CN101921840B - 一种基于dna分子标签技术和dna不完全打断策略的pcr测序方法 - Google Patents

一种基于dna分子标签技术和dna不完全打断策略的pcr测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种PCR测序方法，通过本专利中的引物标签+DNA不完全打断策略+二代测序技术(Pair-End测序技术)的组合在充分利用第二代测序仪高通量、低成本特点的同时，使测序仪能够测通的PCR产物长度超过测序仪本身测长以上，大大扩大了其适用范围。同时，本发明还提供了用于上述PCR测序方法的引物标签，以及该方法用于基因分型，特别是HLA分析的用途。

Description

一种基于DNA分子标签技术和DNA不完全打断策略的PCR测序方法
技术领域
本发明涉及核酸测序技术领域，特别是PCR测序技术领域。另一方面，本发明还涉及PCR-index/barcode技术领域。本发明的方法特别适用于第二代测序技术，尤其是第二代测序技术中的Pair-end测序技术，还可以用于HLA基因分型。
背景技术
PCR测序(PCR sequencing)方法是通过PCR的方法得到目的基因DNA片段，再通过对所得到的目的基因DNA片段进行DNA序列检测，从而得到目的基因DNA序列信息的一种技术，其具有直观、准确的特点，长久以来广泛应用于基因突变检测以及基因分型等领域。
PCR-index/barcode技术，通过在PCR引物的5’末端添加引物标签(primer index)序列，可在PCR过程中对每个样本引入独特的引物标签，使样本在利用第二代DNA测序技术(以Illumina GA，Roche454，ABI Solid等测序仪为代表的可大规模，高通量，单分子测序的测序仪)检测过程中，除PCR环节必须逐个样本处理外，其它实验环节可把多个样本混在一起同时处理，最终每个样本的检测结果可以通过其独特的引物标签序列找回；该方法具有成本低，通量大和可同时检测大量样本的多个不同基因位点的特点。
第二代DNA测序技术与第一代(Sanger法)DNA测序技术相比，其可连续测序的长度较短。以Illumina GA(Illumina公司的GenomeAnalyzer测序仪，简称Illumina GA)为例，当前Illumina GA的最大测序长度为200bp，当PCR产物的长度大于200bp，利用Illumina GA测序，直接采取PCR测序的方法，不能把整个PCR产物测通，得不到被检测PCR产物的全部DNA序列信息的。短的测序读长限制了第二代测序技术的应用，除了通过逐步改进测序技术来获得更长的实际测序读长外，开发可克服第二代DNA测序仪现有测序读长在PCR测序应用领域不足的新技术也成为当务之急。
发明内容
当前利用第二代测序技术，对大量样本中的特定基因相关序列同时进行测序分析时，一般会采用PCR测序的策略，直接利用引物标签+二代测序技术的组合。当所用测序仪的测长可以覆盖整个PCR产物的长度时，上述技术就足够满足要求了。但当所用测序仪的测长不够覆盖整个PCR产物的长度时，要么更换具有更长测长的第二代测序仪(如用Roche 454GS-FLX)替代Illumina GA，如果测长还不满足要求的话，只能牺牲成本和通量，改用第一代测序仪。
现实情况是，Illumina GA具有超高测序通量，但其测长才200bp；Roche 454GS-FLX的测长虽然可以达到500bp，但其测序成本较高，通量较小；第一代测序仪的测长虽然可以达到1000bp以上，但其通量和成本没法和第二代测序仪相比。
有没有能够兼顾成本和通量，能提高测序仪可以测通的PCR产物长度的技术呢？本专利中的引物标签+DNA不完全打断策略+二代测序技术的组合能在充分利用第二代测序仪高通量、低成本特点的同时，使测序仪能够测通的PCR产物长度达到测序仪本身测长以上，大大扩大了其适用范围。其中，本发明的所采用的二代测序技术包括第二代测序技术中的Pair-end测序技术，以及针对PCR模板有DNA参考序列(DNA Reference Sequence)的PCR测序技术。
本发明提供了用于PCR测序的方法，通过所述方法减少了自身测序读长较短造成的限制，扩大了第二代DNA测序技术在PCR测序应用领域的应用。
引物标签的设计根据所应用的实验平台不同而不同，考虑Illumina GA测序平台本身的特点，本发明在设计引物标签时主要考虑了以下几点：1：引物标签序列中避免3个以上(包括3个)单碱基重复序列，2：所有引物标签的同一位点中碱基A和碱基C的总含量占所有碱基含量的30％-70％之间，3：引物标签序列本身的GC含量在40-60％之间，4：引物标签之间序列差异度大于4个碱基，5：引物标签序列中避免出现与Illumina GA测序引物相似度高的序列，6：减少引物标签序列添加到PCR引物上后，对PCR引物造成的严重发卡(hairpin)，二聚体(dimer)情况的出现。
本发明通过PCR反应在PCR产物两端各引入一个引物标签(引物标签序列可以相同也可以不同)，使PCR产物任何一端的引物标签都可以特异的标记PCR产物的样本信息。所得PCR产物经过经不完全打断。所谓不完全打断，指打断终产物中包含完整的未被打断的PCR产物和局部打断的PCR产物。所述打断方法包括但不限于化学打断方法(例如酶切)和物理打断方法，所述物理打断方法包括超声波打断方法或机械打断方法等。打断的DNA经2％琼脂糖电泳，割胶纯化回收从测序仪最大读取长度到测序仪可适用的最长DNA长度范围之间的所有DNA条带(Illumina GA测序仪可适用的最长DNA为700bp，此长度为原始DNA长度，没有包括文库接头序列长度)。纯化回收方法包括但不限于电泳割胶回收，也可以是磁珠回收等。回收的DNA片段再按照第二代测序仪测序文库构建的流程构建测序文库，然后进行测序，优选为采用PCR-FREE测序文库构建的流程构建测序文库，测序方法优选采用Pair-End方法测序。PCR-Free测序文库构建的流程按照本领域技术人员已知方法构建。在得到测序总数据中，通过引物标签序列可以找到所有所测样本的序列信息，利用BWA把各个测序序列定位到PCR产物的相应DNA参考序列(Reference Sequence)上，再通过测序序列之间的重叠和连锁关系拼接出PCR产物的完整序列(图1)。此处连锁是指由Pair-End测序特点决定的pair-end连锁关系。
“接头(adapter)”或“文库接头(library adapter)”标签技术是指通过对多个测序文库添加不同文库接头(不同文库接头的组成序列不同，序列不同的部分称为接头标签(adapter index))，构建标签测序文库，从而可实现多个不同标签测序文库混合测序，且最终各个标签测序文库的测序结果可相互区分的一种文库标签技术。
基于DNA分子标签技术和DNA不完全打断策略的PCR测序方法的使用可在不增加引物标签数目的情况下，大大提高可唯一标记的样本数目。
结合文库接头标签技术的PCR-FREE的文库构建方法，是指将文库接头直接连接至测序文库中的DNA片段两端，文库接头的导入过程因为没有PCR的参与，因此称作PCR-Free文库构建。其中接入方法可以采用DNA连接酶进行连接。其整个文库构建过程中无PCR的参与，避免了在高序列相似度的PCR产物混合(pooling)文库的构建过程中，由PCR引入错误而导致最后结果的不准确性。
在本发明中，通过对正反PCR引物添加引物标记，结合DNA不完全打断策略，使第二代测序技术应用于PCR测序领域时，实际可测得的PCR产物长度超过测序仪的最大测序长度。
在本发明的一个方面中，提供了一组引物标签(primer index)，其包括表1所示95对引物标签中的至少10对，或至少20对，或至少30对，或至少40对，或至少50对，至少60对，或至少70对，或至少80对，或至少90对，或95对(或者所述一组引物标签由表1所示95对引物标签中的10-95对(例如10-95对，20-95对，30-95对，40-95对，50-95对，60-95对，70-95对，80-95对，90-95对，或95对)组成)，并且
所述一组引物标签优选地至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者它们任何两个或者多个的组合。
根据本发明另一方面，还提供了所述的引物标签用于PCR测序方法的用途，其中特别是，每一对引物标签与用于扩增待测目的序列的PCR引物对组合成一对标签引物，正反PCR引物的5’端分别具有(或者任选通过连接序列连接)正向引物标签和反向引物标签。
在本发明的一个具体实施方式中，所述PCR引物是用于扩增HLA的特定基因的PCR引物，优选是用于扩增HLA-A/B 2，3，4号外显子和HLA-DRB12号外显子的PCR引物，优选的所述PCR引物如表2所示。
本发明另一方面中，提供了上文所述一组引物标签与用于扩增待测目的序列的PCR引物对组合成的一组标签引物，其中每一对引物标签与PCR引物对组合成一对标签引物，正反PCR引物的5’端分别具有(或者任选通过连接序列连接)正向引物标签和反向引物标签。
在本发明的一个具体实施方式中，上文所述标签引物中的PCR引物是用于扩增HLA的特定基因的PCR引物，优选是用于扩增HLA-A/B 2，3，4号外显子和HLA-DRB12号外显子的PCR引物，优选的所述PCR引物如表2所示。在本发明的另一个具体实施方式中，所述的标签引物用于PCR测序方法。
本发明另一方面中，提供了一种测定样品中目的核酸的核苷酸序列的方法，其包括：
1)提供n个样品，n为大于等于1的整数，所述样品优选地来自哺乳动物，更优选是人，特别是人的血样；可选地，将待分析的n个样品分成m个小组，m为整数且n≥m≥1；
2)扩增：对于每一个样品，使用一对标签引物，在存在来自该样品的模板时，在适于扩增目的核酸的条件下进行PCR扩增，其中，每一对标签引物由包含引物标签的正向标签引物和反向标签引物(均可以是简并引物)构成，其中正向标签引物和反向标签引物所包含的引物标签可以相同或者不同；不同样品所用标签引物对中的引物标签彼此不同；
3)打断：将所得的PCR产物文库进行不完全打断；
4)测序：将回收的DNA混合物利用二代测序技术，优选的是Pair-End技术(例如Illumina GA、Illumina Hiseq 2000)进行测序，获得打断后的DNA的序列；
5)拼接：基于每个样品独特的引物标签将获得的测序结果与样品一一对应，利用比对程序(例如Blast，BWA程序)把各个测序序列定位到PCR产物的相应DNA参考序列上，通过序列重叠和连锁关系，从打断后的DNA的序列拼接出完整的目的核酸。
本发明另一方面，提供了一种测定样品中目的核酸的核苷酸序列的方法，其包括：
1)提供n个样品，n为大于等于1的整数，所述样品优选地来自人，特别是人的血样；可选地，将待分析的n个样品分成m个小组，m为整数且n≥m≥1；
2)扩增：对于每一个样品，使用一对标签引物，在存在来自该样品的模板时，在适于扩增目的核酸的条件下进行PCR扩增，其中，每一对标签引物由包含引物标签的正向标签引物和反向标签引物(均可以是简并引物)构成，其中正向标签引物和反向标签引物所包含的引物标签可以相同或者不同；不同样品所用标签引物对中的引物标签彼此不同；
3)混合：将各样品的PCR扩增产物混合在一起，获得PCR产物文库；
4)打断：将所得的PCR产物文库进行不完全打断；
5)建库：将打断后的PCR产物文库构建PCR-Free测序文库，回收位于所用测序仪最大读长长度到所用测序仪适用的最长DNA长度范围之间的所有DNA条带，可以对文库添加不同的文库接头(adapter)以区分不同的PCR-Free测序文库；
6)测序：将回收的DNA混合物利用二代测序技术，优选的是Pair-End技术(例如Illumina GA、Illumina Hiseq 2000)进行测序，获得打断后的DNA的序列；
7)拼接：基于各个文库不同的文库接头序列和每个样品独特的引物标签将获得的测序结果与样品一一对应，利用比对程序(例如Blast，BWA程序)把各个测序序列定位到PCR产物的相应DNA参考序列上，通过序列重叠和连锁关系，从打断后的DNA的序列拼接出完整的目的核酸。
在本发明的一个具体实施方式中，在上文所述的测序方法中，每一对引物标签与PCR引物对组合成一对标签引物，正反PCR引物的5’端分别具有(或者任选通过连接序列连接)正向引物标签和反向引物标签。
在本发明的一个具体实施方式中，在上文所述的测序方法中，所述PCR引物是用于扩增HLA的特定基因的PCR引物，优选是用于扩增HLA-A/B的2，3，4号外显子以及HLA-DRB12号外显子的PCR引物，优选的所述PCR引物如表2所示。
在本发明的一个具体实施方式中，在上文所述的测序方法中，所述引物标签针对PCR引物进行设计，优选针对用于扩增HLA的特定基因的PCR引物进行设计，更优选针对用于扩增HLA-A/B的2，3，4号外显子以及HLA-DRB12号外显子的PCR引物，特别是如表2所示的PCR引物进行设计，所述引物标签特别是包括表1所示95对引物标签中的至少10对，或至少20对，或至少30对，或至少40对，或至少50对，至少60对，或至少70对，或至少80对，或至少90对，或95对(或者所述一组引物标签由表1所示95对引物标签中的10-95对(例如10-95对，20-95对，30-95对，40-95对，50-95对，60-95对，70-95对，80-95对，90-95对，或95对)组成)，并且
所述一组引物标签优选地至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者它们任何两个或者多个的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，在上文所述的测序方法中，所述DNA打断包括化学打断方法和物理打断方法，其中所述化学方法包括酶切方法，所述物理打断方法包括超声波打断方法或机械打断方法。所述DNA打断后，分离450-750bp长度的片段。
本发明另一方面中，提供了一种HLA分型方法，包括：使用上文所述的测序方法对来自患者的样品(特别是血样)进行测序，以及将测序结果与HLA数据库(如IMGT HLA专业数据库)中的标准序列数据比对，序列比对结果100％匹配的即为对应样本的HLA基因型别。
附图说明
图1：为引物标签标记，DNA打断和DNA测序后，序列拼接图示。第N号样本的PCR产物两端引入了正反引物标签序列Index-N-F/R(1)，PCR产物经物理方法打断后的产物中包括：一端带有引物标签序列的产物，两端都不带引物标签序列的产物，完全未被打断的产物，割胶纯化回收位于测序仪最大读长长度到测序仪适用的最长DNA长度范围之间的所有DNA条带用于测序(2)，利用Index-N-F/R在测序结果中找回属于第N号样本的PCR产物的测序结果，利用PCR产物已知的参考序列信息定位各个测序序列相对参考的位置，并根据测序序列之间的重叠和连锁关系组装成完整的PCR产物的测序结果(3，4)。
图2：为1号样本HLA-A/B/DRB1相应外显子PCR产物电泳结果，从电泳图上看，PCR产物为一系列片段大小300bp-500bp的单一条带，其中泳道M是分子量标记物(DL 2000，Takara公司)，泳道1-7为1号样本的HLA-A/B/DRB1各外显子(A2、A3、A4、B2、B3、B4、DRB1-2)PCR扩增产物，阴性对照(N)无扩增条带。其它样品的结果与此类似。
图3：为HLA-Mix打断后DNA电泳情况(割胶前后)，割胶区域为450-750bp区域。其中泳道M是分子量标记物(NEB-50bp DNALadder)，泳道1是割胶前HLA-Mix的电泳情况，泳道2是割胶后HLA-Mix的胶图。
图4：1号样本的一致性(consensus)序列构建程序截图，示例说明了根据引物标签和DNA片段之间的重叠关系拼接出PCR产物的完整序列。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
在本发明的实施例中，通过采取引物标签+DNA不完全打断策略+Illumia GA测序仪Pair-End 100测序技术的组合对95个样本的HLA-A/B 2，3，4号外显子以及HLA-DRB12号外显子的基因分型(PCR产物长度大小处于290bp-500bp之间)，证明该策略可以在充分发挥第二代测序仪高通量、低成本特点的同时，可以实现对超过测序仪本身测长以上的基因片段的分型。
原理：将待分析的样本，通过PCR反应在HLA-A/B 2，3，4号外显子以及HLA-DRB12号外显子的PCR产物两端引入引物标签，使其特异的标记PCR产物的样本信息。将各组内样品的HLA-A/B/DRB1三个位点的PCR扩增产物混合在一起，获得PCR产物文库；所得PCR产物文库经过超声不完全打断后，构建PCR-Free测序文库，测序文库经2％低熔点琼脂糖电泳，割胶纯化回收位于450bp-750bp长度范围之间的所有DNA条带(PCR-Free测序文库的构建过程中在DNA片段的两端都添加上了文库接头，使DNA片段在电泳图上体现的长度比实际长度大了250bp左右，因此，此处回收450bp-700bp的片段，实际上相当于回收原长度为200bp-500bp的DNA片段)。回收的DNA经Illumina GA PE-100测序。通过引物标签序列可以找到所有所测样本的序列信息，再通过已知DNA片段的参考序列信息和DNA片段序列之间的重叠和连锁关系组装出整个PCR产物的序列，再通过与HLA-A/B/DRB1相应外显子的标准数据库的比对结果可组装出原PCR产物的全序列，实现HLA-A/B/DRB1的基因分型。
实施例1
样本提取
使用KingFisher自动提取仪(美国Thermo公司)从95份已知HLA-SBT分型结果的血样(中国造血干细胞捐献者资料库(以下称“中华骨髓库”))中提取DNA。主要步骤如下：取出6个Kingfisher自动提取仪配套的深孔板及1个浅孔板，根据说明书分别加入一定量配套的试剂并做好标记，将所有已加好试剂的孔板按要求置于相应的位置，选定程序“Bioeasy_200ul Blood DNA_KF.msz”程序，按下“star”执行该程序进行核酸提取。程序结束后收集plate Elution中的100ul左右的洗脱产物即为提取的DNA。
实施例2
PCR扩增
通过合成在5’末端具有不同引物标签的PCR引物制作不同的PCR标签引物，这样不同的PCR标签引物可以用于不同的样本，所述PCR引物是针对HLA-A/B的2，3，4号外显子以及HLA-DRB12号外显子的PCR引物。其后通过PCR反应在PCR产物两端引入引物标签，从而特异地标记了来自不同样本的PCR产物。
以95套PCR标签引物来分别扩增95份DNA样本，每套PCR标签引物由一对双向引物标签(表1)和用于扩增HLA-A/B的2，3，4号外显子以及HLA-DRB12号外显子的PCR引物(表2)组成，其中每个正向PCR引物的5’末端上连接一对引物标签的正向引物标签，而反向PCR引物的5’末端上连接一对引物标签的反向引物标签。引物标签在引物合成时直接添加在PCR引物的5’末端。
把实施例1的样本提取步骤中所得的95份DNA，依次编号1-95，PCR反应在96孔板中进行，共7板，编号分别为HLA-P-A2、HLA-P-A3、HLA-P-A4、HLA-P-B2、HLA-P-B3、HLA-P-B4以及HLA-P-DRB1-2(A2/3/4，B2/B3/B4，DRB1-2表示扩增的位点)，板内设置一个不添加模板的阴性对照，阴性对照所用引物与模板1的对应引物相同。实验的同时，记录下每对引物标签对应的样本编号信息。
表1，引物标签的相关信息
  引物标签编号 正向引物标签 反向引物标签   对应96孔板位置   对应模板(组1)
  PI-1   TCGCAGACATCA   TGACACGATGCT   A1   1
  PI-2   TACATCGCACTA   TACAGATGCTGA   A2   2
  PI-3   CTCGATGAGTAC   ACGTCTAGACAC   A3   3
  PI-4   TCTGTATACTCA   TGCTGTAGTGAC   A4   4
  PI-5   TATCTGCTCATA   AGATATCGAGCT   A5   5
  PI-6   TACATGCTGAGC   ACGTGTCTATCA   A6   6
  PI-7   TCATATCGCGAT   AGATCGTATAGC   A7   7
  PI-8   ACAGATGCACGC   ATCTCGTGACAG   A8   8
  PI-9   TAGATCGTACAT   ACTAGTACACGC   A9   9
  PI-10   ACTACACGTCTC   ATAGTCACGCGT   A10   10
  PI-11   AGACTCGCGTAT   TACTAGCTGACG   A11   11
  PI-12   ATACTAGTGCTC   TGTATCGTGCTC   A12   12
  PI-13   CACGATGACATC   TAGTGAGCGCAC   B1   13
  PI-14   TGCTGTCTCGAG   CATAGCAGTGTC   B2   14
  PI-15   TGTGCTCGAGTC   TCTGATCGAGCA   B3   15
  PI-16   CACTCGTACATC   AGCGATGCTCAT   B4   16
  PI-17   CGACGTGCTCGC   CGCGTACTGCAG   B5   17
  PI-18   ACGCATCTATAC   CTAGTATCGCAG   B6   18
  PI-19   CGAGATGACTCT   TGTATACACGAT   B7   19
  PI-20   ACTGTCTCGAGC   ACGTAGCGCACA   B8   20
  PI-21   CATCTGCTATAG   TCTAGCTCATGA   B9   21
  PI-22   ACGCACTCTAGA   CTATGCACTGAT   B10   22
  PI-23   TGAGATACAGTA   ATCTGCTATGAC   B11   23
  PI-24   ACTCATCGTGCT   TAGAGCTGTCAC   B12   24
  PI-25   TACACTGTCTAT   CAGCACATAGAT   C1   25
  PI-26   CACAGTACTCGC   CTGCTAGTGTAT   C2   26
  PI-27   TGTACTATCATA   TGTGATAGACAC   C3   27
  PI-28   CTAGTACTGACG   AGCGAGTCTACT   C4   28
  PI-29   TAGACTGAGCTA   ACATACTGAGAC   C5   29
  PI-30   CAGACGCGTGAG   TACATCTCGTAT   C6   30
  PI-31   CGCGACATCACG   TAGCGATGAGAC   C7   31
  PI-32   ACACTCATAGAT   CTATCATGACAC   C8   32
  PI-33   AGCGTATACTAG   CATACTCACGTA   C9   33
  PI-34   TGTCGTGCTATC   ACATGACTCACG   C10   34
  PI-35   CGCTAGACTGTA   TACTATAGTCGA   C11   35
  PI-36   ACAGTGTAGCGC   TGATATGCTACA   C12   36
  PI-37   CACTCTATCGAC   TCACGCGATGAG   D1   37
  PI-38   ACACTCTAGTCA   ACGTAGATCTAT   D2   38
  PI-39   CATATGAGATCG   AGCAGAGTGCTC   D3   39
  PI-40   CAGCTATCATAC   CACTGCAGACGA   D4   40
  PI-41   TATACTCTAGAT   TGCATAGAGCGC   D5   41
  PI-42   TGTATGCTCGTC   TCGTGACAGATC   D6   42
  PI-43   TAGTGATGCTCT   ACGAGCTGATAT   D7   43
  PI-44   AGACTCTGAGTC   CTGATAGTATCA   D8   44
  PI-45   CTCATAGACTAC   ATCGCGAGTGAC   D9   45
  PI-46   TCGCTCACTACA   TGTCTCGACATC   D10   46
  PI-47   ATAGAGTCTCAT   CGCATAGCGTAT   D11   47
  PI-48   CGAGACACTCGC   TCGTAGTCTACA   D12   48
  PI-49   CAGCATACTATC   TCGTGATACAGA   E1   49
  PI-50   CAGCTATAGTCT   ATGCAGATATCT   E2   50
  PI-51   TCTATCGATGCA   ACACGCAGATCG   E3   51
  PI-52   CATGAGTATAGC   CTAGCTGAC GTA   E4   52
  PI-53   TAGCATATCGAG   TACACGTATGAG   E5   53
  PI-54   ACGACTCGCTAC   TCATGACTAGTA   E6   54
  PI-55   TAGCATACACGC   TGACGCGTATAC   E7   55
  PI-56   CGTCATATGCAG   TATAGCGATGAC   E8   56
  PI-57   TGCAGCGAGTAC   TCGACGCTAGCG   E9   57
  PI-58   CGTGTCGACAGA   CAGTCGTGAGCA   E10   58
  PI-59   ACTCGACGTGAG   ACGCGAGTGATA   E11   59
  PI-60   ACTCGTCTGACG   TGCTATCACTGA   E12   60
  PI-61   CATACTGTATCT   TACATAGATGTC   F1   61
  PI-62   TCTACTCGTGAC   CACGTATAGTGA   F2   62
  PI-63   CTGCACTAGACA   ACTCATATCGCA   F3   63
  PI-64   ACACGAGCTCAT   CACTCATATCGA   F4   64
  PI-65   TACAGATAGTCT   TCGTCTGTGATA   F5   65
  PI-66   TACACTCGTGCT   TGACGCTCATCT   F6   66
  PI-67   TACATGTGACGA   TCGTACATGCTC   F7   67
  PI-68   TGTATGATCTCG   CACTGTGCTCAT   F8   68
  PI-69   CAGTACACTCTA   ACTGCATGATCG   F9   69
  PI-70   CATACTATCACG   TCGTGTCACTAC   F10   70
  PI-71   CACTATACAGAT   CGACACGTACTA   F11   71
  PI-72   ATATCGTAGCAT   TCGTGATCACTA   F12   72
  PI-73   TAGTCTATACAT   AGACGCTGTCGA   G1   73
  PI-74   TGTCACAGTGAC   TCATATGATCGA   G2   74
  PI-75   ATCGACTATGCT   CGATCATATGAG   G3   75
  PI-76   ATACTAGCATCA   TCATGCTGACGA   G4   76
  PI-77   CACTGACGCTCA   CACTACATCGCT   G5   77
  PI-78   TCGCTCATCTAT   TAGTACAGAGCT   G6   78
  PI-79   TGTATCACGAGC   ATGATCGTATAC   G7   79
  PI-80   TACTGCTATCTC   CGCTGCATAGCG   G8   80
  PI-81   CGCGAGCTCGTC   ACTCGATGAGCT   G9   81
  PI-82   TAGAGTCTGTAT   TGTCTATCACAT   G10   82
  PI-83   TACTATCGCTCT   TATGTGACATAC   G11   83
  PI-84   TAGATGACGCTC   TACTCGTAGCGC   G12   84
  PI-85   TCGCGTGACATC   ATCTACTGACGT   H1   85
  PI-86   ACACGCTCTACT   ACAGTAGCGCAC   H2   86
  PI-87   TACATAGTCTCG   CTAGTATCATGA   H3   87
  PI-88   TGAGTAGCACGC   TCGATCATGCAG   H4   88
  PI-89   TAGATGCTATAC   TACATGCACTCA   H5   89
  PI-90   ATCGATGTCACG   CAGCTCGACTAC   H6   90
  PI-91   ATCATATGTAGC   CTCTACAGTCAC   H7   91
  PI-92   TAGCATCGATAT   AGATAGCACATC   H8   92
  PI-93   TGATCGACGCTC   CTAGATATCGTC   H9   93
  PI-94   TGCAGCTCATAG   TACAGACTGCAC   H10   94
  PI-95   CGACGTAGAGTC   CAGTAGCACTAC   H11   95
表2，未添加引物标签前用于扩增HLA-A/B/DRB1相应外显子的PCR引物
Figure BSA00000171339700141
Figure BSA00000171339700151
D2-F1，D2-F2，D2-F3，D2-F4，D2-F5，D2-F6，D2-F7为扩增HLA-DRB12号外显子的正向引物，D2-R为扩增HLA-DRB12号外显子的反向引物。
HLA-A/B/DRB1的PCR程序如下：
96℃2min
95℃30s→60℃30s→72℃20s(32cycles)
15℃∞
HLA-A/B的PCR反应体系如下所有试剂均购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司(Promega)
  Promega 5×buffer I(Mg2+plus)   5.0ul
  dNTP Mixture(各2.5mM/ul)   2.0ul
  PInf-A/B-F2/3/4(2pmol/ul)   1.0ul
  PInr-A/B-R2/3/4(2pmol/ul)   1.0ul
  Promega Taq(5U/ul)   0.2ul
  DNA(约20ng/ul)   5.0ul
  ddH2O   10.8ul
  Total   25.0ul
HLA-DRB1的PCR反应体系如下：
 Promega 5×buffer I(Mg2+plus)   5.0ul
 dNTP Mixture(各2.5mM/ul)   2.0ul
 PInf-D2-F1(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F2(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F3(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F4(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F5(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F6(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F7(2pmol/ul)   1.0ul
 PInr-D2-R(2pmol/ul)   1.0ul
 Promega Taq(5U/ul)   0.2ul
 DNA(约20ng/ul)   5.0ul
 ddH2O   4.8ul
 Total   25.0ul
其中PInf-A/B/D2-F1/2/3/4/5/6/7表示引物5’末端带有第n号正向引物标签序列(表1)的HLA-A/B/DRB1的F引物，PInf-A/B/D2-R2/3/4表示引物5’末端带有第n号反向引物标签序列的HLA-A/B/DRB1的R引物(此处n≤95)，其它依次类推。且每个样本对应特定的一套PCR引物(PInf-A/B/D2-F1/2/3/4/5/6/7，PInf-A/B/D2-R2/3/4)。
PCR反应在Bio-Rad公司的PTC-200PCR仪上运行。PCR完成后，取2ul PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。图2显示了1号样本HLA-A/B/DRB1相应外显子PCR产物电泳结果，DNA分子标记为DL2000(Takara公司)，胶图上有一系列片段大小为300bp-500bp单一条带，表明1号样本的HLA-A/B/DRB1各外显子(A2、A3、A4、B2、B3、B4、DRB1-2)PCR扩增成功，阴性对照(N)无扩增条带。其它样品的结果与此类似
实施例3
PCR产物混合和纯化
从96孔板HLA-P-A2剩余的PCR产物中(阴性对照除外)各取20ul混合在一个3ml的EP管中，标记为HLA-A2-Mix，对其它6个96孔板进行同样的操作，分别标记为HLA-A3-Mix、HLA-A4-Mix、HLA-B2-Mix、HLA-B3-Mix、HLA-B4-Mix和HLA-D2-Mix，震荡混匀，从HLA-A2-Mix、HLA-A3-Mix、HLA-A4-Mix、HLA-B2-Mix、HLA-B3-Mix、HLA-B4-Mix和HLA-D2-Mix中各取200ul混合在一个3ml的EP管中，标记为HLA-Mix，从HLA-Mix中取500ul DNA混合物经Qiagen DNA Purification kit试剂盒(QIAGEN公司)过柱纯化(具体纯化步骤详见说明书)，纯化所得的200ul DNA，经Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific公司)测定HLA-Mix DNA浓度为48ng/ul。
实施例4
PCR产物的打断，以及Illumina GA PCR-Free测序文库的构建
1.DNA打断
从纯化后的HLA-Mix中取总量5ug的DNA用带AFA纤维扣盖的Covaris微管在Covaris S2DNA打断仪(Covaris公司)上打断。打断条件如下：
频率扫描(frequency sweeping)
  负载比(Duty Cycle)   10％
  强度(Intensity)   5
  循环/脉冲(Cycles/Burst)   200
  时间(秒)(Time seconds)   300
2.打断后纯化
将HLA-Mix的所有打断产物用QIAquick PCR Purification Kit回收纯化，分别溶于37.5ul的EB(QIAGEN Elution Buffer)中；
3.末端修复反应
对打断后纯化的HLA-Mix进行DNA末端修复反应，体系如下(试剂均购自Enzymatics公司)：
Figure BSA00000171339700181
反应条件为：恒温混匀器(Thermomixer，Eppendorf公司)20℃温浴30min。
反应产物经QIAquick PCR Purification Kit回收纯化，溶于34μl的EB(QIAGEN Elution Buffer)中。
4.3’末端加A反应
上一步回收DNA的3’末端加A反应，体系如下(试剂均购自Enzymatics公司)：
Figure BSA00000171339700182
反应条件为：恒温混匀器(Thermomixer，Eppendorf公司)37℃温浴30min。
反应产物经MiniElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)回收纯化，溶于13μl的EB溶液(QIAGEN Elution Buffer)中。
5.连接Illumina GA PCR-Free文库接头(adapter)
术语“PCR-Free文库接头(adapter)”是指经设计的一段碱基，其主要作用是辅助固定DNA分子在测序芯片上以及提供通用测序引物的结合位点，PCR-Free文库接头可以通过DNA连接酶将其直接连接至测序文库中的DNA片段两端，文库接头的导入过程因为没有PCR的参与，因此称作PCR-Free文库接头。
加A后的产物连接Illumina GA PCR-Free文库接头，体系如下(试剂均购自Illumina公司)：
Figure BSA00000171339700191
反应条件为：恒温混匀器(Thermomixer，Eppendorf公司)20℃温浴15min。
反应产物经Ampure Beads(Beckman Coulter Genomics)纯化后溶于50ul去离子水，经荧光定量PCR(QPCR)检测到DNA浓度结果如下：
  qPCR检测结果(nM)
  HLA-Mix   78.90
6.割胶回收
取30μL HLA-Mix用2％低熔点琼脂糖胶进行回收。电泳条件为100V，100min。DNA marker为NEB公司的50bp DNA marker。割胶回收450-750bp长度范围的DNA片段(附图3)。胶回收产物经QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)回收纯化，纯化后体积为32ul，经荧光定量PCR(QPCR)检测到DNA浓度结果为10.16nM。
实施例5
Illumina GA测序
根据QPCR检测结果，取10pmol DNA用Illumina GA PE-100程序测序，具体操作流程详见Illumina GA操作说明书(Illumina GAII x)。
实施例6
结果分析
Illumina GA产出的测序结果是一系列DNA序列，通过查找测序结果中的正反引物标签序列和引物序列，建立各个引物标签对应样本HLA-A/B/DRB1各外显子PCR产物测序结果的数据库。通过BWA(Burrows-Wheeler Aligner)把各外显子的测序结果定位在相应外显子的参考序列上(参考序列来源：http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)同时，构建各个数据库的一致性(consensus)序列，再对数据库中DNA序列进行筛选和测序错误校正。校正后的DNA序列通过序列重叠(overlap)和连锁(Pair-End连锁)关系可组装成HLA-A/B/DRB1各外显子相应的序列。所得DNA序列利用与IMGT HLA专业数据库中HLA-A/B/DRB1相应各外显子的序列数据库比对，序列比对结果100％匹配的即为对应样本的HLA-A/B/DRB1基因型别。可参考图4示例说明的1号样品的HLA-A位点的2号外显子一致性序列构建程序的截图。
所有95个样本，得到的分型结果与原已知分型结果完全相符，其中1-32号样本的具体结果如下：
样本编号                        原HLA-A/B/DRB1型别
1    A＊02:03  A＊11:01  B＊38:02  B＊48:01  DRB1＊14:54  DRB1＊15:01
2    A＊01:01  A＊30:01  B＊08:01  B＊13:02  DRB1＊03:01  DRB1＊07:01
3    A＊01:01  A＊02:01  B＊15:11  B＊47:01  DRB1＊13:02  DRB1＊15:01
4    A＊24:08  A＊26:01  B＊40:01  B＊51:01  DRB1＊04:04  DRB1＊09:01
5    A＊01:01  A＊24:02  B＊54:01  B＊55:02  DRB1＊04:05  DRB1＊09:01
6    A＊01:01  A＊03:02  B＊15:11  B＊37:01  DRB1＊10:01  DRB1＊14:54
7    A＊11:01  A＊30:01  B＊13:02  B＊15:18  DRB1＊04:04  DRB1＊07:01
8     A＊01:01  A＊02:01  B＊35:03  B＊81:01  DRB1＊11:01  DRB1＊15:01
9     A＊02:06  A＊31:01  B＊27:07  B＊40:02  DRB1＊03:01  DRB1＊13:02
10    A＊01:01  A＊66:01  B＊37:01  B＊49:01  DRB1＊10:01  DRB1＊13:02
11    A＊01:01  A＊03:01  B＊35:01  B＊52:01  DRB1＊01:01  DRB1＊15:02
12    A＊11:01  A＊11:01  B＊15:01  B＊15:05  DRB1＊04:06  DRB1＊15:01
13    A＊01:01  A＊11:02  B＊07:02  B＊15:02  DRB1＊09:01  DRB1＊15:01
14    A＊01:01  A＊02:01  B＊52:01  B＊67:01  DRB1＊15:02  DRB1＊16:02
15    A＊01:01  A＊02:05  B＊15:17  B＊50:01  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01
16    A＊01:01  A＊11:01  B＊37:01  B＊40:02  DRB1＊10:01  DRB1＊12:02
17    A＊24:07  A＊32:01  B＊35:05  B＊40:01  DRB1＊03:01  DRB1＊04:05
18    A＊11:01  A＊24:02  B＊13:01  B＊35:01  DRB1＊16:02  DRB1＊16:02
19    A＊11:01  A＊11:01  B＊40:02  B＊55:12  DRB1＊04:05  DRB1＊15:01
20    A＊02:11  A＊24:02  B＊40:01  B＊40:06  DRB1＊11:01  DRB1＊15:01
21    A＊01:01  A＊02:06  B＊51:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊12:01
22    A＊01:01  A＊29:01  B＊07:05  B＊15:01  DRB1＊04:05  DRB1＊07:01
23    A＊01:01  A＊02:07  B＊37:01  B＊46:01  DRB1＊04:03  DRB1＊10:01
24    A＊24:85  A＊30:01  B＊13:02  B＊55:02  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01
25    A＊11:01  A＊31:01  B＊07:06  B＊51:01  DRB1＊12:02  DRB1＊14:05
26    A＊01:01  A＊11:01  B＊46:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊08:03
27    A＊01:01  A＊02:01  B＊15:18  B＊37:01  DRB1＊04:01  DRB1＊15:01
28    A＊01:01  A＊24:02  B＊37:01  B＊46:01  DRB1＊09:01  DRB1＊10:01
29    A＊26:01  A＊66:01  B＊40:40  B＊41:02  DRB1＊12:01  DRB1＊15:01
30    A＊02:01  A＊29:02  B＊13:02  B＊45:01  DRB1＊03:01  DRB1＊12:02
31    A＊01:01  A＊11:03  B＊15:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01
32    A＊11:01  A＊26:01  B＊35:03  B＊38:01  DRB1＊11:03  DRB1＊14:04
样本编号              测得的HLA-A/B/DRB1型别
1     A＊02:03  A＊11:01  B＊38:02  B＊48:01  DRB1＊14:54  DRB1＊15:01
2     A＊01:01  A＊30:01  B＊08:01  B＊13:02  DRB1＊03:01  DRB1＊07:01
3     A＊01:01  A＊02:01  B＊15:11  B＊47:01  DRB1＊13:02  DRB1＊15:01
4     A＊24:08  A＊26:01  B＊40:01  B＊51:01  DRB1＊04:04  DRB1＊09:01
5     A＊01:01  A＊24:02  B＊54:01  B＊55:02  DRB1＊04:05  DRB1＊09:01
6     A＊01:01  A＊03:02  B＊15:11  B＊37:01  DRB1＊10:01  DRB1＊14:54
7     A＊11:01  A＊30:01  B＊13:02  B＊15:18  DRB1＊04:04  DRB1＊07:01
8     A＊01:01  A＊02:01  B＊35:03  B＊81:01  DRB1＊11:01  DRB1＊15:01
9     A＊02:06  A＊31:01  B＊27:07  B＊40:02  DRB1＊03:01  DRB1＊13:02
10    A＊01:01  A＊66:01  B＊37:01  B＊49:01  DRB1＊10:01  DRB1＊13:02
11    A＊01:01  A＊03:01  B＊35:01  B＊52:01  DRB1＊01:01  DRB1＊15:02
12    A＊11:01  A＊11:01  B＊15:01  B＊15:05  DRB1＊04:06  DRB1＊15:01
13    A＊01:01  A＊11:02  B＊07:02  B＊15:02  DRB1＊09:01  DRB1＊15:01
14    A＊01:01  A＊02:01  B＊52:01  B＊67:01  DRB1＊15:02  DRB1＊16:02
15    A＊01:01  A＊02:05  B＊15:17  B＊50:01  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01
16    A＊01:01  A＊11:01  B＊37:01  B＊40:02  DRB1＊10:01  DRB1＊12:02
17    A＊24:07  A＊32:01  B＊35:05  B＊40:01  DRB1＊03:01  DRB1＊04:05
18    A＊11:01  A＊24:02  B＊13:01  B＊35:01  DRB1＊16:02  DRB1＊16:02
19    A＊11:01  A＊11:01  B＊40:02  B＊55:12  DRB1＊04:05  DRB1＊15:01
20    A＊02:11  A＊24:02  B＊40:01  B＊40:06  DRB1＊11:01  DRB1＊15:01
21    A＊01:01  A＊02:06  B＊51:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊12:01
22    A＊01:01  A＊29:01  B＊07:05  B＊15:01  DRB1＊04:05  DRB1＊07:01
23    A＊01:01  A＊02:07  B＊37:01  B＊46:01  DRB1＊04:03  DRB1＊10:01
24    A＊24:85  A＊30:01  B＊13:02  B＊55:02  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01
25    A＊11:01  A＊31:01  B＊07:06  B＊51:01  DRB1＊12:02  DRB1＊14:05
26    A＊01:01  A＊11:01  B＊46:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊08:03
27    A＊01:01  A＊02:01  B＊15:18  B＊37:01  DRB1＊04:01  DRB1＊15:01
28    A＊01:01  A＊24:02  B＊37:01  B＊46:01  DRB1＊09:01  DRB1＊10:01
29    A＊26:01  A＊66:01  B＊40:40  B＊41:02  DRB1＊12:01  DRB1＊15:01
30    A＊02:01  A＊29:02  B＊13:02  B＊45:01  DRB1＊03:01  DRB1＊12:02
31    A＊01:01  A＊11:03  B＊15:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01
32    A＊11:01  A＊26:01  B＊35:03  B＊38:01  DRB1＊11:03  DRB1＊14:04
注：HLA-DRB1型别中的DRB1＊1201不排除DRB1＊1206/1210/1217的可能性，DRB1＊1454不排除DRB1＊1401的可能性，因为上述等位基因在HLA-DRB12号外显子的序列完全相同。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
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Claims (56)

1.一种测定样品中目的核酸的核苷酸序列的方法，其包括如下步骤：
1)提供n个样品，n为大于等于1的整数，所述样品来自哺乳动物；将待分析的n个样品分成m个小组，m为整数且n≥m≥1；
2)扩增：对于每一个样品，使用一对或多对标签引物，在存在来自该样品的模板时，在适于扩增目的核酸的条件下进行PCR扩增，其中，每一对标签引物由包含引物标签的正向标签引物和反向标签引物构成，其中正向标签引物和反向标签引物所包含的引物标签相同或者不同；不同样品所用标签引物对中的引物标签彼此不同；
3)混合：当n＞1时，将各样品的PCR扩增产物混合在一起；
4)打断：将所得的扩增产物进行不完全打断，并进行纯化回收；
5)测序：将回收的DNA混合物利用二代测序技术进行测序，获得打断后的DNA的序列；和
6)拼接：基于每个样品独特的引物标签将获得的测序结果与样品一一对应，利用比对程序把各个测序序列定位到PCR产物的相应DNA参考序列上，通过序列重叠和连锁关系，从打断后的DNA的序列拼接出完整的目的核酸。
2.权利要求1所述的方法，其中样品来自人。
3.权利要求2所述的方法，其中样品是人的血样。
4.权利要求1所述的方法，其中步骤2)中，正向标签引物和反向标签引物均是简并引物。
5.权利要求1所述的方法，其中步骤5)中利用Pair-End技术进行测序。
6.权利要求5所述的方法，其中Pair-End技术是Illumina GA或Illumina Hiseq2000。
7.权利要求1所述的方法，其中步骤6)中比对程序是Blast或BWA程序。
8.权利要求1所述的方法，其中每一对引物标签与PCR引物对组合成一对标签引物，正反PCR引物的5’端分别具有正向引物标签和反向引物标签。
9.权利要求8所述的方法，其中正反PCR引物的5’端分别通过连接序列连接正向引物标签和反向引物标签。
10.权利要求1所述的方法，其中所述PCR引物是用于扩增HLA-A/B的2，3，4号外显子以及HLA-DRB1 2号外显子的PCR引物。
11.权利要求10所述的方法，其中所述PCR引物如表2所示。
12.权利要求1所述的方法，其中所述引物标签针对PCR引物进行设计。
13.权利要求12所述的方法，其中所述引物标签针对用于扩增HLA的特定基因的PCR引物进行设计。
14.权利要求12所述的方法，其中所述引物标签针对用于扩增HLA-A/B的2，3，4号外显子以及HLA-DRB1 2号外显子的PCR引物进行设计。
15.权利要求12所述的方法，其中所述引物标签针对如表2所示的PCR引物进行设计。
16.权利要求12所述的方法，其中所述引物标签包括表1所示95对引物标签中的至少10对，并且
所述引物标签     至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
17.权利要求16所述的方法，其中所述引物标签包括表1所示95对引物标签中的至少20对，并且
所述引物标签    至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
18.权利要求16所述的方法，其中所述引物标签包括表1所示95对引物标签中的至少30对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
19.权利要求16所述的方法，其中所述引物标签包括表1所示95对引物标签中的至少40对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
20.权利要求16所述的方法，其中所述引物标签包括表1所示95对引物标签中的至少50对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
21.权利要求16所述的方法，其中所述引物标签包括表1所示95对引物标签中的至少60对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
22.权利要求16所述的方法，其中所述引物标签包括表1所示95对引物标签中的至少70对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
23.权利要求16所述的方法，其中所述引物标签包括表1所示95对引物标签中的至少80对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至P1-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
24.权利要求16所述的方法，其中所述引物标签包括表1所示95对引物标签中的至少90对，并且
所述引物标签至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
25.权利要求16所述的方法，其中所述引物标签包括表1所示95对引物标签中的95对。
26.权利要求1所述的方法，其中所述打断包括化学打断方法和物理打断方法，其中所述化学方法包括酶切方法，所述物理打断方法包括超声波打断方法或机械打断方法。
27.权利要求1所述的方法，其中所述DNA打断后，纯化回收从测序仪最大读取长度到测序仪可适用的最长DNA长度范围之间的所有DNA条带，其中所述纯化回收方法为电泳割胶回收或磁珠回收。
28.权利要求1所述的方法，其中所述方法还可以包括权利要求1所述的步骤1)-4)，以及如下步骤：
5)建库：将打断后的PCR产物文库构建PCR-Free测序文库，可以对文库添加不同的文库接头以区分不同的PCR-Free测序文库，纯化回收位于所用测序仪最大读长长度到所用测序仪适用的最长DNA长度范围之间的所有DNA条带；
6)测序：将回收的DNA混合物利用二代测序技术进行测序，获得打断后的DNA的序列；
7)拼接：基于各个文库不同的文库接头序列和每个样品独特的引物标签将获得的测序结果与样品一一对应，利用比对程序把各个测序序列定位到PCR产物的相应DNA参考序列上，通过序列重叠和连锁关系，从打断后的DNA的序列拼接出完整的目的核酸。
29.权利要求28所述的方法，其中步骤5)中纯化回收450-750bp长度范围的DNA片段。
30.权利要求28所述的方法，其中步骤6)中利用Pair-End技术进行测序。
31.权利要求30所述的方法，其中Pair-End技术是Illumina GA或Illumina Hiseq2000。
32.权利要求28所述的方法，其中步骤7)中比对程序是Blast或BWA程序。
33.权利要求1-32中任一项所述的方法用于HLA分型的用途，其特征在于包括：使用权利要求1-32中任一项的方法对来自患者的样品进行测序，以及将测序结果与HLA数据库中HLA-A/B的2，3，4号外显子和HLA-DRB1 2号外显子的序列数据比对，序列比对结果100％匹配的即为对应样本的HLA-A/B/DRB1基因型别。
34.权利要求33所述的用途，其中患者的样品是血样。
35.权利要求33所述的用途，其中HLA数据库是IMGT HLA专业数据库。
36.用于权利要求1的方法的一组引物标签，其包括表1所示95对引物标签中的至少10对，并且
所述一组引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
37.权利要求36所述的一组引物标签，其包括表1所示95对引物标签中的至少20对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
38.权利要求36所述的一组引物标签，其包括表1所示95对引物标签中的至少30对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
39.权利要求36所述的一组引物标签，其中包括表1所示95对引物标签中的至少40对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
40.权利要求36所述的一组引物标签，其包括表1所示95对引物标签中的至少50对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
41.权利要求36所述的一组引物标签，其包括表1所示95对引物标签中的至少60对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
42.权利要求36所述的一组引物标签，其包括表1所示95对引物标签中的至少70对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
43.权利要求36所述的一组引物标签，其包括表1所示95对引物标签中的至少80对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个。
44.权利要求36所述的一组引物标签，其包括表1所示95对引物标签中的至少90对，并且
所述引物标签  至少包括表1所示95对引物标签中的PI-1至PI-10，或PI-11至PI-20，或PI-21至PI-30，或PI-31至PI-40，或PI-41至PI-50，或PI-51至PI-60，或PI-61至PI-70，或PI-71至PI-80，或PI-81至PI-90，或PI-91至PI-95，或者这些引物标签组合中任何两个或者多个的组合。
45.权利要求36所述的一组引物标签，其包括表1所示95对引物标签中的95对。
46.权利要求36-45中任一项所述的一组引物标签用于PCR测序方法的用途，其中，每一对引物标签与用于扩增待测目的序列的PCR引物对组合成一对标签引物，正反PCR引物的5’端分别具有正向引物标签和反向引物标签。
47.权利要求46所述的用途，其中，正反PCR引物的5’端分别通过连接序列连接正向引物标签和反向引物标签。
48.权利要求46所述的用途，其中PCR引物是用于扩增HLA的基因的PCR引物。
49.权利要求46所述的用途，其中PCR引物是用于扩增HLA-A/B的2，3，4号外显子以及HLA-DRB1 2号外显子的PCR引物。
50.权利要求46所述的用途，其中所述PCR引物如表2所示。
51.权利要求36-45中任一项所述的一组引物标签与用于扩增待测目的序列的PCR引物对组合成的一组标签引物，其中每一对引物标签与PCR引物对组合成一对标签引物，正反PCR引物的5’端各具有一个引物标签。
52.权利要求51所述的一组标签引物，其中，正反PCR引物的5’端分别通过连接序列连接一个引物标签。
53.权利要求51所述的一组标签引物，其中所述PCR引物是用于扩增HLA的基因的PCR引物。
54.权利要求51所述的一组标签引物，其中所述PCR引物是用于扩增HLA-A/B的2，3，4号外显子以及HLA-DRB1 2号外显子的PCR引物。
55.权利要求51所述的一组标签引物，其中所述PCR引物如表2所示。
56.权利要求51所述的一组标签引物用于PCR测序方法的用途。
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