CN108676846A - 一种桥式寡核苷酸在文库目标区域捕获中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改良的序列捕获方法,所述方法包括:1)提取DNA,打断;2)将所述打断的DNA的两端与接头连接,所述打断的DNA一端的接头序列远端包括长度6‑8nt的标签序列;3)将所述连接接头的DNA进行Pre‑PCR反应;4)将探针与封闭试剂混合,对所述Pre‑PCR反应进行捕获,所述封闭试剂包括与打断的DNA之外的序列互补的封闭序列,其中所述标签序列处用同样长度的C3间臂封闭;5)杂交捕获后PCR扩增。本发明的桥式封闭设计策略,分别对插入片段的两端的接头序列设计对应的封闭序列,对于中间部分的标签序列采取用C3间臂进行桥式连接,节约成本和简化文库构建过程中的繁琐性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,更具体而言,本发明公开了一种桥式寡核苷酸在文库目标区域捕获中的应用。
背景技术
在文库构建过程中,往往会引入一些插入片段以外的序列,而这些序列对上机测序、样本区分和追溯原始DNA分子的来源有着重要的意义。然而在杂交捕获过程中需要将这些插入片段以外的非目标序列进行有效封闭,封闭掉这些序列的意义在于,防止在杂交过程中,探针与这些目标区域外的序列进行非特异性结合。同时也需要对标签序列进行有效封闭,否则不同插入片段的文库会通过与标签序列之间进行退火,引起大量文库片段非特异性结合在一起,这样会带来非特异性捕获的严重后果。目前针对于接头和标签序列的封闭采用的是对通用序列和标签序列同时进行封闭,然而对标签序列上的随机碱基采用的是一一对应的封闭策略,一般标签序列的碱基数目为6-8个,根据每次构建文库的个数,一般选择标签序列的种类为96种,用于标签序列的随机碱基数目一般为4-8个,标签序列的种类为44-48种。这样需要设计一一对应的封闭序列的种类为:3×46-3×410。按照这个数量级来合成封闭序列所需要数额成本,具有极大的不可操作性。并且在建库过程中加入对应96种标签序列的封闭序列,增加了建库过程中实验操作的繁琐性。
为了控制成本,也有人提出针对标签序列的封闭采取对相应数目次黄嘌呤来进行封闭的策略,然而次黄嘌呤对封闭的碱基具有一定的偏好性,造成了对有些标签序列封闭效果差,进而影响了捕获率,同时合成次黄嘌呤成本比较昂贵。
因此,本领域中需要一种对带有标签序列的接头序列进行有效封闭的新策略。
发明内容
为了节约成本和简化文库构建过程中的繁琐性,发明人提出了一种桥式封闭设计策略,分别对插入片段两端的接头序列设计对应的封闭序列,对于中间部分的标签序列采取用6-8个C3间臂进行桥式连接。
因此,本发明提供了一种改良的序列捕获方法,所述方法包括:
1)提取DNA,打断DNA片段大小范围为160bp-180bp,优选末端修复和3’端加“A”;
2)将所述打断的DNA的两端与接头连接,所述打断的DNA一端的接头序列远端包括长度6-8nt的第一标签序列,优选在所述DNA另一端的接头序列远端包括长度6-8nt的第二标签序列;
3)利用所述接头序列的互补序列将所述连接接头的DNA进行Pre-PCR反应,优选通过所述Pre-PCR在所述连接接头的DNA两端引入测序接头序列;
4)将探针与封闭试剂混合,对所述Pre-PCR反应产物进行杂交捕获,
所述封闭试剂包括与打断的DNA之外的序列互补的封闭序列,其中所述第一标签序列处用同样长度的C3间臂进行封闭,优选与所述第二标签序列处用同样长度的C3间臂封闭;
5)杂交捕获后PCR扩增,利用所述接头序列的互补序列。
在一个实施方案中,其中在2)中,将所述打断的DNA的两端与两个接头分别连接,成线形DNA分子。
在一个实施方案中,其中在2)中,将所述打断的DNA的两端与一个接头的两端分别连接,成环形DNA分子。
在一个实施方案中,其中在4)中,所述探针与目标序列互补配对序列长度一般为80-120bp,优选100bp,用于获取目标区域序列。
在一个实施方案中,其中在4)中,所述探针包括两翼固定长度序列,其长度一般为10-30bp,优选15bp,用于扩增大量可以用于捕获的探针。
在一个实施方案中,其中在2)中,
所述接头是:
Adapter-1:ACCGAGATCT[标签序列]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQID NO.2),
Adapter-2:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.11);
其中在3)中,将所述带有接头的DNA进行Pre-PCR反应;
引物是:
PE1.0:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO.1);
PE2.0:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGT;
其中在4)中,
所述探针序列:TGCCTCTTTATCTGT(SEQ ID NO.20)(探针左翼固定序列)+与目标序列配对序列+CATTTCCGATACACC(SEQ ID NO.21)(探针右翼固定序列)
所述封闭寡核苷酸序列:
a-1:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT+6-8个C3间臂+GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ ID NO.5);
a-2:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)+6-8个C3间臂+GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10)
b-1:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO.1)+6-8个C3间臂+ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.2);
b-2:AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCA+6-8个C3间臂+GTCACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO.4);
其中在5)中,所述引物是:
P5:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO.12),
P7:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO.13)。
在一个实施方案中,其中在2)中,
所述接头是:
5′-/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCUACACTCTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQ ID NO.19);
其中在3)中,所述引物是:标签序列引物:
5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10)-3′;
Universal PCR引物:
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQID NO.18);
其中在4)中,所述探针序列:TGCCTCTTTATCTGT(SEQ ID NO.20)(探针左翼固定序列)+与目标序列配对序列+CATTTCCGATACACC(SEQ ID NO.21)(探针右翼固定序列)
所述封闭寡核苷酸序列:
a-1:AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.3)+6-8个C3间臂+ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO.4),
a-2:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCT(SEQID NO.18),
b-1:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)+6-8个C3间臂+GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10),
b-2:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ IDNO.14);
其中在5)中,所述引物是:标签序列引物:5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ IDNO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10)-3′;UniversalPCR引物:
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQID NO.18)。
本发明方法的优点在于:
通过设计6-8个C3间臂占据6-8随机碱基的位置,目的为了让标签序列和标签序列两端的接头序列与封闭序列更好地结合。与其它封闭序列相比,这样设计的优点有以下几点:
(1)本发明中设计的桥式封闭寡核苷酸序列应用范围广,适合于Illumina、NEB和Ion Torrent等多种测序平台。
(2)桥式封闭尤其适合于低频突变的检测,原因在于一般选择标签序列的种类为96种,标签序列的随机碱基数目为4-8个,标签序列的种类为44-48种。这样需要设计一一对应的封闭序列的种类为:3×46-3×410。按照这个数量级来合成封闭序列需要巨额成本,具有极大现实应用的局限性。而桥式封闭只需要设计一段6-8个C3间臂与标签序列和标签序列两端接头序列互补配对的寡核苷酸链进行连接,这样省去了设计的复杂性和对成本的可控性。
(3)在捕获过程中,如果使用与标签序列一一对应的封闭序列,需要记录每个文库对应的标签序列编号,找到对应的封闭序列,这样会造成实验操作的繁琐性,同时还容易带来实验错误。而通过使用桥式封闭寡核苷酸链进行封闭,只需要保证每个文库中都加入封闭序列,不需要一一进行核对,这样简化了实验操作流程。
附图说明
通过以下附图对本发明进行说明,
图1是桥式-block的示意图;
图2是U-block的示意图。
具体实施方式
在本发明中,标签(index)序列用于区分不同的样品,或者用于区分不同DNA分子,一个DNA片段上也可以带两个标签序列用于区分不同样品和不同DNA分子,或者多个标签序列。一般而言,标签序列可以为6-8nt的特异性序列。这类序列的选取遵循一般的特异性序列选取规则即可,例如GC含量不能过高,连续相同碱基不能超过三个,与基因组序列不一致等。标签序列可以与接头一块引入至DNA片段上,也可以通过PCR时的引物序列引入至DNA片段上。同一个DNA片段上的两个或多个标签序列可以通过相同方式或不同方式,例如通过接头和PCR引物,引入到DNA片段上。
在本发明中,打断的DNA一端的接头序列远端是至接头序列上非与打断DNA连接的一端。
在本发明中,接头序列的组成部分包括:与测序芯片上结合互补序列,目的间接用于固定上机测序的文库,标签序列用于区分不同样本,或者用于区分插入的不同DNA分子,测序引物对应的互补序列,间接用于测序过程中对插入一定长度的片段进行测序。接头序列的选择同样根据常规方法设计即可,例如GC含量不能过高,与基因组序列不一致等。
在本发明中,对于中间部分的标签序列采取用C3间臂进行桥式连接,目的在于防止中间部分的标签序列由于缺少碱基互补配对而形成泡状结构,影响了两端的block与相应的接头序列结合不牢固情况的发生。C3间臂的长度与标签序列的长度相同。当引入C3间臂时,可以更好地调节两端封闭(block)至适当的位置,同时这种修饰有效地去除了磷酸骨架上静电斥力的影响。这样加强了两端封闭序列与相应接头序列的紧密结合,从而起到最优的封闭效果。通过对本发明的桥式封闭的应用,极大地缩短了捕获过程中的操作时间,并且简化了繁琐的操作步骤。
尤其对于cfDNA这种低频突变的样品来说,本发明的桥式封闭方法更具有现实意义。由于在文库构建过程中,高保真酶的复制错误率为10-6,错误率还会随着循环数的增加而增加,同时在测序过程中,仪器对碱基的读错率为0.01%-1%之间,这样很难区分突变率在1%以下的突变,而在cfDNA样品中突变率在1%以下时,对临床用药和耐药机制的产生都具有一定指导意义。为了检测出这些低频突变,需要通过设计标签序列的策略来排除这些背景干扰。然而本发明通过桥式封闭寡核苷酸可以简单有效地针对带有标签序列的文库进行有效封闭,通过对建库产物和下机测序数据的分析,发现文库产量和捕获率都有大幅度的提高。由于捕获率的提高,在仅需要检测少量数据的情况下,便可以检测出突变频率在1%以下的突变信息。
在本发明中,碳臂被用来研究双螺旋的形成,产生一个核苷酸与另外一个修饰核苷酸之间的空间位阻,对3'OH进行修饰,具有阻止链延伸等作用。碳臂通常分别C3、C6、C9、C12和C18等,考虑到本发明研究目的优选C3,一个C3相当于一个碱基,标签序列优选6-8个,因此我们优选6-8个C3作为碳臂来形成合适的空间位阻,调节两端的封闭序列与相应的接头序列进行结合。C3间臂(spacer C3)为封闭基团,用于阻止探针自连后的扩增。C3间臂主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔,或“替代”一个序列中未知碱基。3'-C3间臂用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用,由序列合成公司提供。
实施例:
实施例1——Illumina测序平台建库过程:
1.文库结构和封闭寡核苷酸结构
1)Illumina测序平台prePCR文库结构:为了清晰表示,显示了正反两条链,两条序列的结构如下:
a(5’至3’):AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO.1)[标签序列]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.2)[与目标序列配对序列]AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.3)[标签序列]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO.4)
b(3’至5’):TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTG(SEQ ID NO.5)[标签序列]TGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGA(SEQ ID NO.6)[与目标序列配对序列]TCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTG(SEQ ID NO.7)[标签序列]TAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC(SEQ ID NO.8)
与目标序列配对序列长度80-120bp,优选100bp。
2)Illumina测序平台的封闭寡核苷酸序列:
a-1:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(B’)+6-8个C3间臂+GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ ID NO.5),封闭文库上的AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO.1)[标签序列]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.2)序列;
a-2:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)+6-8个C3间臂+GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10),封闭文库上的AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.3)[标签序列]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO.4)序列;
b-1:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO.1)+6-8个C3间臂+ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.2)封闭文库上的TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTG(A’)[标签序列]TGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGA(SEQ ID NO.6)序列;
b-2:AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.3)+6-8个C3间臂+ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO.4)封闭文库上的TCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTG(SEQ ID NO.7)[标签序列]TAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC(SEQ ID NO.8)序列;
2.Illumina测序平台文库构建方法:
以cfDNA的标准品HD780(horizon公司)为例进行建库,片段大小范围为160bp-180bp。
1)对HD780进行末端修复和3’端加“A”
(1)简短震荡离心,将PCR管放回冰盒上,立即进行下步实验;
(2)运行PCR仪程序,设置PCR仪参数。热盖温度设置85℃;加热模块设置20℃,时间30分钟;65℃,时间30分钟;
(3)将PCR管放入PCR仪,运行程序;程序运行完成后立即进行下步连接反应。
2)接头连接
接头序列如下:
Adapter-1:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.2),
Adapter-2:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.11);
反应体系如下:
反应步骤如下:
(1)轻轻吸打混匀6次,避免产生气泡,然后短暂离心;
(2)运行PCR仪程序(要求无热盖),设置PCR仪参数,加热模块设置20℃,时间15分钟。将PCR管放入PCR仪,运行程序;
(3)将磁珠拿至室温提前震荡混合均匀,室温孵育30分钟备用;
(4)在(2)步骤进行完的PCR管中,按照0.8X体积的纯化磁珠进行实验;
(5)轻轻吸打混匀6次;
(6)室温静置孵育5min,将PCR管置于磁力架上3min;
(7)将PCR管置于磁力架上,3分钟移除上清,向PCR管内加入200μl 80%乙醇溶液,静置30秒后彻底移除上清。
(8)将PCR管继续放置在磁力架上,向PCR管内加入200μl 80%乙醇溶液,静置30s后彻底移除上清。
(9)室温静置3-5分钟,使残留乙醇彻底挥发;
(10)把PCR管从磁力架取下,加入22ul的H2O轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡,室温静置5分钟;
(11)将PCR管置于磁力架上2分钟;
(12)用移液器吸取20μl上清液,用于下一步的PCR扩增。
3)Pre-PCR反应
引物序列:
PE1.0:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO.1);
PE2.0:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGT;
反应体系:
反应步骤如下:
(1)使用移液器轻轻吹打混匀,然后短暂离心;
(2)将样品置于PCR仪上,启动PCR程序,如下:
热盖加热100℃
95℃,45秒
12个循环:
98℃,15秒
60℃,30秒
72℃,30秒
72℃,1分钟
4℃保持
4)PCR扩增后纯化
(1)向PCR产物中加入50μl磁珠,用移液器吹打混匀,避免产生气泡;
(2)室温孵育5分钟,把PCR管置于磁力架上2-3分钟;
(3)移除上清,PCR管继续放置在磁力架上,向PCR管内加入200μl 80%乙醇溶液,静置30s;
(4)移除上清,再向PCR管内加入200μl 80%乙醇溶液,静置30秒后彻底移除上清。
(5)室温静置5分钟,使残留乙醇彻底挥发;
(6)加入25ulH2O,将离心管从磁力架取下,使用移液器轻轻吸打重悬磁珠;
(7)室温静置5分钟,将200μl PCR管置于磁力架上2分钟;
(8)用移液器将上清液转移至一个新的200μl PCR管中(置于冰盒上),在反应管上标记好样本号,准备下一步反应;
5)样品、探针杂交
按照以下体系将4)获得产物与封闭试剂充分混匀,标记为B
所述探针序列:TGCCTCTTTATCTGT(SEQ ID NO.20)(探针左翼固定序列)+与目标序列配对序列+CATTTCCGATACACC(SEQ ID NO.21)(探针右翼固定序列)
反应体系:
反应步骤:
(1)将准备好的样品和封闭试剂混合物放入真空浓缩离心机,打开PCR管盖,启动离心机,打开真空泵开关,开始浓缩;
(2)将抽干的样品重新溶在9ul H2O中待用;
(3)将杂交缓冲液置于室温融化,未加热前会有沉淀出现,混匀后置于65℃水浴锅内预热,完全溶解后取20ul杂交缓冲液置于新的200μlPCR管内,盖好管盖,标记为A,继续置于65℃水浴锅内孵育待用;
(4)取5ul RNase封闭阻断剂与2ul探针置于200μlPCR管内,轻轻吸打混匀,短暂离心后置于冰上待用,标记为C;
(5)设置PCR仪参数,热盖加热100℃,95℃,5分钟;65℃,维持;
(6)将PCR管B置于PCR仪上,运行以上程序;
(7)当PCR仪温度降至65℃时,将PCR管A置于PCR仪上孵育,盖上PCR仪热盖;
(8)5分钟后,将C置于PCR上孵育,盖上PCR仪热盖;
(9)将PCR管C放置入PCR仪2分钟后,把移液器调至13ul,从PCR管A中吸取13ul杂交缓冲液移至PCR管C中,吸取全部PCR管B中样品移至PCR管C中,轻轻吸打10次,充分混匀,避免产生大量气泡,密封管盖,盖上PCR仪热盖,65℃孵育过夜(8-16h)。
6)捕获磁珠准备
(1)将磁珠从4℃取出,涡旋震荡重悬;
(2)取50ul磁珠置于新的PCR管内,置于磁力架上1分钟,移除上清;
(3)从磁力架上取下PCR管,加入200μL结合缓冲液轻轻吸打数次混匀,重悬磁珠;
(4)置磁力架上1分钟,移除上清;
(5)重复步骤3-4两次,共清洗磁珠3次;
(6)从磁力架上取下PCR管,加入200μL结合缓冲液,轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
7)获取目标区域DNA文库
(1)保持杂交产物PCR管C在PCR仪上,将步骤6)获得中重悬后的200μL磁珠加入到杂交后的产物PCR管C中,用移液器吸打6次混匀,置于旋转混匀仪上室温结合30分钟;
(2)将PCR管置于磁力架上2分钟,移除上清液;
(3)向PCR管C内加入200μL的洗脱缓冲液1,轻轻吸打6次混匀,置于旋转混匀仪上清洗15分钟,然后短暂离心,将PCR管放于磁力架上2分钟,移除上清;
(4)加入200ul的65℃预热的洗脱缓冲液2,涡旋混匀5秒,置于ThermoMixer上65℃孵育10分钟,转速800转/分钟进行清洗;
(5)短暂离心,将PCR管放于磁力架上2分钟,移除上清。重复清洗2次,共计3次。最后一次彻底移除除洗脱缓冲液2(可用10ul移液器移除残留);
(6)PCR管继续置于磁力架上,向PCR管内加入200ul 80%乙醇,静置30秒后彻底移除乙醇溶液(可用10ul移液器移除残留),室温晾干2分钟;
(7)向PCR管加入20μL H2O,从磁力架上取下PCR管,轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
8)Post-PCR反应
(1)捕获后需要对DNA文库进行富集,根据下表配制Mix
引物序列:
P5:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO.12),
P7:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO.13)。
(2)将移液器调至35ul,轻轻吸打混匀6次,然后置于PCR仪上。
(3)运行PCR仪程序:
热盖加热 100℃
95℃ 4分钟
15个循环:
98℃ 20秒
65℃ 30秒
72℃ 30秒
72℃ 5分钟
12℃ 维持
(4)PCR结束后向样品加入45μl磁珠,用移液器轻轻吸打6次混匀;
(5)室温孵育5分钟,把PCR管置于磁力架上3分钟;
(6)移除上清,PCR管继续置于磁力架上,加入200μl 80%无水乙醇,静置30秒;
(7)移除上清,再向PCR管内加入200μl 80%无水乙醇,静置30后彻底移除上清(可用10ul移液器移除底部残留酒精);
(8)室温放置5分钟,使得残留乙醇彻底挥发;
(9)加入25ul H2O,将PCR管从磁力架拿下,轻轻吹打混匀重悬磁珠,室温放置2分钟;
(10)将PCR管置于磁力架上2分钟;
(11)用移液器转移23μl上清液至1.5ml离心管,标记样品信息;
9)捕获文库产量和测序结果分析:
表-1:
封闭寡核苷酸 | 次黄嘌呤-block | U-block | 桥式-block |
panel名称 | T040v19 | T040v19 | T040v19 |
目标区域大小 | 79165 | 79165 | 79165 |
文库产量 | 55ng | 35ng | 90ng |
捕获率 | 43% | 39% | 46% |
测10000层所需数据量 | 2.6G | 3.3G | 1.7G |
表-2:
T040V19panel大小为67.29K,目标区域设计探针的条数为3013,覆盖区域大小为77662bp,包括EGFR,KRAS,NRAS和PIK3CA等8个基因,突变位点涉及EGFRL858R,EGFRDelE746-A750,EGFRT790M,EGFRV769-D770insASV,KRASG12D,NRASQ61K,NRASA59T和PIK3CAE454K等位点。
次黄嘌呤封闭法虽然可以对任何分子标签进行封闭,但是会对封闭的碱基具有一定的偏好性,造成了对有些标签序列封闭效果差,进而影响了捕获率,同时合成次黄嘌呤成本比较昂贵。
桥式-block为本发明的通用封闭,通过一定长度的C3间臂作为桥梁,调节两端的封闭序列到合适的位置与所要封闭的接头序列进行紧密结合,对非目标区域的序列起到了很好的封闭效果。图1是桥式-block的示意图,由图1可以看出,桥式-block为本发明的通用封闭block,通过适当长度的C3间臂作为桥梁把A’和B’两端与接头上的A和B互补的寡核苷酸连接起来,调节两端的封闭序列与所要封闭的接头序列A和B进行紧密结合,对非目标区域的序列起到了很好的封闭效果。同理D’和F’两端与接头上的D和F互补的寡核苷酸连接起来,起到同样很好的封闭效果。
U-block为分段式封闭,对标签序列不做任何封闭,只对标签序列前后两段接头序列分别进行封闭。图2是U-block的示意图,由图2可以看出,U-block为分段式封闭,A’和B’两端与接头上的A和B互补的寡核苷酸进行互补配对,只对标签序列前后两段接头序列分别进行封闭,同理D’和F’两端与接头上的D和F进行互补配对,通过这种方式设计的block,在对文库进行封闭的过程中,中间的标签序列会产生泡状结构,导致两端的封闭序列A’,C’,D’和F’与A,C,D和F在配对过程中发生错位,不能对插入片段以外的序列进行很好封闭,同时不同文库序列会通过标签序列之间进行退火,会形成“daisy chain”这样会捕获到大量非特异性序列的严重后果。
次黄嘌呤-block和U-block的实验过程与桥式-block的实验过程完全一致。
从表-1可以看出,在杂交捕获过程中,通过桥式-block对文库封闭的效果最好,体现在文库产量和捕获率分别为90ng和46%,而次黄嘌呤-block对文库的封闭效果次之,文库产量和捕获率分别为55ng和43%,U-block对文库封闭的效果最差,文库产量和捕获率分别为35ng和39%。
从表-2可以看出桥式-block方法可以检测出HD780标准品中0.1%突变频率,并结合表-1发现桥式-block方法仅需要1.7G的数据量,便可以检测到0.1%突变频率。而对于次黄嘌呤-block和U-block需要2.6-3.3G的数据量测才可以检测到0.1%突变频率,并且很难检测到indel突变形式。
实施例2——NEB测序平台建库过程
1.文库结构和封闭寡核苷酸结构
1)NEB测序平台prePCR文库结构:为了清晰表示,显示了正反两条链,双链两条序列的结构如下:
a(5’至3’):
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10)[与目标序列配对序列]AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ ID NO.14)
b(3’至5’):
GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTA(SEQ ID NO.15)[标签序列]CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGA(SEQ ID NO.16)[与目标序列配对序列]TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA(SEQ ID NO.17)
与目标序列配对序列长度80-120bp,优选100bp。
2)NEB测序平台封闭寡核苷酸序列:
a-1:AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.3)+6-8个C3间臂+ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO.4),封闭文库上的CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10)序列;
a-2:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO.18)封闭文库上的AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ ID NO.14)序列;
b-1:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)+6-8个C3间臂+GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10),封闭文库上的GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTA(SEQ ID NO.15)[标签序列]CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGA(SEQ ID NO.16)序列;
b-2:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ IDNO.14)封闭文库上的TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA(SEQ ID NO.17)序列。
2.NEB测序平台文库构建方法:
以cfDNA的标准品HD780(horizon公司)为例进行建库,片段大小范围为160bp-180bp。
1)对HD780进行末端修复和3’端加“A”
(1)简短震荡离心,将PCR管放回冰盒上,立即进行下步实验;
(2)运行PCR仪程序,设置PCR仪参数。热盖温度设置85℃;加热模块设置20℃,时间30分钟;65℃,时间30分钟;
(3)将PCR管放入PCR仪,运行程序;程序运行完成后立即进行下步连接反应。
2)接头连接
接头序列如下:
接头序列如下:
5′-/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCUACACTCTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQ ID NO.19);
反应体系如下:
反应步骤如下:
(1)轻轻吸打混匀6次,避免产生气泡,然后短暂离心;
(2)运行PCR仪程序(要求无热盖),设置PCR仪参数,加热模块设置20℃,时间15分钟。将PCR管放入PCR仪,运行程序;
(3)将磁珠拿至室温提前震荡混合均匀,室温孵育30分钟备用;
(4)在(2)步骤进行完的PCR管中,按照0.8X体积的纯化磁珠进行实验;
(5)轻轻吸打混匀6次;
(6)室温静置孵育5min,将PCR管置于磁力架上3min;
(7)将PCR管置于磁力架上,3分钟移除上清,向PCR管内加入200μl 80%乙醇溶液,静置30秒后彻底移除上清。
(8)将PCR管继续放置在磁力架上,向PCR管内加入200μl 80%乙醇溶液,静置30s后彻底移除上清。
(9)室温静置3-5分钟,使残留乙醇彻底挥发;
(10)把PCR管从磁力架取下,加入22ul的H2O轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡,室温静置5分钟;
(11)将PCR管置于磁力架上2分钟;
(12)用移液器吸取20μl上清液,用于下一步的PCR扩增。
3)Pre-PCR反应
引物序列:
标签序列引物:5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10)-3′;
Universal PCR引物:
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQID NO.18);
反应体系:
反应步骤如下:
(1)使用移液器轻轻吹打混匀,然后短暂离心;
(2)将样品置于PCR仪上,启动PCR程序,如下:
热盖加热100℃
95℃,45秒
12个循环:
98℃,15秒
60℃,30秒
72℃,30秒
72℃,1分钟
4℃保持
4)PCR扩增后纯化
(1)向PCR产物中加入50μl磁珠,用移液器吹打混匀,避免产生气泡;
(2)室温孵育5分钟,把PCR管置于磁力架上2-3分钟;
(3)移除上清,PCR管继续放置在磁力架上,向PCR管内加入200μl 80%乙醇溶液,静置30s;
(4)移除上清,再向PCR管内加入200μl 80%乙醇溶液,静置30秒后彻底移除上清。
(5)室温静置5分钟,使残留乙醇彻底挥发;
(6)加入25ulH2O,将离心管从磁力架取下,使用移液器轻轻吸打重悬磁珠;
(7)室温静置5分钟,将200μl PCR管置于磁力架上2分钟;
(8)用移液器将上清液转移至一个新的200μl PCR管中(置于冰盒上),在反应管上标记好样本号,准备下一步反应;
5)样品、探针杂交
按照以下体系将4)获得产物与封闭试剂充分混匀,标记为B
所述探针序列:TGCCTCTTTATCTGT(SEQ ID NO.20)(探针左翼固定序列)+与目标序列配对序列+CATTTCCGATACACC(SEQ ID NO.21)(探针右翼固定序列)
反应体系:
反应步骤:
(1)将准备好的样品和封闭试剂混合物放入真空浓缩离心机,打开PCR管盖,启动离心机,打开真空泵开关,开始浓缩;
(2)将抽干的样品重新溶在9ul H2O中待用;
(3)将杂交缓冲液置于室温融化,未加热前会有沉淀出现,混匀后置于65℃水浴锅内预热,完全溶解后取20ul杂交缓冲液置于新的200μlPCR管内,盖好管盖,标记为A,继续置于65℃水浴锅内孵育待用;
(4)取5ul RNase封闭阻断剂与2ul探针置于200μlPCR管内,轻轻吸打混匀,短暂离心后置于冰上待用,标记为C;
(5)设置PCR仪参数,热盖加热100℃,95℃,5分钟;65℃,维持;
(6)将PCR管B置于PCR仪上,运行以上程序;
(7)当PCR仪温度降至65℃时,将PCR管A置于PCR仪上孵育,盖上PCR仪热盖;
(8)5分钟后,将C置于PCR上孵育,盖上PCR仪热盖;
(9)将PCR管C放置入PCR仪2分钟后,把移液器调至13ul,从PCR管A中吸取13ul杂交缓冲液移至PCR管C中,吸取全部PCR管B中样品移至PCR管C中,轻轻吸打10次,充分混匀,避免产生大量气泡,密封管盖,盖上PCR仪热盖,65℃孵育过夜(8-16h)。
6)捕获磁珠准备
(1)将磁珠从4℃取出,涡旋震荡重悬;
(2)取50ul磁珠置于新的PCR管内,置于磁力架上1分钟,移除上清;
(3)从磁力架上取下PCR管,加入200μL结合缓冲液轻轻吸打数次混匀,重悬磁珠;
(4)置磁力架上1分钟,移除上清;
(5)重复步骤3-4两次,共清洗磁珠3次;
(6)从磁力架上取下PCR管,加入200μL结合缓冲液,轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
7)获取目标区域DNA文库
(1)保持杂交产物PCR管C在PCR仪上,将步骤6)获得中重悬后的200μL磁珠加入到杂交后的产物PCR管C中,用移液器吸打6次混匀,置于旋转混匀仪上室温结合30分钟;
(2)将PCR管置于磁力架上2分钟,移除上清液;
(3)向PCR管C内加入200μL的洗脱缓冲液1,轻轻吸打6次混匀,置于旋转混匀仪上清洗15分钟,然后短暂离心,将PCR管放于磁力架上2分钟,移除上清;
(4)加入200ul的65℃预热的洗脱缓冲液2,涡旋混匀5秒,置于ThermoMixer上65℃孵育10分钟,转速800转/分钟进行清洗;
(5)短暂离心,将PCR管放于磁力架上2分钟,移除上清。重复清洗2次,共计3次。最后一次彻底移除除洗脱缓冲液2(可用10ul移液器移除残留);
(6)PCR管继续置于磁力架上,向PCR管内加入200ul 80%乙醇,静置30秒后彻底移除乙醇溶液(可用10ul移液器移除残留),室温晾干2分钟;
(7)向PCR管加入20μL H2O,从磁力架上取下PCR管,轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
8)Post-PCR反应
(1)捕获后需要对DNA文库进行富集,根据下表配制Mix
所述引物是:标签序列引物:5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10)-3′;Universal PCR引物:
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQID NO.18)。
(2)将移液器调至35ul,轻轻吸打混匀6次,然后置于PCR仪上。
(3)运行PCR仪程序:
热盖加热 100℃
95℃ 4分钟
15个循环:
98℃ 20秒
65℃ 30秒
72℃ 30秒
72℃ 5分钟
12℃ 维持
(4)PCR结束后向样品加入45μl磁珠,用移液器轻轻吸打6次混匀;
(5)室温孵育5分钟,把PCR管置于磁力架上3分钟;
(6)移除上清,PCR管继续置于磁力架上,加入200μl 80%无水乙醇,静置30秒;
(7)移除上清,再向PCR管内加入200μl 80%无水乙醇,静置30后彻底移除上清(可用10ul移液器移除底部残留酒精);
(8)室温放置5分钟,使得残留乙醇彻底挥发;
(9)加入25ul H2O,将PCR管从磁力架拿下,轻轻吹打混匀重悬磁珠,室温放置2分钟;
(10)将PCR管置于磁力架上2分钟;
(11)用移液器转移23μl上清液至1.5ml离心管,标记样品信息;
9)捕获文库产量和测序结果分析:
表-3:
表-4:
T057V2C panel大小为779.998K,目标区域设计探针的条数约为30000条,包括EGFR,KRAS,NRAS,BRCA1,BRCA2,MYC,RET,PIK3CA等113个基因,突变位点涉及EGFRL858R,EGFRDelE746-A750,EGFRT790M,EGFRV769-D770insASV,KRASG12D,NRASQ61K,NRASA59T和PIK3CAE454K等位点。
次黄嘌呤-block和U-block的实验过程同桥式-block的实验步骤完全一致。
从表-3可以看出,在杂交捕获过程中,通过桥式-block对文库封闭的效果最好,体现在文库产量和捕获率分别为96ng和65%,而次黄嘌呤-block对文库的封闭效果次之,文库产量和捕获率分别为58ng和58%,U-block对文库封闭的效果最差,文库产量和捕获率分别为33ng和51%。
从表-4可以看出桥式-block方法可以检测出HD780标准品中0.1%突变频率,并结合表-1发现桥式-block方法仅需要12G的数据量,便可以检测到0.1%突变频率。而对于次黄嘌呤-block和U-block需要18-23G的数据量测才可以检测到0.1%突变频率,并且很难检测到indel突变形式。
序列表
<110> 艾吉泰康生物科技(北京)有限公司
<120> 一种桥式寡核苷酸在文库目标区域捕获中的应用
<130> CF180229S
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 2
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 3
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcac 34
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 4
atctcgtatg ccgtcttctg cttg 24
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 5
ttactatgcc gctggtggct ctagatgtg 29
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 6
tgtgagaaag ggatgtgctg cgagaaggct aga 33
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 7
tctagccttc tcgtgtgcag acttgaggtc agtg 34
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 8
tagagcatac ggcagaagac gaac 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 9
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 10
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 11
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 33
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 12
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 13
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 14
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 14
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgtagatctc ggtggtcgcc gtatcatt 58
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 15
gttcgtcttc tgccgtatgc tcta 24
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 16
cactgacctc aagtctgcac acgagaaggc taga 34
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 17
tctagccttc tcgcagcaca tccctttctc acatctagag ccaccagcgg catagtaa 58
<210> 18
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 18
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 19
<211> 64
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 19
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cuacactctt ccctacacga cgctcttccg 60
atct 64
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 20
tgcctcttta tctgt 15
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 21
catttccgat acacc 15
Claims (7)
1.一种改良的序列捕获方法,所述方法包括:
1)提取DNA,打断DNA片段大小范围为160bp-180bp,优选末端修复和3’端加“A”;
2)将所述打断的DNA的两端与接头连接,所述打断的DNA一端的接头序列远端包括长度6-8nt的第一标签序列,优选在所述DNA另一端的接头序列远端包括长度6-8nt的第二标签序列;
3)利用所述接头序列的互补序列将所述连接接头的DNA进行Pre-PCR反应,优选通过所述Pre-PCR在所述连接接头的DNA两端引入测序接头序列;
4)将探针与封闭试剂混合,对所述Pre-PCR反应进行捕获,
所述封闭试剂包括与打断的DNA之外的序列互补的封闭序列,其中所述第一标签序列处用同样长度的C3间臂进行封闭,优选与所述第二标签序列处用同样长度的C3间臂封闭;
5)杂交捕获后PCR扩增,利用所述接头序列的互补序列。
2.根据权利要求1的方法,其中在4)中,所述探针与目标序列互补配对序列一般为160-180bp,优选170bp,用于获取目标区域序列。
3.根据权利要求1的方法,其中在4)中,所述探针包括两翼固定长度序列,其长度一般为10-30bp,优选15bp。
4.根据权利要求1的方法,其中在2)中,将所述打断的DNA的两端与两个接头分别连接,成线形DNA分子。
5.根据权利要求4的方法,其中在2)中,
所述接头是:
Adapter-1:ACCGAGATCT[标签序列]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO.2),
Adapter-2:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.11);
其中在3)中,将所述带有接头的DNA进行Pre-PCR反应;
引物是:
PE1.0:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO.1);
PE2.0:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGT;
其中在4)中,
所述探针序列:TGCCTCTTTATCTGT(SEQ ID NO.20)+与目标序列配对序列+CATTTCCGATACACC(SEQ ID NO.21)
所述封闭寡核苷酸序列:
a-1:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT+6-8个C3间臂+GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ ID NO.5);
a-2:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)+6-8个C3间臂+GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10)
b-1:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO.1)+6-8个C3间臂+ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.2);
b-2:AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.3)+6-8个C3间臂+ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO.4);
其中在5)中,所述引物是:
P5:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO.12),
P7:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO.13)。
6.根据权利要求1的方法,其中在2)中,将所述打断的DNA的两端与一个接头的两端分别连接,成环形DNA分子。
7.根据权利要求6的方法,其中在2)中,
所述接头是:
5′-/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCUACACTCTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQ ID NO.19);
其中在3)中,所述引物是:
标签序列引物:5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10)-3′;
Universal PCR引物:
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQ IDNO.18);
其中在4)中,所述探针序列:TGCCTCTTTATCTGT(SEQ ID NO.20)+与目标序列配对序列+CATTTCCGATACACC(SEQ ID NO.21)
所述封闭寡核苷酸序列:
a-1:AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.3)+6-8个C3间臂+ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO.4),
a-2:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO.18),
b-1:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)+6-8个C3间臂+GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10),
b-2:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ IDNO.14);
其中在5)中,所述引物是:
标签序列引物:5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.10)-3′;
Universal PCR引物:
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQ IDNO.18)。
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