CN116574791A - 一种快速hla测序分型组合试剂盒及分析方法 - Google Patents

一种快速hla测序分型组合试剂盒及分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种快速HLA测序分型组合试剂盒及分析方法。本发明公开了一种快速HLA测序分型组合试剂盒，其包含HLA基因PCR扩增试剂盒和测序试剂盒，其中HLA基因PCR扩增试剂盒中含有HLA基因特异性扩增引物组，同时还公开了快速HLA测序分型的分析方法。本发明可在5小时内获得样本的HLA不同类型的序列数据，并一次性达到HLA分型的最高分辨率，可对套峰的数据进行分析，增加了数据的可利用性。

Description

一种快速HLA测序分型组合试剂盒及分析方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种快速HLA测序分型组合试剂盒及分析方法。
背景技术
人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)系统是机体免疫系统的重要组成部分，在机体的抗原呈递和免疫应答中发挥重要作用。HLA基因与人类多种疾病的发生、发展和预后密切相关。人类的I类基因位点命名为HLA-A、HLA-B、HLA-C，分布于所有的组织细胞上，为细胞膜上的移植抗原，是引起移植后排斥反应发生的主要抗原。Ⅱ类基因则命名为HLA-D，HLA-D又分为HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等亚区，主要分布于免疫细胞上，它们可以作为免疫细胞间识别标记而诱发免疫应答和调节免疫细胞间的相互作用，在免疫应答反应中发挥重要作用。Ⅲ类基因区位于HLA-I、Ⅱ类基因区之间，由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因组成。这些基因在机体的免疫及机体对外界环境的适应性方面均有重要作用。准确的HLA抗原分型技术无疑在基础研究和临床应用上都有很重要的意义。
HLA分型主要应用于组织配型、输血配型、疾病相关等位基因检测及遗传进化分析等方面。现有的HLA分型技术：1、PCR-SSP方法：借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，其优点是简单易行,分辨率可从低到高,成本低，但其缺点是不易自动化，不能检测新的等位基因，不能识别非经典的HLA基因和假基因；2、PCR-SSO方法：主要为Onelambda试剂盒检测分型，是针对目前已有的类型进行检测，此方法具有灵敏度、特异性强、需样本量少等优点，但不同探针的杂交条件的须严格统一(如温度，离子强度),易出现误差，不能检测新等位基因，对某些杂合子分辨率也不好；3、PCR-SBT测序分型：通过PCR扩增所要分析的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型，其分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因，但是由于杂合子的存在，无法分辨单元型。只能进行局部(外显子)测序而使模棱两可基因分型结果的出现比率较高。对于测序的区域外显子序列一样的类型、以及不同等位基因的组合具有相同结果的测序结果无法正确分型；4、NGS法：NGS法保证了分型结果的准确性和极高的分辨率，但NGS法在样本制备时需要用特殊序列对每个个体进行标识，读取数据后需要进行大量的重复序列拼接处理，需要有强大计算机硬件和软件系统的支持。鉴定时间长约1个月左右，对于临床急需的结果无法满足，且成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速HLA测序分型组合试剂盒及分析方法，已解决现有技术存在样本分型准确性欠缺、耗时长、数据利用性低等问题。
本发明公开了一种快速HLA测序分型组合试剂盒，其包含HLA基因PCR扩增试剂盒和测序试剂盒，其中HLA基因PCR扩增试剂盒中含有HLA基因特异性扩增引物组，引物序列信息如下：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2(A)、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4(B)、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6(C)、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8(DPA)、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10(DPB)、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12(DQA)、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14(DQB)、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16(DR)、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.20(DR345-3)、SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.20(DR345-4)、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20(DR345-5)。
本发明从IMGT/HLA数据库进行序列收集，建立HLA序列的数据库，因基因HLA多态性高，比对分析数据难度大，筛选出能涵盖所有的位点引物组合是难度极大的，因此我们对于每一类的HLA，分别初步挑选出待优化的HLA特异性引物各20对，通过样本测试，对引物进行筛选和反应体系的优化，再次结合HLA保守序列分析软件进行分析，筛选出引物找到合适的引物序列和扩增位点，使其能满足：设计区域包括内含子区域，减少扩增的污染；能涵盖多个外显子的区段，达到一次扩增测序能覆盖更广的位点信息；对各类的HLA类型均能有效扩增，能得到特异性的扩增条带；非特异性扩增少等优良的特点
在一优选实施例中，所述HLA基因PCR扩增试剂盒含有PCR扩增反应体系试剂，其含DNA聚合酶、反应缓冲液等；
在一优选实施例中，所述HLA基因PCR扩增试剂盒为直扩PCR扩增试剂盒；
在一优选实施例中，所述测序试剂盒为Sanger测序试剂盒，其含有测序引物，测序引物序列为：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2(A)、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4(B)、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6(C)、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8(DPA)、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10(DPB)、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12(DQA)、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14(DQB)、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16(DR)、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.20(DR345-3)、SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.20(DR345-4)、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20(DR345-5)。
另外一方面，本发明还提供快速HLA测序分型的分析方法，包含下列步骤：
S1.采集生物样本；
S2.分别采用不同HLA基因特异性扩增引物对进行样本PCR扩增；
S3.纯化获得各自的不同HLA基因特异性扩增产物；
S4.纯化的HLA基因特异性扩增产物在测序仪上测序，得到序列峰图；
S5.序列峰图与HLA基因外显子在数据库中的标准序列进行对比，确定HLA基因的型别；
其中步骤S2中所述HLA基因特异性扩增引物组，其扩增引物序列为：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2(A)、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4(B)、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6(C)、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8(DPA)、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10(DPB)、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12(DQA)、SEQID NO.13和SEQ ID NO.14(DQB)、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16(DR)、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.20(DR345-3)、SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.20(DR345-4)、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20(DR345-5)。步骤S4中所述3)数据库为国际组织IMGT数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)。
在一优选实施例中，所述步骤S1所述生物样品为全血、颊粘膜拭子、活检样本或冷冻组织或包含基因组DNA的任何其它样品，优选为血浆；所述步骤S1还含DNA提取步骤；
在一优选实施例中，所述步骤S2为PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行纯化；
在一优选实施例中，所述步骤S5中，对于存在缺失、移位导致套峰结果情况，进行下列步骤：两个亲本之间的碱基序列的不同，包括长度的不同；若存在碱基缺失，移动序列，再跟测序峰图比对，观察测序峰是否一致，再进行常规分析。
本领域以前对于测序数据中存在套峰的情况，均舍弃，本发明人通过对大量的数据分析，总结了存在缺失、移位导致套峰出现的情况，可对套峰的数据进行分析，增加了数据的可利用性。
本发明试剂盒及方法可在5小时内获得样本的HLA不同类型的序列数据，并一次性达到HLA分型的最高分辨率，同时还可以通过测序的方式，发现新的等位基因，以及在测序结果方面，相较以前的方法，时间更为快速，更好地了解样本本身的序列情况，从而对型别的判定更加合理和准确。因此，本发明在检测效率、成本控制、数据质量等方面都有质的飞跃。应用这种新技术进行高分辨配型，成本显著降低，且本发明得到的数据更加可靠、真实。且本方法新开发了一种对于套峰分析的方法，增加了数据的可利用性。
附图说明
图1样本HLA特异性PCR扩增电泳图。
图2测序结果无套峰出现的样本结果分析。
图3测序结果有套峰出现的样本结果分析-1。
图4测序结果有套峰出现的样本结果分析-2。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
如本文使用的，“生物样品”可以是例如全血、颊粘膜拭子、活检样本或冷冻组织或包含基因组DNA的任何其它样品。尽管对于分子基因分型而言可以使用几乎任何组织来源，但最常使用的是例如来自外周血的淋巴细胞。也可以使用通过非侵入性方法获得的样品，例如通过基于脸颊拭子或唾液的DNA收集。
“DNA”是指本领域中所知道的各种形式的脱氧核糖核酸，如基因组DNA。从这些来源提取DNA的多种适合的方法是本领域已知的。这些方法的范围从有机溶剂提取到二氧化硅包覆的珠及阳离子交换柱的吸附。DNA自动提取系统也是商业可得的且可提供高质量、高纯度的DNA。
如本文使用的，“聚合酶链式反应”或PCR是核酸的扩增，由以下步骤组成：起始变性步骤，其分离双链核酸样品的链，然后通过重复(i)退火步骤，允许扩增引物与靶序列的旁侧位置特异性退火；(ii)延伸步骤，其使引物以5’至3’方向延伸因而形成与靶序列互补的扩增子多核苷酸，和(iii)变性步骤，其引起扩增子从靶序列上分离(Mullis等人编辑，The Polymerase Chain Reaction，BirkHauser，Boston，Mass.(1994)。每个上面的步骤可以在不同的温度下进行，优选使用自动化的热循环仪(Applied Biosystems LLC，LifeTechnologies Corporation，Foster City，CA.的一个部门)。如果需要，可以通过本领域技术人员已知的方法将RNA样品转换成DNA/RNA异型双链或双链cDNA。PCR方法还包括逆转录酶-PCR和遵循PCR原理的其它反应。
如本文使用的，“扩增”是指线性地或指数地增加多核苷酸序列的广泛的技术。示例性扩增技术包括但不限于PCR或任何其它应用引物延伸步骤的方法。扩增的其它非限制性例子包括但不限于连接酶检测反应(LDR)和连接酶链式反应(LCR)。扩增方法可以包括热循环或可以等温进行。在各种具体实施方案中，术语“扩增产物”包括来自任何扩增反应循环数目的产物。
在某些具体实施方案中，扩增方法包括至少一个扩增循环，例如但不限于以下的连续过程：将引物杂交至靶序列的引物特异性部分或扩增来自任何扩增反应循环数目的产物；使用聚合酶以依赖模板的方式合成核苷酸的链；和将新形成的核酸双链变性从而分离链。循环可以重复或可以不重复。
有许多已知的扩增核酸序列的方法，包括例如PCR。例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification(编辑H.A.Erlich，FreemanPress，NY，N.Y.，1992)；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(编辑Innis等人，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)；Mattila等人，Nucleic AcidsRes.19，4967(1991)；Eckert等人，PCR Methods and Applications 1，17(1991)；PCR(编辑McPherson等人，IRL Press，Oxford)；和美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,1594,965,188和5,333,675，为了所有的目的其中的每个通过引用以其全部并入本文。
“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的本发明的具体实施方案。但是，在相同的或其它的情况下其它的具体实施方案也可以是优选的。另外，对一个或多个优选的具体实施方案的详述不意味着其它的具体实施方案是没有用途的，不用于从本发明的范围中排除其它的具体实施方案。
术语“含有”和其变体在这些术语出现在说明书和权利要求中的地方不具有限制性意思。
还在本文，通过端点详述的数值范围包括所有包括在该范围内的数值。术语“和/或”意思是一个或所有列出的元素或任何两个或两个以上列出元素的组合。
实施例1.样本PCR扩增
(1)、根据编排好的样本顺序，取200ul血样于对应标记好的1.5mL离心管中。于离心机，6000rpm离心5min。离心后去掉上层血清，保留下层血浆。
(2)、根据编排好的样本顺序，按照对应的样本标记在PCR反应的生工96孔板(即反应板，其命名规则为“实验日期-样本标号-位点信息)或生工200ul反应管。用移液器按顺序从离心后保留的血浆样品管中转移1ul，根据需要做的位点数转移相应的次数(每个样本每个位点一个反应)。样本应加到反应孔底部，若加样过程中，样品为加到反应孔底部，则加样完成后要短暂离心，封口待用。
(3)、分别使用不同的引物对，引物对名称和编号见下表。使用不同的引物对进行扩增时，其扩增过程和反应体系均是相似的。
(4)、PCR反应体系如下：
试剂组分 用量
KOD One Master Mix 10ul
10μM forward primer 0.6ul
10μM reverse primer 0.6ul
人血浆 1ul
Water,nuclease-free 7.8ul
(5)、设置好PCR反应体系后，所有反应均在同一型号的PCR仪中用一种扩增条件进行同步扩增，循环参数如下：
(6)、对获得的PCR扩增产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果显示：从电泳图1上看本发明设计的引物均得到较为单一的条带，且条带明亮，可见获得足够的DNA量。即经上述设计的特异性引物对血液样本进行扩增，电泳条带具有显著单一条带的优良特点。
(7)、用胶回收试剂盒对产物进行切胶回收，并用Nanodrop测定浓度。
实施例3.样本PCR产物测序及分析
(1)、对上述回收的PCR产物进行Sanger测序，得到的测序返回结果进行分析。
(2)、用snapgene软件对样本的HLA测序结果进行分析。
序列结果分析示例：首先看测序峰图是否乱，长度是否完整。
对于测序序列的颜色说明：黑色代表G，绿色代表A，红色代表T，蓝色代表C
对于下图中框住的红色文本框示例，测序的结果显示此时为黑色(G)和蓝色(C)的套峰，比对上该样本的此位点参考结果为G、C，故而此位点的测序结果与参考序列一致(图2)。
接下来继续比对分析，峰形干净且与两条参考结果的序列一致。
接下来继续分析，发现蓝色文本框处出现套峰，因而看测序峰图(图2)，第一个碱基测序的结果显示此时为绿色(A)和蓝色(C)的套峰，比对上该样本的此位点参考结果为A、C，故而此位点的测序结果与参考序列一致；第二个碱基测序的结果显示此时为绿色(A)和红色(T)的套峰，比对上该样本的此位点参考结果为A、T，故而此位点的测序结果与参考序列一致。依此类推分析接下来的测序结果与参考结果的比对情况。进而分析完该样本的测序结果判断样本的分型结果。
本方法新开发了一种对于套峰分析的方法，以前对于测序数据中存在套峰的情况，均舍弃。但本方法，通过对大量的数据分析，总结了存在缺失、移位导致套峰出现的情况，可对套峰的数据进行分析，提高了数据的可利用性。
若存在少数位点不一致的情况可以将该分型结果的亚型序列作为参考序列一起分析。
对于峰图较混乱DQA分析，需要找到两个亲本之间的碱基序列的不同，包括长度的不同，有可能是PCR扩增过程中两个亲本模板之间有碱基缺失导致测序峰图；如图3、4所示，DQA1 01和DQA1 02之间有3个碱基缺失，会出现测序峰经过缺失峰的时候出现乱峰，此时需要一个亲本的碱基序列向前移动三个碱基，再跟测序峰图比对，看测序峰是否一致。
实施例4对比试验
仪器和试剂：
分别用普通HLA分型测序方法1，2、Onelambda SSO分型方法和本发明HLA分型测序方法对HLA样本进行测序分析，本发明方法所用的试剂如上述所示，采用同样的测序仪器为ABI3730高通量分析仪进行测序。
三者的试剂的主要区别为普通HLA分型测序方法、Onelambda SSO分型方法对杂合子分辨率不好。运用本发明方法，可在5小时内获得样本的HLA不同类型的序列数据，并一次性达到HLA分型的最高分辨率，同时还可以通过测序的方式，发现新的等位基因。且本方法新开发了一种对于套峰分析的方法，提高了数据的可利用性。
结果对比：本方法整理出样本测序结果是否与SSO、Onelambda等HLA分型检测试剂盒对样本的分型结果是否一致。
分型方法 耗时 11个位点分型成本 分辨率
本发明方法 5h 200元 高分
SSO 3h 1000元 中低分
普通HLA测序分型 48h 1200元 高分
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。
参考文献
1.Adams SD,Barracchini KC,Simonis TB,Stroncek D,Marincola FM.HIGHTHROUGHPUT HLA SEQUENCE-BASED TYPING(SBT)UTILIZING THE ABI PRISM@3700DNAANALYZER.Published online 2001:840-843.
2.Discrepancies in HLA Typing by PCR-SSOP and SBT Techniques:A CaseStudy Author(s):BRUGES-ARMAS and ANTóNIO BREHMStable URL:http://www.jstor.org/stable/41466510.2014；79(5):537-543.

Claims (10)

1.一种快速HLA测序分型组合试剂盒，其包含HLA基因PCR扩增试剂盒和测序试剂盒，其特征在于所述HLA基因PCR扩增试剂盒中含有HLA基因特异性扩增引物组，引物序列信息如下：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQID NO.20、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。
2.如权利要求1所述的快速HLA测序分型组合试剂盒，其特征在于所述HLA基因PCR扩增试剂盒含有PCR扩增反应体系试剂。
3.如权利要求2所述的快速HLA测序分型组合试剂盒，其特征在于所述HLA基因PCR扩增试剂盒为直扩PCR扩增试剂盒。
4.如权利要求1所述的快速HLA测序分型组合试剂盒，其特征在于所述测序试剂盒为Sanger测序试剂盒。
5.如权利要求1所述的快速HLA测序分型组合试剂盒，其特征在于所述步骤S2中，所述引物对为HLA的特异性引物对。
6.一种快速HLA测序分型的分析方法，包含下列步骤：
S1.采集生物样本；
S2.分别采用不同HLA基因特异性扩增引物对进行样本PCR扩增；
S3.纯化获得各自的不同HLA基因特异性扩增产物；
S4.纯化的HLA基因特异性扩增产物在测序仪上测序，得到序列峰图；
S5.序列峰图与HLA基因外显子在数据库中的标准序列进行对比，确定HLA基因的型别；
其中步骤S2中所述HLA基因特异性扩增引物，其扩增引物序列为：SEQ ID NO.1和SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。
7.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述步骤S1所述生物样品为全血、颊粘膜拭子、活检样本或冷冻组织或包含基因组DNA的任何其它样品。
8.如权利要求7所述的分析方法，其特征在于所述步骤S1所述生物样品为为血浆。
9.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述步骤S2为PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
10.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述步骤S5中，对于存在缺失、移位导致套峰结果情况，进行下列步骤：两个亲本之间的碱基序列的不同，包括长度的不同；若存在碱基缺失，移动序列，再跟测序峰图比对，观察测序峰是否一致，再进行常规分析。
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