列リードが、大規模並列シーケンシングを含む方法によって得られることを特徴とする、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記配列リードが、両端対シーケンシングを含む方法によって得られることを特徴とする、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記核酸のライブラリーが少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードを含むことを特徴とする、請求項５１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードの各々が前記ライブラリーの異なる核酸に存在することを特徴とする、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記第１及び第２のＵブロック核酸が前記第１の非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的であり、且つ前記第３及び第４のＵブロック核酸が前記第２の非ネイティブ核酸の部分と実質的に相補的であることを特徴とする、請求項５１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記ライブラリーが４つ以下のＵブロック核酸と接触させられることを特徴とする、請求項５１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記４つのＵブロック核酸が実質的に同じ核酸配列を含むことを特徴とする、請求項５１又は７０に記載の方法。
  72. 前記４つのＵブロック核酸が実質的に異なる核酸配列を含むことを特徴とする、請求項５１又は７０に記載の方法。
  73. 前記キャプチャー核酸が、前記複数のインサートのサブセットと特異的にハイブリダイズするように立体配置されていることを特徴とする、請求項５１又は７２に記載の方法。
  74. 前記４つ以上のサンプルが１つ又は複数の種から得られることを特徴とする、請求項５１又は７３に記載の方法。
  75. 前記４つ以上のサンプルが８つ以上のサンプルを含むことを特徴とする、請求項５１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸が前記１つ又は複数の種のゲノムに対して内因性ではないことを特徴とする、請求項７４又は７５に記載の方法。
  77. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸が前記１つ又は複数の種のゲノム中に存在しないことを特徴とする、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記４つ以上のサンプルが４つ以上の組織から得られることを特徴とする、請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記４つ以上のサンプルが４つ以上の異なる哺乳動物から得られることを特徴とする、請求項５１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記１つ又は複数の哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸が前記４つ以上の異なる哺乳動物のゲノムに対して内因性ではないことを特徴とする、請求項７９又は８０に記載の方法。
  82. 前記核酸のライブラリーが１０以上の識別可能な核酸バーコードを含むことを特徴とする、請求項５１〜８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記第１及び第２の識別可能な核酸バーコードが、１００％同一である核酸配列を有することを特徴とする、請求項５１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記第１及び第２の識別可能な核酸バーコードが、異なっており且つ識別可能である核酸配列を有することを特徴とする、請求項５１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記Ｕブロック核酸の各々が、ポリメラーゼによる伸長を阻止するように立体配置されていることを特徴とする、請求項５１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸が合成核酸であることを特徴とする、請求項５１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸が実質的に同一ではないことを特徴とする、請求項５１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記第１及び第２の非ネイティブ核酸がアダプター核酸を含むことを特徴とする、請求項５１〜８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記４つのＵブロック核酸の各々が１０〜４０ヌクレオチドの長さを含むことを特徴とする、請求項５１〜８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記４つのＵブロック核酸の各々が１０〜３０ヌクレオチドの長さを含むことを特徴とする、請求項５１〜８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記４つのＵブロック核酸の各々が１０〜２０ヌクレオチドの長さを含むことを特徴とする、請求項５１〜９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記４つのＵブロック核酸の各々がロックド核酸を含むことを特徴とする、請求項５１〜９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記４つのＵブロック核酸の各々が架橋核酸を含むことを特徴とする、請求項５１〜９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記４つのＵブロック核酸の各々が約６５℃〜約９０℃の融解温度を含むことを特徴とする、請求項５１〜９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記４つのＵブロック核酸の各々が少なくとも６５℃の融解温度を含むことを特徴とする、請求項５１〜９３のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記４つのＵブロック核酸の各々が少なくとも７５℃の融解温度を含むことを特徴とする、請求項５１〜９３のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記第１のＵブロック核酸及び前記第２のＵブロック核酸が実質的に同じであり、且つ前記第３及び前記第４のＵブロック核酸と異なることを特徴とする、請求項５１〜９４のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記第１、第２、第３及び第４のＵブロック核酸が実質的に同じであることを特徴とする、請求項５１〜９６のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記第１、第２、第３及び第４のＵブロック核酸が実質的に異なることを特徴とする、請求項５１〜９６のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記４つのＵブロック核酸が前記少なくとも８つの識別可能な核酸バーコードと実質的に相補的ではないことを特徴とする、請求項６７〜９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記４つのＵブロック核酸が識別可能な核酸バーコードと実質的にハイブリダイズしないことを特徴とする、請求項５１〜１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記４つのＵブロック核酸が識別可能な核酸バーコードのいずれの部分ともハイブリダイズしないことを特徴とする、請求項５１〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. コンペティター核酸を含むことを特徴とする、請求項５１〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記４つのＵブロック核酸が一本鎖であることを特徴とする、請求項５１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記４つのＵブロック核酸のうちの少なくとも１つが鎖ターミネータを含むことを特徴とする、請求項５１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記４つのＵブロック核酸のうちの少なくとも１つが逆向き反復配列を含むことを特徴とする、請求項５１〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記核酸のライブラリーが一本鎖核酸を含むことを特徴とする、請求項５１〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記複数のライブラリーインサートがゲノム核酸を含むことを特徴とする、請求項５１〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記４つのＵブロック核酸が変性ヌクレオチド塩基を含まないことを特徴とする、請求項５１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記変性ヌクレオチド塩基が３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、その類似体又は誘導体を含むことを特徴とする、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記変性ヌクレオチド塩基がイノシン、２’−デオキシイノシン、その類似体又は誘導体を含むことを特徴とする、請求項１０９に記載の方法。
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