JP7431802B2 - ライブラリー富化を改善するための組成物および方法 - Google Patents
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- C12Q2527/101—Temperature
Description
本願は、米国特許法第119条(e)項の下、2018年8月15日出願の米国特許仮出願第62/764,753号の利益を主張する。この仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
次世代シーケンシング(NGS)の処理量が急速に進歩しているにもかかわらず、古典的なライブラリー調製法および富化法は、多くの時間を必要とし、処理量を制限する障害となることがある。本開示は、ブロッカーおよび/またはハイブリダイゼーションバッファーを含む組成物、それらの組成物を使用するための方法、ならびに配列決定前に核酸選択の効率を改善するための方法を記載する。
本開示は、ブロッカーおよび/またはハイブリダイゼーションバッファーを含む組成物、ならびに配列決定前に核酸選択の効率を改善するための方法を記載し、その方法には、それらの組成物を使用する方法およびハイブリッド捕捉を含む方法が含まれる。
ハイブリッド捕捉による富化
ブロッカーオリゴヌクレオチド
表1A-例示的アダプター配列
表2A-例示的ブロッカー配列
表2B-例示的ブロッカー配列
表2C-例示的ブロッカー配列
チミンを含むブロッカー
ユニバーサル塩基および少なくとも1つの非ユニバーサル塩基を含むブロッカー
スプリットブロッカー
ハイブリダイゼーションバッファー
ハイブリッド捕捉
ライブラリーのプール
プローブのハイブリダイズ
捕捉
増幅
実施形態
例示的なブロッカー実施形態
そのブロッカーは、アダプターに結合することができ、そのアダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み;
アダプターのインデックス領域および/またはUMIに結合することができるブロッカーの領域は、
少なくとも3つのチミン塩基、少なくとも4つのチミン塩基、少なくとも5つのチミン塩基、少なくとも6つのチミン塩基、少なくとも7つのチミン塩基、少なくとも8つのチミン塩基、少なくとも9つのチミン塩基もしくは少なくとも10個のチミン塩基;または
ユニバーサル塩基および少なくとも1つの非ユニバーサル塩基を含む、ブロッカー。
例示的なスプリットブロッカー実施形態
前記ブロッカーは、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み;
前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、アダプターのインデックス領域および/またはUMIに対応しない塩基を含む、ブロッカー。
例示的なハイブリダイゼーションバッファー実施形態
0.5%~10%デキストラン硫酸、
0.05mg/mL~0.5mg/mLヒトCot-1DNA、
1%~15%(v/v)ホルムアミド、
40mM~80mM KH2PO4-K2HPO4、
0.1M~4M NaCl、および
0.001%~10%(v/v)Tween(登録商標)20
を含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか1つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
1.5%デキストラン硫酸、
0.2mg/mLヒトCot-1DNA、
10%(v/v)ホルムアミド、
66.6mM KH2PO4-K2HPO4、
0.2mM 強化アダプターブロッカー(各アダプターに対して0.1mM)
0.8M NaCl、および
0.04%(v/v)Tween(登録商標)20
を含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか1つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
前記ブロッカーは、オリゴヌクレオチドを含み;
前記ブロッカーは、アダプターに結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み;
前記アダプターのインデックス領域および/またはUMIに結合することができるブロッカーの領域は、
少なくとも3つのチミン塩基、少なくとも4つのチミン塩基、少なくとも5つのチミン塩基、少なくとも6つのチミン塩基、少なくとも7つのチミン塩基、少なくとも8つのチミン塩基、少なくとも9つのチミン塩基もしくは少なくとも10個のチミン塩基;または
ユニバーサル塩基および少なくとも1つの非ユニバーサル塩基
を含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか1つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
前記ブロッカーは、接続されていない2つのオリゴヌクレオチドを含み;
前記ブロッカーは、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み;
前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、アダプターのインデックス領域および/またはアダプターのUMIに対応しない塩基を含む、前述のハイブリダイゼーションバッファー実施形態のいずれか1つに記載のハイブリダイゼーションバッファー。
ハイブリダイゼーションバッファーを使用する例示的な方法(バッファー方法実施形態)
0.5%~10%デキストラン硫酸、
0.05mg/mL~0.5mg/mL Cot-1、
1%~15%(v/v)ホルムアミド、
40mM~80mM KH2PO4-K2HPO4、
0.1M~4M NaCl、および
0.001%~10%(v/v)TWEEN(登録商標)20
を含む、前述のバッファー方法実施形態のいずれか1つに記載の方法。
1.5%デキストラン硫酸、
0.2mg/mL Cot-1、
10%(v/v)ホルムアミド、
66.6mM KH2PO4-K2HPO4、
0.8M NaCl、および
0.04%(v/v)TWEEN(登録商標)20
を含む、前述のバッファー方法実施形態のいずれか1つに記載の方法。
前記ブロッカーが、アダプターに結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み;
前記アダプターのインデックス領域および/またはUMIに結合することができるブロッカーの領域は、
少なくとも3つのチミン塩基、少なくとも4つのチミン塩基、少なくとも5つのチミン塩基、少なくとも6つのチミン塩基、少なくとも7つのチミン塩基、少なくとも8つのチミン塩基、少なくとも9つのチミン塩基もしくは少なくとも10個のチミン塩基;または
ユニバーサル塩基および少なくとも1つの非ユニバーサル塩基
を含む、バッファー方法実施形態24~71のいずれかに記載の方法。
前記ブロッカーが、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み;
前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、前記アダプターのインデックス領域および/または前記アダプターのUMIに対応しない塩基を含む、バッファー方法実施形態24~72のいずれかに記載の方法。
PCRなしのハイブリッド捕捉の例示的な方法(捕捉方法実施形態)
および前記ライブラリーをプローブと接触させる工程
を含む、方法であって、前記プローブは、ライブラリーメンバー内の目的の領域にハイブリダイズし;
前記方法は、前記ライブラリーメンバーを配列決定する前にPCRを用いて前記ライブラリーメンバーを増幅する工程を含まない、方法。
0.5%~10%デキストラン硫酸、
0.05mg/mL~0.5mg/mLヒトCot-1DNA、
1%~15%(v/v)ホルムアミド、
40mM~80mM KH2PO4-K2HPO4、
0.1M~4M NaCl、および
0.001%~10%(v/v)Tween(登録商標)20
を含む、捕捉方法実施形態12に記載の方法。
前記ブロッカーが、アダプターに結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み;
前記アダプターのインデックス領域および/またはUMIに結合することができるブロッカーの領域が、
少なくとも3つのチミン塩基、少なくとも4つのチミン塩基、少なくとも5つのチミン塩基、少なくとも6つのチミン塩基、少なくとも7つのチミン塩基、少なくとも8つのチミン塩基、少なくとも9つのチミン塩基もしくは少なくとも10個のチミン塩基;または
ユニバーサル塩基および少なくとも1つの非ユニバーサル塩基
を含む、前述の捕捉方法実施形態のいずれか1つに記載の方法。
前記ブロッカーが、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み;
前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、前記アダプターのインデックス領域および/または前記アダプターのUMIに対応しない塩基を含む、前述の捕捉方法実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態
ハイブリダイゼーション
非強化ハイブリダイゼーションバッファーは、100μLのハイブリダイゼーション反応物中に以下の構成要素/最終濃度を含む:ヒトCot-1 0.2mg/ml、ホルムアミド 10%(v/v)、KH2PO4-K2HPO4 66.6mM、NaCl 0.8M、TWEEN(登録商標)20 0.04%(v/v)。
捕捉
実施例2-チミンを含むブロッカー
実施例4-スプリットブロッカー
実施例5-ハイブリダイゼーションバッファー
実施例6-改良型アダプター+強化ハイブリダイゼーションバッファー
実施例7A-TRUSEQアダプターライゲート済みライブラリーを用いたPCRなしのハイブリッド捕捉
1.ビーズを10μLの0.1N NaOHとインキュベートし、捕捉されたライブラリーをプローブから変性させ、溶液中に放出する。
2.捕捉されたライブラリー溶液をビーズから取り出し(磁石を用いて)、10μLの200mM Tris.HCl pH7.0で中和する。
3.(必要に応じて)変性させたPhiX Control v3(Illumina,Inc.,San Diego,CA)をサンプルに、最大7.5μLの再懸濁バッファー(RSB)(Illumina,Inc.,San Diego,CA)を加える。
4.27.5uLの2×HT1(ハイブリダイゼーションバッファー、Illumina,Inc.,San Diego,CA)を加える。
実施例7B-ビーズベースのNEXTERAライブラリーを用いたPCRなしのハイブリッド捕捉により、短いハイブリダイゼーション時間でエクソーム品質が改善される
実施例8-ブロッカーの比較
実施例9-スプリットブロッカーの比較
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
クラウディング剤と、ヒトCot-1DNA、不安定化剤、塩およびブロッカーのうちの少なくとも1つとを含むハイブリダイゼーションバッファー。
(項目2)
前記クラウディング剤が、デキストラン、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコール(PEG)、フィコール、グリセロールおよびベタインのうちの少なくとも1つを含む、項目1に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
(項目3)
クラウディング剤およびブロッカーを含む、項目1または項目2に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
(項目4)
クラウディング剤、ヒトCot-1DNA、ブロッカー、不安定化剤、バッファー、塩および界面活性剤を含む、項目1または項目2に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
(項目5)
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、バッファーを含み、前記バッファーは、リン酸バッファーである、項目1~4のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
(項目6)
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、塩を含み、前記塩は、NaClまたはクエン酸ナトリウムである、項目1~5のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
(項目7)
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、不安定化剤を含み、前記不安定化剤は、ホルムアミドもしくは尿素またはそれらの混合物である、項目1~6のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
(項目8)
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、界面活性剤を含み、前記界面活性剤は、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)80またはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である、項目1~7のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
(項目9)
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、
0.5%~10%デキストラン硫酸、
0.05mg/mL~0.5mg/mLヒトCot-1DNA、
1%~15%(v/v)ホルムアミド、
40mM~80mM KH 2 PO 4 -K 2 HPO 4 、
0.1M~4M NaCl、および
0.001%~10%(v/v)TWEEN(登録商標)20
を含む、項目1に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
(項目10)
前記ハイブリダイゼーションバッファーが、ブロッカーを含み、前記ブロッカーは、
(a)T m を高める複数の修飾;
(b)架橋オリゴヌクレオチド;修飾5-メチルデオキシシチジン(5-メチル-dc);2,6-ジアミノプリン;ロック核酸(LNA);架橋型核酸(BNA);三環式核酸;ペプチド核酸(PNA);C5修飾ピリミジン塩基;プロピニルピリミジン;モルホリノ;ホスホルアミダイト;および5’-ピレンキャップのうちの少なくとも1つを含む前記ブロッカーのT m を上昇させる複数の修飾;
(c)オリゴヌクレオチドであって、ここで、前記ブロッカーは、アダプターに結合する
ことができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み;前記アダプターの前記インデックス領域および/またはUMIに結合することができる前記ブロッカーの前記領域は、少なくとも3つのチミン塩基、少なくとも4つのチミン塩基、少なくとも5つのチミン塩基、少なくとも6つのチミン塩基、少なくとも7つのチミン塩基、少なくとも8つのチミン塩基、少なくとも9つのチミン塩基もしくは少なくとも10個のチミン塩基;またはユニバーサル塩基および少なくとも1つの非ユニバーサル塩基を含む、オリゴヌクレオチド;または
(d)接続されていない2つのオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記ブロッカーは、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列とインデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み;前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、前記アダプターの前記インデックス領域および/または前記UMIに対応しない塩基を含む、接続されていない2つのオリゴヌクレオチド
のうちの少なくとも1つを含む、項目1~9のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
(項目11)
富化ライブラリーを調製する方法であって、前記方法は、ハイブリダイゼーション混合物を形成するために、ライブラリーメンバー、項目1~10のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファーおよびプローブを含むハイブリダイゼーション混合物を、前記プローブがライブラリーメンバー内の目的の領域にハイブリダイズするのに十分な条件下で形成する工程を含み、ここで、前記プローブは、リガンドを含む、方法。
(項目12)
ハイブリダイズした後の前記プローブを、捕捉手段を用いて捕捉する工程、および
捕捉されたライブラリーメンバーを前記捕捉手段から富化ライブラリーメンバーを含む溶離液に溶離する工程であって、ここで、前記溶離液のDNA濃度は、1.3pM~250pMの範囲内である、工程
を含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記ハイブリダイゼーション混合物が、少なくとも2つのライブラリー調製物由来のサンプルを含み、ここで、各ライブラリー調製物の少なくとも10ng、少なくとも25ng、少なくとも50ng、少なくとも100ng、少なくとも200ngまたは少なくとも500ngのDNAが合わせられている、項目11または項目12に記載の方法。
(項目14)
前記ハイブリダイゼーション混合物のDNA濃度が、0.1ng/μL~120ng/μLの範囲内である、項目11~13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記富化ライブラリーメンバーを配列決定する工程を含み、前記方法は、前記ライブラリーメンバーを捕捉する工程の前に前記ライブラリーメンバーを増幅する工程を含まない、項目11~14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記配列決定する工程が、フローセル上で行われ、前記方法が、前記富化ライブラリーメンバーを少なくとも1.1pM、少なくとも1.2pM、少なくとも1.3pM、少なくとも10pMまたは少なくとも100pMの濃度かつ最大100pM、最大200pM、最大250pMまたは最大300pMの濃度で前記フローセルにロードする工程を含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
ダイレクトフローセルローディングジグを用いて、前記富化ライブラリーメンバーをフローセル上にロードする工程を含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
項目1~10のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファーおよび使用説明書を含む、キット。
(項目19)
オリゴヌクレオチドを含むブロッカーであって、前記ブロッカーは、アダプターに結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み、前記アダプターの前記インデックス領域および/またはUMIに結合することができる前記ブロッカーの前記領域は、少なくとも3つのチミン塩基、少なくとも4つのチミン塩基、少なくとも5つのチミン塩基、少なくとも6つのチミン塩基、少なくとも7つのチミン塩基、少なくとも8つのチミン塩基、少なくとも9つのチミン塩基もしくは少なくとも10個のチミン塩基;またはユニバーサル塩基および少なくとも1つの非ユニバーサル塩基を含む、ブロッカー。
(項目20)
接続されていない2つのオリゴヌクレオチドを含むブロッカーであって、前記ブロッカーは、アダプターの少なくとも一部に結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み、前記接続されていないオリゴヌクレオチドは、前記アダプターの前記インデックス領域および/または前記UMIに対応しない塩基を含む、ブロッカー。
(項目21)
前記ユニバーサルプライマー配列が、P5、P7、P5’、P7’、V2.A14.METS、V2.B15.METS、V2.A14.METSの相補鎖およびV2.B15.METSの相補鎖のうちの少なくとも1つを含む、項目19または項目20に記載のブロッカー。
(項目22)
前記ブロッカーが、修飾を含まない同じブロッカーと比べて前記ブロッカーのT m を上昇させる修飾を含む、項目19~21のいずれか1項に記載のブロッカー。
(項目23)
前記ブロッカーが、低GC領域を捕捉するように修飾されたDNAオリゴヌクレオチドまたはRNAオリゴヌクレオチド;架橋オリゴヌクレオチド;修飾5-メチルデオキシシチジン(5-メチル-dc);2,6-ジアミノプリン;ロック核酸(LNA);架橋型核酸(BNA);三環式核酸;ペプチド核酸(PNA);C5修飾ピリミジン塩基;プロピニルピリミジン;モルホリノ;ホスホルアミダイト;および5’-ピレンキャップのうちの少なくとも1つを含む、項目19~22のいずれか1項に記載のブロッカー。
Claims (17)
- クラウディング剤、ヒトCot-1DNA、不安定化剤、塩およびブロッカーを含むハイブリダイゼーションバッファーであって、前記ブロッカーは、アダプターに結合することができ、前記アダプターは、ユニバーサルプライマー配列と、インデックス領域またはユニーク分子識別子(UMI)のうちの少なくとも1つとを含み;前記アダプターの前記インデックス領域および/またはUMIに結合することができる前記ブロッカーの領域は、少なくとも3つのチミン塩基、少なくとも4つのチミン塩基、少なくとも5つのチミン塩基、少なくとも6つのチミン塩基、少なくとも7つのチミン塩基、少なくとも8つのチミン塩基、少なくとも9つのチミン塩基もしくは少なくとも10個のチミン塩基を含む、ハイブリダイゼーションバッファー。
- 前記クラウディング剤が、デキストラン、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコール(PEG)、フィコール、グリセロールおよびベタインのうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
- クラウディング剤、ヒトCot-1DNA、ブロッカー、不安定化剤、バッファー、塩および界面活性剤を含む、請求項1または請求項2に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
- 前記ハイブリダイゼーションバッファーが、バッファーを含み、前記バッファーは、リン酸バッファーである、請求項1~3のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
- 前記塩は、NaClまたはクエン酸ナトリウムである、請求項1~4のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
- 前記不安定化剤は、ホルムアミドもしくは尿素またはそれらの混合物である、請求項1~5のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
- 前記ハイブリダイゼーションバッファーが、界面活性剤を含み、前記界面活性剤は、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)80またはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である、請求項1~6のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。
- 前記ハイブリダイゼーションバッファーが、
0.5%~10%デキストラン硫酸、
0.05mg/mL~0.5mg/mLヒトCot-1DNA、
1%~15%(v/v)ホルムアミド、
40mM~80mM KH2PO4-K2HPO4、
0.1M~4M NaCl、および
0.001%~10%(v/v)TWEEN(登録商標)20
を含む、請求項1に記載のハイブリダイゼーションバッファー。 - 前記ブロッカーは、
(a)Tmを高める複数の修飾;または
(b)架橋オリゴヌクレオチド;修飾5-メチルデオキシシチジン(5-メチル-dc);2,6-ジアミノプリン;ロック核酸(LNA);架橋型核酸(BNA);三環式核酸;ペプチド核酸(PNA);C5修飾ピリミジン塩基;プロピニルピリミジン;モルホリノ;ホスホルアミダイト;および5’-ピレンキャップのうちの少なくとも1つを含む前記ブロッカーのTmを上昇させる複数の修飾
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファー。 - 富化ライブラリーを調製する方法であって、前記方法は、ハイブリダイゼーション混合物を形成するために、ライブラリーメンバー、請求項1~9のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファーおよびプローブを含むハイブリダイゼーション混合物を、前記プローブがライブラリーメンバー内の目的の領域にハイブリダイズするのに十分な条件下で形成する工程を含み、ここで、前記プローブは、リガンドを含む、方法。
- ハイブリダイズした後の前記プローブを、捕捉手段を用いて捕捉する工程、および
捕捉されたライブラリーメンバーを前記捕捉手段から富化ライブラリーメンバーを含む溶離液に溶離する工程であって、ここで、前記溶離液のDNA濃度は、1.3pM~250pMの範囲内である、工程
を含む、請求項10に記載の方法。 - 前記ハイブリダイゼーション混合物が、少なくとも2つのライブラリー調製物由来のサンプルを含み、ここで、各ライブラリー調製物の少なくとも10ng、少なくとも25ng、少なくとも50ng、少なくとも100ng、少なくとも200ngまたは少なくとも500ngのDNAが合わせられている、請求項10または請求項11に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション混合物のDNA濃度が、0.1ng/μL~120ng/μLの範囲内である、請求項10~12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記富化ライブラリーメンバーを配列決定する工程を含み、前記方法は、前記ライブラリーメンバーを捕捉する工程の前に前記ライブラリーメンバーを増幅する工程を含まない、請求項10~13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記配列決定する工程が、フローセル上で行われ、前記方法が、前記富化ライブラリーメンバーを少なくとも1.1pM、少なくとも1.2pM、少なくとも1.3pM、少なくとも10pMまたは少なくとも100pMの濃度かつ最大100pM、最大200pM、最大250pMまたは最大300pMの濃度で前記フローセルにロードする工程を含む、請求項14に記載の方法。
- ダイレクトフローセルローディングジグを用いて、前記富化ライブラリーメンバーをフローセル上にロードする工程を含む、請求項15に記載の方法。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションバッファーおよび使用説明書を含む、キット。
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