CN101921842B - Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法 - Google Patents

Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于HLA-A，B基因分型的PCR引物，已经所述PCR引物基于测序方法用于HLA基因分析的方法。

Description

HLA-A,B基因分型用PCR引物及其使用方法
技术领域
本发明涉及核酸测序技术领域，特别是PCR测序技术领域。特别地，本发明提供了用于HLA-A，B(第二代测序法)基因分型的PCR引物。另一方面，本发明的方法涉及DNA序列的分型方法，特别是HLA基因高分辨率分型方法。 
背景技术
人类白细胞抗原，即HLA(human leukocyte antigen，HLA)，是迄今为止发现的多态性最高的基因系统之一，它是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统，与同种异体器官移植的排斥反应密切相关。研究发现，移植时，供受双方的HLA相关基因匹配程度越高，分辨率越高，移植物的存活时间越长。 
目前国际标准的HLA基因分型技术包括PCR-SSP(序列特异引物聚合酶链式反应)，PCR-SSO(聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交)和PCR-SBT(聚合酶链式反应产物直接测序分型)。 
HLA-SSP的原理是设计出一整套等位基因组特异性引物，借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，通过电泳分析决定HLA型别。HLA-SSO的原理是设计HLA型别特异的寡核苷酸序列作为探针，把PCR产物标记，以PCR产物(待检测基因DNA)与探针杂交。通过检测荧光信号判断HLA型别。HLA-SSP和HLA-SSO的检测信号均是模拟信号，分辨率只能到达中低水平且都不能检测新的等位基因。 
HLA-SBT是一种通过对HLA基因的相关区域(HLA-A/B基因分型一般同时扩增2，3，4外显子用于分型，其PCR产物长度都在1kb以上)PCR扩增后的DNA产物直接进行Sanger法测序(毛细管 微电泳)，测定核酸序列，从而判断HLA基因型别的高分辨分型方法，其具有直观、高分辨且能检测新的等位基因的特点。HLA-SBT整个实验流程复杂、通量低和实验成本高等缺点使其很难应用于大规模HLA高分辨分型项目。 
基于以Illumina GA(Illumina公司的Genome Analyzer测序仪)和Roche 454(Roche公司)为代表的第二代测序法(以下简称新测序技术)的HLA-SBT也是一种通过对PCR扩增后的DNA产物直接测定核酸序列，从而判断HLA基因型别的高分辨分型方法，其除了原有直观、高分辨且能检测新等位基因的特点外，还具有单分子测序特点。其结合PCR-index/barcode技术，通过在PCR引物的5’末端添加引物标签(primer index)序列合成标签引物，可在PCR过程中对每个样本引入独特的引物标签，使样本在利用第二代DNA测序技术检测过程中，除PCR环节必须逐个样本处理外，其它实验环节可把多个样本混在一起同时处理，最终每个样本的检测结果可以通过其独特的引物标签序列找回；使该方法具有成本低，通量大和可同时检测大量样本的多个不同基因位点的特点。但与第一代测序技术(以Sanger法测序原理为基础的测序技术)相比，能用于新测序技术测序文库制备的DNA长度不能太长(Illunina GA的最大适用长度为700bp)，再加上新测序技术读长普遍偏短，当前Illumina GA双向读长只能达到200bp，原用于HLA-SBT方法的PCR引物不再适用。结合HLA新测序技术的特点，PCR产物的长度不宜超过700bp。 
发明内容
鉴于现有新测序技术对DNA模板长度的要求和新测序技术读长偏短的事实，原用于HLA-SBT方法的PCR引物不再适用以新测序技术为基础的HLA高分辨分型方法。本发明设计了一套全新的分别单独扩增HLA-A，B基因的2，3，4号外显子的特异性和保守性良好的PCR引物，且PCR产物长度不大于700bp，特别适用于Illumina GA(当前Illumina GA适用的最大DNA长度为700bp)。本发明所提供 的一套PCR引物可用于对受试者(特别是人)进行大规模、高通量和低成本的HLA基因分型。 
本发明采用的技术方案是，从IMGT/HLA因特网站点(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)下载所有最新HLA-A/B基因序列，然后保存到本地磁盘中做为HLA-A数据集；同时下载所有最新非HLA-A的HLA-I类基因序列做为比较数据集。将两数据集进行比较，在2，3，4号外显子两端和内部寻找各基因位点保守和特异序列，并将设计的PCR引物序列与人类全基因组序列进行同源性比较。由于HLA-A/B基因与同属于HLA-I类分子的其它基因具有很高的序列相似性，在设计PCR引物时尽量保证引物3’末端特异，确保引物扩增HLA-A/B基因的特异性。同时使PCR产物的长度小于700bp，且正反引物的退火温度基本保持一致。 
将满足设计要求的多对候选HLA-A/B引物用于扩增少数具有HLA-A/B常见血清型的模板DNA，从中筛选出保守性和特异性最好的，分别用于扩增2，3，4号外显子的6对HLA-A/B的PCR引物。 
用筛选出的6对PCR引物为基础引物，并以此设计95套标签引物分别扩增95个具有HLA-A/B常见血清型的DNA模板(该部分模板的HLA型别包括所有常见HLA-A/B的血清型)。所有PCR产物等量混合后用Illumina GA Pair-End 100测序，组装后的测序结果通过分型与原分型结果比较来验证PCR引物的保守性和特异性。 
本发明设计的HLA-A，B位点引物，即分别用于扩增2，3，4号外显子的6对HLA-A/B的PCR引物见表1。 
表1HLA-A，B位点PCR引物 
Figure BSA00000171236100031
本发明一方面提供了一套用于HLA-A，B基因分型的PCR引物，其特征在于所述PCR引物如表1所示。 
本发明另一方面提供了表1所示的PCR引物的用于测序的方法，其包括： 
提供样品，特别是是血样，所述血样优选地来自哺乳动物，特别是人； 
扩增：使用所述PCR引物用于扩增血样来源的DNA从而得到PCR产物，并对PCR产物进行纯化； 
测序：对所述PCR产物进行测序，测序方法可以是Sanger测序法，或者可以是第二代测序法(例如HiSeq 2000、Illumina GA和Roche454) 
本发明另一方面提供了表1所示的PCR引物用于HLA基因分型的用途，其特征在于使用上述的PCR引物，根据上述方法得到的测序结果进行组装和比对分析，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，得到HLA基因分型结果。 
另一方面，本发明还提供了一种用于进行HLA基因分型的试剂盒，所述试剂盒中包括本发明的PCR引物。 
本发明另一方面中，提供了一种HLA分型的方法，其包括： 
1)提供n个样品，n为大于等于1的整数，所述样品优选地来自哺乳动物，更优选是人，特别是人的血样； 
2)将待分析的n个样品分成m个小组，m为整数且n≥m≥1； 
3)扩增：对于每一个样品，使用一对标签引物，在存在来自该样品的模板时，在适于扩增目的核酸的条件下进行PCR扩增，其中，每一对标签引物由包含引物标签的正向标签引物和反向标签引物(均可以是简并引物)构成，其中正向标签引物和反向标签引物所包含的引物标签可以相同或者不同；不同样品所用标签引物对中的引物标签彼此不同； 
4)混合：将各样品的PCR扩增产物混合在一起，获得PCR产物文库； 
5)打断：将所得的PCR产物文库进行不完全打断； 
6)建库：结合文库接头标签技术，将打断后的PCR产物文库构建PCR-Free测序文库，回收位于所用测序仪最大读长长度到所用测序仪适用的最长DNA长度范围之间的所有DNA条带，可以对文库添加不同的文库接头(adapter)以区分不同的PCR-Free测序文库； 
7)测序：将回收的DNA混合物利用二代测序技术，优选的是Pair-End技术(例如Illumina GA)进行测序，获得打断后的DNA的序列； 
8)拼接：基于各个文库不同的文库接头序列和每个样品独特的引物标签将获得的测序结果与样品一一对应，利用比对程序(例如Blast，BWA程序)把各个测序序列定位到PCR产物的相应DNA参考序列上，通过序列重叠和连锁关系，从打断后的DNA的序列拼接出完整的目的核酸。 
在本发明的一个具体实施方式中，在上文所述的方法中，所述结合文库接头标签技术，将打断后的PCR产物文库构建PCR-Free测序文库是指使用m种文库接头给4)中得到的m个PCR产物文库加上接头，其中每一个PCR产物文库使用一种不同的文库接头，从而构建m个接头标签测序文库；将m个接头标签测序文库等摩尔混合在一起构建混合接头标签测序文库。其中连接文库接头的方法是指不通过PCR程序直接采用DNA连接酶进行连接。 
在本发明的一个具体实施方式中，在上文所述的方法中，每一对 引物标签与PCR引物对组合成一对标签引物，正反PCR引物的5’端分别具有(或者任选通过连接序列连接)正向引物标签和反向引物标签。 
在本发明的一个具体实施方式中，在上文所述的方法中，所述PCR引物是用于扩增HLA的特定基因的PCR引物，优选是用于扩增HLA-A/B 2，3，4号外显子和HLA-DRB12号外显子的PCR引物，优选的所述PCR引物如表3所示。 
本发明所提供的一套用于HLA基因分型的PCR引物，其中 
1)6对PCR引物扩增HLA-A、B两位点2，3，4号外显子的序列，PCR产物长度均在700bp以内。 
2)引物保守性良好和特异性良好。 
附图说明
图1：为1号样本HLA-A/B/DRB1相应外显子PCR产物电泳结果，从电泳图上看，PCR产物为一系列片段大小300bp-500bp的单一条带，其中泳道M是分子量标记物(DL 2000，Takara公司)，泳道1-7为1号样本的HLA-A/B/DRB1各外显子(A2、A3、A4、B2、B3、B4、DRB1-2)PCR扩增产物，阴性对照(N)无扩增条带。其它样品的结果与此类似。 
图2：为HLA-Mix打断后DNA电泳情况(割胶前后)，割胶区域为450-750bp区域。其中泳道M是分子量标记物(NEB-50bp DNALadder)，泳道1是割胶前HLA-Mix的电泳情况，泳道2是割胶后HLA-Mix的胶图。 
图3：1号样本一致性(consensus)序列构建程序截图，示例说明了根据引物标签和DNA片段之间的重叠关系拼接出PCR产物的完整序列。关于HLA分型命名的查询可见于http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/align.html。从左侧结果输出栏里面我们看到了A＊02:03:01A＊11:01:01的所有编码序列的结果，其中2号外显子的序列与1号模板原已知结果相同。 
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。 
在本发明的实施例中，采用本发明的PCR引物和HLA-DRB12号外显子的PCR引物，对95例已知HLA常见基因型别的血样进行HLA-A/B/DRB1位点PCR扩增，扩增产物经Illumina GA Pair-End100测序，测序结果经过组装和比对分析得到样品的分型结果。 
实施例1
样本提取 
使用KingFisher自动提取仪(美国Thermo公司)从95份已知HLA-SBT分型结果的血样(中国造血干细胞捐献者资料库(以下称“中华骨髓库”))中提取DNA。主要步骤如下：取出6个Kingfisher自动提取仪配套的深孔板及1个浅孔板，根据说明书分别加入一定量配套的试剂并做好标记，将所有已加好试剂的孔板按要求置于相应的位置，选定程序“Bioeasy_200ul Blood DNA_KF.msz”程序，按下“star”执行该程序进行核酸提取。程序结束后收集plate Elution中的100ul左右的洗脱产物即为提取的DNA。 
实施例2
通过合成在5’末端具有不同引物标签的PCR引物制作不同的PCR标签引物，这样不同的PCR标签引物可以用于不同的样本，所述PCR引物是针对HLA-A/B的2，3，4号外显子以及HLA-DRB12号外显子的PCR引物。其后通过PCR反应在PCR产物两端引入引物标签，从而特异地标记了来自不同样本的PCR产物。 
以95套PCR标签引物来分别扩增95份DNA样本，每套PCR标签引物由一对双向引物标签(表2)和用于扩增HLA-A/B的2，3，4号外显子以及HLA-DRB12号外显子的PCR引物(表3)组成，其 中每个正向PCR引物的5’末端上连接一对引物标签的正向引物标签，而反向PCR引物的5’末端上连接一对引物标签的反向引物标签。引物标签在引物合成时直接添加在PCR引物的5’末端。 
把实施例1的样本提取步骤中所得的95份DNA，依次编号1-95，PCR反应在96孔板中进行，共7板，编号分别为HLA-P-A2、HLA-P-A3、HLA-P-A4、HLA-P-B2、HLA-P-B3、HLA-P-B4以及HLA-P-DRB1-2(A2/3/4、B2/B3/B4、DRB1-2表示扩增的位点)，板内设置一个不添加模板的阴性对照，阴性对照所用引物与模板1的对应引物相同。实验的同时，记录下每对引物标签对应的样本编号信息。 
表2，引物标签的相关信息 
  引物标签   编号   正向引物标签   反向引物标签   对应96孔板   位置   对应模板   (组1)
  PI-1   TCGCAGACATCA   TGACACGATGCT   A1   1
  PI-2   TACATCGCACTA   TACAGATGCTGA   A2   2
  PI-3   CTCGATGAGTAC   ACGTCTAGACAC   A3   3
  PI-4   TCTGTATACTCA   TGCTGTAGTGAC   A4   4
  PI-5   TATCTGCTCATA   AGATATCGAGCT   A5   5
  PI-6   TACATGCTGAGC   ACGTGTCTATCA   A6   6
  PI-7   TCATATCGCGAT   AGATCGTATAGC   A7   7
  PI-8   ACAGATGCACGC   ATCTCGTGACAG   A8   8
  PI-9   TAGATCGTACAT   ACTAGTACACGC   A9   9
  PI-10   ACTACACGTCTC   ATAGTCACGCGT   A10   10
  PI-11   AGACTCGCGTAT   TACTAGCTGACG   A11   11
  PI-12   ATACTAGTGCTC   TGTATCGTGCTC   A12   12
  PI-13   CACGATGACATC   TAGTGAGCGCAC   B1   13
  PI-14   TGCTGTCTCGAG   CATAGCAGTGTC   B2   14
  PI-15   TGTGCTCGAGTC   TCTGATCGAGCA   B3   15
  PI-16   CACTCGTACATC   AGCGATGCTCAT   B4   16
  PI-17   CGACGTGCTCGC   CGCGTACTGCAG   B5   17
[0051] 
  PI-18   ACGCATCTATAC   CTAGTATCGCAG   B6   18
  PI-19   CGAGATGACTCT   TGTATACACGAT   B7   19
  PI-20   ACTGTCTCGAGC   ACGTAGCGCACA   B8   20
  PI-21   CATCTGCTATAG   TCTAGCTCATGA   B9   21
  PI-22   ACGCACTCTAGA   CTATGCACTGAT   B10   22
  PI-23   TGAGATACAGTA   ATCTGCTATGAC   B11   23
  PI-24   ACTCATCGTGCT   TAGAGCTGTCAC   B12   24
  PI-25   TACACTGTCTAT   CAGCACATAGAT   C1   25
  PI-26   CACAGTACTCGC   CTGCTAGTGTAT   C2   26
  PI-27   TGTACTATCATA   TGTGATAGACAC   C3   27
  PI-28   CTAGTACTGACG   AGCGAGTCTACT   C4   28
  PI-29   TAGACTGAGCTA   ACATACTGAGAC   C5   29
  PI-30   CAGACGCGTGAG   TACATCTCGTAT   C6   30
  PI-31   CGCGACATCACG   TAGCGATGAGAC   C7   31
  PI-32   ACACTCATAGAT   CTATCATGACAC   C8   32
  PI-33   AGCGTATACTAG   CATACTCACGTA   C9   33
  PI-34   TGTCGTGCTATC   ACATGACTCACG   C10   34
  PI-35   CGCTAGACTGTA   TACTATAGTCGA   C11   35
  PI-36   ACAGTGTAGCGC   TGATATGCTACA   C12   36
  PI-37   CACTCTATCGAC   TCACGCGATGAG   D1   37
  PI-38   ACACTCTAGTCA   ACGTAGATCTAT   D2   38
  PI-39   CATATGAGATCG   AGCAGAGTGCTC   D3   39
  PI-40   CAGCTATCATAC   CACTGCAGACGA   D4   40
  PI-41   TATACTCTAGAT   TGCATAGAGCGC   D5   41
  PI-42   TGTATGCTCGTC   TCGTGACAGATC   D6   42
  PI-43   TAGTGATGCTCT   ACGAGCTGATAT   D7   43
  PI-44   AGACTCTGAGTC   CTGATAGTATCA   D8   44
  PI-45   CTCATAGACTAC   ATCGCGAGTGAC   D9   45
  PI-46   TCGCTCACTACA   TGTCTCGACATC   D10   46
[0052] 
  PI-47   ATAGAGTCTCAT   CGCATAGCGTAT   D11   47
  PI-48   CGAGACACTCGC   TCGTAGTCTACA   D12   48
  PI-49   CAGCATACTATC   TCGTGATACAGA   E1   49
  PI-50   CAGCTATAGTCT   ATGCAGATATCT   E2   50
  PI-51   TCTATCGATGCA   ACACGCAGATCG   E3   51
  PI-52   CATGAGTATAGC   CTAGCTGACGTA   E4   52
  PI-53   TAGCATATCGAG   TACACGTATGAG   E5   53
  PI-54   ACGACTCGCTAC   TCATGACTAGTA   E6   54
  PI-55   TAGCATACACGC   TGACGCGTATAC   E7   55
  PI-56   CGTCATATGCAG   TATAGCGATGAC   E8   56
  PI-57   TGCAGCGAGTAC   TCGACGCTAGCG   E9   57
  PI-58   CGTGTCGACAGA   CAGTCGTGAGCA   E10   58
  PI-59   ACTCGACGTGAG   ACGCGAGTGATA   E11   59
  PI-60   ACTCGTCTGACG   TGCTATCACTGA   E12   60
  PI-61   CATACTGTATCT   TACATAGATGTC   F1   61
  PI-62   TCTACTCGTGAC   CACGTATAGTGA   F2   62
  PI-63   CTGCACTAGACA   ACTCATATCGCA   F3   63
  PI-64   ACACGAGCTCAT   CACTCATATCGA   F4   64
  PI-65   TACAGATAGTCT   TCGTCTGTGATA   F5   65
  PI-66   TACACTCGTGCT   TGACGCTCATCT   F6   66
  PI-67   TACATGTGACGA   TCGTACATGCTC   F7   67
  PI-68   TGTATGATCTCG   CACTGTGCTCAT   F8   68
  PI-69   CAGTACACTCTA   ACTGCATGATCG   F9   69
  PI-70   CATACTATCACG   TCGTGTCACTAC   F10   70
  PI-71   CACTATACAGAT   CGACACGTACTA   F11   71
  PI-72   ATATCGTAGCAT   TCGTGATCACTA   F12   72
  PI-73   TAGTCTATACAT   AGACGCTGTCGA   G1   73
  PI-74   TGTCACAGTGAC   TCATATGATCGA   G2   74
  PI-75   ATCGACTATGCT   CGATCATATGAG   G3   75
[0053] 
  PI-76   ATACTAGCATCA   TCATGCTGACGA   G4   76
  PI-77   CACTGACGCTCA   CACTACATCGCT   G5   77
  PI-78   TCGCTCATCTAT   TAGTACAGAGCT   G6   78
  PI-79   TGTATCACGAGC   ATGATCGTATAC   G7   79
  PI-80   TACTGCTATCTC   CGCTGCATAGCG   G8   80
  PI-81   CGCGAGCTCGTC   ACTCGATGAGCT   G9   81
  PI-82   TAGAGTCTGTAT   TGTCTATCACAT   G10   82
  PI-83   TACTATCGCTCT   TATGTGACATAC   G11   83
  PI-84   TAGATGACGCTC   TACTCGTAGCGC   G12   84
  PI-85   TCGCGTGACATC   ATCTACTGACGT   H1   85
  PI-86   ACACGCTCTACT   ACAGTAGCGCAC   H2   86
  PI-87   TACATAGTCTCG   CTAGTATCATGA   H3   87
  PI-88   TGAGTAGCACGC   TCGATCATGCAG   H4   88
  PI-89   TAGATGCTATAC   TACATGCACTCA   H5   89
  PI-90   ATCGATGTCACG   CAGCTCGACTAC   H6   90
  PI-91   ATCATATGTAGC   CTCTACAGTCAC   H7   91
  PI-92   TAGCATCGATAT   AGATAGCACATC   H8   92
  PI-93   TGATCGACGCTC   CTAGATATCGTC   H9   93
  PI-94   TGCAGCTCATAG   TACAGACTGCAC   H10   94
  PI-95   CGACGTAGAGTC   CAGTAGCACTAC   H11   95
表3，未添加引物标签前用于扩增HLA-A/B/DRB1相应外显子的PCR引物 
Figure BSA00000171236100111
Figure BSA00000171236100121
D2-F1，D2-F2，D2-F3，D2-F4，D2-F5，D2-F6，D2-F7为扩增HLA-DRB12号外显子的正向引物，D2-R为扩增HLA-DRB12号外显子的反向引物。 
HLA-A/B/DRB1的PCR程序如下： 
96℃2min 
95℃30s→60℃30s→72℃20s(32cycles) 
15℃∞ 
HLA-A/B的PCR反应体系如下 
  Promega 5×buffer I(Mg2+plus)   5.0ul
  dNTP Mixture(各2.5mM)   2.0ul
  PInf-A/B-F2/3/4(2pmol/ul)   1.0ul
  PInr-A/B-R2/3/4(2pmol/ul)   1.0ul
[0064] 
  Promega Taq(5U/ul)   0.2ul
  DNA(约20ng/ul)   5.0ul
  ddH2O   10.8ul
  Total   25.0ul
HLA-DRB1的PCR反应体系如下：
 Promega 5×buffer I(Mg2+plus)   5.0ul
 dNTP Mixture(各2.5mM)   2.0ul
 PInf-D2-F1(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F2(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F3(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F4(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F5(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F6(2pmol/ul)   1.0ul
 PInf-D2-F7(2pmol/ul)   1.0ul
 PInr-D2-R(2pmol/ul)   1.0ul
 Promega Taq(5U/ul)   0.2ul
 DNA(约20ng/ul)   5.0ul
 ddH2O   4.8ul
 Total   25.0ul
其中PInf-A/B/D2-F1/2/3/4/5/6/7表示引物5’末端带有第n号正向引物标签序列(表1)的HLA-A/B/DRB1的F引物，PInf-A/B/D2-R2/3/4表示引物5’末端带有第n号反向引物标签序列的HLA-A/B/DRB1的R引物(此处n≤95)，其它依次类推。且每个样本对应特定的一套PCR引物(PInf-A/B/D2-F1/2/3/4/5/6/7，PInf-A/B/D2-R2/3/4)。 
PCR反应在Bio-Rad公司的PTC-200PCR仪上运行。PCR完成后，取2ul PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。图1显示了1号样本HLA-A/B/DRB1相应外显子PCR产物电泳结果，DNA分子标记为DL2000(Takara公司)，胶图上有一系列片段大小为300bp-500bp单一 条带，表明1号样本的HLA-A/B/DRB1各外显子(A2、A3、A4、B2、B3、B4、DRB1-2)PCR扩增成功，阴性对照(N)无扩增条带。其它样品的结果与此类似 
实施例3
PCR产物混合和纯化 
从96孔板HLA-P-A2剩余的PCR产物中(阴性对照除外)各取20ul混合在一个3ml的EP管中，标记为HLA-A2-Mix，对其它6个96孔板进行同样的操作，分别标记为HLA-A3-Mix、HLA-A4-Mix、HLA-B2-Mix、HLA-B3-Mix、HLA-B4-Mix和HLA-D2-Mix，震荡混匀，从HLA-A2-Mix、HLA-A3-Mix、HLA-A4-Mix、HLA-B2-Mix、HLA-B3-Mix、HLA-B4-Mix和HLA-D2-Mix中各取200ul混合在一个3ml的EP管中，标记为HLA-Mix，从HLA-Mix中取500ul DNA混合物经Qiagen DNA Purification kit(QIAGEN公司)过柱纯化(具体纯化步骤详见说明书)，纯化所得的200ul DNA，经Nanodrop8000(Thermo Fisher Scientific公司)测定HLA-Mix DNA浓度为48ng/ul。 
实施例4
PCR产物的打断，以及Illumina GA PCR-Free测序文库的构建 
1.DNA打断 
从纯化后的HLA-Mix中取总量5ug的DNA用CovarismicroTube with AFA fiber and Snap-Cap在Covaris S2(Covaris公司)上打断。打断条件如下： 
频率扫描(frequency sweeping) 
  负载比(Duty Cycle)   10％
  强度(Intensity)   5
  循环/脉冲(Cycles/Burst)   200
  时间(秒)(Time seconds)   300
[0078] 2.打断后纯化 
将HLA-Mix的所有打断产物用QIAquick PCR Purification Kit回收纯化，分别溶于37.5ul的EB(QIAGEN Elution Buffer)中； 
3.末端修复反应 
对打断后纯化的HLA-Mix进行DNA末端修复反应，体系如下(试剂均购自Enzymatics公司)： 
Figure BSA00000171236100151
反应条件为：Thermomixer(Eppendorf公司)20℃温浴30min。 
反应产物经QIAquick PCR Purification Kit回收纯化，溶于34μl的EB(QIAGEN Elution Buffer)中。 
4.3’末端加A反应 
上一步回收DNA的3’末端加A反应，体系如下(试剂均购自Enzymatics公司)： 
Figure BSA00000171236100152
反应条件为：Thermomixer 37℃温浴30min。 
反应产物经MiniElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)回收纯化，溶于13μl的EB溶液(QIAGEN Elution Buffer)中。 
5.连接Illumina GA PCR-Free文库接头(adaptor) 
术语“PCR-Free文库接头(adapter)”是指经设计的一段碱基，其主要作用是辅助固定DNA分子在测序芯片上以及提供通用测序引物的结合位点，PCR-Free文库接头可以通过DNA连接酶将其直接连接至测序文库中的DNA片段两端，接头的导入过程因为没有PCR的参与，因此称作PCR-Free文库接头。 
加A后的产物连接Illumina GA PCR-Free文库接头，体系如下(试剂均购自Illumina公司)： 
Figure BSA00000171236100161
反应条件为：Thermomixer 20℃温浴15min。 
反应产物经Ampure Beads(Beckman Coulter Genomics)纯化后溶于50ul去离子水，经荧光定量PCR(QPCR)检测到DNA浓度结果如下： 
    qPCR检测结果(nM)
  HLA-Mix   78.90
6.割胶回收 
取30μL HLA-Mix用2％低熔点琼脂糖胶进行回收。电泳条件为100V，100min。DNA marker为NEB公司的50bp DNA marker。割胶回收450-750bp长度范围的DNA片段(附图2)。胶回收产物经QIAquickPCR Purification Kit(QIAGEN公司)回收纯化，纯化后体积为32ul， 经荧光定量PCR(QPCR)检测到DNA浓度结果为10.16nM。 
实施例5
Illumina GA测序 
根据QPCR检测结果，取10pmol DNA用Illumina GA PE-100程序测序，具体操作流程详见Illumina GA操作说明书(Illumina GAIIx)。 
实施例6
结果分析 
Illumina GA产出的测序结果是一系列DNA序列，通过查找测序结果中的正反引物标签序列和引物序列，建立各个引物标签对应样本HLA-A/B/DRB1各外显子PCR产物测序结果的数据库。通过BWA(Burrows-Wheeler Aligner)把各外显子的测序结果定位在相应外显子的参考序列上(参考序列来源：http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)同时，构建各个数据库的一致性(consensus)序列，再对数据库中DNA序列进行筛选和测序错误校正。校正后的DNA序列通过序列重叠(overlap)和连锁(Pair-End连锁)关系可组装成HLA-A/B/DRB1各外显子相应的序列。所得DNA序列利用与IMGT HLA专业数据库中HLA-A/B/DRB1相应各外显子的序列数据库比对，序列比对结果100％匹配的即为对应样本的HLA-A/B/DRB1基因型别。可参考图3示例说明的1号样品的HLA-A位点的2号外显子一致性序列构建程序的截图。 
所有95个样本，得到的分型结果与原已知分型结果完全相符，其中1-32号样本的具体结果如下： 
样本编号                原HLA-A/B/DRB1型别 
1    A＊02:03  A＊11:01  B＊38:02  B＊48:01  DRB1＊14:54  DRB1＊15:01 
2    A＊01:01  A＊30:01  B＊08:01  B＊13:02  DRB1＊03:01  DRB1＊07:01 
3    A＊01:01  A＊02:01  B＊15:11  B＊47:01  DRB1＊13:02  DRB1＊15:01 
4    A＊24:08  A＊26:01  B＊40:01  B＊51:01  DRB1＊04:04  DRB1＊09:01 
5    A＊01:01  A＊24:02  B＊54:01  B＊55:02  DRB1＊04:05  DRB1＊09:01 
6    A＊01:01  A＊03:02  B＊15:11  B＊37:01  DRB1＊10:01  DRB1＊14:54 
7     A＊11:01  A＊30:01  B＊13:02  B＊15:18  DRB1＊04:04  DRB1＊07:01 
8     A＊01:01  A＊02:01  B＊35:03  B＊81:01  DRB1＊11:01  DRB1＊15:01 
9     A＊02:06  A＊31:01  B＊27:07  B＊40:02  DRB1＊03:01  DRB1＊13:02 
10    A＊01:01  A＊66:01  B＊37:01  B＊49:01  DRB1＊10:01  DRB1＊13:02 
11    A＊01:01  A＊03:01  B＊35:01  B＊52:01  DRB1＊01:01  DRB1＊15:02 
12    A＊11:01  A＊11:01  B＊15:01  B＊15:05  DRB1＊04:06  DRB1＊15:01 
13    A＊01:01  A＊11:02  B＊07:02  B＊15:02  DRB1＊09:01  DRB1＊15:01 
14    A＊01:01  A＊02:01  B＊52:01  B＊67:01  DRB1＊15:02  DRB1＊16:02 
15    A＊01:01  A＊02:05  B＊15:17  B＊50:01  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01 
16    A＊01:01  A＊11:01  B＊37:01  B＊40:02  DRB1＊10:01  DRB1＊12:02 
17    A＊24:07  A＊32:01  B＊35:05  B＊40:01  DRB1＊03:01  DRB1＊04:05 
18    A＊11:01  A＊24:02  B＊13:01  B＊35:01  DRB1＊16:02  DRB1＊16:02 
19    A＊11:01  A＊11:01  B＊40:02  B＊55:12  DRB1＊04:05  DRB1＊15:01 
20    A＊02:11  A＊24:02  B＊40:01  B＊40:06  DRB1＊11:01  DRB1＊15:01 
21    A＊01:01  A＊02:06  B＊51:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊12:01 
22    A＊01:01  A＊29:01  B＊07:05  B＊15:01  DRB1＊04:05  DRB1＊07:01 
23    A＊01:01  A＊02:07  B＊37:01  B＊46:01  DRB1＊04:03  DRB1＊10:01 
24    A＊24:85  A＊30:01  B＊13:02  B＊55:02  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01 
25    A＊11:01  A＊31:01  B＊07:06  B＊51:01  DRB1＊12:02  DRB1＊14:05 
26    A＊01:01  A＊11:01  B＊46:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊08:03 
27    A＊01:01  A＊02:01  B＊15:18  B＊37:01  DRB1＊04:01  DRB1＊15:01 
28    A＊01:01  A＊24:02  B＊37:01  B＊46:01  DRB1＊09:01  DRB1＊10:01 
29    A＊26:01  A＊66:01  B＊40:40  B＊41:02  DRB1＊12:01  DRB1＊15:01 
30    A＊02:01  A＊29:02  B＊13:02  B＊45:01  DRB1＊03:01  DRB1＊12:02 
31    A＊01:01  A＊11:03  B＊15:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01 
32    A＊11:01  A＊26:01  B＊35:03  B＊38:01  DRB1＊11:03  DRB1＊14:04 
样本编号                测得的HLA-A/B/DRB1型别 
1     A＊02:03  A＊11:01  B＊38:02  B＊48:01  DRB1＊14:54  DRB1＊15:01 
2     A＊01:01  A＊30:01  B＊08:01  B＊13:02  DRB1＊03:01  DRB1＊07:01 
3     A＊01:01  A＊02:01  B＊15:11  B＊47:01  DRB1＊13:02  DRB1＊15:01 
4     A＊24:08  A＊26:01  B＊40:01  B＊51:01  DRB1＊04:04  DRB1＊09:01 
5     A＊01:01  A＊24:02  B＊54:01  B＊55:02  DRB1＊04:05  DRB1＊09:01 
6     A＊01:01  A＊03:02  B＊15:11  B＊37:01  DRB1＊10:01  DRB1＊14:54 
7     A＊11:01  A＊30:01  B＊13:02  B＊15:18  DRB1＊04:04  DRB1＊07:01 
8     A＊01:01  A＊02:01  B＊35:03  B＊81:01  DRB1＊11:01  DRB1＊15:01 
9     A＊02:06  A＊31:01  B＊27:07  B＊40:02  DRB1＊03:01  DRB1＊13:02 
10    A＊01:01  A＊66:01  B＊37:01  B＊49:01  DRB1＊10:01  DRB1＊13:02 
11    A＊01:01  A＊03:01  B＊35:01  B＊52:01  DRB1＊01:01  DRB1＊15:02 
12    A＊11:01  A＊11:01  B＊15:01  B＊15:05  DRB1＊04:06  DRB1＊15:01 
13    A＊01:01  A＊11:02  B＊07:02  B＊15:02  DRB1＊09:01  DRB1＊15:01 
14    A＊01:01  A＊02:01  B＊52:01  B＊67:01  DRB1＊15:02  DRB1＊16:02 
15    A＊01:01  A＊02:05  B＊15:17  B＊50:01  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01 
16    A＊01:01  A＊11:01  B＊37:01  B＊40:02  DRB1＊10:01  DRB1＊12:02 
17    A＊24:07  A＊32:01  B＊35:05  B＊40:01  DRB1＊03:01  DRB1＊04:05 
18    A＊11:01  A＊24:02  B＊13:01  B＊35:01  DRB1＊16:02  DRB1＊16:02 
19    A＊11:01  A＊11:01  B＊40:02  B＊55:12  DRB1＊04:05  DRB1＊15:01 
20    A＊02:11  A＊24:02  B＊40:01  B＊40:06  DRB1＊11:01  DRB1＊15:01 
21    A＊01:01  A＊02:06  B＊51:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊12:01 
22    A＊01:01  A＊29:01  B＊07:05  B＊15:01  DRB1＊04:05  DRB1＊07:01 
23    A＊01:01  A＊02:07  B＊37:01  B＊46:01  DRB1＊04:03  DRB1＊10:01 
24    A＊24:85  A＊30:01  B＊13:02  B＊55:02  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01 
25    A＊11:01  A＊31:01  B＊07:06  B＊51:01  DRB1＊12:02  DRB1＊14:05 
26    A＊01:01  A＊11:01  B＊46:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊08:03 
27    A＊01:01  A＊02:01  B＊15:18  B＊37:01  DRB1＊04:01  DRB1＊15:01 
28    A＊01:01  A＊24:02  B＊37:01  B＊46:01  DRB1＊09:01  DRB1＊10:01 
29    A＊26:01  A＊66:01  B＊40:40  B＊41:02  DRB1＊12:01  DRB1＊15:01 
30    A＊02:01  A＊29:02  B＊13:02  B＊45:01  DRB1＊03:01  DRB1＊12:02 
31    A＊01:01  A＊11:03  B＊15:01  B＊57:01  DRB1＊07:01  DRB1＊15:01 
32    A＊11:01  A＊26:01  B＊35:03  B＊38:01  DRB1＊11:03  DRB1＊14:04 
注：HLA-DRB1型别中的DRB1＊1201不排除DRB1＊1206/1210/1217的可能性，DRB1＊1454不排除DRB1＊1401的可能性，因为上述等位基因在HLA-DRB12号外显子的序列完全相同。 
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。 
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Figure ISA00000171236300011
Figure ISA00000171236300031
Figure ISA00000171236300041
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Figure ISA00000171236300221
Figure ISA00000171236300231
Figure ISA00000171236300241
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Claims (7)

1.一套用于HLA-A，B基因分型的PCR引物，其特征在于所述PCR引物如表1所示。
2.权利要求1所述的PCR引物，其中所述分型是基于测序法，包括第二代测序法，和Sanger法。
3.权利要求1所述的PCR引物的用于测序的方法，其包括：
提供样品，所述样品是血样；
扩增：使用所述PCR引物用于扩增血样来源的DNA从而得到PCR产物，并对PCR产物进行纯化；
测序：对所述PCR产物进行测序，测序方法是Sanger测序法，或者是第二代测序法。
4.权利要求3所述的方法，其中所述血样来自人。
5.权利要求3所述的方法，其中所述第二代测序法是HiSeq2000、Illumina GA和Roche454。
6.权利要求1所述的PCR引物用于HLA基因分型的用途，其特征在于使用权利要求1所述的PCR引物，根据权利要求2的方法得到的结果进行组装和比对分析，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，得到HLA基因分型结果。
7.一种用于进行HLA基因分型的试剂盒，所述试剂盒中包括权利要求1所述的PCR引物。
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