JP7054398B2 - 改変されたマルチプレックスおよびマルチステップ増幅反応ならびにそのための試薬 - Google Patents

改変されたマルチプレックスおよびマルチステップ増幅反応ならびにそのための試薬 Download PDF

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Description

本発明は、特に重複アンプリコンが産生される場合のマルチプレックス核酸増幅の効率を改良するための試薬および方法に関する。本発明はまた、マルチステップ核酸増幅の効率、特に同じ反応混合物中または反応容器中で連続的に起こるように設計された２つの個別の増幅反応の性能を改良する為の試薬および方法に関する。本発明はさらに、第１の増幅反応のアウトプットを制御することによってマルチステップ核酸増幅反応を改良するための試薬および方法に関する。特に、異常な増幅生成物の形成を最小化するプライマーが提供される。そのようなプライマーは第１の増幅反応および第２の増幅反応が単一の反応混合物中または反応容器中で起こる場合に特に有用である。
マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ｍＰＣＲ）はＰＣＲの変形であり、単一の核酸増幅反応に核酸増幅プライマーまたはＰＣＲプライマーの２つ以上の対を含ませることによって２つ以上の標的配列を増幅することができる。マルチプレックスＰＣＲは実験室において時間と労力をかなり削減できる可能性を有している。１９８８年にこれが最初に記述されて以来、この手法は遺伝子欠失解析、変異および多形の解析、定量解析、ならびに逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ等のヒトにおけるＤＮＡ検査の多くの領域に適用され成功してきた。感染症の分野では、マルチプレックスＰＣＲはウイルス、細菌、および寄生体の同定のための価値あるツールであることが示されてきた。
しかしｍＰＣＲの最適化には、感度が低い、特異性が低い、ある種の特定の標的が優先的に増幅される、および／または意図しない配列が増幅される等のいくつかの難点がある。
他の標的配列に対する１つの標的配列の優先的な増幅は、ｍＰＣＲにおける既知の現象である。この傾向を誘起する２つの主なプロセスの種類が確認されており、それはＰＣＲドリフトとＰＣＲ選択である。ＰＣＲドリフトは、特に初期のサイクルにおいて、特にテンプレートの濃度が極めて低い場合のＰＣＲ試薬の相互作用の変動によると考えられる傾向である。一方、ＰＣＲ選択は標的の特性、標的の横にある配列、または標的ゲノム全体によるある種のテンプレートの増幅に有利な機構として定義される。これらの特性には、短い配列の優先的な増幅が含まれる。
特に、マルチプレックスＰＣＲにおける２つ以上のプライマー対の存在により、たとえば短い、望ましくない断片の優先的な増幅によって異常な増幅生成物が得られる機会が増大する。ｍＰＣＲを実施する際に直面する異常な（意図しない）アンプリコンの増幅の論点を図１に示す。
本発明者らの目的は、マルチプレックスＰＣＲに基づく検査の開発において、単一の検査で多重の反応容器の使用を必要とする、不要で異常な生成物（短い異常な生成物が好ましい）の問題に対処することである。例として、ＢＲＣＡ遺伝子の重複領域を増幅する現在のＰＣＲ検査は、標的配列が信頼性をもってカバーされていることを保証するために４つの個別のチューブで増幅を実施することを必要とする。このため、検査が複雑になる。
典型的には、マルチプレックスＰＣＲは２つの個別の反応で起こることになる。第１の反応では、標的特異的プライマーとユニバーサルタグとのセットを用いてそれぞれのアンプリコンにユニバーサルフォワードタグおよびユニバーサルリバースタグを付加する。次いでその生成物を第２の増幅反応の前に精製する。次に第２の反応では、これらのタグに対して設計されたユニバーサルプライマーを用いて全てのアンプリコンを増幅し、さらなるプロセシングおよび同定の目的のために必要な任意のさらなる配列（アダプター等）を付加する。
このシステムは次善の策であり、労力がかかる。さらに、第１のステップの後に反応混合物を停止し分離する必要があるので、過誤の可能性やシステムへの夾雑がもたらされる。したがって、単一の反応容器中でこれらのステップの両方を実施できる方法を特定することが望ましい。
本発明者らはマルチプレックスおよびマルチステップの核酸増幅反応において遭遇した問題への種々の解決策を考案した。理想的には、種々の解決策を組み合わせて、第１の増幅とそれに続く「ユニバーサル」増幅（即ち、標的配列に関わらない共通のプライマー対に基づく）において、重複する標的配列の増幅を可能にし、アダプター配列を、さらなる検出方法、好ましくは次世代シーケンシングに用いることができる最終増幅生成物に組み込むことができる。明確にするため、改良されるそれぞれの領域を個別の見出しの下に記述し、その後に種々の組合せを論じる。しかし、有利に組み合わせるための種々の解決策が考案され、そのような全ての組合せが本発明の範囲内で予想されることに留意されたい。改良の１つの領域に関して記述した選択肢が他の領域、たとえば試料のタイプ、核酸のタイプ等にも必要に応じて変更して適用できることも認識されたい。しかし、本発明の全ての態様に共通の要素の理解を容易にするため、以下の導入的定義を提供する。このような定義は本発明の開示にわたって適用され、それぞれの態様をさらに詳しく記述する場合には追加の説明を提供する。
本発明は核酸増幅反応に関する。本発明の全ての態様によれば、核酸増幅は典型的にまた好ましくはＰＣＲによる。しかし、本発明は当業者によって認識され、必要な他の増幅システムに適合させることができる。
本発明は特に、２つ以上の標的配列が並列に増幅されるマルチプレックス核酸増幅に関する。これは典型的には単一の核酸増幅反応に２つ以上の核酸増幅プライマー対を含ませることによって達成される。本発明のいくつかの態様によれば、マルチプレックス増幅には標的核酸分子の重複領域を増幅するプライマー対が関連している。
本発明はまた、２つ以上の異なった増幅反応が起こるマルチステップ核酸増幅に関する。典型的には、第１の増幅反応は標的の核酸分子を増幅する標的特異的プライマーを利用する。標的特異的プライマーはユニバーサルタグも含んでいる。ユニバーサルタグは反応が進行するとともに増幅生成物に組み込まれる。第２の増幅反応では、次にこれらのタグ配列とハイブリダイズするように設計されたユニバーサルプライマーが用いられて第１の増幅からの増幅生成物が増幅される。第２の増幅にはさらなるプロセシングおよび同定の目的のために必要なさらなる配列（アダプター等）を組み込むプライマーが関与している。したがって、「ユニバーサル」増幅の概念は、増幅される最初の標的分子の特異的なターゲット配列に依存せずに増幅が実施されるという事実によって支配される。これは、第２の増幅においてプライマー結合部位として作用することができる付加的な配列（いわゆる「ユニバーサルタグ」）を、第１の増幅反応の増幅生成物に組み込むことによっている。したがって、第２の増幅におけるプライマーのプライマー領域は、ユニバーサルタグ配列に対応している。そのようなプライマー領域に含まれるプライマーを、本明細書では「ユニバーサルプライマー」と称する。
本発明によれば標的の核酸分子に制限はない。本発明の試薬および方法を用いて任意の好適な標的核酸分子を増幅することができる。多くの異なった標的核酸分子を標的とすることができる。これには多重標的核酸特異的プライマー対の使用が含まれる。本発明の全ての態様によれば、標的の核酸分子が二本鎖である場合には、それぞれの特異的プライマー対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー領域は、それぞれ二本鎖標的核酸分子の逆平行の相補的鎖に相補的または実質的に相補的であり、これとハイブリダイズすることができる。もちろん、増幅プロセスの間に標的の核酸分子が増幅される（複製される）とともに、それぞれの特異的プライマー対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれのプライマー領域を介して、増幅の間に形成された、増幅された（複製された）標的核酸分子の相補領域に結合することができる。これは事実上、当技術で既知の増幅プロセスに照らして当業者には明白であるように、増幅された（複製された）標的の核酸分子が（指数関数的に）増幅の間に形成されるとともに、優先的に起こることになる。したがって、「標的核酸分子」という用語は、増幅が始まる前に存在していた最初の標的核酸分子の部分としてか、増幅の間に産生された標的核酸分子であるかにかかわらず、増幅すべき核酸分子の所望の領域を意味する。したがって、「最初の標的核酸分子」という用語は、増幅が始まる前に存在していた標的核酸分子（即ちもとの試料から抽出された）を意味するために用いられる。
好ましい実施形態では、本発明の全ての態様によれば、標的核酸分子はＤＮＡ分子である。ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ等でよい。ゲノムＤＮＡが好ましい。ＤＮＡは任意の好適な試料から精製してよい。試料の種類には血液試料（特に血漿、およびまた血清から）、唾液、尿またはリンパ液等のその他の体液が含まれる。その他の試料の種類には凍結組織またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）材料等の固体組織が含まれる。特に好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子である。鎖は当技術で慣用されているように、それぞれ「センス」または「コーディング」鎖および「アンチセンス」または「非コーディング」鎖と称される。これらの実施形態では、特異的プライマー対のフォワードプライマーのプライマー領域はアンチセンス鎖の領域に相補的であり、同じ特異的プライマー対のリバースプライマーのプライマー領域は、フォワードプライマーが結合している領域の下流のセンス鎖の領域に相補的である。代替の実施形態では、ＤＮＡ分子は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子である。いくつかの実施形態では、ｓｓＤＮＡはもとの試料中で既にインサイチューで変性している。たとえば、ｓｓＤＮＡはＦＦＰＥ材料から精製してよい。ｓｓＤＮＡを用いる場合は、特異的プライマー対のフォワードプライマーまたはリバースプライマーのプライマー領域はｓｓＤＮＡ分子に相補的である。特異的プライマー対の他方のプライマーは、増幅サイクルの間に形成された相補的ｓｓＤＮＡ分子に相補的で、したがってこれとハイブリダイズするプライマー領域を含む。さらなる実施形態では、最初の標的核酸分子はｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ分子の両方として存在してよい。たとえば、ＦＦＰＥ材料から精製したＤＮＡの場合には、ＤＮＡはｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡの両方を含んでよい。ＤＮＡは試料中の細胞の中に見出され、またはこれから誘導される。あるいは、ＤＮＡは循環する、または「無細胞」ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）であってよい。そのようなＤＮＡは血液試料（特に血漿、およびまた血清から）、唾液、尿またはリンパ液等の他の体液を含む種々の体液から得ることができる。
いくつかの実施形態では、本発明の全ての態様によれば、標的核酸分子はＲＮＡ分子から誘導される。ＲＮＡは上で論じたＤＮＡと同じ試料の種類から得てよい。ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等であってよい。ｍＲＮＡが好ましい。そのような実施形態では、ＲＮＡは典型的には逆転写酵素によって逆転写されて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を形成し、次いでこれを本発明のプライマーを用いて増幅することができる。逆転写酵素によってＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は当技術で公知である。任意の好適な逆転写酵素を用いることができ、好適な逆転写酵素の例は当技術で広く利用可能である。したがってそのような実施形態では、最初の標的核酸分子はｃＤＮＡ分子である。ＤＮＡポリメラーゼを用いて相補的鎖を産生させるまでは、最初のｃＤＮＡ分子は一本鎖であってよい。相補的鎖のこの合成は、本発明のプライマーを用いて実施することができる。二本鎖ＤＮＡ分子がいったん生成すれば、本発明のプライマー対はさらなる増幅を指令することができる。したがって、特定の実施形態では、本発明の全ての態様によれば、試料からのＲＮＡは最初にｃＤＮＡに逆転写され、次いで本明細書で定義したプライマーのセットを用いてｃＤＮＡ分子が増幅される。逆転写反応およびこれに続く増幅反応は、（好ましくは）同じ反応容器中で起こってよい。
したがって、明らかになるように、本発明の全ての態様によれば、それぞれのプライマーの「プライマー領域」は、標的核酸分子の鎖とハイブリダイズして（ＤＮＡ）ポリメラーゼ酵素による新たな相補的核酸分子鎖の合成を指令することができるプライマーの領域を画定する。
標的核酸分子は任意の好適な試料から得てよい。容易に認識されるように、本発明の方法はインビトロ法であり、予め単離された試料を用いて実施してよい。好ましい実施形態では、試料はヒト対象から得てよい。しかし、本発明の種々の態様によれば、任意の供給源からの任意の核酸含有試料が増幅に受け入れられる可能性がある。
標的核酸分子を増幅するように設計されたプライマー対は、一般にタグを組み込んでいる。これらのタグは、本発明の大多数の実施形態において、ユニバーサル増幅が起こるために重要であり、本明細書では「ユニバーサルタグ」と称する。そのようなタグは最初の標的核酸分子とハイブリダイズする必要はない。この機能はプライマー領域によって提供される。しかし、いったんタグが増幅生成物に含まれると、これらは第２の増幅ステップでユニバーサルプライマーがハイブリダイズする次の標的として作用することができる。好適なタグは当技術で公知である。典型的には、タグはユニバーサルプライマーがその配列に対して特異的に設計されることを可能にするために十分な長さを有する。したがって、これらは典型的には２０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。本発明によって有用なタグは配列番号１（タグ１）または配列番号２（タグ２）のヌクレオチド配列を含み、実質的にこれらからなり、またはこれらからなる。
本発明の全ての態様によれば、第２の増幅はさらなる増幅生成物にアダプター配列を含ませるように用いられる。アダプター配列は下流のプロセシングのための任意の好適な配列であってよい。下流のプロセシングによって、標的核酸を試料中で検出し、および／または定量することが可能になる。たとえば、好適な固体表面上に固定されたオリゴヌクレオチドに相補的なアダプター配列によって、そのようなアダプターを組み込んだ配列の固定が可能になる。その他の応用は、液体中のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするアダプターによっている。アダプターはアレイに基づく解析またはシーケンシングに基づく解析に有用である。本発明の全ての態様による好ましい実施形態では、アダプター配列は高スループット核酸シーケンシングのための任意の好適なアダプター配列であってよい。そのようなシーケンシングは典型的には、また好ましくは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プラットフォームを用いて実施される。ＮＧＳプラットフォームの例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング（Ｈｉ－ＳｅｑおよびＭｉ－Ｓｅｑ等）、ＳＭＲＴシーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ナノポアシーケンシング、ＳｏＬＩＤシーケンシング、パイロシーケンシング（たとえばＲｏｃｈｅ４５４）、単分子シーケンシング（ＳｅｑＬＬ／Ｈｅｌｉｃｏｓ）、およびＩｏｎ－Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が含まれ、これらは当業者には公知である。当業者には知られているように、アダプター配列はシーケンシングのための好適な固体表面（その性質はフローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ゼロモードウェーブガイド（ＳＭＲＴ）またはビーズ（パイロシーケンシング）等のシーケンシングプラットフォームによる）に固定されたオリゴヌクレオチドに相補的である。本発明はアダプター配列の細目に関して限定することを意図していない。本発明の利点は、下流のプロセシングをいかにして実施するかよりむしろ、増幅試薬およびプロセスの改変にある。アダプターの具体的な例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑプラットフォームによるシーケンシングに有用なｐ５アダプターおよびｐ７アダプター、ならびにＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｉｏｎ－Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォームを用いるシーケンシングに有用なＡアダプターおよびＰ１アダプターが含まれる。
本発明の種々のプライマーは増幅生成物にバーコードを含ませるためにも用いられる。バーコード配列は当技術で公知である。第１の増幅に用いる標的特異的プライマーに関する本発明の態様のため、分子バーコードが有利にプライマーに含まれる。分子バーコードは、それが組み込まれる次のアンプリコンをシーケンシング後のインシリコ解析において同定することを可能にする特定の核酸配列である。
第２ラウンドの増幅（典型的にはいわゆる「ユニバーサル」増幅、好ましくはユニバーサルＰＣＲ）を含む本発明の態様に特に関係するバーコードの主な形態は、試料バーコードである。したがって、試料バーコードは有利には第２ラウンド増幅（即ちユニバーサル）プライマーに含まれてよい。試料バーコード配列は試料の同定を可能にするために用いられる。これは単一のシーケンシング操作で複数の試料を検討する場合に有利である。しかし、これは任意選択的にある。いくつかの応用、たとえば試料のウルトラディープシーケンシングのため、試料バーコード配列は冗長であってよい。含まれる場合には、試料バーコード配列は高スループット核酸シーケンシングのための任意の好適な試料バーコード配列であってよい。いくつかの実施形態では、バーコード配列は選択したＮＧＳプラットフォームに基づいて選択してよい。試料バーコード配列は本明細書では分子識別子（ＭＩＤ）配列またはユニークインデックス配列と称してもよい。これは特定のアンプリコンの起源を同定し、特定の起源を有するアンプリコンをグループ化するために、シーケンシング後のインシリコ解析において用いることができる所定の（他のバーコード配列に比較して）ユニークな配列である。そのような配列の使用は当技術で公知である。特定の実施形態では、それぞれの試料バーコードの長さは少なくとも４、６または８ヌクレオチドであり、任意選択的に２０ヌクレオチドまでである。
本発明のいくつかの態様では、プライマーまたはプライマーをコードする配列はブロッキング基を含んでよい。ブロッキング基は関係する配列の望ましくない伸長を防止する。この目的のため任意の好適なブロッキング基を使用することができ、用いることができるブロッキング基は当業者には周知である。ある実施形態では、ブロッキング基は３’ｄｄＣ、３’反転ｄＴ、３’Ｃ３スペーサー（Ｃ３プロパンジオールスペーサー等）、３’アミノ、および３’ホスホリル化から選択される。
本発明の重要な利点は、単一の反応混合物中でマルチプレックス反応およびマルチステップ反応を実施する能力である。「単一反応混合物」は、関係する増幅生成物（第１ラウンドおよび第２ラウンドの両方）を産生することを含むそれまでの方法ステップの全てが、成分を分離しまたは除去する必要なく行なわれることを意味する。特に、ユニバーサル増幅の前に第１の増幅生成物を精製する必要はない。いくつかの実施形態では、本方法（即ち、さらなる増幅生成物を産生する）に必要な全ての試薬は、第１の増幅を行う前に合わせられる。したがって、本方法は単一の反応容器中で実施される。いったん反応混合物が形成されれば（増幅そのもの、たとえばサーマルサイクリングの実施は別として）さらなる増幅生成物が産生されるまで、反応容器をさらに操作する必要はない。したがって本方法は「ワンチューブの」または「均一な」方法と考えてよい。本発明は、本明細書に記載した増幅反応を実施するために必要な試薬を含む反応容器に関する。
疑念を避けるため、本発明の方法はさらなる増幅生成物の産生の後の（即ち、ユニバーサル、または第２ラウンドの増幅の後の）追加のステップの実施を包含している。そのような方法は反応容器の同じ反応混合物に制約されない。そのような方法は典型的には標的核酸分子の検出、および多くの場合に定量を含む。好ましい実施形態では、本発明の方法は特定の標的核酸分子を同定し、任意選択的に定量するために用いられる。好ましい実施形態では、本方法はさらなる増幅生成物のシーケンシングをさらに含む。シーケンシングは典型的には大量並列法で実施される。好ましくは、シーケンシングは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）手法を用いて実施される。シーケンシングは本発明の増幅反応の反応混合物とは異なる反応混合物中で起こり得る。
用語「アンプリコン」は本明細書で「増幅生成物」と相互交換可能に用いられる。
＜重複標的配列を含むマルチプレックス増幅の改良＞
本発明者らは、重複標的配列を含むマルチプレックス増幅（特にｍＰＣＲ）を実施するための改良された試薬を開発した。特に本発明者らはｍＰＣＲ等のマルチプレックス核酸増幅アッセイにおいて異常なアンプリコン（即ち意図しないアンプリコン）の増幅を制限しまたは無効にする手段を提供する。これは単一の反応容器中または混合物中でマルチプレックス核酸増幅アッセイを行うために特に有利である。それにより、個別の反応容器中または混合物中で重複増幅反応を実施する必要がなくなる。
したがって、第１の態様では、本発明は標的核酸分子の重複領域のマルチプレックス増幅における使用のためのプライマーのセットを提供し、このセットは、
ａ．標的核酸分子の第１の領域を増幅するように設計された第１のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域を組み込んだ第１のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだ第１のリバースプライマー
を含む、第１のプライマー対、
ｂ．第１の領域と少なくとも部分的に重複する標的核酸分子の第２の領域を増幅するように設計された第２のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域および第１のリバースプライマーの５’末端に組み込まれた核酸タグと５’から３’への方向で同一であるプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだ第２のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域を組み込んだ第２のリバースプライマー
を含む、第２のプライマー対
を含み、
第１のリバースプライマーと第２のフォワードプライマーとの間に異常な（短い）増幅生成物が形成される事象において、異常な（短い）増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な（短い）増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成される。この概念を説明するため、これを図２に示す。標的核酸分子の第１の領域は標的核酸分子の第２の領域の上流（５’から３’への方向で（二本鎖の場合のセンス鎖で））にある。
いくつかの実施形態では、第１のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーはまた、プライマー領域の５’の核酸タグを組み込んでいる。さらに、第１のフォワードプライマーの核酸タグと第２のリバースプライマーの核酸タグは５’から３’への方向で同一であり、それにより、第１のフォワードプライマーと第２のリバースプライマーとの間に異常な（長い）増幅生成物が形成される事象において、異常な（長い）増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な（長い）増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成される。この概念を説明するため、これを図４に示す。
したがって、本明細書の全ての態様によれば、異常な増幅生成物は長さによって（相互に、また必要であれば所望の増幅生成物から）区別することができる。「短い」異常な増幅生成物は、第１のプライマー対のリバースプライマーがすぐ下流にある第２のプライマー対のフォワードプライマーと増幅生成物を形成することによって生じる。対照的に、「長い」異常な増幅生成物は、第１のプライマー対のフォワードプライマーがすぐ下流にある第２のプライマー対のリバースプライマーと増幅生成物を形成することによって生じる。短い異常生成物は特に問題であり、したがって本発明の１つの焦点である。
標的核酸分子の特定の領域を増幅するように設計された特定のプライマー対における両方のプライマーがプライマー領域の５’の核酸タグを含む場合には、対におけるそれぞれのプライマーに組み込まれた核酸タグ（たとえば第１のフォワードプライマーの核酸タグおよび第１のリバースプライマーの核酸タグ）は異なっている。したがって、タグは実質的に同一でなく、好ましくは５’から３’への方向で同一性を共有しない。したがって、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する機構は避けられる。所望の増幅生成物の３’末端には５’核酸タグへのリバース相補配列は形成されず、分子内ハイブリダイゼーション事象が起こることが可能になる。この概念を説明するため、これを図４に示す。
さらなる実施形態では、プライマーのセットは、
ａ．第２の領域と少なくとも部分的に重複する標的核酸分子の第３の領域を増幅するように設計された第３のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだ第３のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域を組み込んだ第３のリバースプライマー
を含む、第３のプライマー対をさらに含み、
第３のフォワードプライマーの核酸タグと、第２のリバースプライマーの核酸タグは、ともに５’から３’への方向で同一であり、それにより、第３のフォワードプライマーと第２のリバースプライマーとの間に異常な（短い）増幅生成物が形成される事象において、異常な（短い）増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な（短い）増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な（短い）増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成される。この概念を説明するため、これを図５Ａ～Ｃに示す。標的核酸分子の第３の領域は標的核酸分子の第２の領域の下流（即ちセンス鎖の５’から３’への方向で）にある。
さらなる実施形態では、第３のリバースプライマーはまた、プライマー領域の５’の核酸タグを組み込んでおり、第２のフォワードプライマーの核酸タグと第３のリバースプライマーの核酸タグも５’から３’への方向で同一であり、それにより、第２のフォワードプライマーと第３のリバースプライマーとの間に異常な（長い）増幅生成物が形成される事象において、異常な（長い）増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な（長い）増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成されることをさらに特徴とする。この概念を説明するため、これを図５Ａ～Ｃに示す。
同様に、プライマーのセットは、第３の領域の下流（センス鎖の５’から３’への方向で）にあり、これと少なくとも部分的に重複する標的核酸分子の第４の領域、第４の領域の下流（センス鎖の５’から３’への方向で）にあり、これと少なくとも部分的に重複する標的核酸分子の第５の領域、等々をそれぞれ増幅するように設計された第４のプライマー対、第５のプライマー対、等々をさらに含んでよく、第４、第５等のプライマー対は、第１、第２または第３のプライマー対について記述した１つまたは複数の核酸タグを、必要に応じて変更して有してよい。本発明による単一マルチプレックス増幅反応（ｍＰＣＲ等）において同時に用いることができるプライマーのセットにおけるプライマー対の総数には特に制限はないが、その代わり当業者には理解されるように所望のアンプリコンの数、用いる（ＤＮＡ）ポリメラーゼの効率による。特定の実施形態では、プライマーのセットにおけるプライマー対の数は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００等であってよい。特定の実施形態では、プライマーのセットにおけるプライマー対の数は５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００等までであってよい。本発明によればマルチプレックスフォーマットで大きなＤＮＡ標的を効率的に増幅し、異常な増幅生成物の生成を最小化しまたは排除することを可能にするためにこの配置に従う任意の数のプライマー対が提供される。プライマー対の任意の所望の総数に従って、隣接するプライマー対の間の同一のタグの相互配置を用いることができる。同様に、単一の反応において複数の異なった標的をマルチプレックス化することができる。標的の少なくとも１つおよび好ましくは全ての標的が重複領域の増幅に関与し、したがって本発明のプライマーのセットを用いて増幅することができる。
したがって、主要で高度に有利な態様においては、本発明は、標的核酸分子の重複領域のマルチプレックス増幅における使用のためのプライマーのセットであって、
ａ．標的核酸分子の重複領域を増幅するように設計された少なくとも２つのプライマー対を含み、それぞれのプライマー対が
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだリバースプライマー
を含む、少なくとも２つのプライマー対を含み、
それぞれのプライマー対におけるフォワードプライマーとリバースプライマーの核酸タグが異なっており、直近のプライマー対におけるフォワードプライマーとリバースプライマーのタグが５’から３’への方向で同一であり、それにより、直近のプライマー対のフォワードプライマーとリバースプライマーの間で異常な増幅生成物が形成される事象において異常な増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成される、プライマーのセットを提供する。
本明細書に記述した「プライマー対」は特定の所望の増幅生成物を生成するように設計されたプライマーの対を意味することに注意されたい。したがって、プライマー対は意図せずに異常な増幅生成物の産生をもたらすプライマーを記述するために用いる用語ではない。それぞれのプライマー対におけるフォワードプライマーとリバースプライマーの核酸タグは異なっている。これはさらに増幅されることが防止される意図した増幅生成物の産生を阻害する。それと対照的に、直近のプライマー対におけるフォワードプライマーとリバースプライマーのタグは５’から３’への方向に同一である。本明細書で詳細に説明するように、そのような配置によって、直近のプライマー対のフォワードプライマーとリバースプライマーとの間で異常な増幅生成物が形成される事象において、異常な増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こる。これにより、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造の形成がもたらされる。したがって、プライマー対の中およびその間のタグのこの全体の配置によって、長短両方の異常な増幅生成物のさらなる産生が阻害される。
本発明の全ての態様によれば、核酸タグは最初の標的核酸分子に相補的でなく、したがってこれとハイブリダイズすることができないプライマーの領域である。その５’末端における核酸タグとその３’末端における相補配列を含む異常な増幅生成物（これは図３Ａ～Ｃに示し、本明細書に詳しく説明したように、増幅の間に産生される）が形成されると、核酸タグと異常な増幅生成物の３’末端におけるその相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成される。
より具体的には、増幅のラウンドまたはサイクル（これらの用語は本明細書で相互交換可能に用いられる）の間に異常な増幅生成物が生成し、次の増幅のラウンドまたはサイクルで（当技術で公知のＰＣＲ等の増幅方法ごとに）単一の核酸鎖に解離する（融解する）ために十分な程度に加熱されると、アニーリングステップの間に温度が引き続いて低下された際に、核酸タグと一本鎖の異常な増幅生成物の３’末端におけるその相補配列とのハイブリダイゼーションは、一本鎖の異常な増幅生成物とさらなるプライマーとの分子間ハイブリダイゼーションよりも有利になる。この分子内ハイブリダイゼーション事象によって、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成される。タグと相補体との相互作用により、ヘアピンまたは馬蹄形の分子が産生される。二次構造の正確なコンフォメーションは重要ではない。重要なことは、分子の末端の間の相互作用が異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害するということである。
タグはヌクレオチドの配列から形成され、（ＤＮＡ）ポリメラーゼが相補配列を合成するためのテンプレートとしてこれらを用いることができれば、ＤＮＡ系、ＲＮＡ系、またはそれらの組合せであってよい。好ましくはこれらはＤＮＡからなっている。核酸タグはカノニカルヌクレオチドおよび／または非カノニカルヌクレオチドを含んでよい。カノニカルヌクレオチドにはグアニン、シトシン、チミン、アデニン、およびウラシルが含まれる。非カノニカルヌクレオチドにはイノシン、チオウリジン、イソグアニン、イソシトシン、およびジアミノピリミジンが含まれる。好適な相補的塩基対形成、即ち相互にハイブリダイズすることができるヌクレオチドの対である塩基対形成は、当業者にはよく知られている。
融解温度（Ｔｍ）は当技術で（および本明細書において）核酸デュプレックスの二本鎖が解離して一本鎖になる温度と定義される。したがって、Ｔｍはデュプレックスの安定性の指標を提供する。特定の実施形態では、相補的タグ由来配列（短い異常増幅生成物における）の間の分子内ハイブリダイゼーションによる二次構造のＴｍは、標的配列への分子間ハイブリダイゼーションに関連するプライマーのＴｍ最高値より高い。したがって、プライマーをその標的核酸分子の相補的結合領域から解離させる温度では、核酸タグと一本鎖の異常な増幅生成物の３’末端におけるその相補配列との間で形成された二次構造は変化しないままであり、したがって異常な増幅生成物のさらなる増幅は阻害される。特に、相補的タグ由来配列（短い異常な増幅生成物における）の間の分子内ハイブリダイゼーションによる二次構造のＴｍは、標的配列への分子間ハイブリダイゼーションに関連するプライマーのＴｍ最高値より、少なくとも１または２℃高く、任意選択的に３、４、５、６、７、８、９もしくは１０℃またはそれ以上高くてよい。
本発明のプライマーに組み込まれたタグはユニバーサルタグを含み、実質的にこれからなり、またはこれからなってよい。このユニバーサルタグ配列は増幅生成物に含まれ、したがってユニバーサルプライマーの使用を必要とする第２の増幅が起こることを可能にする。本明細書で定義したプライマーの対（即ち所望の増幅生成物を増幅するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー）については、フォワードプライマーに組み込まれたユニバーサルタグ配列はリバースプライマーに組み込まれたユニバーサルタグ配列とは異なる。これにより、さらなる増幅が防止される意図された（所望の）増幅生成物の産生が防止される。しかし、そのようなタグ配列の以前の実施とは対照的に、本発明では直近のプライマー対におけるフォワードプライマーとリバースプライマーのユニバーサルタグは５’から３’への方向で同一である。本明細書で詳細に説明するように、そのような配置によって、直近のプライマー対のフォワードプライマーとリバースプライマーとの間で異常な増幅生成物が形成される事象において、異常な増幅生成物の５’末端のユニバーサルタグと増幅の間に形成された異常な増幅生成物の３’末端の相補配列との間で分子内ハイブリダイゼーション事象が起こることが保証される。これにより、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造の生成がもたらされる。したがって、プライマー対の中およびその間のユニバーサルタグのこの全体の配置によって、長短両方の異常な増幅生成物のさらなる産生が阻害される。
ユニバーサルタグ配列は、同じ配列の対が全てのプライマーに使用されるので、いわゆる「ユニバーサル」であることを理解されたい。次いで第２ラウンドの増幅が、標的配列に関わらず、単一のユニバーサルプライマー対によって指令される。しかし本発明では、隣接するプライマー対の間のタグの相互配置は、ユニバーサルプライマーが第１の増幅反応の生成物を増幅するために対応する様式で作用することを単に意味している。典型的には、そのような増幅生成物は分子のそれぞれの末端にタグおよびアダプター配列を組み込む。これを本明細書でさらに論じ、一般的概念を図６Ａ～Ｃに示す。
この配置が第２の増幅において異常な増幅生成物をさらに抑制しまたは排除する機会を提供することはさらに留意に値する。もし何らかの望ましくない増幅生成物がユニバーサルプライマーによって増幅されることができるならば、これらはいずれかの末端に相補的アダプターまたは任意選択的にバーコード配列をさらに組み込むことになる。それにより鎖のいずれかの末端に相補性領域が伸長し、したがって分子内相互作用がさらに有利になり、それによりさらなる増幅が抑制される。
タグに関してより一般的に、また疑念を避けるために、ユニバーサルタグはヌクレオチドの配列から形成され、（ＤＮＡ）ポリメラーゼが相補配列を合成するためのテンプレートとしてこれらを用いることができれば、ＤＮＡベース、ＲＮＡベース、またはこの二つの組合せであってよい。本明細書で論じるいくつかの（ＲＮａｓｅ Ｈ）実施形態では、これらはＲＮＡベースではない。これらは好ましくはＤＮＡからなっている。ユニバーサルタグはカノニカルヌクレオチドおよび／または非カノニカルヌクレオチドを含んでよい。カノニカルヌクレオチドにはグアニン、シトシン、チミン、アデニンおよびウラシルが含まれる。非カノニカルヌクレオチドにはイノシン、チオウリジン、イソグアニン、イソシトシンおよびジアミノピリミジンが含まれる。好適な相補的塩基対形成、即ち相互にハイブリダイズすることができるヌクレオチドの対である塩基対形成は、当業者にはよく知られている。
それぞれのタグはプライマー領域の５’（または上流）に位置していなければならない。しかし、プライマーはプライマー領域の上流にさらに付加的な配列を含んでよい。これらは好ましくはタグとプライマー領域との間に位置するが、タグの上流であってよい。含まれてもよい他の付加的な配列は、リアルタイムで増幅をモニターすることを可能にする、いわゆる「スコーピオン」プローブ等のプローブである。そのようなプローブ配列は典型的にはタグの上流に位置する。
含まれてもよいさらに他の付加的な配列はバーコード、特に当技術で既知の分子バーコードである。簡潔には、それぞれの分子バーコードは、それが組み込まれる次のアンプリコンをシーケンシング後のインシリコ解析において同定することを可能にする特定の核酸配列である。
当業者には容易に理解されるように、プライマーはたとえばフルオロフォアでラベルしてもよい。
タグの長さは、所与の増幅反応において異常な増幅生成物の生成が最小化されることを保証するように当業者によって容易に決定することができる。本発明者らによって、２４ヌクレオチドのタグが最適であるが、広範囲のタグ長さが十分であることが示された。多くの実施形態では、タグはさらなる「ユニバーサル」プライマーがハイブリダイズする配列を提供するように用いられる。したがって、そのようなタグは、当業者にはよく知られているように、プライマー設計の要求に一致している。したがって、いくつかの実施形態では、それぞれのタグは少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２または３３ヌクレオチドの長さを有している。いくつかの実施形態では、それぞれのタグは１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２または３３ヌクレオチドの長さを有している。いくつかの実施形態では、それぞれのタグは１５～３５ヌクレオチドの長さ、または２０～３０ヌクレオチドの長さ、好ましくは２０～２５ヌクレオチドの長さを有している。
タグの組成も融解温度およびハイブリダイゼーション特性の観点から重要である。さらなる実施形態では、それぞれのタグはＧＣの多い配列を含む。ＧＣの多い配列はそれぞれの塩基対が３つの水素結合を含むので好ましい（２つだけの水素結合を含むＡＴ対と比較して）。「ＧＣが多い」は主としてグアニンヌクレオチドおよび／またはシトシンヌクレオチドを含む核酸配列を意味する。これは５０％超および１００％の間のグアニン残基およびシトシン残基のいずれでもよい。タグはたとえば５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％のグアニンヌクレオチドおよび／またはシトシンヌクレオチドを含んでよい。特定の実施形態では、タグはグアニンヌクレオチドのみ、またはシトシンヌクレオチドのみを含む。他の実施形態では、タグはグアニンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドの組合せを含む。タグが１００％未満のグアニンヌクレオチドおよび／またはシトシンヌクレオチドである場合には、残りのヌクレオチドは他の任意のカノニカルヌクレオチドまたは非カノニカルヌクレオチドから選択してよい。
所望の増幅生成物の大きさは、用いるべき特定の増幅反応による。これは標的配列の性質にもよる。ｍＰＣＲでは、それぞれのプライマー対は３０～５００ヌクレオチド、好ましくは３０～３００ヌクレオチド、より好ましくは５０～１５０ヌクレオチドの範囲の増幅生成物を生成するように意図してよい。増幅生成物を次の次世代シーケンシングに用いる場合には、それぞれのプライマー対は３０～５００ヌクレオチド、好ましくは３０～３００ヌクレオチド、より好ましくは７０～２５０ヌクレオチドの範囲の増幅生成物を生成するように意図してよい。ｍＰＣＲを用い、たとえばプローブに基づくシステムを用いて増幅生成物をリアルタイムで検出する場合には、短い増幅生成物が好ましい。したがって、それぞれのプライマー対は３０～３００ヌクレオチド、好ましくは３０～２５０ヌクレオチド、より好ましくは３０～１５０ヌクレオチドの範囲の増幅生成物を生成するように意図してよい。関連する実施形態では、直近のプライマー対から産生される意図された増幅生成物の間の重複のレベルは１０～１００ヌクレオチド、好ましくは１０～５０ヌクレオチド、より好ましくは１０～３０ヌクレオチドの範囲である。重複の領域は短い異常増幅生成物の長さ（マイナスタグ配列）に対応する。しかし、所望の増幅生成物の長さは本発明の基本的特徴ではないことを理解されたい。したがって、それぞれのプライマー対は５００ヌクレオチドより大きく、たとえば１０００、２０００ヌクレオチド等までの増幅生成物を生成するように意図してよい。それぞれの所望の増幅生成物の長さは、使用する（ＤＮＡ）ポリメラーゼ酵素の伸長限界の長さであるか、それに近い。したがって、本発明によって、所望の増幅生成物の長さに関するユーザー融通性が可能になる。それは、これが標的核酸分子中の目的の標的領域に相補的なプライマー領域に過ぎないからである。目的の標的領域に適したプライマー領域（したがってアンプリコンの大きさ）の設計は、増幅の目的に応じて当業者には慣習的である。
特定の実施形態では、それぞれのタグは標的核酸分子との同一性を示さない。そのため、異常なタグ結合の可能性が最小化される。しかし、プライマー領域が同じ領域で標的核酸分子にも結合し、（増幅を指令するという意味で）生産的でないハイブリダイゼーションが起こることは極めて考えにくいので、これは本質的な特徴ではない。
本発明のプライマー対はキットの形でも提供することができる。したがって、関連する態様では、本発明によって本明細書で定義するプライマーのセットを含むマルチプレックス核酸増幅用のキットが提供される。
特定の実施形態では、キットは後続のシーケンシングのためのユニバーサルプライマーをさらに含み、それぞれのユニバーサルプライマーは５’から３’の順に、
ａ．アダプター配列、
ｂ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｃ．マルチプレックス増幅に用いられる対応するプライマーのユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む。
アダプター配列は次世代（ＮＧＳ）プラットフォームを用いる高スループット核酸シーケンシングのための任意の好適なアダプター配列でよい。ＮＧＳプラットフォームの例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング（Ｈｉ－ＳｅｑおよびＭｉ－Ｓｅｑ等）、ＳＭＲＴシーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ナノポアシーケンシング、ＳｏＬＩＤシーケンシング、パイロシーケンシング（たとえばＲｏｃｈｅ４５４）およびＩｏｎ－Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が含まれ、これらは当業者には周知である。アダプター配列はシーケンシングのための好適な固体表面（その性質はフローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ゼロモードウェーブガイド（ＳＭＲＴ）またはビーズ（パイロシーケンシング）等のシーケンシングプラットフォームによる）に固定化されたオリゴヌクレオチドに相補的であってよい。例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑプラットフォームを用いるシーケンシングに必要なｐ５アダプターおよびｐ７アダプター、ならびにＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎプラットフォームを用いるシーケンシングに必要なＡアダプターおよびＰ１アダプターが含まれる。
試料バーコード配列は試料の同定を可能にするために用いられる。これは単一のシーケンシング操作で複数の試料を検討する場合に有利である。しかしこれは任意選択的にある。いくつかの応用、たとえば試料のウルトラディープシーケンシングのため、試料バーコード配列は冗長であってよい。含まれる場合には、試料バーコード配列は選択したＮＧＳプラットフォームを用いる高スループット核酸シーケンシングのための任意の好適な試料バーコード配列であってよい。
プライマー対がマルチプレックスにおいて用いられる場合に増幅生成物に組み込まれるユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一であるユニバーサルプライマー領域は、それが（ＤＮＡ）ポリメラーゼのためのプライマーとして作用することができれば、ＤＮＡ系もしくはＲＮＡ系またはそれらの組合せであってよい。好ましくは、ユニバーサルプライマー領域はＤＮＡからなっている。ユニバーサルプライマー領域はカノニカルヌクレオチドおよび／または非カノニカルヌクレオチドを含んでよい。カノニカルヌクレオチドにはグアニン、シトシン、チミン、アデニンおよびウラシルが含まれる。非カノニカルヌクレオチドにはイノシン、チオウリジン、イソグアニン、イソシトシンおよびジアミノピリミジンが含まれる。再び、ユニバーサルプライマーは種々のＮＧＳプラットフォームにおける使用のための技術で周知である。
さらなる実施形態では、キットは、ポリメラーゼ、ジヌクレオチドトリリン酸（ｄＮＴＰ）、ＭｇＣｌ２、および緩衝剤の１つまたは複数、その全てまでを含むｍＰＣＲのための好適な試薬をさらに含んでよい。任意の好適なポリメラーゼが利用できる。一般に、本発明の核酸標的を増幅するためにＤＮＡポリメラーゼが用いられる。例には、ＴａｑポリメラーゼまたはＰｆｕポリメラーゼ等の熱安定性ポリメラーゼおよびこれらの酵素の種々の誘導体が含まれる。好適な緩衝剤も周知で購入可能であり、ＰＣＲ増幅に必要な多数の成分を含むＰＣＲマスターミックスの中に含まれていてよい。
さらなる実施形態では、キットは逆転写酵素を含むＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写のための好適な試薬をさらに含んでよい。任意の好適な逆転写酵素を利用することができる。好適な緩衝剤も周知で購入可能であり、逆転写に必要な多数の成分を含む逆転写マスターミックスの中に含まれていてよい。
好ましい実施形態では、キットはユニバーサルプライマーの対を含む。これらはそれぞれ第１のユニバーサルプライマーおよび第２のユニバーサルプライマーと称され得る。より具体的には、第１のユニバーサルプライマーは、５’から３’の順に、
ａ．第１のアダプター配列（本明細書で定義する）、
ｂ．（任意選択的に）試料バーコード配列（本明細書で定義する）、
ｃ．プライマー対がマルチプレックス増幅で用いられる場合に増幅生成物に組み込まれる第１のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む。
第２のユニバーサルプライマーは、５’から３’の順に、以下を含む。
ａ．第２のアダプター配列（本明細書で定義する）。第２のアダプターは一般に第１のアダプター配列と異なる。典型的には、第２のアダプター配列は第１のアダプター配列との配列同一性を実質的にまたは殆ど共有しない。
ｂ．（任意選択的に）本明細書で定義する試料バーコード配列。
ｃ．プライマー対がマルチプレックス増幅で用いられる場合に増幅生成物に組み込まれる第２のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域。
図６Ａ～Ｃに示すユニバーサルプライマーの対を用いる増幅により、第１のアダプター配列（および任意選択的に試料バーコード配列）が一端に組み込まれ、第２のアダプター配列（および任意選択的に試料バーコード配列）が他端に組み込まれた所望の増幅生成物が産生される。これにより（直ちに）高スループットの大量の並列ＤＮＡシーケンシングにおける使用が可能になる。いくつかの好ましい実施形態では、第１のアダプター配列および第２のアダプター配列はそれぞれＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑプラットフォームを用いるシーケンシングに必要なｐ５アダプターおよびｐ７アダプターである。他の同様に好ましい実施形態では、第１のアダプター配列および第２のアダプター配列はそれぞれＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎプラットフォームを用いるシーケンシングに必要なＡアダプターおよびＰ１アダプターである。
さらなる実施形態では、ユニバーサルプライマーは、本明細書で定義され、当技術で知られているように、ユニバーサルプライマー領域の上流であるがアダプター配列の下流に試料バーコードを含んでよい。したがって、特定の実施形態では、その／それぞれのユニバーサルプライマーは５’から３’の順に、アダプター配列、試料バーコード、およびユニバーサルプライマー領域を含む。
さらなる態様では、本発明は本明細書で定義されるプライマーのセットを用いて本明細書で定義されるタグ付けされた増幅生成物を創成する、本明細書で定義される標的核酸分子の重複領域の増幅を含むマルチプレックス核酸増幅反応（たとえばｍＰＣＲ）をも提供する。
いくつかの実施形態では、マルチプレックス核酸増幅反応は、増幅生成物を検出するステップをさらに含む。増幅生成物の検出は、たとえばゲル電気泳動等の日常的な方法によってよく、またはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｈｏｌｌａｎｄら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｂｙ ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ ｔｈｅ ５’－３’ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８、７２７６～７２８０頁（１９９１年）、Ｇｅｌｍｉｎｉら、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｆｌｕｒｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｂｅｓ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ Ｃ－Ｅｒｂ－２ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３，７５２～７５８頁（１９９７）およびＬｉｖａｋら、「Ｔｏｗａｒｄｓ ｆｕｌｌｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．９， ３４１～３４２頁（１９９９５）等のインターカレーティング蛍光染料の使用等のリアルタイムまたはエンドポイント検出法、またはモレキュラービーコンシステム、Ｔｙａｇｉ、Ｋｒａｍｅｒ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ－ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ ｈｙｂｒｉｄａｚａｔｉｏｎ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４、３０３～３０８（１９９６）およびＴｙａｇｉら、「Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ ｆｏｒ ａｌｌｅｌｅ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６、４９～５３（１９９８）を用いて行なってよい。ＳｃｏｒｐｉｏｎシステムおよびＦＲＥＴ系システム等の他のシステムを必要に応じて採用してよい。
代替の実施形態では、マルチプレックス核酸増幅反応はシーケンシングのためのタグ付けされた増幅生成物を調製する付加的な増幅を含み、付加的な増幅反応はユニバーサルプライマーを利用し、それぞれのユニバーサルプライマーは５’から３’の順に、
ａ．本明細書で定義するアダプター配列、
ｂ．任意選択的に本明細書で定義する試料バーコード配列、
ｃ．プライマー対が本明細書で定義するマルチプレックス増幅で用いられる場合に増幅生成物に組み込まれるユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一であるユニバーサルプライマー領域
を含む。
そのような付加的な増幅は好ましくは本発明のユニバーサルプライマーの対を使用する。
アダプター配列、ユニバーサルプライマー、および試料バーコードは上で論じた。上の議論は必要に応じて変更して適用され、簡潔のため繰り返さない。
本発明は標的核酸分子を検出しおよび／または定量するためのシーケンシング反応をも包含する。そのような方法は、本発明による増幅反応およびそれに続く、好ましくは次世代シーケンシング手法を用いる増幅生成物のシーケンシングを含む。
＜第１の増幅反応の程度の制御によって単一反応混合物中のマルチステップ増幅反応を可能にする＞
本発明者らは、単一の反応混合物中または反応容器中におけるマルチステップ、典型的には２ステップの増幅の性能を向上させる第１の増幅反応で用いるプライマーを開発した。第１の増幅における第１のプライマーの役割は目的の標的配列を増幅し、アンプリコンにユニバーサルタグを組み込むことである。タグ付けされたアンプリコンは次いで第２の増幅のためのテンプレートとして作用し、第２の増幅においてユニバーサルプライマーはタグにハイブリダイズして、さらなるプロセシングおよび同定の目的に必要な追加的な配列、特にアダプターを組み込む。マルチステップ増幅が単一の反応混合物中または反応容器中で行なわれる場合、第１のプライマーが生成物を産生し続け、第２の増幅反応と事実上、競合するという問題がある。これは異常な生成物の産生をもたらす可能性がある。したがって第１の増幅反応の程度を制御する必要がある。
本発明のプライマーは、１つの鎖の上にＲＮＡ塩基を含む二本鎖ＤＮＡ配列を切断するＲＮａｓｅ Ｈの能力を利用している。ＲＮＡ塩基の傍に典型的には少なくとも４つ（ただしこの数は増幅に用いる正確なＲＮａｓｅ Ｈ酵素による。実験ではパイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）からのＲＮａｓｅ Ｈ２はＲＮＡ塩基の３’の少なくとも４つの塩基対のデュプレックス領域を必要とすることが示されている）の二本鎖（または「デュプレックス」）ＤＮＡの塩基対がいずれかの側に存在するならば、ＲＮａｓｅ ＨはＲＮＡ塩基の５’末端を切断することになる。したがって、本発明のプライマーは、全プライマー配列が二本鎖増幅生成物に組み込まれるまではＲＮａｓｅ Ｈが作用できないような位置に存在するＲＮＡ塩基を含む。相補的鎖の合成によってＲＮＡ塩基が修正される。したがって、本発明のさらなるプライマーが相補的鎖に結合すれば、いずれかの側に二本鎖（または「デュプレックス」）ＤＮＡの少なくとも４つ（これは増幅に用いる正確なＲＮａｓｅ Ｈ酵素によるが）の塩基対が傍にあるＲＮＡ塩基を含む二本鎖配列が産生される。したがってＲＮａｓｅ ＨがＲＮＡ塩基を切断する。この反応は第１の増幅反応の効率を低減するように働き、最終混合物中の異常な配列の割合を低減する。
特にパイロコッカス・アビシからのＲＮａｓｅ Ｈ２を用いる場合、いずれかの側の４塩基対の二本鎖領域が切断事象を引き起こすために最小であると考えられるが、ＲＮＡヌクレオチドのいずれかの側の二本鎖ＤＮＡの短い領域を用いて他のＲＮａｓｅ Ｈ酵素が有効であることも可能である。これはたとえばＤｏｂｏｓｙ ＪＲ、Ｒｏｓｅ ＳＤ、Ｂｅｌｔｚ ＫＲ、Ｒｕｐｐ ＳＭ、Ｐｏｗｅｒｓ ＫＭ、Ｂｅｈｌｋｅ ＭＡ、Ｗａｌｄｅｒ ＪＡ（２０１１年）、「ＲＮａｓｅ Ｈ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＰＣＲ （ｒｈＰＣＲ）：ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｂｌｏｃｋｅｄ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｐｒｉｍｅｒｓ」、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１１巻、８０頁に説明されている実験的アプローチによって容易に試験することができる。７頁に記載されている実験を参照されたい。ＲＮＡヌクレオチドの３’のプライマー領域が標的核酸分子とハイブリダイズする必要があり、したがって実際上、４ヌクレオチドより有意に長いことになることも留意されたい。典型的には、プライマー領域は最小で１５ヌクレオチドで、一般には少なくとも２０ヌクレオチドである。
１つの態様によれば、本発明は、５’から３’の順に、
ａ．ユニバーサルタグ、
ｂ．ＲＮＡヌクレオチド、
ｃ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域
を含む、標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のためのプライマーを提供する。
ＲＮａｓｅ Ｈの要求により、本発明のこの態様による標的核酸分子はＤＮＡである。ＤＮＡはＲＮＡの逆転写によって産生することができる。したがって、標的核酸分子はゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含んでよい。標的核酸分子は二本鎖または一本鎖であってよい。
マルチステップ増幅は典型的には２ステップ反応であり、好ましくは単一の反応混合物中または反応容器中で起こる。第１の増幅は標的核酸分子を増幅し、アンプリコンにユニバーサルタグを組み込むために用いられる。第２の増幅はユニバーサル増幅であり、ここではユニバーサルタグがさらなるプロセシングおよび同定の目的のためのアダプター配列を組み込むために用いられるユニバーサルプライマーのためのハイブリダイゼーション部位として作用する。したがって、本発明のプライマーはマルチステップ増幅の第１ステップにおける使用のためである。
プライマーは５’から３’の順に、以下を含む。
ａ．ユニバーサルタグ
タグはいわゆる「ユニバーサル」タグであり、第２ラウンドの「ユニバーサル」プライマーがハイブリダイズすることができる配列を第１ラウンドの増幅生成物に組み込むために用いられる。したがって、タグ配列はユニバーサルプライマーのプライマー領域と同じであるように設計される。
したがって、タグは最初の標的核酸分子の配列と一致しない。最初の標的核酸分子へのハイブリダイゼーションは別のプライマー領域によって達成される。もちろん、いったんタグが増幅生成物に組み込まれれば、タグ配列はプライマーのためのさらなるハイブリダイゼーション領域として作用する。
第２の増幅反応を妨げる可能性があるＲＮａｓｅ Ｈによる望ましくない切断を防止するため、タグはＲＮＡヌクレオチドを含まないことが重要である。したがって典型的には、タグはＤＮＡヌクレオチドからなる。しかし、ヌクレオチドが第２の増幅において適切に設計されたユニバーサルプライマーと塩基対を形成することができるならば、ＲＮａｓｅ Ｈ活性に感受性のない任意のヌクレオチドを使用することができる。
ｂ．ＲＮＡヌクレオチド
特定のＲＮＡヌクレオチドは重要ではない。それは単に二本鎖ＤＮＡのコンテキストに存在する場合にＲＮａｓｅ Ｈによって切断できるヌクレオチドであればよい。上で論じたように、典型的には、二本鎖ＤＮＡのコンテキストはＲＮＡヌクレオチドのいずれかの側に二本鎖（または「デュプレックス」）ＤＮＡ塩基の４塩基対を最小限必要とする。好ましくは、単一のＲＮＡヌクレオチドがプライマーに含まれる。ＲＮＡヌクレオチドは標的ＤＮＡ分子中の対応するＤＮＡヌクレオチドと一致しても、一致しなくてもよいことにも留意されたい。いずれの場合にも、ＲＮＡヌクレオチドは増幅生成物に組み込まれる。相補的鎖の合成によってＲＮＡ塩基が修正され、対応するＤＮＡヌクレオチドが含まれる。したがって、本発明のさらなるプライマーが相補的鎖に結合すれば、いずれかの側に二本鎖（または「デュプレックス」）ＤＮＡの少なくとも４つ（これは増幅に用いる正確なＲＮａｓｅ Ｈ酵素によるが）の塩基対が傍にあるＲＮＡ塩基を含む二本鎖配列が産生される。したがってＲＮａｓｅ ＨがＲＮＡ塩基を切断する。この反応は第１の増幅反応の効率を低減するように働き、最終混合物中の異常な配列の割合を低減する。
ｃ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域
プライマー領域は標的核酸分子の増幅を指令する。再び、標的核酸の増幅を妨げる可能性があるＲＮａｓｅ Ｈによる望ましくない切断を防止するため、プライマー領域はＲＮＡヌクレオチドを含まないことが重要である。したがって典型的には、プライマー領域は標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡヌクレオチドからなる。しかし、ヌクレオチドが標的核酸配列と塩基対を形成することができるならば、ＲＮａｓｅ Ｈ活性に感受性のない任意のヌクレオチドを使用することができる。最初のプライマー結合の際にＲＮａｓｅ Ｈ基質が産生されず、その代わりに相補的鎖の合成とそれに続くプライマーの相補的鎖への結合に依存する作用機序によって、標的に関してプライマー領域を設計する自由度がある。したがって、所望の標的ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションを確実にするというプライマー設計の制約の中で、ミスマッチは許容され、本発明の実施に不都合な影響を及ぼすことはない。所与の標的核酸配列に対するプライマーの設計は十分に当業者の能力の範囲内である。
いくつかの実施形態では、プライマー領域はＲＮＡヌクレオチドを組み込むことができることに留意されたい。これには最初の標的ＤＮＡ分子へのプライマーの結合がＲＮａｓｅ Ｈ基質を産生しないという前提がある。したがって典型的には、ＲＮＡヌクレオチドはプライマー領域の開始から（５’から３’への方向で）３ヌクレオチドを超えて下流にあることはできない。それにより、ＲＮＡヌクレオチドは、最初の標的核酸分子の増幅の前に、いずれかの側に少なくとも４塩基対の二本鎖（または「デュプレックス」）ＤＮＡ塩基が存在しないということが保証される。これを模式的に図１０に示す。
典型的には、ＲＮＡヌクレオチドは別として、プライマー中の残りのヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。しかし既に論じたように、他の非ＲＮＡヌクレオチドも、それらが対応するＤＮＡヌクレオチドの機能を再現し、ＲＮａｓｅ Ｈ活性に感受性がないならば、プライマーに用いることができる。
Ｄｏｂｏｓｙら（Ｄｏｂｏｓｙ Ｊｒ、Ｒｏｓｅ Ｓｄ、Ｂｅｌｔｚ Ｋｒ、Ｒｕｐｐ Ｓｍ、Ｐｏｗｅｒｓ Ｋｍ、Ｂｅｈｌｋｅ ＭＡ、Ｗａｌｄｅｒ ＪＡ（２０１１年）、「ＲＮａｓｅ Ｈ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＰＣＲ （ｒｈＰＣＲ）：ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｂｌｏｃｋｅｄ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｐｒｉｍｅｒｓ」、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１１：８０）はｒｈＰＣＲを開発した。このシステムはプライマーダイマーを排除するためにＲＮａｓｅ Ｈ活性によっている。これはＲＮａｓｅ Ｈ活性によって活性化されるブロックされたプライマーによっている。このシステムとは対照的に、本発明はブロックされたプライマーを必要としない。したがって、本発明のプライマーはブロッキング基を必要とせず、特にＲＮＡ塩基の下流のブロッキング基を必要としない。それにも関わらず、いくつかの実施形態では、本発明のプライマーは最初にＤｏｂｏｓｙによって述べられた機能を含むように改変され得る（Ｄｏｂｏｓｙの図１を参照）。これには第１のＲＮＡヌクレオチドの（５’から３’の方向に）下流のさらなるＲＮＡヌクレオチドを必要とする。したがって、いくつかの実施形態では、標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のためのプライマーは、５’から３’の順に、
ａ．ユニバーサルタグ、
ｂ．ＲＮＡヌクレオチド、
ｃ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域、
ｄ．さらなるＲＮＡヌクレオチド、
ｅ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするさらなる領域、
ｆ．ブロッキング基
を含む。
したがって、本発明のプライマーはＲＮａｓｅ Ｈ依存性ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）反応における使用のために適合させることができる。このシステムはプライマーダイマーの形成およびその他のテンプレートに依存しない反応を避けるために特に有利である。これは標的ＤＮＡ分子への最初のプライマー結合に際して形成されるＲＮａｓｅ Ｈ基質に依存している。ブロックされたプライマーは不活性である。ＲＮａｓｅ Ｈによる切断に際して、プライマー領域（ｃ）のブロックが効果的に解除され、ＤＮＡ鎖の合成を開始することができる。
そのようなプライマーについて必要な追加的な特徴は、以下の通りである。
ｄ．さらなるＲＮＡヌクレオチド
さらなる切断部位がプライマーに導入される必要があり、これはプライマー領域の下流である必要がある。特定のＲＮＡヌクレオチドは重要ではない。それは単に二本鎖ＤＮＡのコンテキストに存在する場合にＲＮａｓｅ Ｈによって切断できるヌクレオチドであればよい。上で論じたように、典型的には、二本鎖ＤＮＡのコンテキストはＲＮＡヌクレオチドのいずれかの側に二本鎖（または「デュプレックス」）ＤＮＡ塩基の４塩基対を最小限必要とする。好ましくは、単一のさらなるＲＮＡヌクレオチドがプライマーに含まれる。ＲＮＡヌクレオチドは好ましくは標的ＤＮＡ分子中の対応するＤＮＡヌクレオチドと一致することにも留意されたい。これにより、ＲＮａｓｅ Ｈによる切断の効率が最大化される。したがって、本発明のプライマーが標的ＤＮＡに結合すれば、いずれかの側に二本鎖（または「デュプレックス」）ＤＮＡの典型的には少なくとも４つ（これは増幅に用いる正確なＲＮａｓｅ Ｈ酵素によるが）の塩基対が傍にあるＲＮＡ塩基を含む二本鎖配列が産生される。したがってＲＮａｓｅ ＨがＲＮＡ塩基を切断し、プライマー領域を直接合成に放出する。
ｅ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするさらなる領域
さらなる領域は標的核酸分子の鎖とハイブリダイズし、したがってプライマー領域のみの使用と比較して標的ＤＮＡ分子への特異性が改良される。さらなるＲＮＡヌクレオチドおよびさらなる領域は、プライマー領域の結合部位から続く連続的なＤＮＡ塩基にハイブリダイズする。さらなる領域が存在してＤＮＡ標的への結合に際してＲＮａｓｅ Ｈ切断のためのコンテキストを提供するので、これはプライマー領域と組み合わせて、さらなるＲＮＡヌクレオチドのいずれかの側の二本鎖（または「デュプレックス」）ＤＮＡ塩基の十分な塩基対を提供するために十分な長さがあればよい。典型的には、さらなる領域は、標的結合に際してＲＮａｓｅ Ｈ媒介切断のための関連するコンテキストを産生するために最小で４ヌクレオチドの長さである。これらのヌクレオチドの少なくとも最初のものは、好ましくは標的ＤＮＡ分子と一致する。これはＲＮａｓｅ Ｈによる効率の良い切断を保証する最も重要なヌクレオチドである。しかし理想的には、少なくとも最初の１、２、３または４つ、および好ましくは全てのヌクレオチドが、標的ＤＮＡ分子と一致する。これによって切断効率が最大化されるが、必須ではない。
単一のさらなるＲＮＡヌクレオチドが必要なものの全てであり、したがって好ましいが、さらなる領域にはＲＮａｓｅ Ｈによって切断する追加のさらなるＲＮＡヌクレオチドが含まれてもよい。必要なものの全ては、増幅を指令することを可能にするプライマー領域のブロックの放出である。さらなる領域は単にＲＮａｓｅ Ｈ活性のための適切な基質コンテキストを提供しさえすればよく、それ自体でさらなる機能を提供するわけではない。したがって、切断がブロッキング基の除去をもたらし、プライマー領域が標的核酸分子を伸長させることを可能にするならば、多重の切断事象が可能である。しかし典型的には、さらなる領域は標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡヌクレオチドからなる。それにも関わらず、ヌクレオチドが標的核酸配列と塩基対を形成することができるならば、ＲＮａｓｅ Ｈ活性に感受性のない任意のヌクレオチドを使用することができる。
ｆ．ブロッキング基
ブロッキング基はＲＮａｓｅ Ｈによる切断（これによりプライマー領域のブロックが効果的に解除される）の前に望ましくない伸長を防止する。この目的のため任意の好適なブロッキング基を使用することができ、用いることができるブロッキング基は当業者には周知である。ある実施形態では、ブロッキング基は３’ｄｄＣ、３’反転ｄＴ、３’Ｃ３スペーサー（Ｃ３プロパンジオールスペーサー等）、３’アミノ、および３’ホスホリル化から選択される。
本発明のプライマーは追加の要素を組み込んでもよい。たとえば、プライマーは増幅生成物の増幅および／または検出のモニタリングを容易にするため好適なラベルを含んでよい。好ましい実施形態では、本発明のプライマーはバーコード配列をさらに含む。典型的には、バーコード配列はＲＮＡヌクレオチドの下流に配置される。好ましいバーコード配列は分子バーコードである。特定の実施形態では、分子バーコードの長さは少なくとも４、６または８ヌクレオチドである。一般には、分子バーコードの長さは２０ヌクレオチドを超えない。
本発明のプライマーは「標準の」第２のプライマー（即ち、タグを有する標的特異的プライマー）と組み合わせてプライマー対を形成するために用いることができるが、本発明のプライマーは有利には第１の増幅において対で用いられる。したがって、本発明は標的核酸分子を増幅するための本発明のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対をも提供する。
本発明を実施するための重要な試薬がＲＮａｓｅ Ｈである。ＲＮａｓｅ Ｈのリボヌクレアーゼ活性により、ＤＮＡ／ＲＮＡデュプレックス基質中のＲＮＡの３’－Ｏ－Ｐ結合が切断して、３’－ヒドロキシルおよび５’－ホスフェート末端生成物が産生される。本発明において有用なＲＮａｓｅ Ｈ酵素は核酸増幅の間、活性でなければならない。酵素はプライマーがテンプレートにハイブリダイズするとともに増幅生成物上でリアルタイムに作用する。したがって、ＰＣＲが本発明によって最も好ましい増幅プロセスであるので、典型的には、ＲＮａｓｅ Ｈは熱安定なＲＮａｓｅ Ｈである。好ましくは、そのようなＲＮａｓｅ ＨはＰＣＲの間に用いられる高温（サーマルサイクリング）よりも、室温での活性が顕著に低い。しかし、等温増幅反応（たとえばＮＡＳＢＡ）を実施する場合には、熱安定なＲＮａｓｅ Ｈは必須ではない。
したがって、本発明はＲＮａｓｅ Ｈとともに本発明のプライマーまたはプライマー対を含む、標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のための試薬のセットをさらに提供する。好ましくは、ＲＮａｓｅ Ｈは熱安定性である。パイロコッカス・アビシからのＲＮａｓｅ Ｈ２等のＲＮａｓｅ Ｈ２が利用できる。
本発明は、本発明のプライマー、プライマー対または試薬のセットの使用を含む、標的核酸分子のマルチステップ（典型的には２ステップ）増幅を提供する。そのような反応は、好ましくは単一の反応混合物中または反応容器中で起こる。
本発明は、本発明の第１のプライマー対を用いてＲＮａｓｅ Ｈの存在下に標的核酸分子を増幅するステップを含む、標的核酸分子の増幅のための方法であって、
ａ．第１ラウンドの増幅の後、標的核酸分子が複製され、第１の増幅生成物がユニバーサルタグおよび第１のフォワードプライマーのＲＮＡヌクレオチドを組み込み、第２の増幅生成物がユニバーサルタグおよび第１のリバースプライマーのＲＮＡヌクレオチドを組み込み、
ｂ．第２ラウンドの増幅では、第１のリバースプライマーが、第１の増幅生成物とハイブリダイズして、ユニバーサルタグの相補体と第１のフォワードプライマーのＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ相補体とを組み込んだ第３の増幅生成物を産生し、第１のフォワードプライマーが、第２の増幅生成物とハイブリダイズして、ユニバーサルタグの相補体と第１のリバースプライマーのＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ相補体とを組み込んだ第４の増幅生成物を産生し、第３の増幅生成物および第４の増幅生成物がそれぞれＲＮａｓｅ Ｈ活性の基質となり、それによりＲＮＡヌクレオチドの切断がもたらされ、それにより標的核酸分子のさらなる増幅が制限される、方法を提供する。
上で言及したように、第１ラウンドおよび第２ラウンドの増幅は、それぞれ本発明の第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含む。したがって、この方法は第１の増幅反応を記述している。これはマルチステップ増幅反応のコンテキストで起こってよく、好ましくはまさに起こっている。そのような反応は好ましくは単一の反応混合物中または反応容器中で起こる。
したがって、増幅の方法はシーケンシングのためのタグ付けされた増幅生成物を調製するための追加的な増幅をさらに含んでよく、追加的な増幅反応はユニバーサルプライマーを利用し、それぞれのユニバーサルプライマーは５’から３’の順に、
ａ．本明細書で定義するアダプター配列、
ｂ．任意選択的に本明細書で定義する試料バーコード配列、
ｃ．プライマー対が本明細書で定義するマルチプレックス増幅で用いられる場合に増幅生成物に組み込まれるユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一であるユニバーサルプライマー領域
を含む。
そのような追加的な増幅には、好ましくは本発明のユニバーサルプライマーの対が使用される。より具体的には、第１のユニバーサルプライマーは５’から３’の順に、
ａ．第１のアダプター配列（本明細書で定義する）、
ｂ．（任意選択的に）試料バーコード配列（本明細書で定義する）、
ｃ．プライマー対がマルチプレックス増幅で用いられる場合に増幅生成物に組み込まれる第１のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一であるユニバーサルプライマー領域
を含む。
第２のユニバーサルプライマーは５’から３’の順に、以下を含む。
ａ．第２のアダプター配列（本明細書で定義する）。第２のアダプターは一般に第１のアダプター配列と異なる。典型的には、第２のアダプター配列は第１のアダプター配列との配列同一性を実質的にまたは殆ど共有しない。
ｂ．（任意選択的に）本明細書で定義する試料バーコード配列。
ｃ．プライマー対がマルチプレックス増幅で用いられる場合に増幅生成物に組み込まれる第２のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一であるユニバーサルプライマー領域。
本発明は標的核酸分子を検出しおよび／または定量するためのシーケンシング反応をも包含する。そのような方法は、本発明による増幅反応およびそれに続く、好ましくは次世代シーケンシング手法を用いる増幅生成物のシーケンシングを含む。
本発明のプライマー、プライマー対および試薬のセットは、キットの形でも提供され得る。したがって、関連する態様では、本発明は上記のプライマー、プライマー対または試薬のセットを含む標的核酸分子のマルチステップ増幅のためのキットを提供する。
特定の実施形態では、キットは後続のシーケンシングのためのユニバーサルプライマーをさらに含み、それぞれのユニバーサルプライマーは５’から３’の順に、
ａ．アダプター配列、
ｂ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｃ．第１の増幅で用いる対応するプライマーのユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一であるユニバーサルプライマー領域
を含む。
アダプター配列は次世代（ＮＧＳ）プラットフォームを用いる高スループット核酸シーケンシングのための任意の好適なアダプター配列でよい。ＮＧＳプラットフォームの例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング（Ｈｉ－ＳｅｑおよびＭｉ－Ｓｅｑ等）、ＳＭＲＴシーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ナノポアシーケンシング、ＳｏＬＩＤシーケンシング、パイロシーケンシング（たとえばＲｏｃｈｅ４５４）およびＩｏｎ－Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が含まれ、これらは当業者には周知である。アダプター配列はシーケンシングのための好適な固体表面（その性質はフローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ゼロモードウェーブガイド（ＳＭＲＴ）またはビーズ（パイロシーケンシング）等のシーケンシングプラットフォームによる）に固定化されたオリゴヌクレオチドに相補的であってよい。例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑプラットフォームを用いるシーケンシングに必要なｐ５アダプターおよびｐ７アダプター、ならびにＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎプラットフォームを用いるシーケンシングに必要なＡアダプターおよびＰ１アダプターが含まれる。
試料バーコード配列は試料の同定を可能にするために用いられる。これは単一のシーケンシング操作で複数の試料を検討する場合に有利である。しかしこれは任意選択的にある。いくつかの応用、たとえば試料のウルトラディープシーケンシングのため、試料バーコード配列は冗長であってよい。含まれる場合には、試料バーコード配列は選択したＮＧＳプラットフォームを用いる高スループット核酸シーケンシングのための任意の好適な試料バーコード配列であってよい。
プライマー対が第１の増幅において用いられる場合に増幅生成物に組み込まれるユニバーサルタグと同一（５’から３’への方向で）のユニバーサルプライマー領域は、それが（ＤＮＡ）ポリメラーゼのためのプライマーとして作用することができれば、ＤＮＡ系もしくはＲＮＡ系またはそれらの組合せであってよい。好ましくは、ユニバーサルプライマー領域はＤＮＡからなっている。ユニバーサルプライマー領域はカノニカルヌクレオチドおよび／または非カノニカルヌクレオチドを含んでよい。カノニカルヌクレオチドにはグアニン、シトシン、チミン、アデニンおよびウラシルが含まれる。非カノニカルヌクレオチドにはイノシン、チオウリジン、イソグアニン、イソシトシンおよびジアミノピリミジンが含まれる。再び、ユニバーサルプライマーは種々のＮＧＳプラットフォームにおける使用のための技術で周知である。
好ましい実施形態では、キットはユニバーサルプライマーの対を含む。これらはそれぞれ第１のユニバーサルプライマーおよび第２のユニバーサルプライマーと称され得る。より具体的には、第１のユニバーサルプライマーは５’から３’の順に、
ａ．第１のアダプター配列（本明細書で定義する）、
ｂ．（任意選択的に）試料バーコード配列（本明細書で定義する）、
ｃ．プライマー対がマルチプレックス増幅で用いられる場合に増幅生成物に組み込まれる第１のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一であるユニバーサルプライマー領域
を含む。
第２のユニバーサルプライマーは、５’から３’の順に、以下を含む。
ａ．第２のアダプター配列（本明細書で定義する）。第２のアダプターは一般に第１のアダプター配列と異なる。典型的には、第２のアダプター配列は第１のアダプター配列との配列同一性を実質的にまたは殆ど共有しない）。
ｂ．（任意選択的に）本明細書で定義する試料バーコード配列。
ｃ．プライマー対がマルチプレックス増幅で用いられる場合に増幅生成物に組み込まれる第２のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一であるユニバーサルプライマー領域。
さらなる実施形態では、ユニバーサルプライマーは、本明細書で定義され、当技術で知られているように、ユニバーサルプライマー領域の上流であるがアダプター配列の下流に試料バーコードを含んでよい。したがって、特定の実施形態では、その／それぞれのユニバーサルプライマーは５’から３’の順に、アダプター配列、試料バーコード、およびユニバーサルプライマー領域を含む。
さらなる実施形態では、キットは、ポリメラーゼ、ジヌクレオチドトリリン酸（ｄＮＴＰ）、ＭｇＣｌ２、および緩衝剤の１つまたは複数、その全てまでを含むｍＰＣＲのための好適な試薬をさらに含んでよい。任意の好適なポリメラーゼが利用できる。一般に、本発明の核酸標的を増幅するためにＤＮＡポリメラーゼが用いられる。例には、ＴａｑポリメラーゼまたはＰｆｕポリメラーゼ等の熱安定性ポリメラーゼおよびこれらの酵素の種々の誘導体が含まれる。好適な緩衝剤も周知で購入可能であり、ＰＣＲ増幅に必要な多数の成分を含むＰＣＲマスターミックスの中に含まれていてよい。
さらなる実施形態では、キットは逆転写酵素を含むＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写のための好適な試薬をさらに含んでよい。任意の好適な逆転写酵素を利用することができる。好適な緩衝剤も周知で購入可能であり、逆転写に必要な多数の成分を含む逆転写マスターミックスの中に含まれていてよい。
キットは後続のシーケンシングのための試薬をさらに含んでもよい。
キットは使用説明書を含んでよい。そのような説明書はキットの中に添付文書として含まれてよい。
＜ユニバーサルプライマーの生成を遅延させることによって単一の反応混合物中のマルチステップ増幅反応を可能にする＞
本発明者らは、標的核酸分子のマルチステップ、特に少なくとも２ステップの増幅（特にＰＣＲ）を実施するための改良された試薬を開発した。特に、本発明者らは単一の反応容器中でマルチステップ核酸増幅アッセイを実施するための試薬のセットを提供する。それにより、個別の反応容器中でマルチステップ増幅反応のそれぞれのステップを実施する必要がなくなる。試薬は、標的核酸の第１の増幅と同時にユニバーサルプライマーを産生するために用いられる。したがって、本発明によればユニバーサルプライマーを産生するために増幅反応が必要である。それにより、標的核酸の第１の増幅に対してユニバーサルプライマーの産生に遅れが生じる。この遅れにより、ユニバーサルプライマーの基質として作用する第１の増幅反応の生成物（即ちタグ付けされたアンプリコン）の十分な量の産生が可能になる。これが次に、単に反応の開始時にユニバーサルプライマーを加えた場合に優勢となる非特異的相互作用を低減することを助ける。
したがって、第１の態様では、本発明は標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のための試薬のセットを提供し、該セットは、
ａ．標的核酸分子を増幅するように設計された第１のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第１のユニバーサルタグを組み込んだ第１のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第２のユニバーサルタグを組み込んだ第１のリバースプライマー
を含む、第１のプライマー対、
ｂ．第１の核酸分子であって、５’から３’の順に、
ｉ．第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．アダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む、第１の核酸分子、
ｃ．第２の核酸分子であって、５’から３’の順に、
ｉ．第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第２のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む、第２の核酸分子、
ｄ．第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する、第１のアダプタープライマー
ｅ．第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する、第２のアダプタープライマー
を含み、
ｄおよびｅの第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて産生された増幅生成物は、ユニバーサルプライマー対を形成し、ここで第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグは、プライマーとして作用して、第１のプライマー対によって産生された増幅生成物を増幅して、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグならびにアダプターを組み込んださらなる増幅生成物を生成する。
したがって第１の核酸分子および第２の核酸分子はユニバーサルプライマー対を形成するユニバーサルプライマー配列のリバース相補体を表す。第１の核酸分子および第２の核酸分子を第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーとともに用いることによって、第１のプライマー対によって産生される増幅生成物を増幅するユニバーサルプライマー対の生成の一時的な遅れが生じる。これにより、第１の（標的特異的）プライマー対を用いてユニバーサルプライマー対のための過剰な基質を産生する標的核酸分子の十分な増幅が可能になる。これにより、単一の反応容器中でマルチステップ増幅を行う試みからさもなければ生じるかも知れない非特異的な効果が低減される。
標的分子を増幅する第１のプライマー対は、現在用いられているタグ付けされた標的特異的プライマー対と比較して、改変する必要はない（マルチステップ増幅を行うための先行技術のシステムの説明については図１を参照されたい）。したがって、標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のための試薬のセットも提供され、該セットは、
ａ．第１の核酸分子であって、５’から３’の順に、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズする第１のプライマー対のフォワードプライマーに組み込まれた第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第１のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む、第１の核酸分子、
ｂ．第２の核酸分子であって、５’から３’の順に、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズする第１のプライマー対のリバースプライマーに組み込まれた第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第２のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む、第２の核酸分子、
ｃ．第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．第１のユニバーサルタグ
を含む、増幅生成物を産生する、第１のアダプタープライマー、
ｄ．第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．第２のユニバーサルタグ
を含む、増幅生成物を産生する、第２のアダプタープライマー
を含み、
ｃおよびｄの第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて産生された増幅生成物は、ユニバーサルプライマー対を形成し、ここで第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグは、プライマーとして作用して、第１のプライマー対によって産生された増幅生成物を増幅して、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグならびにアダプターを組み込んださらなる増幅生成物を生成する。
しかし好ましい実施形態では、本発明のプライマーはこれらの（リバース相補体）核酸分子とともに用いられる。したがって、本明細書に記載した試薬（のセット）は、単一の反応混合物中で実施される標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のために好適である。
本発明の関連する態様によれば、標的核酸分子のマルチステップ増幅のための方法であって、
ａ．第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグを組み込んだ第１の増幅生成物を生成するために、第１のプライマー対を用いて標的核酸分子を増幅するステップと、ここで、第１のプライマー対は、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第１のユニバーサルタグを組み込んだ第１のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第２のユニバーサルタグを組み込んだ第１のリバースプライマー
を含み、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第１のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第１の核酸分子を増幅するステップと、ここで、５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生するために、第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズする第１のアダプタープライマーを用い、
ｃ．５’から３’の順に、
ｉ．第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第２のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第２の核酸分子を増幅するステップと、ここで、５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生するために、第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズする第２のアダプタープライマーを用い、
ｄ．ステップｂおよびステップｃの増幅生成物をユニバーサルプライマー対として用いて、第１のプライマー対によって産生された増幅生成物を増幅するステップと、ここで、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグが、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグならびに機能性配列を組み込んださらなる増幅生成物を生成するプライマーとして作用する、
を含み、単一の反応混合物中で実施される、方法が提供される。
疑念を避けるため、本発明の方法はさらなる増幅生成物の産生の後の（即ち、ユニバーサル増幅の後の）追加のステップの実施を包含している。そのような方法は反応容器の同じ反応混合物に制約されない。そのような方法は典型的には標的核酸分子の検出を含んでいる。好ましい実施形態では、本発明の方法は特定の標的核酸分子を同定し、任意選択的に定量するために用いられる。好ましい実施形態では、本方法はさらなる増幅生成物のシーケンシングをさらに含む。シーケンシングは典型的には大量並列法で実施される。好ましくは、シーケンシングは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）手法を用いて実施される。シーケンシングはステップａ～ｄの反応混合物とは異なる反応混合物中で行なってよい。
したがって、本発明は、標的核酸分子のマルチステップ増幅を含む、標的核酸分子を検出し、任意選択的に定量するための方法であって、
ａ．第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグを組み込んだ第１の増幅生成物を生成するために、第１のプライマー対を用いて標的核酸分子を増幅するステップと、ここで、第１のプライマー対は、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第１のユニバーサルタグを組み込んだ第１のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第２のユニバーサルタグを組み込んだ第１のリバースプライマー
を含み、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉｉｉ．第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｖ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｖ．第１のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第１の核酸分子を増幅するステップと、ここで、５’から３’の順に、
ｉｉｉ．第１のアダプター配列、
ｉｖ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生するために、第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズする第１のアダプタープライマーを用い、
ｃ．５’から３’の順に、
ｖｉ．第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｖｉｉ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｖｉｉｉ．第２のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第２の核酸分子を増幅するステップと、ここで、５’から３’の順に、
ｉｉｉ．第２のアダプター配列、
ｉｖ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生するために、第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズする第２のアダプタープライマーを用い、
ｄ．ステップｂおよびステップｃの増幅生成物をユニバーサルプライマー対として用いて、第１のプライマー対によって産生された増幅生成物を増幅するステップと、ここで、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグが、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグならびに機能性配列を組み込んださらなる増幅生成物を生成するプライマーとして作用する、
を含み、本方法は、単一の反応混合物中で実施され、
好ましくは次世代シーケンシング手法を用いて、さらなる増幅生成物をシーケンシングする、方法を提供する。
シーケンシングの前に、さらなる増幅生成物を精製してよい。シーケンシングは選択した手法によるが、（当業者には容易に理解されるように）シグナル産生目的のためのさらなる増幅生成物のさらなる増幅を含んでよい。そのようなさらなる増幅は、ブリッジ増幅またはビーズ系増幅（エマルジョンＰＣＲ）等の任意の好適な手法であってよい。本発明による有用なＮＧＳプラットフォームの例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング（Ｈｉ－ＳｅｑおよびＭｉ－Ｓｅｑ等）、ＳＭＲＴシーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ナノポアシーケンシング、ＳｏＬＩＤシーケンシング、パイロシーケンシング（たとえばＲｏｃｈｅ４５４）、単分子シーケンシング（ＳｅｑＬＬ／Ｈｅｌｉｃｏｓ）およびＩｏｎ－Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が含まれ、これらは当業者には周知である。
多くのシーケンシング技術には試料の同定のためにバーコード配列が利用されている。したがって、本発明の全ての態様では、第１の核酸分子は第１のバーコード配列、典型的には第１の試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列をさらに含んでよい。したがって、好ましい実施形態では、第１の核酸分子は５’から３’の順に、
ｉ．第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．第１の試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｖ．アダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む。
第１の核酸分子が第１のバーコード配列、典型的には第１の試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列をさらに含む実施形態では、第１のアダプタープライマーは第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、第１のアダプター配列、第１のバーコード配列および第１のユニバーサルタグを含む増幅生成物を産生する。第１の核酸分子が第１の試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列をさらに含む好ましい実施形態では、第１のアダプタープライマーは第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．第１の試料バーコード、
ｉｉｉ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する。
増幅生成物は、ユニバーサルプライマーとして作用して、第２のアダプタープライマーを用いて産生された増幅生成物とユニバーサルプライマー対を形成し、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグ、第１のバーコード配列、特に試料バーコード、ならびに第１のアダプターおよび第２のアダプターを組み込んださらなる増幅生成物を生成する。
本発明の全ての態様によれば、第２の核酸分子は第２のバーコード配列、典型的には第２の試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列をさらに含んでよい。したがって、好ましい実施形態では、第２の核酸分子は５’から３’の順に、
ｉ．第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．第２の試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列
ｉｖ．アダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む。
第２の核酸分子が第２のバーコード配列、典型的には第２の試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列をさらに含む実施形態では、第２のアダプタープライマーは第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、第２のアダプター配列、第２のバーコード配列および第２のユニバーサルタグを含む増幅生成物を産生する。第２の核酸分子が第２の試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列をさらに含む好ましい実施形態では、第２のアダプタープライマーは第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列
ｉｉ．第２の試料バーコード
ｉｉｉ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する。
この増幅生成物は、ユニバーサルプライマーとして作用して、第１のアダプタープライマーを用いて産生された増幅生成物とユニバーサルプライマー対を形成し、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグ、第２のバーコード配列、特に第２の試料バーコード、ならびに第１のアダプターおよび第２のアダプターを組み込んださらなる増幅生成物を生成する。
特定の実施形態では、第１の核酸分子および第２の核酸分子の両方は、バーコード配列、特に試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列をさらに含む。これらの実施形態では、さらなる増幅生成物は、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグ、第１のバーコード配列および第２のバーコード配列、好ましくは試料バーコード、ならびに第１のアダプターおよび第２のアダプターを組み込む。
したがって、本発明の１つの重要な貢献は、ユニバーサルプライマーに対応するリバース相補体配列の提供である。リバース相補体配列は３’末端でブロックされて、望ましくない増幅を防止している。したがって、関連する態様では、本発明は５’から３’の順に、
ａ．タグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｂ．任意選択的にバーコード配列、好ましくは試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｃ．後続のプロセシングに必要なアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｄ．アダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む核酸分子を提供する。
典型的には、そのような分子は対で提供され、ユニバーサルプライマー対を形成する。したがって、本発明は、第１の核酸分子と、第２の核酸分子との組合せであって、５’から３’の順に、
ａ．第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｂ．任意選択的にバーコード配列、好ましくは試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｃ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｄ．第１のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第１の核酸分子と、
５’から３’の順に、
ａ．第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｂ．任意選択的にバーコード配列、好ましくは試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｃ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｄ．第２のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第２の核酸分子との、組合せを提供する。
本発明によって用いられるユニバーサルプライマーに対応する特定のリバース相補体配列は、配列番号５～２４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、実質的にこれからなり、またはこれからなる。
それぞれのユニバーサルプライマーはアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズするプライマーを用いて産生される。したがって、ユニバーサルプライマーとアダプタープライマーの組合せは、本発明のさらなる態様を形成する。特に、ユニバーサルプライマーリバース相補体核酸分子と、プライマーとの組合せであって、プライマーは、アダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ａ．後続のプロセシングに必要なアダプター配列、
ｂ．任意選択的にバーコード配列、好ましくは試料バーコード、
ｃ．タグ
を含む増幅生成物を産生する、組合せが提供される。
好ましい組合せは、ユニバーサルプライマー対のリバース相補体を表す第１の核酸分子および第２の核酸分子と、それぞれの第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーとの組合せである。特に、
第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ａ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列、
ｂ．任意選択的に第１のバーコード配列、好ましくは試料バーコード、
ｃ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する第１のアダプタープライマー、
第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ａ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列、
ｂ．任意選択的に第２のバーコード配列、好ましくは試料バーコード、
ｃ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する第２のアダプタープライマー
とユニバーサルプライマー対を形成するユニバーサルプライマーリバース相補体核酸分子の組合せが提供される。
本発明による有用な特定のアダプタープライマーは、配列番号３および／または配列番号４のヌクレオチド配列を含み、実質的にこれらからなり、またはこれらからなる。
本発明の関連する態様によれば、上で定義した試薬のセットを用いてタグおよびアダプター配列を組み込んだ増幅生成物を創成する標的核酸分子の増幅を含むマルチステップ核酸増幅反応が提供される。
本発明の試薬のセットは、キットの形でも提供され得る。したがって、関連する態様では、本発明は試薬のセット、核酸分子または上述の組合せを含む標的核酸分子のマルチステップ増幅のためのキットを提供する。
さらなる実施形態では、キットは、ポリメラーゼ、ジヌクレオチドトリリン酸（ｄＮＴＰ）、ＭｇＣｌ２、および緩衝剤の１つまたは複数、その全てまでを含むＰＣＲのための好適な試薬をさらに含んでよい。任意の好適なポリメラーゼが利用できる。一般に、本発明の核酸標的を増幅するためにＤＮＡポリメラーゼが用いられる。例には、ＴａｑポリメラーゼまたはＰｆｕポリメラーゼ等の熱安定性ポリメラーゼおよびこれらの酵素の種々の誘導体が含まれる。
好適な緩衝剤も周知で購入可能であり、ＰＣＲ増幅に必要な多数の成分を含むＰＣＲマスターミックスの中に含まれていてよい。
さらなる実施形態では、キットは逆転写酵素を含むＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写のための好適な試薬をさらに含んでよい。任意の好適な逆転写酵素を利用することができる。好適な緩衝剤も周知で購入可能であり、逆転写に必要な多数の成分を含む逆転写マスターミックスの中に含まれていてよい。
キットは後続のシーケンシングのための試薬をさらに含んでもよい。
キットは使用説明書を含んでよい。そのような説明書はキットの中に添付文書として含まれてよい。
＜重複標的配列を含むマルチプレックス増幅を改良することおよび第１の増幅反応の程度の制御によって単一反応混合物中のマルチステップ増幅反応を可能にする＞
好ましい実施形態では、本発明のプライマーは標的核酸分子の重複領域を増幅するためのマルチプレックスにおける第１の増幅反応に用いられる。これらのプライマーは有利に、次の第２の増幅反応（一般にはＰＣＲ）において増幅することができるタグ付けされた増幅生成物を生成する。本発明は、第１の増幅反応の程度を制御して第２の反応との競合を最小化し、異常な増幅生成物の過剰な生成を防止するプライマーをも提供する。これらのプライマーの特徴は、標的核酸分子の重複領域を増幅するように設計された本発明のプライマーに含んでよい。
したがって、たとえば、
ａ．標的核酸分子の重複領域を増幅するように設計された少なくとも２つのプライマー対を含む、標的核酸分子の重複領域のマルチプレックス増幅における使用のためのプライマーのセットにおいて、それぞれのプライマー対が、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域と、プライマー領域の５’のユニバーサルタグを組み込んだフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域と、プライマー領域の５’のユニバーサルタグを組み込んだリバースプライマー
を含み、
それぞれのプライマー対のフォワードプライマーとリバースプライマーのユニバーサルタグが異なり、直近のプライマー対のフォワードプライマーとリバースプライマーのユニバーサルタグが５’から３’への方向で同一であり、それにより、直近のプライマー対のフォワードプライマーとリバースプライマーとの間で異常な増幅生成物が形成される事象において、異常な増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成され、
プライマーは、５’から３’の順に、
ａ．ユニバーサルタグの下流のＲＮＡヌクレオチド、
ｂ．ＲＮＡヌクレオチドを含まず、標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域
を含んでよい。
そのような実施形態では、ユニバーサルタグはＲＮＡヌクレオチドを含まない。それぞれの関連する態様の全てのさらなる実施形態は必要に応じて変更して適用され、簡潔のため繰り返さない。たとえば、本明細書で定義したユニバーサルプライマーの対はマルチプレックス増幅およびマルチステップ増幅のための試薬のセットに含まれてよい。
そのようなプライマーのセットは、本明細書で論じるように、マルチプレックス増幅およびマルチステップ増幅に用いることができる。これらは本明細書で論じるようにキットに含ませることができる。これらは本明細書で論じるように反応容器に含ませることができる。１つの重要な利点は、単一の反応が同じ反応混合物中で起こり得るという事実である。
第２の増幅反応に続いて、増幅生成物はアダプターおよび任意選択的に下流のプロセシングおよび同定を可能にするバーコードを含む。理想的にはこれは本明細書で論じるようにＮＧＳによって、標的核酸の同定および／または定量が可能になる。
＜重複標的配列を含むマルチプレックス増幅を改良する、およびユニバーサルプライマーの産生を遅延させることによって単一反応混合物中のマルチステップ増幅反応を可能にする＞
好ましい実施形態では、本発明のプライマーは標的核酸分子の重複領域を増幅するためのマルチプレックスにおける第１の増幅反応に用いられる。これらのプライマーは有利に、次の第２の増幅反応（一般にはＰＣＲ）において増幅することができるタグ付けされた増幅生成物を生成する。本発明は、第２の増幅反応に必要なユニバーサルプライマーの生成を遅延させるために有用なユニバーサルプライマーのリバース相補体を形成する核酸分子をも提供する。これは、ユニバーサルプライマーがハイブリダイズする第１の増幅反応からの十分な生成物（タグ付けされたアンプリコン）が産生されるまで第２の増幅反応の開始を制御するために有用である。これらの試薬は、標的核酸分子の重複領域を増幅し、効率的な第２ステージの増幅を確実にするために有利に組み合わせることができる。
したがって、たとえば
ａ．標的核酸分子を増幅するように設計された第１のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第１のユニバーサルタグを組み込んだ第１のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第２のユニバーサルタグを組み込んだ第１のリバースプライマー
を含む第１のプライマー対、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．アダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第１の核酸分子、
ｃ．５’から３’の順に、
ｉ．第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第２のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第２の核酸分子、
ｄ．第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する第１のアダプタープライマー、
ｅ．第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する第２のアダプタープライマー
を含み、
ｄおよびｅの第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて産生された増幅生成物が、ユニバーサルプライマー対を形成し、ここで第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグが、プライマーとして作用して、第１のプライマー対によって産生された増幅生成物を増幅して、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグならびにアダプターを組み込んださらなる増幅生成物を生成する、標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のための試薬のセットにおいて、
標的核酸分子の多重重複領域は、重複領域を増幅する少なくとも２つのプライマー対を用いて増幅される。そのような態様では有利に、試薬は
ａ．標的核酸分子の第１の領域を増幅するように設計された第１のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域を組み込んだ第１のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだ第１のリバースプライマー
を含む第１のプライマー対、
ｂ．第１の領域と少なくとも部分的に重複する標的核酸分子の第２の領域を増幅するように設計された第２のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域および第１のリバースプライマーの５’末端に組み込まれた核酸タグと５’から３’の方向で同一であるプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだ第２のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域を組み込んだ第２のリバースプライマー
を含む、標的核酸分子の重複領域のマルチプレックス増幅における使用のためのプライマーのセットを含み、
第１のリバースプライマーと第２のフォワードプライマーとの間に異常な（短い）増幅生成物が形成される事象において、異常な（短い）増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な（短い）増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成される。
さらにより好ましくは、試薬は標的核酸分子の重複領域のマルチプレックス増幅における使用のためのプライマーのセットを含み、プライマーのセットは
ａ．標的核酸分子の重複領域を増幅するように設計された少なくとも２つのプライマー対を含み、それぞれのプライマー対は
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’のユニバーサルタグを組み込んだフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’のユニバーサルタグを組み込んだリバースプライマー
を含み、
それぞれのプライマー対におけるフォワードプライマーとリバースプライマーのユニバーサルタグが異なっており、直近のプライマー対におけるフォワードプライマーとリバースプライマーのユニバーサルタグが５’から３’への方向で同一であり、それにより、直近のプライマー対のフォワードプライマーとリバースプライマーの間で異常な増幅生成物が形成される事象において異常な増幅生成物の５’末端のユニバーサルタグと増幅の間に形成された異常な増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成される。
それぞれの関連する態様の全てのさらなる実施形態は必要に応じて変更して適用され、簡潔のため繰り返さない。
いくつかの実施形態では、それぞれのプライマー対における少なくとも１つのプライマーはバーコード、任意選択的に分子バーコードを含む。他の実施形態では、標的核酸分子を増幅するためのそれぞれのプライマーはバーコード、任意選択的に分子バーコードを含む。
プライマーを含むそのような試薬のセットは、本明細書で論じるように、マルチプレックス増幅およびマルチステップ増幅に用いることができる。これらは本明細書で論じるようにキットに含ませることができる。これらは本明細書で論じるように反応容器に含ませることができる。１つの重要な利点は、同じ反応混合物中で全体の（マルチプレックスおよびマルチステップ）反応が起こり得るという事実である。
第２の増幅反応に続いて、増幅生成物はアダプターおよび任意選択的に下流のプロセシングおよび同定を可能にするバーコードを含む。理想的にはこれは本明細書で論じるようにＮＧＳによって、標的核酸の同定および／または定量が可能になる。
ユニバーサルプライマーの産生を遅延させることおよび第１の増幅反応の程度を制御することによって、単一の反応混合物中のマルチステップ増幅反応を可能にすること
第１の増幅反応および第２の増幅反応の間のバランスは、両方の反応を単一の反応混合物または反応容器中で行うことの重要な障害である。この問題に対する２つの相補的な解決が提供され、これらは有利に組み合わせることができる。
したがって、たとえば
ａ．標的核酸分子を増幅するように設計された第１のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第１のユニバーサルタグを組み込んだ第１のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第２のユニバーサルタグを組み込んだ第１のリバースプライマー
を含む第１のプライマー対、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．アダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第１の核酸分子、
ｃ．５’から３’の順に、
ｉ．第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第２のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第２の核酸分子、
ｄ．第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する第１のアダプタープライマー、
ｅ．第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する第２のアダプタープライマー
を含み、
ｄおよびｅの第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて産生された増幅生成物が、ユニバーサルプライマー対を形成し、ここで第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグが、プライマーとして作用して、第１のプライマー対によって産生された増幅生成物を増幅して、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグならびにアダプターを組み込んださらなる増幅生成物を生成する、標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のための試薬のセットにおいて、
第１のフォワードプライマーと第１のリバースプライマーの少なくとも１つ、および好ましくは両方は、５’から３’の順に、
ａ．ＲＮＡヌクレオチドを含まないユニバーサルタグ、
ｂ．ＲＮＡヌクレオチド、
ｃ．ＲＮＡヌクレオチドを含まず、標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域
を含む、標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のためのプライマーである。
それぞれの関連する態様の全てのさらなる実施形態は必要に応じて変更して適用され、簡潔のため繰り返さない。
したがって、ＲＮａｓｅ Ｈ（好ましくは熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ）を反応混合物に添加することができる。この試薬の組合せにより、第１の増幅反応の程度を制御することと、第２の増幅反応の開始を遅延させることの両方ができる。それにより、単一の反応混合物または反応容器中で両方の増幅反応の性能を向上することができ、極めて有利である。
プライマーを含むそのような試薬のセットは、本明細書で論じるように、マルチプレックス増幅およびマルチステップ増幅に用いることができる。これらは本明細書で論じるようにキットに含ませることができる。これらは本明細書で論じるように反応容器に含ませることができる。１つの重要な利点は、同じ反応混合物中で全体の（マルチステップ）反応が起こり得るという事実である。
第２の増幅反応に続いて、増幅生成物はアダプターおよび任意選択的に下流のプロセシングおよび同定を可能にするバーコードを含む。理想的にはこれは本明細書で論じるようにＮＧＳによって、標的核酸の同定および／または定量が可能になる。
＜第１の増幅反応の程度の制御によって重複標的配列を含むマルチプレックス増幅を改良することおよび単一の反応混合物中のマルチステップ増幅反応を可能にする、およびユニバーサルプライマーの生成を遅延させることおよび第１の増幅反応の程度の制御によって単一反応混合物中のマルチステップ増幅反応を可能にする＞
最も好ましくは、本発明のプライマーは標的核酸分子の重複領域を増幅するためのマルチプレックスにおける第１の増幅反応に用いられる。これらのプライマーは有利に、次の第２の増幅反応（一般にはＰＣＲ）において増幅することができるタグ付けされた増幅生成物を生成する。本発明は、ＲＮＡヌクレオチドを組み込んで第１の増幅反応の程度を制御し、第２の反応との競合を最小化して異常な増幅生成物の過剰な生成を防止するプライマーをも提供する。これらのプライマーの特徴は、標的核酸分子の重複領域を増幅するように設計された本発明のプライマーに含ませることができる。
そのような第１ステージのプライマーは有利に核酸分子と組み合わされて、ユニバーサルプライマーのリバース相補体、好ましくはユニバーサルプライマー対を形成し、これは第２の増幅反応に必要なユニバーサルプライマーの生成を遅延させるために有用である。これは、ユニバーサルプライマーがハイブリダイズする第１の増幅反応からの十分な生成物（タグ付けされたアンプリコン）が産生されるまで第２の増幅反応の開始を制御するために有用である。これらの試薬は、標的核酸分子の重複領域を増幅し、効率的な第２ステージの増幅を確実にするために有利に組み合わせることができる。
プライマーを含むそのような試薬のセットは、本明細書で論じるように、マルチプレックス増幅およびマルチステップ増幅に用いることができる。これらは本明細書で論じるようにキットに含ませることができる。これらは本明細書で論じるように反応容器に含ませることができる。１つの重要な利点は、同じ反応混合物中で全体の（マルチプレックスおよびマルチステップ）反応が起こり得るという事実である。
第２の増幅反応に続いて、増幅生成物はアダプターおよび任意選択的に下流のプロセシングおよび同定を可能にするバーコードを含む。理想的にはこれは本明細書で論じるようにＮＧＳによって、標的核酸の同定および／または定量が可能になる。
それぞれの関連する態様の全ての関連する実施形態は必要に応じて変更して適用され、簡潔のため繰り返さない。
アンプリコンが重複領域を共有するマルチプレックスＰＣＲ反応における異常な増幅生成物の生成に関連する問題の模式図である。 短い異常な増幅生成物の増幅を阻害する本発明のプライマーのセットの使用の模式図である。 どのようにしてヘアピン様二次構造が形成され、短い異常な増幅生成物の増幅が阻害されるかを説明するための、本発明のプライマーのセットを用いた３ラウンドのｍＰＣＲの模式図である。 どのようにしてヘアピン様二次構造が形成され、短い異常な増幅生成物の増幅が阻害されるかを説明するための、本発明のプライマーのセットを用いた３ラウンドのｍＰＣＲの模式図である。 どのようにしてヘアピン様二次構造が形成され、短い異常な増幅生成物の増幅が阻害されるかを説明するための、本発明のプライマーのセットを用いた３ラウンドのｍＰＣＲの模式図である。 長短両方の異常な増幅生成物の増幅を阻害するための本発明のプライマーの２つのセットの使用の模式図である。 長短の異常な増幅生成物の実質的に全ての増幅を阻害するための本発明のプライマーの３つのセットの使用の模式図である。 長短の異常な増幅生成物の実質的に全ての増幅を阻害するための本発明のプライマーの３つのセットの使用の模式図である。 長短の異常な増幅生成物の実質的に全ての増幅を阻害するための本発明のプライマーの３つのセットの使用の模式図である。 長短両方の異常な増幅生成物の増幅を阻害するための本発明のプライマーの２つのセットの使用およびそれに続く本発明のユニバーサルプライマーによる第２の増幅の模式図である。 長短両方の異常な増幅生成物の増幅を阻害するための本発明のプライマーの２つのセットの使用およびそれに続く本発明のユニバーサルプライマーによる第２の増幅の模式図である。 長短両方の異常な増幅生成物の増幅を阻害するための本発明のプライマーの２つのセットの使用およびそれに続く本発明のユニバーサルプライマーによる第２の増幅の模式図である。 標準のＢＲＣＡ腫瘍ＭＡＳＴＲ Ｄｘプライマーの使用により異常な短いＰＣＲ生成物の形成が生じることを証明するトレースである。 ＢＲＣＡ腫瘍プライマー対に結合したタグ配列を重複するアンプリコンの１ステップマルチプレックスに適合させるための適応によって、異常な短いＰＣＲ生成物の形成が排除され、所望のアンプリコンの生成のみが生じることを証明するトレースである。 本発明によるプライマーの模式図を図９Ａに示す。そのようなプライマーの代表的な配列および最初の標的核酸分子上のプライマーの結合部位を図９Ｂに示す。分子バーコードを含む本発明によるプライマーの模式図を図９Ｃに示す。 本発明によるさらなるプライマーの模式図を図１０Ａに示す。そのようなプライマーの代表的な配列および最初の標的核酸分子上のプライマーの結合部位を図１０Ｂに示す。分子バーコードを含む本発明によるさらなるプライマーの模式図を図１０Ｃに示す。 第１の増幅反応の効率を低減させるための本発明のプライマーの使用の模式図である。 第２の「ユニバーサル」増幅反応を示す図である。 標的核酸分子のマルチステップ増幅を行うための従来技術の２チューブシステムの模式図である。 単一の反応混合物中で標的核酸分子のマルチステップ増幅を行うための本発明の試薬のセットの使用の模式図である。 単一の反応混合物中で標的核酸分子のマルチステップ増幅を行うための本発明の試薬のセットの使用の模式図である。 単一の反応混合物中で標的核酸分子のマルチステップ増幅を行うための本発明の試薬のセットの使用の模式図である。 ＭＩＤおよびｒｃＭＩＤプライマーを用いる第２のＰＣＲ生成物の断片分析である。 ＭＩＤプライマーとｒｃＭＩＤ＋ｐ５／ｐ７プライマーを用いた第２のＰＣＲの結果の断片分析に基づく比較である。上のパネルはＭＩＤプライマーによる増幅の結果、下のパネルはｒｃＭＩＤ＋ｐ５／７プライマーによる増幅の結果である。 それぞれＭＩＤプライマーとｒｃＭＩＤ＋ｐ５／ｐ７プライマーを用いた２ステップ（上のパネル）および１ステップ（下のパネル）の間の断片分析に基づく比較である。着色したボックスは期待されるアンプリコンの位置を示す。 Ｘ軸上にアンプリコンの長さ、Ｙ軸上にそれぞれのピークの高さとして表したそれぞれのアンプリコンの収率を示す断片分析の結果である。図１７Ａは、第１のプライマー対にＲＮＡ塩基を含まない１ステップＰＣＲの断片分析の結果を示す図である。図１７Ｂは、同じ結果であるが、それぞれが第１のＰＣＲ生成物の予想される大きさを表す長方形（灰色のバンド）を重ねた図である。図１７Ｃは、同じ結果であるが、それぞれがユニバーサルＰＣＲの後のＰＣＲ生成物の予想される大きさを表す長方形（灰色のバンド）を重ねた図である。 Ｘ軸上にアンプリコンの長さ、Ｙ軸上にそれぞれのピークの高さとして表したそれぞれのアンプリコンの収率を示す断片分析の結果である。図１８Ａは、第１のプライマー対にＲＮＡ塩基を含む１ステップＰＣＲの断片分析の結果を示す図である。図１８Ｂは、同じ結果であるが、それぞれが第１のＰＣＲ生成物の予想される大きさを表す長方形（灰色のバンド）を重ねた図である。図１８Ｃは、同じ結果であるが、それぞれがユニバーサルＰＣＲの後のＰＣＲ生成物の予想される大きさを表す長方形（灰色のバンド）を重ねた図である。
＜重複標的配列を含むマルチプレックス増幅の改良＞
図１は、アンプリコンが重複領域を共有するマルチプレックスＰＣＲ反応における異常な増幅生成物の生成に付随する問題を示す。ここでは例として、増幅すべき２つの標的配列、即ち標的配列１（ＴＳ１；１２）および標的配列２（ＴＳ２；１３）を含むＤＮＡデュプレックス鎖（１１）を示す。読者の利便のため、それぞれの標的配列は独立に示しているが、これらの配列の両方は実際上、同じＤＮＡデュプレックス鎖の上に存在し、重複していることを理解されたい。重複領域は点々のボックスとして示している。フォワードプライマー（１４）とリバースプライマー（１５）はＴＳ１を増幅してアンプリコン１（ＡＭ１；１６）を生成するように設計されている。第２のフォワードプライマー（１７）と第２のリバースプライマー（１８）はＴＳ２を増幅してアンプリコン２（ＡＭ２；１９）を生成するように設計されている。その機構が当技術で周知の増幅の間、ＡＭ１とＡＭ２の両方が期待通り産生される。しかし、ＤＮＡデュプレックス鎖の上に重複する標的配列により、示されているように異常な増幅生成物も生成する。「長い」異常な増幅生成物１（ＡＢ１；１１１）は、ＴＳ２リバースプライマー（１８）と協奏して作用するＴＳ１フォワードプライマー（１４）によって形成される。「短い」異常な増幅生成物２（ＡＢ２；１１２）は、ＴＳ１リバースプライマー（１５）と協奏して作用するＴＳ２フォワードプライマー（１７）によって形成される。最も短いアンプリコンであるＡＢ２が優先的に形成され得る。
図２は、本発明のプライマーのセットの使用が図１に示した問題の克服をいかにして助けるかを説明する。したがって、図２は増幅すべき２つの標的配列、即ち標的配列１（ＴＳ１；２２）および標的配列２（ＴＳ２；２３）を含むＤＮＡデュプレックス鎖（２１）を示す。読者の利便のため、それぞれの標的配列は独立に示しているが、これらの配列の両方は実際上、同じＤＮＡデュプレックス鎖（２１）の上に存在し、重複していることを理解されたい。重複領域は点々のボックスとして示している。第１のフォワードプライマー（２４）と第１のリバースプライマー（２５）はＴＳ１を増幅してアンプリコン１（ＡＭ１；２６）を生成するように設計されている。即ち、第１のフォワードプライマー（２４）はＤＮＡデュプレックス鎖（２１）のアンチセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（実線矢印）を含み、第１のリバースプライマー（２５）はＴＳ１のそれぞれの境界でＤＮＡデュプレックス鎖（２１）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（点線矢印）を含む。第２のフォワードプライマー（２７）と第２のリバースプライマー（２８）はＴＳ２を増幅してアンプリコン２（ＡＭ２；２９）を生成するように設計されている。したがって、第２のフォワードプライマー（２７）はＤＮＡデュプレックス鎖（２１）のアンチセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（実線矢印）を含み、第２のリバースプライマー（２８）はＴＳ２のそれぞれの境界を画定するＤＮＡデュプレックス鎖（２１）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（点線矢印）を含む。
本発明によれば、第１のリバースプライマー（２５）と第２のフォワードプライマー（２７）は、それぞれの５’末端に同一のヌクレオチド配列（白丸；以後「タグ」と称する）でそれぞれタグ付けされている。疑念を避けるため、配列は５’から３’の方向で同一である。タグは増幅前の最初のＤＮＡデュプレックス鎖（２１）とはハイブリダイズしない。
その機構が当技術で周知の、少なくとも３サイクルのｍＰＣＲ増幅（一連の変性ステップである１つの増幅サイクル、それに続くアニーリングステップ、それに続く伸長ステップ）の間、ＡＭ１とＡＭ２の両方が期待通り産生される。ＡＭ１は第１の（ＴＳ１）リバースプライマー（２５）と協奏して作用する第１の（ＴＳ１）フォワードプライマー（２４）によって生成し、ＡＭ２は第２の（ＴＳ２）リバースプライマー（２８）と協奏して作用する第２の（ＴＳ２）フォワードプライマー（２７）によって生成する。しかし重要なことに、第２の（ＴＳ２）フォワードプライマー（２７）および第１の（ＴＳ１）リバースプライマー（２５）の代わりにタグ付けされていない従来のプライマーを用いた場合に指数関数的に形成されるであろう短い異常な増幅生成物は、何ら顕著な程度には蓄積しない。これは、短い異常な増幅生成物が形成された場合に、それぞれの一本鎖がその５’末端に核酸タグを、またその３’末端に核酸タグの相補体（黒丸で表す）を含むからである。これにより、核酸タグとその相補体との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次ヘアピン様構造（２１２）が形成することが可能になる。より具体的には、増幅サイクルの間に異常な増幅生成物が形成され、次いで単一の核酸鎖に解離（融解）するのに十分な程度に加熱される。次の増幅サイクルの間、アニーリングステップの間に温度が下がると、５’核酸タグと一本鎖の異常な増幅生成物の３’末端の相補配列とのハイブリダイゼーションは、一本鎖の異常な増幅生成物とさらなるプライマーとの分子間ハイブリダイゼーションよりもエントロピー的に有利になる。したがって、短い異常な増幅生成物のさらなる増幅が阻害される。結果として、ＡＭ１およびＡＭ２の増幅効率が改良される。
この例では、第２の（ＴＳ２）リバースプライマー（２８）と協奏して作用する第１の（ＴＳ１）フォワードプライマー（２４）によって、長い異常な増幅生成物（２１１）は依然として形成され得る。しかしそれにも関わらず、ＡＭ１およびＡＭ２の方が短いのでそれらの生成が優先する。
短い異常な増幅生成物からの二次ヘアピン様構造の形成を、図３Ａ～Ｃにより詳細に示す。図３Ａに示すように、第１ラウンドのｍＰＣＲの間に、最初の標的核酸分子のＤＮＡデュプレックスは変性（または融解）して、センス鎖（３１）とアンチセンス鎖（３２）に分離している。アニーリングステップの間の冷却は、第２の（ＴＳ２）フォワードプライマー（２７）がその相補的プライマー領域（実線矢印）を介して標的核酸分子のアンチセンス鎖（３２）にハイブリダイズしていることを意味する。第１の（ＴＳ１）リバースプライマー（２５）はその相補的プライマー領域（破線矢印）を介して標的核酸分子のセンス鎖（３１）にハイブリダイズしている。第２の（ＴＳ２）フォワードプライマー（２７）と第１の（ＴＳ１）リバースプライマー（２５）の両方はそれらのそれぞれの５’末端に核酸タグを含み、核酸タグは、説明のためのみであるが、ヌクレオチド配列ＣＴＡＧＴＴ（５’から３’へ）として示される。それぞれのハイブリダイズしたプライマーからのＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’への方向の伸長により、新たなセンス鎖（３３）およびアンチセンス鎖（３４）が合成され、それらのそれぞれの５’末端にＣＴＡＧＴＴタグが組み込まれる。
図３Ｂに示すように、第２ラウンドのｍＰＣＲで、増幅ラウンド１で形成された二本鎖ＤＮＡデュプレックスは変性（または融解）して、センス鎖とアンチセンス鎖に分離する。簡潔にするため、それらのそれぞれの５’末端にＣＴＡＧＴＴタグを組み込んだ新たなセンス鎖（３３）およびアンチセンス鎖（３４）のみを示す。変性に続いて、アニーリングステップの間の冷却は、第２の（ＴＳ２）フォワードプライマー（２７）がその相補的プライマー領域（実線矢印）を介してアンチセンス鎖（３４）にハイブリダイズしていることを意味する。第１の（ＴＳ１）リバースプライマー（２５）はその相補的プライマー領域（破線矢印）を介してセンス鎖（３３）にハイブリダイズしている。それぞれのハイブリダイズしたプライマーからのＤＮＡポリメラーゼによる伸長により、それぞれ別の新たなセンス鎖（３５）およびアンチセンス鎖（３６）が合成される。それらのそれぞれの５’末端において、新たなセンス鎖（３５）およびアンチセンス鎖（３６）はＣＴＡＧＴＴ配列を含む。それらのそれぞれの３’末端において、新たなセンス鎖（３５）およびアンチセンス鎖（３６）は、ＤＮＡポリメラーゼを介する複製の機構によって、相補的なＡＡＣＴＡＧ配列を（５’から３’への方向で）含む。
ここで図３Ｃに示すように、第３ラウンドのｍＰＣＲでは、増幅ラウンド２で形成された二本鎖ＤＮＡデュプレックスは変性（または融解）して、センス鎖とアンチセンス鎖に分離する。変性の後、およびアニーリングステップの間の冷却に際して、新たなセンス鎖（３５）と新たなアンチセンス鎖（３６）の相補的な５’および３’タグ末端はハイブリダイズ（３７）して折り畳まれたヘアピン様構造を形成する。この分子内ハイブリダイゼーション事象はさらなるプライマーとの分子間ハイブリダイゼーションよりもエントロピー的に有利であり、その結果、優先的に形成される。したがって、プライマーはここで標的核酸分子に優先的に結合することになり、それによりｍＰＣＲプロセスが改良される。
さらなる実施例で、図４は、本発明による特に好ましいプライマーのセットの使用によって、長短両方の異常な増幅生成物の指数関数的な増幅がいかに防止され、所望の増幅生成物に有利になるかを示す。そのようなプライマーのセットの数を増加させて単一の反応容器中でいくつかの重複領域を増幅させることがいかにしてできるかは容易に予測できる。
したがって、図４は増幅すべき２つの標的配列、即ち標的配列１（ＴＳ１；４２）および標的配列２（ＴＳ２；４３）を含むＤＮＡデュプレックス鎖（４１）を示す。読者の利便のため、それぞれの標的配列は独立に示しているが、これらの配列の両方は実際上、同じＤＮＡデュプレックス鎖（４１）の上に存在し、重複していることを理解されたい。重複領域は点々のボックスとして示している。第１のフォワードプライマー（４４）と第１のリバースプライマー（４５）はＴＳ１を増幅してアンプリコン１（ＡＭ１；４６）を生成するように設計されている。即ち、フォワードプライマー（４４）はＤＮＡデュプレックス鎖（４１）のアンチセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（実線矢印）を含み、リバースプライマー（４５）はＴＳ１のそれぞれの境界でＤＮＡデュプレックス鎖（４１）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（点線矢印）を含む。第２のフォワードプライマー（４７）と第２のリバースプライマー（４８）はＴＳ２を増幅してアンプリコン２（ＡＭ２；４９）を生成するように設計されている。即ち、フォワードプライマー（４７）はＤＮＡデュプレックス鎖（４１）のアンチセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（実線矢印）を含み、リバースプライマー（４８）はＴＳ２のそれぞれの境界でＤＮＡデュプレックス鎖（４１）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（点線矢印）を含む。
重要なことに、第１のリバースプライマー（４５）と第２のフォワードプライマー（４７）は、それぞれのプライマーの５’末端に同一のヌクレオチド配列（白丸；以後「タグセット１」と称する）でタグ付けされている。疑念を避けるため、配列は５’から３’への方向で同一である。
セット１のタグは最初の標的ＤＮＡデュプレックス鎖（４１）とはハイブリダイズしない。さらに、第１のフォワードプライマー（４４）と第２のリバースプライマー（４８）はそれぞれのプライマーの５’末端に、タグセット１のそれとは異なる配列の、同一のヌクレオチド配列（白三角；以後「タグセット２」と称する）でタグ付けされている。疑念を避けるため、配列は５’から３’への方向で同一である。タグセット２も最初の標的ＤＮＡデュプレックス鎖（４１）とはハイブリダイズしない。
その機構が当技術で周知の、少なくとも３ラウンドのｍＰＣＲ増幅（一連の変性ステップである１ラウンドの増幅、それに続くアニーリングステップ、それに続く伸長ステップ）の間、ＡＭ１とＡＭ２の両方が期待通り産生される。ＡＭ１は第１の（ＴＳ１）リバースプライマー（４５）と協奏して作用する第１の（ＴＳ１）フォワードプライマー（４４）によって生成し、ＡＭ２は第２の（ＴＳ２）リバースプライマー（４８）と協奏して作用する第２の（ＴＳ２）フォワードプライマー（４７）によって生成する。しかし重要なことに、タグ付けされていない従来のプライマーを用いた場合に指数関数的に形成される長短両方の異常な増幅生成物は、何ら顕著な程度には蓄積しない。これは、短い異常な増幅生成物が形成された場合に、それぞれの一本鎖がその５’末端にタグセット１の核酸タグを、またその３’末端に核酸タグの相補体（黒丸で表す）を含むからである。これにより、既に述べたように、核酸タグとその相補体との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、短い異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次ヘアピン様構造（４１０）が形成することが可能になる。同様に、長い異常な増幅生成物が形成された場合には、それぞれの一本鎖がその５’末端にタグセット２の核酸タグを、またその３’末端に核酸タグの相補体（黒三角で表す）を含む。これにより、既に述べたように、核酸タグとその相補体との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、長い異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次ヘアピン様構造（４１１）が形成することが可能になる。結果として、ＡＭ１およびＡＭ２の増幅効率が改良される。隣接するプライマー対におけるタグの相互配置によって全ての異常な増幅生成が妨げられるので、この設計は単一の反応容器中での標的核酸の多重重複領域のｍＰＣＲに特に有益である。
さらなる実施例で、図５Ａ～Ｃは、本発明による特に好ましいプライマーのセットの使用によって、実質的に全ての長短の異常な増幅生成物の指数関数的な増幅がいかに防止され、標的核酸分子の３つの重複する標的領域に関する所望の増幅生成物に有利になるかを示す。そのようなプライマーのセットの数をさらに増加させて単一の反応容器中で４つまたはそれ以上（数百または数千を含む）の重複領域を増幅させることがいかにしてできるかは容易に予測できる。
したがって、図５Ａは増幅すべき３つの標的配列、即ち標的配列１（ＴＳ１；５２）、標的配列２（ＴＳ２；５３）、および標的配列３（ＴＳ３；５４）を含むＤＮＡデュプレックス鎖（５１）を示す。読者の利便のため、それぞれの標的配列は独立に示しているが、これらの配列の全ては実際上、同じＤＮＡデュプレックス鎖（５１）の上に存在していることを理解されたい。ＴＳ１（５２）とＴＳ２（５３）は点々のボックス（５１４）として示す重複領域を共有している。ＴＳ２（５３）とＴＳ３（５４）はチェック模様のボックス（５１５）として示す重複領域を共有している。
第１のフォワードプライマー（５５）と第１のリバースプライマー（５６）はＴＳ１（５２）を増幅して図５Ｃに示すアンプリコン１（ＡＭ１；５７）を生成するように設計されている。即ち、フォワードプライマー（５５）はＤＮＡデュプレックス鎖（５１）のアンチセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（実線矢印）を含み、リバースプライマー（５６）はＴＳ１（５２）のそれぞれの境界でＤＮＡデュプレックス鎖（５１）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（点線矢印）を含む。第２のフォワードプライマー（５８）と第２のリバースプライマー（５９）はＴＳ２（５３）を増幅して図５Ｃに示すアンプリコン２（ＡＭ２；５１０）を生成するように設計されている。即ち、フォワードプライマー（５８）はＤＮＡデュプレックス鎖（５１）のアンチセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（実線矢印）を含み、リバースプライマー（５９）はＴＳ２（５３）のそれぞれの境界でＤＮＡデュプレックス鎖（５１）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（点線矢印）を含む。第３のフォワードプライマー（５１１）と第２のリバースプライマー（５１２）はＴＳ３（５４）を増幅して図５Ｃに示すアンプリコン２（ＡＭ３；５１３）を生成するように設計されている。即ち、フォワードプライマー（５１１）はＤＮＡデュプレックス鎖（５１）のアンチセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（実線矢印）を含み、リバースプライマー（５１２）はＴＳ３（５４）のそれぞれの境界でＤＮＡデュプレックス鎖（５１）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（点線矢印）を含む。
重要なことに、第１のリバースプライマー（５６）と第２のフォワードプライマー（５８）は、それぞれのプライマーの５’末端に同一のヌクレオチド配列（白丸；以後「タグセット１」と称する）でタグ付けされている。疑念を避けるため、配列は５’から３’への方向で同一である。セット１のタグは最初の標的ＤＮＡデュプレックス鎖（５１）とはハイブリダイズしない。さらに、第１のフォワードプライマー（５５）と第２のリバースプライマー（５９）はそれぞれのプライマーの５’末端に、タグセット１のそれとは異なる配列の、同一のヌクレオチド配列（白三角；以後「タグセット２」と称する）でタグ付けされている。疑念を避けるため、配列は５’から３’への方向で同一である。タグセット２も最初の標的ＤＮＡデュプレックス鎖（５１）とはハイブリダイズしない。さらに、第３のフォワードプライマー（５１１）も５’末端に第２のリバースプライマー（５９）のそれと同一のヌクレオチド配列（５’から３’への方向で）を有するタグでタグ付けされており、第３のリバースプライマー（５１２）は５’末端に第２のフォワードプライマー（５８）のそれと同一のヌクレオチド配列（５’から３’への方向で）を有するタグでタグ付けされている。いずれのタグも、最初の標的ＤＮＡデュプレックス鎖（５１）とはハイブリダイズできない。
その機構が当技術で周知の、少なくとも３ラウンドのｍＰＣＲ増幅（一連の変性ステップである１ラウンドの増幅、それに続くアニーリングステップ、それに続く伸長ステップ）の間、ＡＭ１、ＡＭ２、およびＡＭ３の全てが期待通り産生される。ＡＭ１（５７）は第１の（ＴＳ１）リバースプライマー（５６）と協奏して作用する第１の（ＴＳ１）フォワードプライマー（５５）によって生成し、ＡＭ２（５１０）は第２の（ＴＳ２）リバースプライマー（５９）と協奏して作用する第２の（ＴＳ２）フォワードプライマー（５８）によって生成し、ＡＭ３（５１３）は第３の（ＴＳ３）リバースプライマー（５１２）と協奏して作用する第３の（ＴＳ３）フォワードプライマー（５１１）によって生成する。しかし重要なことに、タグ付けされていない従来のプライマーを用いた場合に指数関数的に形成される実質的に長短全ての異常な増幅生成物は、何ら顕著な程度には蓄積しない。これは、協奏して作用する第２のフォワードプライマー（５８）と第１のリバースプライマー（５６）によって短い異常な増幅生成物が形成された場合に、それぞれの一本鎖がその５’末端にタグセット１の核酸タグを、またその３’末端に核酸タグの相補体（黒丸で表す）を含むからである。これにより、既に述べたように、核酸タグとその相補体との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、短い異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する図５Ｂに示す二次ヘアピン様構造（５１６）が形成することが可能になる。同様に、協奏して作用する第３のフォワードプライマー（５１１）と第２のリバースプライマー（５９）によって短い異常な増幅生成物が形成された場合には、それぞれの一本鎖がその５’末端にタグセット２の核酸タグを、またその３’末端に核酸タグの相補体（黒三角で表す）を含む。これにより、既に述べたように、核酸タグとその相補体との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、短い異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する図５Ｂに示す二次ヘアピン様構造（５１７）が形成することが可能になる。
協奏して作用する第１のフォワードプライマー（５５）と第２のリバースプライマー（５９）によって長い異常な増幅生成物が形成された場合に、それぞれの一本鎖がその５’末端にタグセット２の核酸タグを、またその３’末端に核酸タグの相補体（黒三角で表す）を含む。これにより、既に述べたように、核酸タグとその相補体との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、長い異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する図５Ｂに示す二次ヘアピン様構造（５１８）が形成することが可能になる。同様に、協奏して作用する第２のフォワードプライマー（５８）と第３のリバースプライマー（５１２）によって長い異常な増幅生成物が形成された場合には、それぞれの一本鎖がその５’末端にタグセット１の核酸タグを、またその３’末端に核酸タグの相補体（黒丸で表す）を含む。これにより、既に述べたように、核酸タグとその相補体との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、長い異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する図５Ｂに示す二次ヘアピン様構造（５１９）が形成することが可能になる。協奏して作用する第１のフォワードプライマー（５５）と第３のリバースプライマー（５１２）によって長い異常な増幅生成物が形成する理論的可能性は残るが、これは最も長いアンプリコンであるので、最も起こりにくい。結果として、タグ付けされていない従来のプライマー対と比べて、本発明によるプライマーセットを用いることによって、ＡＭ１（５７）、ＡＭ２（５１０）、およびＡＭ３（５１３）の増幅効率が改良される。図に示されるように、隣接するプライマー対におけるタグの相互配置によって実質的に全ての異常な増幅生成が妨げられるので、この設計は単一の反応容器中での標的核酸の多重重複領域のｍＰＣＲに特に有益である。
好ましい実施形態では、本発明のプライマーはプライマー領域の上流にユニバーサルタグを含む。このユニバーサルタグは増幅生成物に含まれ、したがってユニバーサルプライマーの使用を必要とする第２の増幅が起こることを可能にする。これを図６Ａ～Ｃに示す。
したがって、図６Ａは増幅すべき２つの標的配列、即ち標的配列１（ＴＳ１；６２）および標的配列２（ＴＳ２；６３）を含むＤＮＡデュプレックス鎖（６１）を示す。読者の利便のため、それぞれの標的配列は独立に示しているが、これらの配列の両方は実際上、同じＤＮＡデュプレックス鎖（６１）の上に存在し、重複していることを理解されたい。重複領域は点々のボックスとして示している。第１のフォワードプライマー（６４）と第１のリバースプライマー（６５）はＴＳ１を増幅してアンプリコン１（ＡＭ１；６６）を生成するように設計されている。即ち、フォワードプライマー（６４）はＤＮＡデュプレックス鎖（６１）のアンチセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（実線矢印）を含み、リバースプライマー（６５）はＴＳ１のそれぞれの境界でＤＮＡデュプレックス鎖（６１）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（点線矢印）を含む。第２のフォワードプライマー（６７）と第２のリバースプライマー（６８）はＴＳ２を増幅してアンプリコン２（ＡＭ２；６９）を生成するように設計されている。即ち、フォワードプライマー（６７）はＤＮＡデュプレックス鎖（６１）のアンチセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（実線矢印）を含み、リバースプライマー（６８）はＴＳ２のそれぞれの境界でＤＮＡデュプレックス鎖（６１）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（点線矢印）を含む。
図４に関して既に述べたように、第１のリバースプライマー（６５）と第２のフォワードプライマー（６７）は、それぞれのプライマーの５’末端に同一のヌクレオチド配列（白丸；以後「第２のユニバーサルタグ」と称する）でタグ付けされている。疑念を避けるため、配列は５’から３’への方向で同一である。第２のユニバーサルタグは最初の標的ＤＮＡデュプレックス鎖（６１）とはハイブリダイズしない。さらに、第１のフォワードプライマー（６４）と第２のリバースプライマー（６８）はそれぞれのプライマーの５’末端に、第２のユニバーサルタグのそれとは異なる配列の、同一のヌクレオチド配列（白三角；以後「第１のユニバーサルタグ１」と称する）でタグ付けされている。疑念を避けるため、配列は５’から３’への方向で同一である。第１のユニバーサルタグも最初の標的ＤＮＡデュプレックス鎖（６１）とはハイブリダイズしない。
図から分かるように、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグはプライマー領域の上流に位置している。ユニバーサルタグは、全てのプライマー対で、相互配置において同じ配列が使用されているので、「ユニバーサル」と称されることを理解されたい。したがって、本発明に従って第３のプライマー対が存在し、第３のフォワードプライマーがユニバーサルタグを含むならば、それは第１のユニバーサルタグ（即ち、第１のフォワードプライマーに含まれる同じユニバーサルタグであるが、第２のフォワードプライマーに含まれるユニバーサルタグとは異なる）になる。そのようなユニバーサルタグの使用により、第２の増幅に必要なプライマーの数を低減し、第２の増幅反応を単純化することができる。第２の増幅は、増幅生成物に組み込まれたユニバーサルタグ配列へのプライマーのハイブリダイゼーションによっている。同様の理由で同じことがリバースプライマーに適用される。したがって、本発明に従って第３のプライマー対が存在し、第３のリバースプライマーがユニバーサルタグを含むならば、それは第２のユニバーサルタグ（即ち、第１のリバースプライマーに含まれる同じユニバーサルタグであるが、第２のリバースプライマーに含まれるユニバーサルタグとは異なる）になる。第１のユニバーサルタグも第２のユニバーサルタグも、最初の標的ＤＮＡデュプレックス鎖（６１）とはハイブリダイズしない。
その機構が当技術で周知の、少なくとも３ラウンドのｍＰＣＲ増幅（一連の変性ステップである１ラウンドの増幅、それに続くアニーリングステップ、それに続く伸長ステップ）の間、ＡＭ１とＡＭ２の両方が期待通り産生される。ＡＭ１は第１の（ＴＳ１）リバースプライマー（６５）と協奏して作用する第１の（ＴＳ１）フォワードプライマー（６４）によって生成し、ＡＭ２は第２の（ＴＳ２）リバースプライマー（６８）と協奏して作用する第２の（ＴＳ２）フォワードプライマー（６７）によって生成する。しかし重要なことに、タグ付けされていない従来のプライマーを用いた場合に指数関数的に形成される長短両方の異常な増幅生成物は、何ら顕著な程度には蓄積しない。これは、短い異常な増幅生成物が形成された場合に、それぞれの一本鎖がその５’末端に第２のユニバーサルタグを、またその３’末端に第２のユニバーサルタグの相補体（黒丸で表す）を含むからである。これにより、既に述べたように、第２のユニバーサルタグとその相補体との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、短い異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次ヘアピン様構造（６１０）が形成することが可能になる。同様に、長い異常な増幅生成物が形成された場合には、それぞれの一本鎖がその５’末端に第１のユニバーサルタグを、またその３’末端に核酸タグの相補体（黒三角で表す）を含む。これにより、既に述べたように、核酸タグとその相補体との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、長い異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次ヘアピン様構造（６１１）が形成することが可能になる。結果として、ＡＭ１およびＡＭ２の増幅効率が改良される。
さらに、ＡＭ１（６６）とＡＭ２（６９）は第１のユニバーサルタグと第２のユニバーサルタグを含む。重要なことに、またより具体的に、ＡＭ１（６６）のセンス鎖は５’末端に第１のユニバーサルタグを含み、ＡＭ１（６６）のアンチセンス鎖は５’末端に第２のユニバーサルタグを含む。対照的に、ＡＭ２（６９）のセンス鎖は５’末端に第２のユニバーサルタグを含み、ＡＭ２（６９）のアンチセンス鎖は５’末端に第１のユニバーサルタグを含む。次いでユニバーサルタグの組込みにより、第２ラウンドの増幅生成物のそれぞれの末端に異なったアダプター分子（および任意選択的に試料バーコード分子）を組み込むさらなる増幅反応が起こることが可能になる。
図６Ｂに示すように、ここで第２の増幅におけるユニバーサルプライマーの対のための結合部位としてユニバーサルタグの相補体を用いることができる。より具体的には、第１のユニバーサルプライマー（６１２）は、５’から３’の順に、
ａ．本明細書で定義するアダプター配列である第１のアダプター配列（アダプター１）、
ｂ．本明細書で定義する試料バーコード配列、
ｃ．図に示されるように生成した増幅生成物に組み込まれた第１のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一であるユニバーサルプライマー領域（白三角）
を含み、
第２のユニバーサルプライマー（６１３）は５’から３’の順に、
ａ．本明細書で定義するアダプター配列であってアダプター１と実質的にまたは殆ど配列同一性を共有しない第２のアダプター配列（アダプター２）、
ｂ．本明細書で定義する試料バーコード配列、
ｃ．図に示されるように生成した増幅生成物に組み込まれた第２のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一であるユニバーサルプライマー領域（白丸）
を含む。
したがって、第２の増幅の間に、第１のユニバーサルプライマー領域（これは（５’から３’への方向で）第１のユニバーサルタグと同一である）は第１のユニバーサルタグの相補体にハイブリダイズし、（ＤＮＡ）ポリメラーゼ酵素によるそれぞれのアンプリコンの伸長を引き起こす。その機構は当技術で周知である。同様に、第２のユニバーサルプライマー領域（これは（５’から３’への方向で）第２のユニバーサルタグと同一である）は第２のユニバーサルタグの相補体にハイブリダイズし、（ＤＮＡ）ポリメラーゼ酵素によるそれぞれのアンプリコンの伸長を引き起こす。
結果として、増幅生成物（６１４）および（６１５）が、図６Ｃに示すように産生される。決定的なことに、ここでそれぞれの生成物はいずれかの末端に第１のアダプター配列および第２のアダプター配列を組み込んでいる。プライマー対におけるユニバーサルタグの配置により、第１のアダプター配列および第２のアダプター配列は異なった増幅生成物中の分子の対向する末端にあってよい。これは後続のプロセシングには問題ではない。それぞれの増幅生成物（６１４）および（６１５）の末端における第１のアダプター配列および第２のアダプター配列の組込みは、これらが今や高スループットの大量並列ＤＮＡシーケンシングのために使用できることを意味している。たとえば、アダプター１およびアダプター２はそれぞれ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑプラットフォームを用いるシーケンシングに必要なｐ５アダプターおよびｐ７アダプターであってよい。あるいは、アダプター１およびアダプター２はそれぞれ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎプラットフォームを用いるシーケンシングに必要なＡアダプターおよびＰ１アダプターであってよい。
特に有利には、第１のフォワードプライマー（６４）、第１のリバースプライマー（６５）、第２のフォワードプライマー（６７）、および第２のリバースプライマー（６５）を用いる第１の増幅、ならびにユニバーサルプライマー（６１２）および（６１３）を用いる第２の増幅は、同じ反応容器中で行うことができる。言い換えると、上述のプライマーの全ては必要な増幅試薬（ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ等）とともに組み合わせて反応の開始時に含ませてよい。したがって、単一の反応容器中で、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端に必須のアダプターを完備した、標的核酸の所望の重複アンプリコンを、高スループットの大量並列ＤＮＡシーケンシングのために産生させることができる。シーケンシングは個別の反応容器中で（たとえばシーケンシング機器のフローセルで）起こることになることが注目される。
第１の増幅反応の程度の制御によって単一反応混合物中のマルチステップ増幅反応を可能にすること
図９Ａに、標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のためのプライマー（１）を模式的に示す。プライマーは５’から３’の順に第１にユニバーサルタグ（２）を含む。タグ（２）は、第２の増幅でユニバーサルプライマーがハイブリダイズすることができる配列を増幅生成物に組み込むために用いられる。タグ（２）はＲＮＡヌクレオチドを含まず、最初の標的核酸分子とハイブリダイズしない。ＲＮＡヌクレオチド（３）はタグ（２）の下流に（即ち３’末端に）見出される。ＲＮＡヌクレオチド（３）の下流にはプライマー領域（４）が存在する。このプライマー領域（４）は標的核酸分子の鎖とハイブリダイズして増幅を指令する。プライマー領域は典型的にはＤＮＡ系であり、ＲＮＡヌクレオチドを何ら含まない。
図９Ｂは図９Ａと同じラベリングを用いており、標的核酸分子へのプライマーの最初のハイブリダイゼーションを示す。これは理論的な標的配列に基づいている。タグ（２）はＤＮＡヌクレオチドからなっており、最初の標的核酸分子とはハイブリダイズしない。ＲＮＡヌクレオチド（３）は、この場合にはウラシルであるが、タグ（２）の下流に（即ち３’末端に）見出される。ＲＮＡヌクレオチド（３）の下流にはプライマー領域（４）が存在する。このプライマー領域（４）は標的核酸分子の鎖（６）とハイブリダイズし、５’から３’への方向の増幅を指令する。プライマー領域はＤＮＡヌクレオチドからなっている。
図９Ｃは図９Ａと同じラベリングを用いており、分子バーコード（７）を組み込むプライマーを示す。この図では分子バーコードはＲＮＡヌクレオチドの下流に位置しているが、これは本質的ではない。典型的には、分子バーコードはユニバーサルタグの下流に存在している。
図１０Ａは図９と同じラベリングを用いており、標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のためのさらなるプライマー（１）を模式的に示す。プライマーは５’から３’の順に第１にユニバーサルタグ（２）を含む。タグ（２）は、第２の増幅でユニバーサルプライマーがハイブリダイズすることができる配列を増幅生成物に組み込むために用いられる。タグ（２）はＲＮＡヌクレオチドを含まず、最初の標的核酸分子とはハイブリダイズしない。ＲＮＡヌクレオチド（３）はタグ（２）の下流で、プライマー領域（４）の第３のヌクレオチドに見出される。このプライマー領域（４）は標的核酸分子の鎖とハイブリダイズして増幅を指令する。プライマー領域は一本鎖ヌクレオチドは別としてＤＮＡ系である。ＲＮＡヌクレオチドの側にはその５’末端（５）に２ＤＮＡ塩基対のみのヌクレオチドが存在し、したがってＲＮａｓｅ Ｈの基質として作用しない。
図１０Ｂは図１０Ａと同じラベリングを用いており、標的核酸分子へのプライマーの最初のハイブリダイゼーションを示す。これは理論的な標的配列に基づいている。タグ（２）はＤＮＡヌクレオチドからなっており、最初の標的核酸分子とはハイブリダイズしない。ＲＮＡヌクレオチド（３）はタグ（２）の下流で、プライマー領域（４）の第３のヌクレオチドに見出される。このプライマー領域（４）は標的核酸分子の鎖（６）とハイブリダイズし、５’から３’への方向の増幅を指令する。プライマー領域はヌクレオチドの一本鎖のＲＮＡ－ＤＮＡ対（３）を含む。しかし、これはＲＮＡヌクレオチドの上流に十分な二本鎖性を与えない。したがって、アニールされたプライマーはＲＮａｓｅ Ｈ活性によって切断されない。これは、ＲＮＡヌクレオチドの側にはその５’末端（５）に２ＤＮＡ塩基対のみのヌクレオチドが存在するからである。
図１０Ｃは図１０Ａと同じラベリングを用いており、分子バーコード（７）を組み込むプライマーを示す。この図では分子バーコードはＲＮＡヌクレオチドの下流に位置しているが、これは本質的ではない。典型的には、分子バーコードはユニバーサルタグの下流に存在している。
図１１Ａは第１の増幅反応を制限するための本発明のプライマーの使用の模式図である。これは図１１Ｂに示す第２の増幅反応との競合を防止するために重要である。第２の増幅反応との競合は、下流のプロセシングのためのアダプター配列を組み込まないタグ付けされた増幅生成物の過剰な生成をもたらす可能性がある。それぞれの図には、種々の分子成分の識別を助けるための符号が含まれている。
図１１Ａに標的二本鎖ＤＮＡ分子（３１）を示す。本発明のフォワードプライマー（３２）およびリバースプライマー（３３）も示されている。フォワードプライマー（３２）およびリバースプライマー（３３）は標的ＤＮＡ（３１）のそれぞれの鎖とハイブリダイズしてＰＣＲによる増幅をもたらし、ＲＮＡ塩基とタグの両方を組み込んだそれぞれの生成物の一本鎖を有する二本鎖の増幅生成物（３４、３５）を生成する。
例としてＲＮＡ塩基およびフォワードプライマー（３２）からのタグを組み込んだ増幅生成物（３４）を用いるＰＣＲの第２サイクルを示す。ＰＣＲの第２サイクルでは、リバースプライマー（３３）は増幅生成物（３４）の３’末端にハイブリダイズして伸長し、二本鎖増幅生成物（３６）を生成する。伸長反応の間にフォワードプライマーがコピーされる。ＲＮＡ塩基はこのプロセスの一部としてＤＮＡポリメラーゼによって「補正」される。したがって、増幅生成物（３６）は５’末端にリバースプライマー（３３）を含み、３’末端（３７）にタグを含むがＲＮＡ塩基を含まないフォワードプライマーのリバース相補体を含む鎖を組み込む。
この増幅生成物（３６）はＲＮａｓｅ Ｈの基質となり、これはＲＮＡ塩基の５’末端を切断して第１のタグ（３８）を放出する。増幅生成物（３６）の最端部の鎖の２つの代替的な運命を図１１Ａにさらに示す。第１に、フォワードプライマー（３２）がこの鎖にハイブリダイズする場合には、ハイブリダイゼーションに際してＲＮａｓｅ Ｈ活性の基質が産生されることになる（３９）。フォワードプライマー（３２）は切断し、したがってタグを組み込まない鎖の増幅を指令することのみができる（図示せず）。したがって、生成物は増幅の第２ラウンドには有用でない。第２に、フォワードプライマー（３２）からの切断されたタグがプライマーとして作用する場合には、これは二本鎖増幅生成物（３１０）を産生する。伸長反応の間にリバースプライマーがコピーされる。ＲＮＡ塩基はこのプロセスの一部としてＤＮＡポリメラーゼによって「補正」される。したがって、増幅生成物（３１０）は５’末端にＲＮＡ塩基を含まずフォワードプライマー（３２）を含み、３’末端（３１１）にタグを含むがＲＮＡ塩基を含まないリバースプライマーのリバース相補体を含む鎖を組み込む。この鎖（３１１）は第２の増幅反応の望ましい生成物である。この二本鎖増幅生成物（３１０）はＲＮａｓｅ Ｈのさらなる基質であり、これはＲＮＡ塩基の５’末端を切断して第２のタグ（３１２）を放出する。
鎖（３１１）を取れば、この鎖にも２つの代替的な運命が存在する。第１に、リバースプライマー（３３）がこの鎖にハイブリダイズする場合には、ハイブリダイゼーションに際してＲＮａｓｅ Ｈ活性の基質が産生されることになる（図示せず）。リバースプライマー（３３）は切断し、したがってタグを組み込まない鎖の増幅を指令することのみができる（図示せず）。したがって、生成物は増幅の第２ラウンドには有用でない。第２に、リバースプライマー（３３）からの切断されたタグがプライマーとして作用する場合には、これはＲＮＡ塩基を含まず分子の両末端にタグ付けされた二本鎖増幅生成物を産生する（３１３）。これは第２の増幅反応を指令する望ましい生成物である。
図１１Ｂに、第１の増幅反応からの二本鎖増幅生成物（３１３）の増幅に基づく第２の増幅反応を示す。代表させる目的で二本鎖増幅生成物（３１３）の最端部の鎖を取れば、第１のアダプター配列およびタグ１配列を組み込んだユニバーサルフォワードプライマー（３１４）はタグ１配列のリバース相補体にハイブリダイズして、アダプターを伸長生成物（３１５）に組み込む伸長を指令する。第２のアダプター配列およびタグ２配列を組み込んだユニバーサルリバースプライマー（３１６）はタグ２配列のリバース相補体にハイブリダイズして、伸長生成物（３１５）をテンプレートとして用いてアダプターを伸長生成物（３１７）に組み込む伸長を指令する。この鎖はいずれかの末端にアダプターを組み込んでいる。ユニバーサルフォワードプライマー（３１４）を用いるこの鎖（３１７）の伸長により、いずれかの末端にアダプター配列を組み込んだ所望の二本鎖生成物（３１８）が生成される。関連する二本鎖ＤＮＡコンテキストには見出されるＲＮＡヌクレオチドが何ら存在しないので、ＲＮａｓｅ Ｈはこれらの生成物のいずれにも作用できないことに留意されたい。したがって、第２の増幅反応の効率は、反応混合物中に存在するＲＮａｓｅ Ｈによって妨げられない。
＜ユニバーサルプライマーの産生を遅延させることによって単一の反応混合物中のマルチステップ増幅反応を可能にする＞
図１２に、２つの反応ステップを分離した反応容器（チューブ１およびチューブ２）中で行うマルチステップ増幅を行う従来技術のシステムを示す。
第１の反応容器は、増幅すべき標的配列（９）を含むＤＮＡデュプレックス鎖（８）を含む。第１のフォワードプライマー（１３）および第１のリバースプライマー（１４）は標的配列を増幅するように設計されている。即ち、第１のフォワードプライマー（１３）は標的配列（１２）のアンチセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（１０）を含み、第１のリバースプライマー（１４）は標的配列（１２）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（１１）を含む。
第１のフォワードプライマー（１３）はその５’末端に第１のユニバーサルタグ（１５）でタグ付けされており、第１のリバースプライマー（１４）はその５’末端に第２のユニバーサルタグ（１６）でタグ付けされている。その機構が当技術で周知のＰＣＲ増幅の間に、第１のフォワードプライマー（１３）および第１のリバースプライマー（１４）は、第１のユニバーサルタグ（１５）および第２のユニバーサルタグ（１６）を組み込んだ増幅生成物（１７）を産生する。
第２の反応容器（チューブ２）中の後続の反応では、第２のフォワードプライマー（１８）および第２のリバースプライマー（１９）が用いられ、チューブ１における第１の反応からの増幅生成物（１７）が増幅される。第２のフォワードプライマー（１８）は５’から３’の順に第１のアダプター配列（１１０）、任意選択的に第１のバーコード配列（１１１）、およびアンチセンス鎖に組み込まれた第１のユニバーサルタグ（１５）の相補体とハイブリダイズするプライマー領域（１１２）を含む。第２のリバースプライマー（１９）は５’から３’の順に第２のアダプター配列（１１３）、第２のバーコード配列（１１４）、および第２のユニバーサルタグ（１６）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（１１５）を含む。ＰＣＲ増幅の間に、第２のフォワードプライマー（１８）および第２のリバースプライマー（１９）は、第１のユニバーサルタグ（１５）および第２のユニバーサルタグ（１６）、第１のバーコード（１１１）および第２のバーコード（１１４）、ならびに第１のアダプター配列（１１０）および第２のアダプター配列（１１３）を組み込んださらなる増幅生成物（１１６）を産生する。
このシステムは非効率で労働集約的である。さらに、第１のステップの後に反応混合物を停止し、分離する必要があるため、エラーやシステムの汚染が生じる。
図１３に、本発明の試薬のセットを用いることによって、単一の反応混合物中で標的核酸分子のマルチステップ増幅を行うことがいかにして可能になるかを示す。これには従来法に対して多くの利点がある。
図１３は、同じ反応混合物または反応容器中で並行して起こる３つの個別の増幅プロセスを説明するために提示している。
図１３Ａに第１の増幅を示す。単一の反応混合物は、増幅すべき標的配列（２２）を含むＤＮＡデュプレックス鎖（２１）を含む。第１のフォワードプライマー（２３）および第１のリバースプライマー（２４）は標的配列を増幅するように設計されている。即ち、第１のフォワードプライマー（２３）は標的配列（２２）のアンチセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（２０）を含み、第１のリバースプライマー（２４）は標的配列（２２）のセンス鎖とハイブリダイズするプライマー領域（２８）を含む。
第１のフォワードプライマー（２３）はその５’末端に第１のユニバーサルタグ（２５）でタグ付けされており、第１のリバースプライマー（２４）はその５’末端に第２のユニバーサルタグ（２６）でタグ付けされている。その機構が当技術で周知のＰＣＲ増幅の間に、第１のフォワードプライマー（２３）および第１のリバースプライマー（２４）は、第１のユニバーサルタグ（２５）および第２のユニバーサルタグ（２６）を組み込んだ増幅生成物（２７）を産生する。
図１３Ｂに、第１の増幅と並行して起こる増幅を示す。反応混合物はまた、５’から３’の順に第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列（２９）、任意選択的に第１のバーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列（２１０）、第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列（２１１）、およびアダプター配列（２１１）を超える伸長を防止するブロッキング基（２２７）を含む第１の核酸分子（２８）を含む。第１のアダプタープライマー（２１２）は第１のアダプター配列のリバース相補体（２１１）とハイブリダイズして、５’から３’の順に第１のアダプター配列（２１４）、任意選択的に第１のバーコード（２１５）、および第１のユニバーサルタグ（２１６）を含む増幅生成物（２１３）を産生する。
反応混合物は、５’から３’の順に第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列（２１８）、任意選択的に第２のバーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列（２１９）、第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列（２２０）、およびアダプター配列（２２０）を超える伸長を防止するブロッキング基（２２８）を含む第２の核酸分子（２１７）をさらに含む。第２のアダプタープライマー（２２１）は第２のアダプター配列のリバース相補体（２２０）とハイブリダイズして、５’から３’の順に第２のアダプター配列（２２３）、任意選択的に第２のバーコード（２２４）、および第２のユニバーサルタグ（２２５）を含む増幅生成物（２２２）を産生する。
図１３Ｃに第２の増幅を示す。図１３Ｂからの増幅生成物２１３および２２５は、ユニバーサルプライマー対を形成し、ここで第１のユニバーサルタグ配列（２１６）および第２のユニバーサルタグ配列（２２３）は、第１の増幅からの増幅生成物（２７）を増幅するプライマーとして作用する。これにより、第１のユニバーサルタグ（２５）および第２のユニバーサルタグ（２６）、任意選択的に第１のバーコード（２１５）および第２のバーコード（２２４）、ならびに第１のアダプター（２１４）および第２のアダプター（２２３）を含むさらなる増幅生成物（２２６）が産生する。さらなる増幅生成物は、典型的には標的核酸分子を検出し、および／または定量するシーケンシングを含む下流のプロセシングに有用である。
第１の核酸分子（２８）および第２の核酸分子（２１７）を第１のアダプタープライマー（２１２）および第２のアダプタープライマー（２２１）とともに使用することにより、増幅生成物２１３および２２２の生成が一時的に遅延される。これにより、標的核酸分子の第１の増幅がタグ付けされた増幅生成物（２７）を生成させることが可能になる。第２の増幅を実施するためのユニバーサルプライマーとして作用する増幅生成物２１３および２２２が産生されるときまでに、基質である増幅生成物（２７）は既に過剰に存在している。
＜箇条項目＞
本明細書に記載した改良は、それぞれ互いに有利に組合せて、改良された方法を可能にすることができる。そのような組合せを以下の項目に詳細に説明する。
１．標的核酸分子の重複領域のマルチプレックス増幅における使用のためのプライマーのセットであって、
ａ．標的核酸分子の第１の領域を増幅するように設計された第１のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域を組み込んだ第１のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだ第１のリバースプライマー
を含む第１のプライマー対、
ｂ．第１の領域と少なくとも部分的に重複する標的核酸分子の第２の領域を増幅するように設計された第２のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域および第１のリバースプライマーの５’末端に組み込まれた核酸タグと５’から３’への方向で同一であるプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだ第２のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域を組み込んだ第２のリバースプライマー
を含む第２のプライマー対
を含み、
第１のリバースプライマーと第２のフォワードプライマーとの間に異常な（短い）増幅生成物が形成される事象において、異常な（短い）増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な（短い）増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成される、プライマーのセット。
２．第１のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーがまた、プライマー領域の５’の核酸タグを組み込んでおり、第１のフォワードプライマーの核酸タグと第２のリバースプライマーの核酸タグが５’から３’への方向で同一であり、それにより、第１のフォワードプライマーと第２のリバースプライマーとの間に異常な（長い）増幅生成物が形成される事象において、異常な（長い）増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な（長い）増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成されることをさらに特徴とする、項目１のプライマーのセット。
３．ａ．第２の領域と少なくとも部分的に重複する標的核酸分子の第３の領域を増幅するように設計された第３のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだ第３のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域を組み込んだ第３のリバースプライマー
を含む、第３のプライマー対をさらに含み、
第３のフォワードプライマーの核酸タグと第２のリバースプライマーの核酸タグも５’から３’の方向で同一であり、それにより、第３のフォワードプライマーと第２のリバースプライマーとの間に異常な（短い）増幅生成物が形成される事象において、異常な（短い）増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な（短い）増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成される、項目２に記載のプライマーのセット。
４．第３のリバースプライマーがまた、プライマー領域の５’の核酸タグを組み込んでおり、第２のフォワードプライマーの核酸タグと第３のリバースプライマーの核酸タグも５’から３’への方向で同一であり、それにより、第２のフォワードプライマーと第３のリバースプライマーとの間に異常な（長い）増幅生成物が形成される事象において、異常な（長い）増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な（長い）増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成されることをさらに特徴とする、項目３のプライマーのセット。
５．標的核酸分子の重複領域のマルチプレックス増幅における使用のためのプライマーのセットであって、
ａ．標的核酸分子の重複領域を増幅するように設計された少なくとも２つのプライマー対であって、それぞれのプライマー対が
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の核酸タグを組み込んだリバースプライマー
を含む、少なくとも２つのプライマー対を含み、
それぞれのプライマー対におけるフォワードプライマーとリバースプライマーの核酸タグが異なっており、直近のプライマー対におけるフォワードプライマーとリバースプライマーの核酸タグが５’から３’への方向で同一であり、それにより、直近のプライマー対のフォワードプライマーとリバースプライマーの間で異常な増幅生成物が形成される事象において異常な増幅生成物の５’末端の核酸タグと増幅の間に形成された異常な増幅生成物の３’末端の相補配列との間に分子内ハイブリダイゼーション事象が起こり、異常な増幅生成物のさらなる増幅を阻害する二次構造が形成される、プライマーのセット。
６．核酸タグおよびその相補配列のＴｍがプライマー領域のＴｍ最高値より高い、先行する項目のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
７．核酸タグおよびその相補配列のＴｍがプライマー領域のＴｍ最高値より少なくとも２℃高く、任意選択的に１０℃まで高い、項目５に記載のプライマーのセット。
８．それぞれのタグの長さが少なくとも４ヌクレオチド、任意選択的に２０ヌクレオチドまでである、先行する項目のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
９．それぞれのタグの長さが４、６、８、または１０ヌクレオチドである、先行する項目のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
１０．それぞれのタグがＧＣの多い配列を含む、先行する項目のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
１１．それぞれのプライマー対が５０～１５０ヌクレオチドの増幅生成物を生成することを意図した、先行する項目のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
１２．直近のプライマー対から産生される意図された増幅生成物の間の重複のレベルが１０～３０ヌクレオチドである、先行する項目のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
１３．それぞれのタグが標的核酸分子との同一性を示さない、先行する項目のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
１４．それぞれの核酸タグがユニバーサルタグを含む、先行する項目のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
１５．それぞれのプライマー対が第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグを含む、項目１４に記載のプライマーのセット。
１６．それぞれのプライマー対における少なくとも１つのプライマーがバーコード、任意選択的に分子バーコードを含む、先行する項目のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
１７．それぞれのプライマーがバーコード、任意選択的に分子バーコードを含む、先行する項目のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
１８．項目１から１７のいずれか１項で定義されるプライマーのセットを含む、マルチプレックス核酸増幅のためのキット。
１９．ａ．それぞれのユニバーサルプライマーが５’から３’の順に、
ｉ．アダプター配列、
ｉｉ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｉｉｉ．マルチプレックス増幅に用いられる対応するプライマーのユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む、ユニバーサルプライマー、
ｂ．ＤＮＡポリメラーゼ、
ｃ．ｄＮＴＰ
の少なくとも１つをさらに含む、項目１８のキット。
２０．ａ．５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｉｉｉ．第１のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む第１のユニバーサルプライマー、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．任意選択的に試料バーコード配列
ｉｉｉ．第２のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む、第２のユニバーサルプライマー
を含む、項目１８または１９のキット。
２１．項目１から１７のいずれか１項で定義されるプライマーのセットを含む、マルチプレックス核酸増幅のための反応容器。
２２．ａ．後続のシーケンシングのためのユニバーサルプライマーであって、それぞれのユニバーサルプライマーが５’から３’の順に、
ｉ．アダプター配列、
ｉｉ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｉｉｉ．マルチプレックス増幅に用いられる対応するプライマーのユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含むユニバーサルプライマー、
ｂ．ＤＮＡポリメラーゼ、
ｃ．ｄＮＴＰ
の少なくとも１つをさらに含む、項目２１の反応容器。
２３．ａ．５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｉｉｉ．第１のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む第１のユニバーサルプライマー、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｉｉｉ．第２のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む、第２のユニバーサルプライマー
を含む、項目２１または２２の反応容器。
２４．逆転写酵素をさらに含む、項目１８から２０のいずれか１項のキット、または項目２１から２３のいずれか１項の反応容器。
２５．第１のアダプター配列が第２のアダプター配列と異なる、項目２０のキット、または項目２３の反応容器。
２６．第１のアダプター配列がｐ５アダプターであり、第２のアダプター配列がｐ７アダプターである、項目２５のキットまたは反応容器。
２７．第１のアダプター配列がＡアダプターであり、第２のアダプター配列がＰ１アダプターである、項目２５のキットまたは反応容器。
２８．項目１から１７のいずれか１項で定義されるプライマーのセットを用いてタグ付けされた増幅生成物を創成する標的核酸分子の重複領域の増幅を含む、マルチプレックス核酸増幅反応。
２９．シーケンシングのためのタグ付けされた増幅生成物を調製するための追加の増幅をさらに含み、追加の増幅反応がユニバーサルプライマーを利用し、それぞれのユニバーサルプライマーが５’から３’の順に、
ａ．アダプター配列、
ｂ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｃ．マルチプレックス増幅に用いられる対応するプライマーのユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む、項目２８のマルチプレックス核酸増幅反応。
３０．ユニバーサルプライマーが、
ａ．５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｉｉｉ．第１のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む第１のユニバーサルプライマー、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｉｉｉ．第２のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む、第２のユニバーサルプライマー
を含むユニバーサルプライマー対を形成する、項目２８または２９のマルチプレックス核酸増幅反応。
３１．第１のアダプター配列がｐ５アダプターであり、第２のアダプター配列がｐ７アダプターである、項目３０のマルチプレックス核酸増幅反応。
３２．第１のアダプター配列がＡアダプターであり、第２のアダプター配列がＰ１アダプターである、項目３０のマルチプレックス核酸増幅反応。
３３．シーケンシングが次世代シーケンシングである、項目２９から３２のいずれか１項のマルチプレックス核酸増幅反応。
３４．標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のためのプライマーであって、５’から３’の順に、
ａ．ＲＮＡヌクレオチドを含まないユニバーサルタグ、
ｂ．ＲＮＡヌクレオチド、
ｃ．ＲＮＡヌクレオチドを含まず、標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域
を含む、プライマー。
３５．ＲＮＡヌクレオチドの下流のブロッキング基を含まない、項目３４のプライマー。
３６．５’から３’の順に、
ａ．ユニバーサルタグ、
ｂ．ＲＮＡヌクレオチド、
ｃ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域、
ｄ．さらなるＲＮＡヌクレオチド、
ｅ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするさらなる領域、
ｆ．ブロッキング基
を含む、項目３４のプライマー。
３７．タグおよび／またはプライマー領域がＤＮＡヌクレオチドからなる、項目３４から３６のいずれか１項のプライマー。
３８．ＲＮＡヌクレオチドの下流にバーコード配列、任意選択的に分子バーコードをさらに含む、項目３４から３７のいずれか１項のプライマー。
３９．５’から３’の順に、
ａ．ＲＮＡヌクレオチドを含まないユニバーサルタグ、
ｂ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズする４つまでのヌクレオチド、
ｃ．ＲＮＡヌクレオチド、
ｄ．ＲＮＡヌクレオチドを含まず、標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域
を含み、領域ｂおよびｄがいずれも同じ標的核酸分子とハイブリダイズして、標的核酸分子中のＤＮＡ塩基と対になったＲＮＡヌクレオチドが生じる、項目３４から３８のいずれか１項のプライマー。
４０．標的核酸分子を増幅するための、項目３４から３９のいずれか１項に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対。
４１．標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のための試薬のセットであって、
ａ．項目３４から３９のいずれか１項に記載のプライマー、または項目４０で定義されるプライマー対、
ｂ．ＲＮａｓｅ Ｈ
を含む、試薬のセット。
４２．項目３４から３９のいずれか１項に記載のプライマー、項目４０に記載のプライマー対、または項目４１に記載の試薬のセットの使用を含む、標的核酸分子のマルチステップ増幅。
４３．第１のプライマー対を用いてＲＮａｓｅ Ｈの存在下に標的核酸分子を増幅するステップを含む、標的核酸分子の増幅のための方法であって、第１のプライマー対が、
ｉ．５’から３’の順に、
ａ．ＲＮＡヌクレオチドを含まないユニバーサルタグ、
ｂ．ＲＮＡヌクレオチド、
ｃ．ＲＮＡヌクレオチドを含まず標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域
を含む第１のフォワードプライマー、
ｉｉ．５’から３’の順に、
ａ．ＲＮＡヌクレオチドを含まないユニバーサルタグ（これは最初の標的核酸分子とハイブリダイズしない）、
ｂ．ＲＮＡヌクレオチド、
ｃ．ＲＮＡヌクレオチドを含まず標的核酸の鎖とハイブリダイズするプライマー領域
を含む第１のリバースプライマー
を含み、それにより、
ｃ．第１ラウンドの増幅の後、標的核酸分子が複製され、第１の増幅生成物がユニバーサルタグおよび第１のフォワードプライマーのＲＮＡヌクレオチドを組み込み、第２の増幅生成物がユニバーサルタグおよび第１のリバースプライマーのＲＮＡヌクレオチドを組み込み、
ｄ．第２ラウンドの増幅では、第１のリバースプライマーが、第１の増幅生成物とハイブリダイズして、ユニバーサルタグの相補体と第１のフォワードプライマーのＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ相補体とを組み込んだ第３の増幅生成物を産生し、第１のフォワードプライマーが、第２の増幅生成物とハイブリダイズして、ユニバーサルタグの相補体と第１のリバースプライマーのＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ相補体とを組み込んだ第４の増幅生成物を産生し、第３の増幅生成物および第４の増幅生成物がそれぞれＲＮａｓｅ Ｈ活性の基質となり、それによりＲＮＡヌクレオチドの切断がもたらされ、それにより標的核酸分子のさらなる増幅が制限される、方法。
４４．第１のフォワードプライマーおよび／または第１のリバースプライマーが項目３４から３９のいずれか１項で定義される、項目４３に記載の方法。
４５．項目３４から３９のいずれか１項に記載のプライマー、項目４０に記載のプライマー対、もしくは項目４１に記載の試薬のセット、または項目４２から４４のいずれか１項に記載の増幅であって、
ａ．ＲＮａｓｅ ＨがＲＮａｓｅ Ｈ２、任意選択的にパイロコッカス・アビシからのＲＮａｓｅ Ｈ２のように熱安定性であり、および／または
ｂ．標的核酸分子がゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡを含み、および／または
ｃ．標的核酸分子が二本鎖または一本鎖である、
プライマー、プライマー対、もしくは試薬のセット、または増幅。
４６．項目３４から３９のいずれか１項に記載のプライマー、項目４０に記載のプライマー対、または項目４１に記載の試薬のセットを含む、標的核酸分子のマルチステップ増幅のためのキット。
４７．ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰの少なくとも１つをさらに含む、項目４６のキット。
４８．セット中の少なくとも１つのプライマーが項目３４から３９のいずれか１項に記載のプライマーである、項目１から１７のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
４９．セット中のそれぞれのプライマー対が項目３４から３９のいずれか１項に記載のプライマーを含む、項目１から１７のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
５０．セット中のそれぞれのプライマー対が項目４０に記載のプライマー対を含む、項目１から１７のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
５１．セット中のそれぞれのプライマーが項目３４から３９のいずれか１項に記載のプライマーである、項目１から１７のいずれか１項に記載のプライマーのセット。
５２．項目４８から５１のいずれか１項に記載のプライマーのセットの使用を含む、標的核酸分子のマルチプレックス増幅およびマルチステップ増幅。
５３．増幅が、標的核酸分子の重複領域の増幅を含むマルチプレックス核酸増幅反応を含む、項目５２の増幅。
５４．
ａ．５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｉｉｉ．第１のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む第１のユニバーサルプライマー、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．任意選択的に試料バーコード配列、
ｉｉｉ．第２のユニバーサルタグと（５’から３’への方向で）同一のユニバーサルプライマー領域
を含む、第２のユニバーサルプライマー
を使用する第２の増幅を含む、項目５２または５３の増幅。
５５．標的核酸分子を検出し、および／または定量する方法であって、
ａ．ユニバーサルタグおよびアダプター配列を組み込んだ増幅生成物を産生するために項目５４の方法を実施するステップ、
ｂ．標的核酸分子を検出し、および／または定量するために増幅生成物をシーケンシングするステップであって、任意選択的にシーケンシングが次世代シーケンシングである、ステップ
を含む、方法。
５６．標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のための試薬のセットであって、
ａ．標的核酸分子を増幅するように設計された第１のプライマー対であって、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第１のユニバーサルタグを組み込んだ第１のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第２のユニバーサルタグを組み込んだ第１のリバースプライマー
を含む第１のプライマー対、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．アダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第１の核酸分子、
ｃ．５’から３’の順に、
ｉ．第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第２のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第２の核酸分子、
ｄ．第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する第１のアダプタープライマー、
ｅ．第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する第２のアダプタープライマー
を含み、
ｄおよびｅの第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて産生された増幅生成物が、ユニバーサルプライマー対を形成し、ここで第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグが、プライマーとして作用して、第１のプライマー対によって産生された増幅生成物を増幅して、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグならびにアダプターを組み込んださらなる増幅生成物を生成する、試薬のセット。
５７．標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のための試薬のセットであって、
ａ．５’から３’の順に、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズする第１のプライマー対のフォワードプライマーに組み込まれた第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第１のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第１の核酸分子、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズする第１のプライマー対のリバースプライマーに組み込まれた第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第２のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第２の核酸分子、
ｃ．第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する、第１のアダプタープライマー、
ｄ．第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生する、第２のアダプタープライマー
を含み、
ｃおよびｄの第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて産生された増幅生成物が、ユニバーサルプライマー対を形成し、ここで第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグが、プライマーとして作用して、第１のプライマー対によって産生された増幅生成物を増幅して、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグならびにアダプターを組み込んださらなる増幅生成物を生成する、試薬のセット。
５８．標的核酸分子のマルチステップ増幅のための方法であって、
ａ．第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグを組み込んだ第１の増幅生成物を生成するために、第１のプライマー対を用いて標的核酸分子を増幅するステップと、ここで、第１のプライマー対は、
ｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第１のユニバーサルタグを組み込んだ第１のフォワードプライマー、
ｉｉ．標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域およびプライマー領域の５’の第２のユニバーサルタグを組み込んだ第１のリバースプライマー
を含み、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第１のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第１の核酸分子を増幅するステップと、ここで、５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生するために、第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズする第１のアダプタープライマーを用い、
ｃ．５’から３’の順に、
ｉ．第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．第２のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第２の核酸分子を増幅するステップと、ここで、５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生するために、第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズする第２のアダプタープライマーを用い、
ｄ．ステップｂおよびステップｃの増幅生成物をユニバーサルプライマー対として用いて、第１のプライマー対によって産生された増幅生成物を増幅するステップと、ここで、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグが、第１のユニバーサルタグおよび第２のユニバーサルタグならびにアダプターを組み込んださらなる増幅生成物を生成するプライマーとして作用する、
を含み、単一の反応混合物中で実施される、方法。
５９．標的核酸分子を検出し、および／または定量する方法であって、
ａ．さらなる増幅生成物を産生するために項目５８の方法を実施するステップ、
ｂ．標的核酸分子を検出し、および／または定量するためにさらなる増幅生成物をシーケンシングするステップであって、ここで、任意選択的にシーケンシングが次世代シーケンシングである、
を含む方法。
６０．項目５６から５９のいずれか１項の試薬のセットまたは方法であって、
ａ．第１の核酸分子が５’から３’の順に、
ｉ．第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．第１のバーコード、好ましくは試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｖ．アダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含み、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．第１のアダプター配列、
ｉｉ．第１のバーコード、好ましくは第１の試料バーコード、
ｉｉｉ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生するために、第１のアダプタープライマーが第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズし、
さらなる増幅生成物が、第１のユニバーサルタグ、第２のユニバーサルタグ、第１のバーコード、好ましくは第１の試料バーコード、ならびに第１のアダプターおよび第２のアダプターを組み込む、
試薬のセットまたは方法。
６１．項目５６から６０のいずれか１項の試薬のセットまたは方法であって、
ａ．第２の核酸分子が５’から３’の順に、
ｉ．第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉ．第２のバーコード、好ましくは試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｉｖ．アダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含み、
ｂ．５’から３’の順に、
ｉ．第２のアダプター配列、
ｉｉ．第２のバーコード、好ましくは第２の試料バーコード、
ｉｉｉ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生するために、第２のアダプタープライマーが第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズし、
さらなる増幅生成物が、第１のユニバーサルタグ、第２のユニバーサルタグ、第２のバーコード、好ましくは第２の試料バーコード、ならびに第１のアダプターおよび第２のアダプターを組み込む、
試薬のセットまたは方法。
６２．標的核酸分子がＤＮＡである、項目５６から６１のいずれか１項の試薬のセットまたは方法。
６３．標的核酸分子がＲＮＡである、項目５６から６２のいずれか１項の試薬のセットまたは方法。
６４．項目５６から６３のいずれか１項の試薬のセットまたは方法であって、標的核酸分子が、
ａ．ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から抽出された、または
ｂ．無細胞ＤＮＡ、任意選択的に
ｉ．母親の血流から得られた無細胞胎児ＤＮＡ、もしくは
ｉｉ．体液、任意選択的に血液、尿、もしくは脊髄液から得られた無細胞ＤＮＡ、もしくは
ｉｉｉ．無細胞腫瘍ＤＮＡであるか、または
ｃ．血液由来である、
試薬のセットまたは方法。
６５．ユニバーサルプライマーのリバース相補体を形成する核酸分子であって、５’から３’の順に、
ａ．タグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｂ．任意選択的に、バーコード、好ましくは試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｃ．後続のプロセシングに必要なアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｄ．アダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む、核酸分子。
６６．項目６５の核酸分子と、プライマーとの組合せであって、プライマーは、アダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズして、５’から３’の順に、
ａ．後続のプロセシングに必要なアダプター配列、
ｂ．任意選択的に試料バーコード、
ｃ．タグ
を含む増幅生成物としてユニバーサルプライマーを産生する、組合せ。
６７．第１の核酸分子と、第２の核酸分子との組合せであって、５’から３’の順に、
ａ．第１のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｂ．任意選択的に、バーコード配列、好ましくは試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｃ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｄ．第１のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む第１の核酸分子と、
５’から３’の順に、
ｅ．第２のユニバーサルタグのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｆ．任意選択的に、バーコード配列、好ましくは試料バーコードのリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｇ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列のリバース相補体であるヌクレオチドの配列、
ｈ．第２のアダプター配列を超える伸長を防止するブロッキング基
を含む、組合せ。
６８．項目６７の核酸分子と、
ａ．５’から３’の順に、
ａ．後続のプロセシングに必要な第１のアダプター配列、
ｂ．任意選択的に、第１のバーコード配列、好ましくは試料バーコード、
ｃ．第１のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生するために第１のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズする、第１のアダプタープライマー、
ｄ．５’から３’の順に、
ａ．後続のプロセシングに必要な第２のアダプター配列、
ｂ．任意選択的に、第２のバーコード配列、好ましくは試料バーコード、
ｃ．第２のユニバーサルタグ
を含む増幅生成物を産生するために、第２のアダプター配列のリバース相補体とハイブリダイズする、第２のアダプタープライマー
との組合せ。
６９．アダプター配列が次世代シーケンシングのためのアダプター配列である、項目５６から６８のいずれか１項の試薬のセット、方法、核酸分子、または組合せ。
７０．それぞれのバーコードの長さが少なくとも４、６、または８ヌクレオチド、任意選択的に２０ヌクレオチドまでである、項目５９から７０のいずれか１項の試薬のセット、方法、核酸分子、または組合せ。
７１．それぞれのタグの長さが少なくとも２０ヌクレオチド、任意選択的に３０ヌクレオチドまでである、項目５６から７０のいずれか１項の試薬のセット、方法、核酸分子、または組合せ。
７２．ブロッキング基が以下の３’ｄｄＣ、３’逆転ｄＴ、３’Ｃ３スペーサー、３’アミノ、および３’ホスホリル化から選択される、項目５６から７１のいずれか１項の試薬のセット、方法、核酸分子、または組合せ。
７３．項目５６から７２のいずれか１項に定義される試薬のセットを用いてタグおよびアダプター配列を組み込んだ増幅生成物を創成する標的核酸分子の増幅を含む、マルチステップ核酸増幅反応。
７４．項目５６から７２のいずれか１項の試薬のセット、核酸分子、または組合せを含む、標的核酸分子のマルチステップ増幅のためのキット。
７５．ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰの少なくとも１つをさらに含む、項目７４のキット。
７６．少なくとも第１のプライマー対および第２のプライマー対を含み、標的核酸分子の重複領域を増幅するように設計されたプライマーのセットを含む、項目５６から７２のいずれか１項の試薬のセット。
７７．プライマーのセットが、項目１から１７のいずれか１項に記載のプライマーのセットを含む、項目７７の試薬のセット。
７８．項目７６または７７に記載の試薬のセットの使用を含む、標的核酸分子のマルチプレックス増幅およびマルチステップ増幅。
７９．標的核酸分子を検出し、および／または定量する方法であって、
ａ．ユニバーサルタグおよびアダプター配列を組み込んだ増幅生成物を産生するために項目７８の増幅を実施するステップ、
ｂ．標的核酸分子を検出し、および／または定量するために増幅生成物をシーケンシングするステップであって、任意選択的にシーケンシングが次世代シーケンシングである、ステップ
を含む、方法。
８０．項目５６から７２のいずれか１項に記載の試薬のセットであって、第１のプライマー対の中の少なくとも１つのプライマーが項目３４から４１のいずれか１項に記載のプライマーである、試薬のセット。
８１．項目５６から７２のいずれか１項に記載の試薬のセットであって、第１のプライマー対の中の両方のプライマーが項目３４から４１のいずれか１項に記載のプライマーである、試薬のセット。
８２．項目５６から７２のいずれか１項に記載の試薬のセットであって、標的核酸分子を増幅するように設計されたそれぞれのプライマーが項目３４から４１のいずれか１項に記載のプライマーである、試薬のセット。
８３．項目８０から８２のいずれか１項に記載の試薬のセットの使用を含む、標的核酸分子のマルチステップ増幅。
８４．標的核酸分子を検出し、および／または定量する方法であって、
ａ．ユニバーサルタグおよびアダプター配列を組み込んだ増幅生成物を産生するために項目８３の増幅を実施するステップ、
ｂ．標的核酸分子を検出し、および／または定量するために増幅生成物をシーケンシングするステップであって、任意選択的にシーケンシングが次世代シーケンシングである、ステップ
を含む方法。
８５．少なくとも第１のプライマー対および第２のプライマー対を含み、標的核酸分子の重複領域を増幅するように設計されたプライマーのセットを含む、項目５６から７２のいずれか１項の試薬のセット。
８６．プライマーのセットが、項目４８から５１のいずれか１項に記載のプライマーのセットを含む、項目８５の試薬のセット。
８７．項目８５または８６に記載の試薬のセットの使用を含む、標的核酸分子のマルチプレックス増幅およびマルチステップ増幅。
８８．増幅が標的核酸分子の重複領域の増幅を含むマルチプレックス核酸増幅反応を含む、項目８７の増幅。
８９．標的核酸分子を検出し、および／または定量する方法であって、
ａ．ユニバーサルタグおよびアダプター配列を組み込んだ増幅生成物を産生するために項目８７または８８の増幅を実施するステップ、
ｂ．標的核酸分子を検出し、および／または定量するために増幅生成物をシーケンシングするステップであって、任意選択的にシーケンシングが次世代シーケンシングである、ステップ
を含む方法。
ここで以下の説明的かつ非限定的な例によって本発明はよりよく理解されよう。
＜重複標的配列を含むマルチプレックス増幅を改良する＞
［実施例１：重複するアンプリコンのマルチプレックス増幅における隣接するプライマー対の間の相互に配置された同一のタグの使用により、異常生成物の形成が低減される］
（方法）
重複するアンプリコンの１ステップマルチプレックスが理論的に予想された通りに機能することを示すための実験を実施した。概念実証として、ＢＲＣＡ腫瘍ＭＡＳＴＲ Ｄｘアッセイ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｏｍ、ＮＶ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を利用した。このアッセイにより１８１個のアンプリコンが生成され、そのうち１７３個のアンプリコンを、重複プライマー対を用いて増幅する。したがって、通常の配置のタグ配列を含むもとのプライマーセットを用いるマルチプレックス反応として（即ち、単一のＰＣＲ反応として）増幅を実施すると、期待されるＰＣＲ生成物より短い異常なＰＣＲ断片が産生される可能性がある。この問題に対する解決策としての本発明の性能を示すため、関連するプライマーセットを再設計して、重複するアンプリコンの１ステップマルチプレックスの要求をタグ配列が満たすようにした（即ち、本明細書で説明したプライマー対の間のプライマー上のタグの相互配置）。したがって、既存のプライマーセットでは、それぞれのフォワードプライマーはタグ１を含み、それぞれのリバースプライマーはタグ２を含んでいた。再設計したプライマーでは、隣接するプライマー対は逆のタグ配向を有していた（フォワードプライマー１－タグ１、リバースプライマー１－タグ２、フォワードプライマー２－タグ２、リバースプライマー２－タグ１、等々）。タグ１配列は配列番号１として提供され、タグ２配列は配列番号２として提供される。
このアッセイの使用説明書に概略が記されている実験条件で、標準の２ステップＰＣＲプロトコルで両方のプライマーセットを用いた。簡潔には、それぞれのプライマーセットについて５０ｎｇのゲノムテンプレートＤＮＡを用いて１つのマルチプレックスＰＣＲ反応を組み立て、第１のＰＣＲ反応を２０サイクル実施した。得られたアンプリコンを１０００倍に希釈し、続いてこの希釈された生成物２μｌを標準の第２の２０サイクルのＰＣＲに用いた。
（結果）
両方の実験で得られたＰＣＲ生成物をフラグメントアナライザーで分析した（図７および図８）。
図７より、標準のＢＲＣＡ腫瘍ＭＡＳＴＲ Ｄｘプライマーを用いた単一のＰＣＲ反応条件の大部分では重複するアンプリコンのプライマーの間で形成された短い望ましくないアンプリコンと符合する大きさの範囲のＰＣＲ生成物が形成され、短いアンプリコンの形成が期待された（長い）アンプリコンの形成より優勢であることが示される。
図８より、この実験において、ＢＲＣＡ腫瘍プライマー対に結合したタグ配列を、期待されるアンプリコンのみが形成される重複するアンプリコンのための１ステップマルチプレックスに準拠するように適合させると、短い望ましくないアンプリコンが存在しないことが明らかである。
＜ユニバーサルプライマーの産生を遅延させることによって単一の反応混合物中のマルチステップ増幅反応を可能にする＞
［実施例２：リバース相補体配列のアダプター部分にハイブリダイズするプライマーを用いてリバース相補体配列を増幅してユニバーサルプライマーを産生させることができる］
（方法）
アダプター配列プライマー（これらの実験でそれぞれｒｃＭＩＤおよびｐ５／ｐ７プライマーと称する）とともに特定のアダプター（およびバーコード）配列を組み込んだユニバーサルプライマーのリバース相補体が、期待されるアンプリコンを産生するために通常のユニバーサルプライマー（これらの実験でＭＩＤプライマーと称する）を置き換えることができることを示すために、第１の概念実証実験を実施した。ここで、通常のＭＩＤ配列およびｒｃＭＩＤ＋ｐ５／ｐ７プライマーを用いて２ステップＰＣＲプロトコルを実施し、市販のアッセイ（ＨＮＰＣＣ ＭＡＳＴＲ）の全ての標的アンプリコンを増幅した。手順はＨＮＰＣＣ使用説明文書に記載されているように実施した（ｗｗｗ．ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｏｍ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｈｎｐｃｃ－ｍａｓｔｒ）。マルチプレックスＰＣＲに基づく標的増幅条件は、ＨＮＰＣＣ ＭＡＳＴＲキットを用いて使用説明書に記載されているように実施したが、全てのＨＮＰＣＣプライマーを５つの個別の部分ではなく１つの反応で一緒に混合したという改変を行なった。簡潔には、５０ｎｇのゲノムテンプレートＤＮＡを用いて、全てのＨＮＰＣＣプライマー対を含む１つのマルチプレックスＰＣＲ反応を組み立て、第１のＰＣＲ反応を２０サイクル実施した。得られたアンプリコンを１０００倍に希釈し、続いてこの希釈された生成物２μｌを、ＭＩＤまたはｒｃＭＩＤ＋ｐ５／ｐ７プライマーとともに第２の２０サイクルのＰＣＲラウンドに用いた。
ｒｃＭＩＤ＋ｐ５／ｐ７プライマーが第１のＰＣＲプライマー対とともに１ステップ反応によって期待されるアンプリコンを産生することができることを示すために、第２の概念実証実験を実施した。ここで、ＢＲＣＡ腫瘍ＭＡＳＴＲプラスＤｘ市販アッセイ（ｗｗｗ．ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｏｍ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂｒｃａ－ｔｕｍｏｒ－ｍａｓｔｒ－ｐｌｕｓ－ｄｘ）の第１の部分からの第１のＰＣＲプライマー対を、ＭＩＤプライマーを用いる２ステップＰＣＲとして、またはｒｃＭＩＤ＋ｐ５／ｐ７プライマーを用いる１ステップＰＣＲとして実施した。２ステップＰＣＲはそれぞれ２０ＰＣＲサイクルの２つの反応で実施した。１ステップＰＣＲは３０ＰＣＲサイクルを超える単一の反応で実施した。両方の実験について、５０ｎｇのインプットゲノムＤＮＡを用いた。
Ｐ５プライマー配列は配列番号３として提供され、Ｐ７プライマー配列は配列番号４として提供される。
それぞれが３’逆転ｄＴブロッキング基でブロックされたｒｃＭＩＤ配列は、配列番号５～２４として提供される。配列番号５～１４を、Ｐ５プライマーを用いる第２ステージの増幅のためのＭＩＤプライマーを生成するために伸長した。これらはタグ１配列のリバース相補体を含み、それぞれはタグ配列のすぐ下流に異なったバーコード配列を含んでいる。配列番号１５～２４を、Ｐ７プライマーを用いる第２ステージの増幅のためのＭＩＤプライマーを生成するために伸長した。これらはタグ２配列のリバース相補体を含み、それぞれはタグ配列のすぐ下流に異なったＭＩＤ配列を含んでいる。
（結果）
第１の概念実証実験の結果を図１４に示す。図１４は断片解析の結果を表し、アンプリコンの長さをＸ軸に、それぞれのピークの高さとして表したそれぞれのアンプリコンの収率をＹ軸に示す（ピークが高ければ収率が良い）。
図１４の左上のパネルは通常のＭＩＤプライマーを用いた第２のＰＣＲの断片解析の結果を示し、このアッセイの予想される断片解析パターンが得られている。
右上のパネルはｒｃＭＩＤ＋ｐ５／ｐ７プライマーを用いた第２のＰＣＲの断片解析の結果を示す。得られたパターンは左上のパネルと同じであるが、全収率のみが低かった。これは、ｒｃＭＩＤプライマーからのＭＩＤプライマーの産生によって第２のＰＣＲの開始の出現が遅延され、それにより低収率となったという事実によって説明できる。
さらに、第２のＰＣＲを成功させるためにｒｃＭＩＤおよびＰ５／Ｐ７を反応に加えることが必要であることが、下のパネルから明らかである。左下のパネルは、Ｐ５プライマーおよびＰ７プライマーのみを反応に加えた場合に増幅生成物が存在しないことを示す。右下のパネルは、ｐ５／ｐ７プライマーなしにｒｃＭＩＤプライマーのみを加えた場合に増幅がないことを示す。
図１５は、ＭＩＤおよびｒｃＭＩＤ＋Ｐ５／Ｐ７プライマーを用いて得られた結果の断片解析結果をより詳細に表す。この図は、両方の増幅のパターンが同一であり、ｒｃＭＩＤ＋ｐ５／ｐ７反応の場合に収率のみが低いことを明らかに示している（下のパネル）。
第２の概念実証実験の結果を図１６に示す。この図から、１ステップＰＣＲの組立てで予想される全てのアンプリコンが存在する（ただし収率は低い。Ｙ軸が同一でないことに注意）ことが明らかである。さらに、１ステップＰＣＲにおいてさらなるアンプリコンが存在していたことが観察された。これらの余分のアンプリコンは、最終アンプリコンの一端または両端にＭＩＤプライマーを欠くアンプリコンを生じる第１のＰＣＲ生成物アンプリコンが相対的に多く存在した結果である。しかし、このデータは、ｒｃＭＩＤ＋Ｐ５／Ｐ７システムによって同じ単一の反応混合物中（１ステップ反応）で両方の増幅を実施できることを明らかに示している。
＜ユニバーサルプライマーの産生を遅延させることおよび第１の増幅反応の程度を制御することによって、単一の反応混合物中のマルチステップ増幅反応を可能にする＞
［実施例３］
（１ステップ反応）
それぞれが（最初の標的ＤＮＡ分子中の標的配列にハイブリダイズする）プライマー領域と、ｒｃＭＩＤ＋ｐ５／ｐ７プライマーと組み合わせたタグ配列（第１のＰＣＲプライマー対）との間にＲＮＡ塩基を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマー（即ちプライマー対）が、１ステップ反応（即ち同じ反応容器中で第１の増幅と第２の増幅の両方が並列に起こる反応）において、ｒｃＭＩＤ＋ｐ５／ｐ７プライマーと組み合わせた、ＲＮＡを含まない第１のＰＣＲプライマー対と比較して、望ましくない短いＰＣＲ生成物の産生が少ないことを示すために、概念実証実験を実施した。
プライマー領域とＢＲＣＡ腫瘍ＭＡＳＴＲプラスＤｘ市販アッセイ（ｗｗｗ．ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｏｍ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂｒｃａ－ｔｕｍｏｒ－ｍａｓｔｒ－ｐｌｕｓ－ｄｘ）の第１部分からのタグとの間にＲＮＡ塩基を含み、または含まない第１のＰＣＲプライマー対を、単一のチューブ中でｒｃＭＩＤ＋ｐ５／ｐ７プライマーと混合した。好適なアダプターを含む第２ラウンドの増幅生成物を産生させることを意図した１ステップＰＣＲを、単一の反応で３０ＰＣＲサイクルより多く、実施した。両方の実験について、５０ｎｇのインプットゲノムＤＮＡを用いた。第１のプライマーのプライマー濃度は、標準の（標的特異的）マルチプレックスＰＣＲ反応で用いたプライマー濃度と比較して１：８であった。熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ２（ＩＤＴ）も、反応あたり９．１ｍＵ（０．４５ｍＵ／μｌ）の濃度で反応に加えた。
（結果）
概念実証実験の結果を図１７および図１８に示す。これらの図は断片解析の結果を表し、アンプリコンの長さをＸ軸に、それぞれのピークの高さとして表したそれぞれのアンプリコンの収率をＹ軸に示す（ピークが高ければ収率が良い）。
ＲＮＡ塩基を含む第１のプライマー対を用いない１ステップ反応では主として第１のプライマー対による増幅に対応する増幅生成物が得られることが予想された。これらの増幅生成物はユニバーサル（ＭＩＤ）プライマーを用いて産生される第２の増幅の後で生じる所望の増幅生成物より短い。図１７から明らかなように、この結果がまさに観察された。
上のパネル（図１７Ａ）は、第１のプライマー対にＲＮＡ塩基を含まない１ステップＰＣＲの断片解析の結果を示す。中央のパネル（図１７Ｂ）は同じ結果であるが長方形（灰色のバンド）を重ねて示し、それぞれの長方形が第１のＰＣＲ生成物の予想される大きさを表す。図１７Ｂから、形成された全てのアンプリコンが第１の（標的特異的）増幅から予想される短いアンプリコンであった一方、ユニバーサルＰＣＲからの第２ラウンドのアンプリコンが欠失していたことが明らかである。図１７Ｃはこれを確認しており、ここで長方形（灰色のバンド）はユニバーサルＰＣＲの後のＰＣＲ生成物の予想される大きさを表している。
対照的に、ＲＮＡ塩基を含む第１のプライマー対を用いた１ステップ反応では主として第２ラウンドのユニバーサルＰＣＲから生じる所望の増幅生成物が得られることが予想された。これらの増幅生成物は第１のプライマー対を用いて産生される予想される断片より長い。図１８から明らかなように、この結果がまさに観察された。
上のパネル（図１８Ａ）は、第１のプライマー対にＲＮＡ塩基を含む１ステップＰＣＲの断片解析の結果を示す。下のパネル（図１８Ｃ）は同じ結果であるが長方形（灰色のバンド）を重ねて示し、それぞれの長方形がユニバーサルＰＣＲ生成物の予想される大きさを表す。図１８Ｃから、形成されたアンプリコンの大部分が第２ラウンドのユニバーサル増幅から予想される長いアンプリコンであった一方、第１のＰＣＲからのアンプリコンが欠失していたことが明らかである。図１８Ｂはこれを確認しており、ここで長方形（灰色のバンド）は第１のＰＣＲの後のＰＣＲ生成物の予想される大きさを表している。
この概念実証実験は、第１のプライマー対にＲＮＡ塩基を添加することによって１ステップ反応を介する標的特異的増幅およびユニバーサル増幅の実施が可能になり、所望のユニバーサルＰＣＲの大きさの生成物の形成がもたらされることを明らかに示している。対照的に、第１のプライマー対に含まれるＲＮＡ塩基がない場合には、第１のＰＣＲから予想される増幅生成物のみが観察された。
本発明は本明細書に記載した具体的な実施形態による範囲に限定されるべきではない。まさに、本明細書に記載した改変に加えて、本発明の種々の改変は、上記の説明および添付した図面から当業者には明白になる。そのような改変は添付した特許請求の範囲に含まれることが意図されている。さらに、本明細書に記載した全ての実施形態は広く適用可能であり、矛盾のない他の全ての実施形態と必要に応じて組合せ可能であると考えられる。
本明細書に種々の出版物を引用したが、その開示は参照により全体として組み込まれる。

Claims (6)

  1. 標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のためのプライマーであって、５’から３’の順に、
    ａ．ＲＮＡヌクレオチドを含まないユニバーサルタグ、
    ｂ．ＲＮＡヌクレオチド、
    ｃ．ＲＮＡヌクレオチドを含まず、前記標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域、
    ｄ．さらなるＲＮＡヌクレオチド、
    ｅ．前記標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするさらなる領域、および
    ｆ．ブロッキング基
    を含む、プライマー。
  2. ａとｂとの間に、
    ｇ．前記標的核酸分子の鎖とハイブリダイズする４つまでのヌクレオチド
    をさらに含み、領域ｇおよびｃがいずれも同じ前記標的核酸分子とハイブリダイズして、前記標的核酸分子中のＤＮＡ塩基と対になったＲＮＡヌクレオチドが生じる、請求項１のプライマー。
  3. 標的核酸分子を増幅するための、請求項１または２に記載のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、プライマー対。
  4. 標的核酸分子のマルチステップ増幅における使用のための試薬のセットであって、
    ａ．請求項１または２に記載のプライマー、または請求項３で定義されるプライマー対、および
    ｂ．ＲＮａｓｅ Ｈ
    を含む、試薬のセット。
  5. 請求項１または２に記載のプライマー、請求項３に記載のプライマー対、または請求項４に記載の試薬のセットの使用を含む、標的核酸分子のマルチステップ増幅の方法。
  6. 第１のプライマー対を用いてＲＮａｓｅ Ｈの存在下に標的核酸分子を増幅するステップを含む、標的核酸分子の増幅のための方法であって、前記第１のプライマー対が、
    ｉ．５’から３’の順に、
    ａ．ＲＮＡヌクレオチドを含まないユニバーサルタグ、
    ｂ．ＲＮＡヌクレオチド、
    ｃ．ＲＮＡヌクレオチドを含まず前記標的核酸分子の鎖とハイブリダイズするプライマー領域
    を含む第１のフォワードプライマー、
    ｉｉ．５’から３’の順に、
    ａ．ＲＮＡヌクレオチドを含まないユニバーサルタグ（これは最初の標的核酸分子とハイブリダイズしない）、
    ｂ．ＲＮＡヌクレオチド、
    ｃ．ＲＮＡヌクレオチドを含まず前記標的核酸の鎖とハイブリダイズするプライマー領域
    を含む第１のリバースプライマー
    を含み、それにより、
    ａ．第１ラウンドの増幅の後、前記標的核酸分子が複製され、第１の増幅生成物が前記ユニバーサルタグおよび前記第１のフォワードプライマーのＲＮＡヌクレオチドを組み込み、第２の増幅生成物が前記ユニバーサルタグおよび前記第１のリバースプライマーのＲＮＡヌクレオチドを組み込み、
    ｂ．第２ラウンドの増幅では、前記第１のリバースプライマーが、前記第１の増幅生成物とハイブリダイズして、前記ユニバーサルタグの相補体と前記第１のフォワードプライマーの前記ＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ相補体とを組み込んだ第３の増幅生成物を産生し、前記第１のフォワードプライマーが、前記第２の増幅生成物とハイブリダイズして、前記ユニバーサルタグの相補体と前記第１のリバースプライマーの前記ＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ相補体とを組み込んだ第４の増幅生成物を産生し、前記第３の増幅生成物および前記第４の増幅生成物がそれぞれＲＮａｓｅ Ｈ活性の基質となり、それにより前記ＲＮＡヌクレオチドの切断がもたらされ、それにより前記標的核酸分子のさらなる増幅が制限される、方法。
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