CN114657232B - 一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用。本发明提供的封闭序列与PCR Primer序列反向互补,且采用锁核苷酸修饰。封闭序列3’端封闭无需修饰;或3’端进行MGB修饰、C3间隔臂修饰,磷酸化修饰,地高辛修饰或生物素修饰。本发明提供的封闭序列能够高效封闭Illumina或MGI平台接头序列,且不受接头序列中Index的影响,操作简便,封闭效率高,能够有效降低背景信号,提升有效数据量,减少测序成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用。
背景技术
近十几年来,NGS(二代测序技术)的快速发展使得DNA测序成本大幅降低,然而就现阶段而言,全基因组重测序的成本依然很高,且得到的海量数据分析速度缓慢,无法大规模地应用。
靶向测序技术可以将感兴趣的基因组区域富集出来进行测序,通过对几十个、或者几百个基因的深度测序,找出突变。单个样本测序数据产出少且分析速度较快,因此更能经济高效地发挥NGS技术的优势,广泛应用到临床检测、健康筛查等众多领域。另外,靶向测序可以对目标区域进行深度测序,增加了目标区域内遗传变异的检测灵敏度和准确性,在低频突变位点的检出方面有很大优势。
在靶向捕获流程中,需要结合不同变异类型,对靶区DNA序列设计序列探针,同时在探针的末端加上生物素标记。在液相杂交体系中,根据DNA碱基互补配对原理,使用生物素标记的探针将靶区序列捕获出来,然后利用链霉亲和素磁珠将探针及结合到探针上的靶区序列捕获下来,通过PCR扩增进一步富集,即得到NGS捕获后的文库。
对捕获后的文库进行NGS二代测序时,目前主要的测序平台有Illumina和MGI平台,其中Illumina平台技术较成熟,应用范围广泛。但是,随着近年来的迅速发展,华大智造(MGI)不断推出了更高测序通量的测序仪,从而测序成本不断降低,相继推出的MGI-200、MGI-2000和T7测序仪,其中T7测序仪是目前市场上测序通量最高和测序成本最低的测序仪。在测序通量、数据产出质量、测序周期以及测序价格等方面表现出了很大的优势,市场上越来越多的NGS建库试剂盒在MGI测序平台的基础上,已经开发出了单端index和双端index接头序列(包括UMI分子标签),因此兼容MGI平台的靶向捕获试剂相关产品的开发也越来越重要。
由于文库构建过程中引入了大量的非靶区DNA序列,如重复序列、接头和标签序列等。这些序列又具有高度的相似性,会在杂交捕获过程中,干扰探针和靶区的结合,引入大量非特异性捕获,导致捕获效率降低。所以在靶向捕获过程中,需要将非靶区DNA序列进行封闭,阻断文库之间的串联反应发生,提高数据利用率。
在液相杂交捕获中,针对重复序列常用的封闭试剂为Human cot DNA或SalmonSperm DNA,其中Human cot DNA主要用于人源样本中重复序列的封闭,Salmon Sperm DNA主要用于非人源样本中重复序列的封闭。
目前针对接头和标签序列等非目标序列的封闭采用的是对接头序列和标签序列同时进行封闭,有一对一和一对多两种封闭方法。一对一是指,每一种标签序列和接头序列都用其对应的互补序列进行封闭。常用的标签序列有6~8个碱基,则需要设计一一对应的封闭序列的种类要上万条。按照这个数量级来合成封闭序列所需成本较高。并且在建库过程中,需要核对标签序列,一一找出其对应的封闭序列,增加了建库过程中实验操作的繁琐性,很容易出现人为识别错误,导致样本数据异常,消耗大量人力物力在问题排查上。一对多的封闭方式是指,对标签序列采用对应数目的次黄嘌呤占位。但是次黄嘌呤的合成价格昂贵,封闭效率不如一对一高。
在Blocker序列方面,目前市场上常用的Adaptor封闭序列选择封闭双链DNA的其中一条,序列保持与扩增时用到的PCR Primer序列部分相同(下文中我们称这种Blocker为正向序列。与PCR Primer序列反向互补的序列,我们称之为反向序列),这种Blocker序列在PCR扩增时,很容易被当成引物参与到模板的PCR扩增,引起标签跳跃,给后续数据分析和结果解读带来影响,所以需要在Blocker的3’端进行封闭修饰,比如MGB、C3间隔臂,磷酸化,地高辛或生物素双脱氧核苷酸等修饰。这样一来就增加了Blocker序列合成时的成本。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用,目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的,一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂,封闭序列与PCR Primer序列反向互补,且采用锁核苷酸修饰。
进一步地,封闭序列3’端封闭无需修饰;或3’端进行MGB修饰、C3间隔臂修饰,磷酸化修饰,地高辛修饰或生物素修饰。
进一步地,通用封闭试剂针对MGI单端index文库,选自组合:
a):
UM5B:AAGT+CGGAT+CGTAG+CCATGT+CGTTC;
UM7B:AGT+CGGAGGC+CAAG+CGGT+CTTAGGAAGA+CAAIIIIIIIIII+CAACTC+CTTGG+CT+CACA;
或b):
M-B-S1:GAA+CGA+CATGG+CTACGAT+CCGACTT-MGB;
M-B-S2:TGTGAGC+CAAGG+AGTTGIIIIIIIIIITTGT+CTTC+CTAAGA+CCGCTTGG+CCTCCGACTT-MGB;
或c):
M-B-S3:AAGT+CGGAT+CGTAG+CCATGT+CGTTC/3SpC3/;
M-B-S4:AGT+CGGAGGC+CAAG+CGGT+CTTAGGAAGA+CAAIIIIIIIIII+CAACTC+CTTGG+CT+CACA/3SpC3/;
或d):
M-B-S5:GAA+CGA+CATGG+CTACGAT+CCGACTT/3SpC3/;
M-B-S6:TGTGAGC+CAAGG+AGTTGIIIIIIIIIITTGT+CTTC+CTAAGA+CCGCTTGG+CCTCCGACTT/3SpC3/;
其中,+表示锁核苷酸修饰,I表示次黄嘌呤,-MGB表示MGB修饰,/3SpC3/表示Spacer C3修饰。
进一步地,通用封闭试剂针对MGI双端index文库,选自组合:
a):
M-B-D1:CTCTC+AGTACGT+CAGCAGTTIIIIIIIIIICAACTC+CTTGG+CTCACAGAA+CGACATGG+CTACGAT+CCGACTT-MGB;
M-B-D2:GCATGG+CGACCT+TATCAGIIIIIIIIIITTGT+CTTCCTAAGA+CCGCTTGG+CCTCCGACTT-MGB;
或b):
C-M-B-D1-2:CTCTC+AGTACGT+CAGCAGTTIIIIIIIIIICAACTC+CTTGG+CTCACAGAA+CGACATGG+CTACGAT+CCGACTT/3SpC3/;
C-M-B-D2-2:GCATGG+CGACCT+TATCAGIIIIIIIIIITTGT+CTTCCTAAGA+CCGCTTGG+CCTCCGACTT/3SpC3/;
或c):
C-M-B-D3:AAGT+CGGAT+CGTAGC+CATGT+CGTTC+TGTGAG+CCAAGGAGTTGIIIIIIIIIIAA+CTGCTGA+CGTA+CTGAGAG/3SpC3/;
C-M-B-D4:AGT+CGGAGG+CCAAG+CGGT+CTTAGGAAGA+CAAIIIIIIIIII+CTGATAAGGT+CGCCATG+C/3SpC3/;
或d):
C-M-B-D5:AAGT+CGGAT+CGTAGC+CATGT+CGTTC+TGTGAG+CCAAGGAGTTGIIIIIIIIIIAA+CTGCTGA+CGTA+CTGAGAG;
C-M-B-D6:AGT+CGGAGG+CCAAG+CGGT+CTTAGGAAGA+CAAIIIIIIIIII+CTGATAAGGT+CGCCATG+C;
其中,+表示锁核苷酸修饰,I表示次黄嘌呤,-MGB表示MGB修饰,/3SpC3/表示Spacer C3修饰。
本发明还提供了一种捕获试剂盒,包含如上述的通用封闭试剂。
进一步地,还包括:杂交试剂、捕获探针、捕获磁珠和磁珠清洗试剂、洗脱试剂和PCR扩增试剂。
进一步地,所述杂交试剂包括杂交缓冲液和杂交缓冲液增强剂;所述杂交缓冲液包括2x SSPE、5x Denhandt’s、2mM EDTA、0.02%SDS、2M甜菜碱、1M四甲基氯化铵、10%硫酸葡聚糖;所述杂交缓冲液增强剂包括甲酰胺和硫氰酸胍。
进一步地,所述捕获磁珠为链霉素亲和磁珠。
进一步地,还包括Human Cot DNA。
本发明还提供了如上述的通用封闭试剂、或试剂盒在目标序列杂交捕获中的应用。
本发明提供了一种用于提高靶向捕获效率的通用杂交增强剂(即为本申请中的通用封闭试剂),能够高效封闭Illumina或MGI平台接头序列,且不受接头序列中Index的影响,操作简便,封闭效率高,能够有效降低背景信号,提升有效数据量,减少测序成本。
综上所述,本发明的优点及积极效果为:
1.本发明根据MGI单端index文库和双端index文库的结构,分别设计DNA封闭序列。
单端index文库的封闭序列一共两条,第一条包括一整条通用封闭序列。第二条包括三个部分,从5’端到3’端依次为:通用封闭序列+Barcode封闭序列+通用封闭序列。单端index文库的两条封闭序列中,通用封闭序列中间包含若干个LNA修饰,Barcode封闭序列为次黄嘌呤碱基,3’端均为C3 Spacer修饰。
双端index文库的封闭序列一共两条,第一条和第二条都包括三个部分,从5’端到3’端依次为:通用封闭序列1+Barcode封闭序列+通用封闭序列2。双端index文库的两条封闭序列中,通用封闭序列1和2中间包含若干个LNA修饰,Barcode封闭序列为次黄嘌呤碱基,3’端均为C3 Spacer修饰。
2.在序列方面,我们设计了Blocker序列为反向序列,避免了PCR扩增时的标签跳跃现象(如背景技术中所描述的,正向序列会引起标签跳跃)。
3.同时测试了正向序列及其不同3’端封闭方式、正向序列及其不同3’端封闭方式。
4.本发明在接头封闭序列和Human cot DNA的基础上,增加了Salmon Sperm DNA,能够封闭不同来源物种基因中的重复序列,提高捕获效率。
5.结果表明,反向序列封闭效果由于正向序列。使用反向序列进行封闭时,3’端是否修饰,封闭效果基本相当,在此基础上,可以去掉3’端修饰,降低实验成本。
6.使用本发明中的封闭序列和150kb大小的Panel进行MGI文库靶向捕获测序,经数据分析,捕获效率能够和一对一封闭效果相当。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明,各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明,均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息,对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变,而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解,本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分,因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上,本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围,在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值,在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此,除非特别说明,否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值,其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
本发明披露了一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用。下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本发明中首先针对MGI单端index文库和MGI双端index文库,设计Blocker,具体如下。
针对MGI单端index文库,设计Blocker,测试组和对照组的MGI Blocker序列如下:
备注:+表示锁核苷酸修饰,I表示次黄嘌呤,-MGB表示MGB修饰,/3SpC3/表示Spacer C3修饰。
针对MGI双端index文库,设计Blocker,测试组和对照组的MGI Blocker序列如下:
备注:+表示锁核苷酸修饰,I表示次黄嘌呤,-MGB表示MGB修饰,/3SpC3/表示Spacer C3修饰。
操作步骤主要包括将制备好的文库与Human Cot DNA、Blocker混合封闭、封闭后样本与探针杂交、洗脱buffer的准备及链霉亲和素磁珠准备、磁珠捕获及清洗和Post-capture PCR。
使用ABclonal-Rapid Plus DNA Lib Prep Kit for Illumina V2(RK20255)试剂盒进行文库制备。
将制备好的文库与Cot DNA(15279011,Invitrogen)、Blocker混合封闭
1.1将MGI Universal Blockers与Human Cot DNA放置室温溶解,旋涡振荡混匀并离心,置于冰上备用。
1.2取一个新的1.5mL管,按照下表加入组分:
1.3涡旋振荡混匀,瞬时离心至管底部。用真空浓缩仪在60℃条件下进行浓缩,至看不见液体为止。
2封闭后样本与探针杂交
2.1将试剂提前置于室温融化。
2.2对于浓缩后的混合物,按照下表加入其它组分:
杂交缓冲液包括2x SSPE、5x Denhandt’s、2mM EDTA、0.02%SDS、2M甜菜碱、1M四甲基氯化铵、10%硫酸葡聚糖组成。杂交缓冲液增强剂为甲酰胺和硫氰酸胍(杂交缓冲液增强剂配比为:甲酰胺(v%):硫氰酸胍(6M,v%)为8:1)。
探针序列如下:
seq-1:
AGAGGAGCGCGTGAGCGTCGCGGGAGCCTCGGGCACCATGAGCGACGTGGCTATTGTGAAGGAGGGTTGGCTGCACAAACGAGGTTAGTACCCGCTGCCAGGGCTGGGCCTGGGGAGGGA
seq-2
TGGCGAGGGTCTGACGGGTAGAGTGTGCGTGGCTCTCACCACCCGCACGTCTGTAGGGGAGTACATCAAGACCTGGCGGCCACGCTACTTCCTCCTCAAGAATGATGGCACCTTCATTGG
seq-3
CTACAAGGAGCGGCCGCAGGATGTGGACCAACGTGAGGCTCCCCTCAACAACTTCTCTGTGGCGCGTAAGTATCCCCTTGGCCTCTCGGGATTCAGATTTGGGGGGTTGGCTGGAGCCCT
seq-4
GCCCCCTTGTGGTTGCCAGGGCCTCGATGCTGGAATGTCAGAGGCCCCCCACTGGCCCCTCAGCCTCCTCCTGCTTTGCACAGGCTGGGCCAGAGCCTGCCACGGAGCCCCAGCGGCTAC
seq-5
ACACTCCACTCACTCACACCTCTCAGGGCCCCGCACGTTCCCACAGCCCTCAGGGTGTACGTGCTGTAGGTGTGGCTGTGCCCCAGGTATGTGTTCCCCAGGTGTGCTTGTGCCCCAGGT
seq-6
GCAGAGTGCCAGCTGATGAAGACGGAGCGGCCCCGGCCCAACACCTTCATCATCCGCTGCCTGCAGTGGACCACTGTCATCGAACGCACCTTCCATGTGGAGACTCCTGAGGAGCGGTAC
seq-7
GCTCCTGATCTGGTACAGGCCTGCAGCCTCACCTGACCTCCTGCAGGGAGGAGTGGACAACCGCCATCCAGACTGTGGCTGACGGCCTCAAGAAGCAGGAGGAGGAGGAGATGGACTTCC
seq-8
GGTCGGGCTCACCCAGTGACAACTCAGGGGCTGAAGAGATGGAGGTGTCCCTGGCCAAGCCCAAGCACCGCGTGGTGAGGCCTGTCCCCACTTCTGCCTGTGCCTGGGGCTGCCTTGGAC
seq-9
TCTGGGGCCCCTCATGCCACCCCACGCATGCCGACCAGCTGGGCACTGTTGGCAGCGCCGCTTGCTGACCCTGGTGCCTGCCCATAGACCATGAACGAGTTTGAGTACCTGAAGCTGCTG
seq-10
GGCAAGGGCACTTTCGGCAAGGTGATCCTGGTGAAGGAGAAGGCCACAGGCCGCTACTACGCCATGAAGATCCTCAAGAAGGAAGTCATCGTGGCCAAGGTGGGGCCGGGGCGGTGGGG
seq-11
GGCAGCTCACCCAGCCCTGCTTTACAGGACGAGGTGGCCCACACACTCACCGAGAACCGCGTCCTGCAGAACTCCAGGCACCCCTTCCTCACAGTGAGTGGGAGCCCAGATGGGGCTGAA
seq-12
GCAGTTCCAGCTCCCCTTCCTTGCAGGCCCTGAAGTACTCTTTCCAGACCCACGACCGCCTCTGCTTTGTCATGGAGTACGCCAACGGGGGCGAGGTAGGGGCTGGGGCTGCGGGGGATG
seq-13
AGGCCATGGGGGCAGAGGCCCGAGCCACGGCTGTGCCTCAGGTTGCGCCTCCCGCAGCTGTTCTTCCACCTGTCCCGGGAGCGTGTGTTCTCCGAGGACCGGGCCCGCTTCTATGGCGCT
seq-14
GAGATTGTGTCAGCCCTGGACTACCTGCACTCGGAGAAGAACGTGGTGTACCGGGACCTCAAGGTGCGCTGGCGGGCAGGCAGGGGGGCAGGGCCCTGGGGGCCTGGCGGCACTGACCTG
seq-15
GGGGGGCAGGGCCCTGGGGGCCTGGCGGCACTGACCTGAGGCCACCTTTCCCCTAGCTGGAGAACCTCATGCTGGACAAGGACGGGCACATTAAGATCACAGACTTCGGGCTGTGCAAGG
seq-16
AGGGGATCAAGGACGGTGCCACCATGAAGACCTTTTGCGGCACACCTGAGTACCTGGCCCCCGAGGTGTGCGCCCCACCTGCGTGCATACGCGTTGCTGCGTCCCCACGTCCTGAGCACA
seq-17
CCACCCGTGCAGGTGCTGGAGGACAATGACTACGGCCGTGCAGTGGACTGGTGGGGGCTGGGCGTGGTCATGTACGAGATGATGTGCGGTCGCCTGCCCTTCTACAACCAGGACCATGAG
seq-18
AAGCTTTTTGAGCTCATCCTCATGGAGGAGATCCGCTTCCCGCGCACGCTTGGTCCCGAGGCCAAGTCCTTGCTTTCAGGGCTGCTCAAGAAGGACCCCAAGCAGAGGTGAGGGCCGCCC
seq-19
TGTTTCCTGCCTGCAGGCTTGGCGGGGGCTCCGAGGACGCCAAGGAGATCATGCAGCATCGCTTCTTTGCCGGTATCGTGTGGCAGCACGTGTACGAGAAGAAGGTGCGGCTGCTCCCCG
seq-20
CTCTGCAGCTCAGCCCACCCTTCAAGCCCCAGGTCACGTCGGAGACTGACACCAGGTATTTTGATGAGGAGTTCACGGCCCAGATGATCACCATCACACCACCTGACCAAGGTGAGGGGC
seq-21
TGAGCTGTCTACACCCACAGATGACAGCATGGAGTGTGTGGACAGCGAGCGCAGGCCCCACTTCCCCCAGTTCTCCTACTCGGCCAGCGGCACGGCCTGAGGCGGCGGTGGACTGCGCTG
seq-22
CAGTGTAAACGGCCTCCTCCGGCGGGATGGGAGCCATCGGGCTCCTGTGGCTCCTGCCGCTGCTGCTTTCCACGGCAGCTGTGGGCTCCGGGATGGGGACCGGCCAGCGCGCGGGCTCCC
seq-23
CAGCTGCGGGGCCGCCGCTGCAGCCCCGGGAGCCACTCAGCTACTCGCGCCTGCAGAGGAAGAGTCTGGCAGTTGACTTCGTGGTGCCCTCGCTCTTCCGTGTCTACGCCCGGGACCTAC
seq-24
TGCTGCCACCATCCTCCTCGGAGCTGAAGGCTGGCAGGCCCGAGGCCCGCGGCTCGCTAGCTCTGGACTGCGCCCCGCTGCTCAGGTTGCTGGGGCCGGCGCCGGGGGTCTCCTGGACCG
seq-25
CCGGTTCACCAGCCCCGGCAGAGGCCCGGACGCTGTCCAGGGTGCTGAAGGGCGGCTCCGTGCGCAAGCTCCGGCGTGCCAAGCAGTTGGTGCTGGAGCTGGGCGAGGAGGCGATCTTGG
seq-26
AGGGTTGCGTCGGGCCCCCCGGGGAGGCGGCTGTGGGGCTGCTCCAGTTCAATCTCAGCGAGCTGTTCAGTTGGTGGATTCGCCAAGGCGAAGGGCGACTGAGGATCCGCCTGATGCCCG
seq-27
AGAAGAAGGCGTCGGAAGTGGGCAGAGAGGGAAGGCTGTCCGCGGCAATTCGCGCCTCCCAGCCCCGCCTTCTCTTCCAGATCTTCGGGACTGGTGAGCAGCTCCCGCCTGAGTGTGCCG
seq-28
GACAGCTAAAAGACACACCCCAAGCACATGGATCAGTGTTTTCTTTATTTTTATGTCCAGGTCATAGCTCCTTGGAATCACCAACAAACATGCCTTCTCCTTCTCCTGATTATTTTACAT
seq-29
GGAATCTCACCTGGATAATGAAAGACTCCTTCCCTTTCCTGTCTCATCGCAGCCGATATGGTAAGTATATGTTTAATATTTACTTGAGATACACTGTCACTATCTCATAATAAGGACTCT
seq-30
AAATGGTTTTTTCCATTGACCCTTGGCTATTATTGCAGGTCTGGAGTGCAGCTTTGACTTCCCCTGTGAGCTGGAGTATTCCCCTCCACTGCATGACCTCAGGAACCAGAGCTGGTCCTG
seq-31
GCGCCGCATCCCCTCCGAGGAGGCCTCCCAGATGGACTTGCTGGATGGGCCTGGGGCAGAGCGTTCTAAGGAGATGCCCAGAGGTAAGGGAGAGGCTGCTGGTGATGTCCTGGGTGGGTC
seq-32
TTTCCCTGTCTCTTTCCAGGCTCCTTTCTCCTTCTCAACACCTCAGCTGACTCCAAGCACACCATCCTGAGTCCGTGGATGAGGAGCAGCAGTGAGCACTGCACACTGGCCGTCTCGGTG
seq-33
CACAGGCACCTGCAGCCCTCTGGAAGGTACATTGCCCAGCTGCTGCCCCACAACGAGGCTGCAAGAGAGATCCTCCTGATGCCCACTCCAGGGAAGCATGGGTAAGTACTTCTCCATGTC
seq-34
CTAATTCTCATATCTGTTTCTCTATGCTTTTCTCCTCTGTTTTCCAATGCAACCAGTTGGACAGTGCTCCAGGGAAGAATCGGGCGTCCAGACAACCCATTTCGAGTGGCCCTGGAATAC
seq-35
ATCTCCAGTGGAAACCGCAGCTTGTCTGCAGTGGACTTCTTTGCCCTGAAGAACTGCAGTGAAGGTATCTGAATCTGGCTTTCCCACGCTCCTTGGTAGCCTATTGTGTTAGATGTGTCA
seq-36
TGCTGCCTGGGGCCATGCAAACTTACCATGGTTGTGTGTCTGTGTGCTCTCCAGGAACATCCCCAGGCTCCAAGATGGCCCTGCAGAGCTCCTTCACTTGTTGGAATGGGACAGTCCTCC
seq-37
AGCTTGGGCAGGCCTGTGACTTCCACCAGGACTGTGCCCAGGGAGAAGATGAGAGCCAGATGTGCCGTGAGTAGATGGGGCTGCCCCACCCTGCCTGAGCCCAGCCCATGCTCATAACCC
seq-38
TATTTTGCCTTTAGTGGTCCTGAAAATGATGGTGCCTCTCTGCTCTCTCCATAGGGAAACTGCCTGTGGGTTTTTACTGCAACTTTGAAGATGGCTTCTGTGGCTGGACCCAAGGCACAC
seq-39
TGTCACCCCACACTCCTCAATGGCAGGTCAGGACCCTAAAGGATGCCCGGTTCCAGGACCACCAAGGTACTACTGCTCTCCTGCCTTCTCTCTGGTGCCCATCTTCATGCCCACATAGAC
seq-40
TCTCTCCTAGACCATGCTCTATTGCTCAGTACCACTGATGTCCCCGCTTCTGAAAGTGCTACAGTGACCAGTGCTACGTTTCCTGCACCGATCAAGAGCTCTCCATGTGAGGCAAGTCTC
seq-41
CATACCTTGTCCTCTGACTCTTCTCGCCCTCACAGCTCCGAATGTCCTGGCTCATTCGTGGAGTCTTGAGGGGAAACGTGTCCTTGGTGCTAGTGGAGAACAAAACCGGGAAGGAGCAAG
seq-42
GCAGGATGGTCTGGCATGTCGCCGCCTATGAAGGCTTGAGCCTGTGGCAGTGGATGGTGTTGCCTCTCCTCGATGTGTCTGACAGGTAGGCTCTATGCATCTCCCCCAATACCCTTCTCC
seq-43
TGATGTGTACAGGTTCTGGCTGCAGATGGTCGCATGGTGGGGACAAGGATCCAGAGCCATCGTGGCTTTTGACAATATCTCCATCAGCCTGGACTGCTACCTCACCAGTGAGTTCACTCT
seq-44
CTCACCCTGAAATCAACCCTCACCTAACTCAGCCCGTGGGGTCTTCTCTATTGCAGTTAGCGGAGAGGACAAGATCCTGCAGAATACAGCACCCAAATCAAGAAACCTGTTTGAGAGAAA
seq-45
CCCAAACAAGGAGCTGAAACCCGGGGAAAATTCACCAAGACAGACCCCCATCTTTGACCCTACAGGTAAGGGTTCAGCTCACAAATGTGAGCACAGTAACTTCTTGTTGCAAAAGGCAGA
seq-46
TGGCCACATGAGTGACTGCCTCTCCTCTTGTGCCACAGTTCATTGGCTGTTCACCACATGTGGGGCCAGCGGGCCCCATGGCCCCACCCAGGCACAGTGCAACAACGCCTACCAGAACTC
seq-47
CAACCTGAGCGTGGAGGTGGGGAGCGAGGGCCCCCTGAAAGGCATCCAGATCTGGAAGGTGCCAGCCACCGACACCTACAGGTGCGTATGGAAGAGGGGGAGGGGAGGGGCAGACCACCC
seq-48
TCTTCATACCACAGCGGGAGCCAACGTTCTTTGTCCCATTGCAGCATCTCGGGCTACGGAGCTGCTGGCGGGAAAGGCGGGAAGAACACCATGATGCGGTCCCACGGCGTGTCTGTGCTG
seq-49
GGCATCTTCAACCTGGAGAAGGATGACATGCTGTACATCCTGGTTGGGCAGCAGGGAGAGGACGCCTGCCCCAGTGTAAGTGCCCAGAGCAGGGGTTTCTCGTCTGCACTCTGTCAGGCC
seq-50
AAAGTGGAGAACTCTGGTTTGGCCACAAACCTAACGTGCTTTTTGTTTCTACAGACAAACCAGTTAATCCAGAAAGTCTGCATTGGAGAGAACAATGTGATAGAAGAAGAAATCCGTGTG
seq-51
AACAGAAGCGTGCATGAGTGGGCAGGAGGCGGAGGAGGAGGGGGTGGAGCCACCTACGTATTTAAGGTATGGTGTGTGCTGCCAGATTTCCACCAGGTTCCTGTGCATCTGCAATGTCAG
seq-52
GGGAAGCACAGCTCGGTTTCTCAATGTCTGAATGTCTCCCCTGGTCAGATGAAGGATGGAGTGCCGGTGCCCCTGATCATTGCAGCCGGAGGTGGTGGCAGGGCCTACGGGGCCAAGACA
seq-53
GACACGTTCCACCCAGAGAGACTGGAGAATAACTCCTCGGTTCTAGGGCTAAACGGCAATTCCGGAGCCGCAGGTAAAGCGCTGCAAGCGTGCCCTCTCCCAGAACCTCTCCCAGGCCTT
seq-54
CACGCAGGTTCCCTATCTCTTCCCGCAGGTGGTGGAGGTGGCTGGAATGATAACACTTCCTTGCTCTGGGCCGGAAAATCTTTGCAGGAGGGTGCCACCGGAGGACATTCCTGCCCCCAG
seq-55
GCCATGAAGAAGTGGGGGTGGGAGACAAGAGGGGGTTTCGGAGGGGGTGGAGGGGGGTGCTCCTCAGGTGGAGGAGGCGGAGGATATATAGGTAAAGATGATTCGTGTTCAAGGTGTCAC
seq-56
TGCTACTCAGGCGGCAATGCAGCCTCAAACAATGACCCCGAAATGGATGGGGAAGATGGGGTTTCCTTCATCAGTCCACTGGGCATCCTGTACACCCCAGCTTTAAAAGGTAGCTTCTCT
seq-57
GAGGCAGGCTCGGCCCAAGACTGACCCTCCCTCCTTGTCACTAGTGATGGAAGGCCACGGGGAAGTGAATATTAAGCATTATCTAAACTGCAGTCACTGTGAGGTAGACGAATGTCACAT
seq-58
GGACCCTGAAAGCCACAAGGTCATCTGCTTCTGTGACCACGGGACGGTGCTGGCTGAGGATGGCGTCTCCTGCATTGGTAAGGGGGCAGGGCCAGGGGAGGCAGAGGGGCCCATAGCCTG
seq-59
TCTTCCAGTGTCACCCACCCCGGAGCCACACCTGCCACTCTCGCTGATCCTCTCTGTGGTGACCTCTGCCCTCGTGGCCGCCCTGGTCCTGGCTTTCTCCGGCATCATGATTGGTGAGTG
seq-60
TGTTGCAGCTGACCACCCACCTGCAGTGTACCGCCGGAAGCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCAGATGGAGCTGCAGAGCCCTGAGTACAAGCTGAGCAAGCTCCGCACCTCGACCATCAT
seq-61
GACCGACTACAACCCCAACTACTGCTTTGCTGGCAAGACCTCCTCCATCAGTGACCTGAAGGAGGTGCCGCGGAAAAACATCACCCTCATTCGGTGAGCGCCCTGCTGCCGTCCTGGGAG
seq-62
TCTCCTTTGCACAGGGGTCTGGGCCATGGCGCCTTTGGGGAGGTGTATGAAGGCCAGGTGTCCGGAATGCCCAACGACCCAAGCCCCCTGCAAGTGGCTGTGAAGGTAAGAAGTGGCTCA
seq-63
CCTCCCCACCCTCCCCTTCTCTGCCCAGACGCTGCCTGAAGTGTGCTCTGAACAGGACGAACTGGATTTCCTCATGGAAGCCCTGATCATCAGGTAAAGCCACAGAGAGACACCCTCACC
seq-64
GATTTGCCCAGACTCAGCTCAGTTAATTTTGGTTACATCCCTCTCTGCTCTGCAGCAAATTCAACCACCAGAACATTGTTCGCTGCATTGGGGTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCA
seq-65
TCCTGCTGGAGCTCATGGCGGGGGGAGACCTCAAGTCCTTCCTCCGAGAGACCCGCCCTCGCCCGGTGAGTGAGAACCAGTCTTTGCTGCAGTTGTTGTGCCAAGGACAGGAGCAAGGAT
seq-66
TCTCCCCACAGAGCCAGCCCTCCTCCCTGGCCATGCTGGACCTTCTGCACGTGGCTCGGGACATTGCCTGTGGCTGTCAGTATTTGGAGGAAAACCACTTCATCCACCGGTGAGTCAAAG
seq-67
TCCTTTCTTCCCAGAGACATTGCTGCCAGAAACTGCCTCTTGACCTGTCCAGGCCCTGGAAGAGTGGCCAAGATTGGAGACTTCGGGATGGCCCGAGACATCTACAGGTGAGTAAAGACT
seq-68
TCCCCACAGGGCGAGCTACTATAGAAAGGGAGGCTGTGCCATGCTGCCAGTTAAGTGGATGCCCCCAGAGGCCTTCATGGAAGGAATATTCACTTCTAAAACAGACACATGGTAAGTCAG
seq-69
CTCTGTCCCATGCCCAGGTCCTTTGGAGTGCTGCTATGGGAAATCTTTTCTCTTGGATATATGCCATACCCCAGCAAAAGCAACCAGGAAGTTCTGGAGTTTGTCACCAGTGGAGGCCGG
seq-70
ATGGACCCACCCAAGAACTGCCCTGGGCCTGTGTATGACTCTTTTAGGAACACTTCTGCTAGTTACTAAGCAGTTTTTCTTTTCAAAAAATATCCAGAGCCACATATGCTTCTTTAAGAT
seq-71
GCTTCTTCTTTTAGATACCGGATAATGACTCAGTGCTGGCAACATCAGCCTGAAGACAGGCCCAACTTTGCCATCATTTTGGAGAGGATTGAATACTGCACCCAGGTAAAACATTTTCTC
seq-72
CCTACGGCAGGACCCGGATGTAATCAACACCGCTTTGCCGATAGAATATGGTCCACTTGTGGAAGAGGAAGAGAAAGTGCCTGTGAGGCCCAAGGACCCTGAGGGGGTTCCTCCTCTCCT
seq-73
GGTCTCTCAACAGGCAAAACGGGAGGAGGAGCGCAGCCCAGCTGCCCCACCACCTCTGCCTACCACCTCCTCTGGCAAGGCTGCAAAGAAACCCACAGCTGCAGAGATCTCTGTTCGAGT
seq-74
CCCTAGAGGGCCGGCCGTGGAAGGGGGACACGTGAATATGGCATTCTCTCAGTCCAACCCTCCTTCGGAGTTGCACAAGGTCCACGGATCCAGAAACAAGCCCACCAGCTTGTGGAACCC
seq-75
AACGTACGGCTCCTGGTTTACAGAGAAACCCACCAAAAAGAATAATCCTATAGCAAAGAAGGAGCCACACGACAGGGGTAACCTGGGGCTGGAGGGAAGCTGTACTGTCCCACCTAACGT
seq-76
TGCAACTGGGAGACTTCCGGGGGCCTCACTGCTCCTAGAGCCCTCTTCGCTGACTGCCAATATGAAGGAGGTACCTCTGTTCAGGCTACGTCACTTCCCTTGTGGGAATGTCAATTACGG
seq-77
CTACCAGCAACAGGGCTTGCCCTTAGAAGCCGCTACTGCCCCTGGAGCTGGTCATTACGAGGATACCATTCTGAAAAGCAAGAATAGCATGAACCAGCCTGGGCCCTGAGCTCGGTCGCA
seq-78
GAAGCACTCAGTTGCCTTCTCGGGCCTCGGCGCCCCCTATGTACGCCTCCCTGGGCTCGGGTCCGGTCGCCCCTTTGCCCGCTTCTGTACCACCCTCAGTTCTCGGGTCCTGGAGCACCG
seq-79
GCGGCAGCAGGAGCTGCGTCCGGCAGGAGACGAAGAGCCCGGGCGGCGCTCGTACTTCTGGCCACTGGGCGAGCGTCTGGCAGGTGAGTGAGGCTGCAGGCATTGACGTCTCCTCCCGGC
seq-80
TGGGCGCACGTGACCGACATGTGGCTGTATTGGTGCAGCCCGCCAGGGTGTCACTGGAGACAGAATGGAGGTGCTGCCGGACTCGGAAATGGGGTAGGTGCTGGAGCCACCATGGCCAGG
seq-81
AAAGAATGGAGCATATTCATGGCGAGGAGCAAAAGCTCTACCCCATTGAAAGGCTTCTTTTCCTCCCTGGCGACAAGGACACATGCATTGGTGGCCAAAAGAGAGAGGAGACAAAACCGC
seq-82
TGCAGATGGCTGATGTGAATCTAGTGGAAAGAGCTACTGGGGATGAGAGAAAGAGGAGGAGGCAGGTACTGCAGAGCGTGAGTGGTGGTGTTGGTTGGTGAAATACTGGTCACCAGTAGT
seq-83
AAATTTTTTAGTAGTGAATTTCAAAATCCTTTTTAACCTTATAGGTCCAAGGGTAGCCAAGGATGGCTGCAGCTTCATATGATCAGTTGTTAAAGCAAGTTGAGGCACTGAAGATGGAGA
seq-84
ACTCAAATCTTCGACAAGAGCTAGAAGATAATTCCAATCATCTTACAAAACTGGAAACTGAGGCATCTAATATGAAGGTATCAAGACTGTGACTTTTAATTGTAGTTTATCCATTTTTAT
seq-85
GGTATCAAGACTGTGACTTTTAATTGTAGTTTATCCATTTTTATTCAGTATTCCCTCTTGTAAACTTGAGGTAAGACACTTTACTTAAAAGTGTATTTTAAATTAAGCAATAATATGTAA
seq-86
TTGTGTTCTTTTTAACAGGAAGTACTTAAACAACTACAAGGAAGTATTGAAGATGAAGCTATGGCTTCTTCTGGACAGATTGATTTATTAGAGCGTCTTAAAGGTAGATTTTAAAAAGGT
seq-87
TTGTTTCTATTTTATTTAGAGCTTAACTTAGATAGCAGTAATTTCCCTGGAGTAAAACTGCGGTCAAAAATGTCCCTCCGTTCTTATGGAAGCCGGGAAGGATCTGTATCAAGCCGTTCT
seq-88
GGAGAGTGCAGTCCTGTTCCTATGGGTTCATTTCCAAGAAGAGGGTTTGTAAATGGAAGCAGAGAAAGTACTGGATATTTAGAAGAACTTGAGAAAGAGAGGTAACTTTTCTTCATATAG
seq-89
AAATAGGTCATTGCTTCTTGCTGATCTTGACAAAGAAGAAAAGGAAAAAGACTGGTATTACGCTCAACTTCAGAATCTCACTAAAAGAATAGATAGTCTTCCTTTAACTGAAAATGTAAG
seq-90
TAGTTTTCCTTACAAACAGATATGACCAGAAGGCAATTGGAATATGAAGCAAGGCAAATCAGAGTTGCGATGGAAGAACAACTAGGTACCTGCCAGGATATGGAAAAACGAGCACAGGTA
seq-91
TTTCTTGTTTTATTTTAGCGAAGAATAGCCAGAATTCAGCAAATCGAAAAGGACATACTTCGTATACGACAGCTTTTACAGTCCCAAGCAACAGAAGCAGAGGTTAGTAAATTGCCTTTC
seq-92
CTTAACAGAGGTCATCTCAGAACAAGCATGAAACCGGCTCACATGATGCTGAGCGGCAGAATGAAGGTCAAGGAGTGGGAGAAATCAACATGGCAACTTCTGGTAATGGTCAGGTAAATA
seq-93
TAATTTTTAGGGTTCAACTACACGAATGGACCATGAAACAGCCAGTGTTTTGAGTTCTAGTAGCACACACTCTGCACCTCGAAGGCTGACAAGTCATCTGGGAACCAAGGTAACAGAAGA
seq-94
TTTTGGATATTAAAGTCGTAATTTTGTTTCTAAACTCATTTGGCCCACAGGTGGAAATGGTGTATTCATTGTTGTCAATGCTTGGTACTCATGATAAGGATGATATGTCGCGAACTTTGC
seq-95
TAGCTATGTCTAGCTCCCAAGACAGCTGTATATCCATGCGACAGTCTGGATGTCTTCCTCTCCTCATCCAGCTTTTACATGGCAATGACAAAGACTCTGTATTGTTGGGAAATTCCCGGG
seq-96
GCAGTAAAGAGGCTCGGGCCAGGGCCAGTGCAGCACTCCACAACATCATTCACTCACAGCCTGATGACAAGAGAGGCAGGCGTGAAATCCGAGTCCTTCATCTTTTGGAACAGATACGCG
seq-97
CTTACTGTGAAACCTGTTGGGAGTGGCAGGAAGCTCATGAACCAGGCATGGACCAGGACAAAAATCCAAGTATGTTCTCTATAGTGTACATCGTAGTGCATGTTTCAAAGCAAATGTGAA
seq-98
TTTATTTTTCAGTGCCAGCTCCTGTTGAACATCAGATCTGTCCTGCTGTGTGTGTTCTAATGAAACTTTCATTTGATGAAGAGCATAGACATGCAATGAATGAACTAGGTAAGACAAAAA
seq-99
TTGTTTTATTTTAGATGATTGTCTTTTTCCTCTTGCCCTTTTTAAATTAGGGGGACTACAGGCCATTGCAGAATTATTGCAAGTGGACTGTGAAATGTATGGGCTTACTAATGACCACTA
seq-100
CAGTATTACACTAAGACGATATGCTGGAATGGCTTTGACAAACTTGACTTTTGGAGATGTAGCCAACAAGGTATGTTTTTATAACATGTATTTCTTAAGATAGCTCAGGTATGAGTTAAT
2.3轻轻旋涡混匀后室温孵育5-10min。
2.4用移液枪再次吹打数次混匀后,短暂离心。
2.5将1.5mL管中的液体转移至0.2mL的PCR管中并短暂离心将液体离至管底。
2.6盖紧管盖,立即放入事先准备的PCR仪中,保持100℃热盖,按照下表程序进行反应:
3洗脱buffer的准备及链霉亲和素磁珠准备
3.1准备洗脱buffer
3.1.1按照下表配置1X working solutions(单个反应):
10x High Stringency Buffer:1XSSC,1%SDS;10x Low Stringency Buffer:10XSSC,1%SDS;10x Washing BufferⅠ:10XSSC;10x Washing BufferⅡ:1XSSC。磁珠清洗试剂包括1M NaCl,10mM Tris-HCl pH7.5,1mM EDTA,0.1%Tween-20。
3.1.2按照下表体积对稀释后的1X Low Stringency Buffer和1X HighStringency Buffer进行预热(单个反应):
3.2链霉亲和素磁珠准备
3.2.1先将链霉亲和素磁珠4℃冰柜取出放置室温孵育至少30min。
3.2.2旋涡振荡磁珠15s使其完全悬浮起来。
3.2.3对于每个杂交反应,取50μL Streptavidin Beads于0.2mL PCR管中。
3.2.4将PCR管置于磁力架上1min,至溶液澄清后吸除上清。
3.2.5将PCR管从磁力架上取出,加入100μL 1X Bead Washing Buffer,旋涡振荡30s。
3.2.6再次将PCR管置于磁力架上1min,至溶液澄清后吸除上清。
3.2.7重复步骤3.2.5和3.2.6两遍(少量的Buffer残留不会影响文库与Bead结合)。
3.2.8在每个杂交反应的磁珠中,加入按照下表组分配置的磁珠重悬液:
3.2.9轻轻振荡10s进行混匀,瞬间离心,即磁珠混合液。
4磁珠捕获及洗脱
4.1磁珠捕获
4.2洗脱
4.2.1热洗脱
4.2.1.1 PCR管中取出后应立即加入100μL预热的1X Low Stringency Buffer,轻轻振荡混匀,防止气泡产生。
4.2.1.2放置于磁力架上2min,至溶液澄清去除上清。
4.2.1.3将PCR管移除磁力架,加入150μL预热的1X High Stringency Buffer,轻轻振荡混匀,防止气泡产生。
4.2.1.4将PCR管中置于65℃孵育5min。
4.2.1.5短暂离心,将PCR管置于磁力架上2min,至溶液澄清后去除上清。
4.2.1.6重复步骤4.2.1.3~4.2.1.5一次。
4.2.2室温洗脱
4.2.2.1加入150μL室温的1X Low Stringency Buffer,轻轻振荡混匀。
4.2.2.2室温孵育2min,每隔30s,混匀一次。
4.2.2.3孵育结束后,短暂离心并置于磁力架上1min,至溶液澄清后吸除上清。
4.2.2.4将PCR管移除磁力架,加入150μL室温的1X Washing Buffer I,轻轻振荡混匀。
4.2.2.5室温孵育2min,每隔30s,混匀一次。
4.2.2.6孵育结束后,短暂离心并置于磁力架上1min,至溶液澄清后吸除上清。
4.2.2.7将PCR管移除磁力架,加入150μL室温的1X Washing Buffer II,轻轻振荡混匀。
4.2.2.8室温孵育2min,每隔30s,混匀一次。
4.2.2.9孵育结束后,短暂离心并置于磁力架上1min,至溶液澄清后吸除上清。
4.2.2.10加入20μL Nuclease-Free Water,用移液枪上下吹打数次,将磁珠。完全重悬。
5 Post-Capture PCR
5.1按照下表配制扩增体系:
MGI 10X PCR Primers(for MBD)序列:
GACTATTCCAGCGGTACG
GACGACTGCATGACTCTC
MGI UDB Primers(for MBS)序列:
TGTGAG+C+CAAGG+AGTTG
GAA+CGA+CATGG+CTA+CGA
5.2涡旋振荡,瞬时离心至管底部。然后,立即进行PCR反应程序,如下表所示:
5.3 PCR反应结束后,直接进行产物纯化。
5.4在每个样本管中加75μL(1.5倍体积)的AMPure XP磁珠,用移液器吹打或者振荡充分混匀。
5.5放置在室温下孵育5min后,转移到磁力架上室温孵育2min左右。
5.6待溶液澄清后,小心吸走并丢弃上清,千万不要吸走或触碰到磁珠。
5.7使用150μL 80%乙醇漂洗磁珠30s,然后小心吸走并丢弃乙醇,千万不要吸走或触碰到磁珠。
5.8重复步骤5.7。
5.9将磁珠在室温下晾干5min至磁珠表面不反光即可(磁珠不要过度干燥)。
5.10移走磁力架,在每个样本管中加入21μL超纯水重悬磁珠,用移液器吹打或者振荡充分混匀,室温孵育1min。
5.11再将每个样品管放置在磁力架上室温下孵育2min,至溶液澄清。
5.12小心吸走20μL上清液,并转移到一个新的PCR管。
6.文库定量和测序
对上述文库用Qubit3.0进行定量检测,并送解码(上海)生物医药科技有限公司测序。
7.测序结果分析
本次针对MGI单端和双端文库结构,分别测试了4组不同的封闭序列,同时测试了市场上的产品作为对照,进行平行比较,分析6个子文库的捕获效率、重复率、均一性和平均有效测序深度等指标(如下表所示),结果表明:
7.1反向序列无修饰,使用Panel1捕获测试,捕获效率平均为62.90%左右;
7.2反向序列,C3修饰,使用Panel1捕获测试,捕获效率平均为64.13%左右;
7.3正向序列,MGB修饰,使用Panel1捕获测试,捕获效率平均为64.44%左右;
7.4正向序列,C3修饰,使用Panel1捕获测试,捕获效率平均为66.33%左右;
7.5商业MGI单端Blocker(泓迅生物),使用Panel1捕获测试,捕获效率平均为35.1%左右;
针对MGI双端文库结构,分别测试了4组不同的封闭序列,同时测试了市场上的产品作为对照,进行平行比较,分析6个子文库的捕获效率、重复率、均一性和平均有效测序深度等指标(如下表所示),结果表明:
8.1反向序列无修饰,使用Panel1捕获测试,捕获效率平均为72.73%左右;
8.2反向序列,C3修饰,使用Panel1捕获测试,捕获效率平均为71.87%左右;
8.3正向序列,MGB修饰,使用Panel1捕获测试,捕获效率平均为63.24%左右;
8.4正向序列,C3修饰,使用Panel1捕获测试,捕获效率平均为61.75%左右;
8.5商业MGI双端Blocker(伯科生物),使用Panel1捕获测试,捕获效率平均为49.94%左右;
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海英基生物科技有限公司
<120> 一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagtcggatc gtagccatgt cgttc 25
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtcggaggc caagcggtct taggaagaca acaactcctt ggctcaca 48
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaacgacatg gctacgatcc gacttmgb 28
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtgagccaa ggagttgttg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 49
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagtcggatc gtagccatgt cgttc 25
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtcggaggc caagcggtct taggaagaca acaactcctt ggctcaca 48
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaacgacatg gctacgatcc gactt 25
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtgagccaa ggagttgttg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 49
<210> 9
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctctcagtac gtcagcagtt caactccttg gctcacagaa cgacatggct acgatccgac 60
tt 62
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcatggcgac cttatcagtt gtcttcctaa gaccgcttgg cctccgactt 50
<210> 11
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctctcagtac gtcagcagtt caactccttg gctcacagaa cgacatggct acgatccgac 60
tt 62
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcatggcgac cttatcagtt gtcttcctaa gaccgcttgg cctccgactt 50
<210> 13
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagtcggatc gtagccatgt cgttctgtga gccaaggagt tgaactgctg acgtactgag 60
ag 62
<210> 14
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agtcggaggc caagcggtct taggaagaca actgataagg tcgccatgc 49
<210> 15
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagtcggatc gtagccatgt cgttctgtga gccaaggagt tgaactgctg acgtactgag 60
ag 62
<210> 16
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agtcggaggc caagcggtct taggaagaca actgataagg tcgccatgc 49
Claims (7)
1.一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂,其特征在于:封闭序列与PCR Primer序列反向互补,且采用锁核苷酸修饰;封闭序列3’端封闭无需修饰;
当封闭序列针对MGI单端index文库,选自组合UM5B和UM7B:
UM5B:AAGT+CGGAT+CGTAG+CCATGT+CGTTC;
UM7B:AGT+CGGAGGC+CAAG+CGGT+CTTAGGAAGA+CAAIIIIIIIIII+CAACTC+CTTGG+CT+CACA;
其中,+N表示锁核苷酸修饰,N表示C或T,I表示次黄嘌呤;
当封闭序列针对MGI双端index文库,选自组合C-M-B-D5和C-M-B-D6:
C-M-B-D5:AAGT+CGGAT+CGTAGC+CATGT+CGTTC+TGTGAG+CCAAGGAGTTGIIIIIIIIIIAA+CTGCTGA+CGTA+CTGAGAG;
C-M-B-D6:AGT+CGGAGG+CCAAG+CGGT+CTTAGGAAGA+CAAIIIIIIIIII+CTGATAAGGT+CGCCATG+C;
其中,+N表示锁核苷酸修饰,N表示C或T,I表示次黄嘌呤。
2.一种捕获试剂盒,其特征在于,包含如权利要求1所述的通用封闭试剂。
3.根据权利要求2所述的一种捕获试剂盒,其特征在于,还包括:杂交试剂、捕获探针、捕获磁珠和磁珠清洗试剂、洗脱试剂和PCR扩增试剂。
4.根据权利要求3所述的一种捕获试剂盒,其特征在于:所述杂交试剂包括杂交缓冲液和杂交缓冲液增强剂;所述杂交缓冲液包括2x SSPE、5x Denhandt’s、2mM EDTA、0.02%SDS、2M甜菜碱、1M四甲基氯化铵、10%硫酸葡聚糖;所述杂交缓冲液增强剂包括甲酰胺和硫氰酸胍。
5.根据权利要求4所述的一种捕获试剂盒,其特征在于:所述捕获磁珠为链霉素亲和磁珠。
6.根据权利要求2所述的一种捕获试剂盒,其特征在于:还包括Human Cot DNA。
7.如权利要求1所述的通用封闭试剂、或权利要求2-6任一所述的试剂盒在目标序列杂交捕获中的应用。
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