KR102511162B1

KR102511162B1 - 한국인 특이적 snp 정보 및 최적화된 파이프라인을 이용한 hla-drb1 유전자형 분석 방법

Info

Publication number: KR102511162B1
Application number: KR1020210147794A
Authority: KR
Inventors: 박현영; 김봉조; 김영진; 황미영; 장혜미; 김성민
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2021-11-01
Filing date: 2021-11-01
Publication date: 2023-03-20

Abstract

본 발명은 한국인 특이적 SNP 정보 및 최적화된 파이프라인을 이용한 HLA-DRB1 유전자형 분석 방법에 관한 것으로, 본 발명의 855개의 SNP 정보를 기반으로 HLA-DRB1 type을 분석하는 방법은 한국인 특이적인 SNP 정보 및 최적화된 분석 파이프라인을 제공함으로써 장기이식 대상자 및 공여자에 대해 사전 검사 등에 유용하게 활용 할 수 있으며, 낮은 비용과 적은 소요 시간으로 HLA type을 제공함으로써 약물유전학, 면역 질환, 관련 만성질환 등 다양한 분야에서 연구에 활용 할 수 있다.

Description

한국인 특이적 SNP 정보 및 최적화된 파이프라인을 이용한 HLA-DRB1 유전자형 분석 방법{HLA-DRB1 genotype analysis method using Korean-specific SNPs and optimized pipeline}

본 발명은 한국인 특이적 SNP 정보 및 최적화된 파이프라인을 이용한 HLA-DRB1 유전자형 분석 방법에 관한 것이다.

인간 백혈구 항원 (HLA) 유전자는 면역계의 주요 기능, 외래 또는 비정상 항원의 검출을 담당하는 세포 표면 항원 단백질을 암호화합니다. 이 유전자는 MHC (major histocompatibility complex)로 알려진 영역에있는 6번 염색체 short arm에 위치해있다.

HLA type은 장기이식 수여자와 공여자의 장기 및 조직 이식 적합성 확인에 중요한 정보이며 면역 질환의 위험요인 분석 및 다양한 연구에 활용되고 있다. 기존의 HLA typing 방법은 sequence-specific oligonucleotide (SSO), sequence-specific primer (SSP), sanger sequencing, high throughput next generation sequencing (NGS) 등의 기술을 통해 제공되었으나 높은 정확도에 비해 가격이 비싸고, 고해상도 HLA type의 경우 실험에 소요되는 시간이 길다는 단점이 있다. 또한, 기존 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 정보로부터 HLA type을 imputation을 통해 예측하는 방법(특허문헌 01)이 제공된 바 있으나, 분석에 사용되는 SNP 및 분석 절차에 필수적인 참조패널 정보에 따라 정확도가 상이하다는 단점이 있다. 특히 기존 SNP 정보들은 주로 서양인 연구 결과에서 확인된 것을 사용하기 때문에 한국인에서 높은 정확도로 HLA type을 제공할 수 없다는 문제점이 있다.

따라서, 본 발명에서는 한국인 특이적인 SNP 정보 및 최적화된 분석 파이프라인을 제공함으로써 한국인 HLA 지역 맞춤형 유전정보 약 855개의 SNP를 사용하고 최적화된 HLA imputation 파이프라인을 이용하여 HLA type을 예측하여 4일 이내에 기존 방법 대비 20배 낮은 가격(약 5만원)에 96.9% 수준 정확도(2-digit 기준)의 HLA type을 제공 할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2020-0092867호

본 발명의 목적은 HLA-DRB1 type 관련 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 HLA-DRB1 유전자형 판별용 마커 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 마커 조성물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 HLA-DRB1 유전자형 분석용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 HLA-DRB1 유전자형 분석용 조성물을 포함하는 HLA-DRB1 유전자형 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 HLA-DRB1 유전자형 분석 방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 HLA-DRB1 type 관련 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 HLA-DRB1 유전자형 판별용 마커 조성물을 제공한다.

이어서, 본 발명은 상기 마커 조성물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 HLA-DRB1 유전자형 분석용 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 HLA-DRB1 유전자형 분석용 조성물을 포함하는 HLA-DRB1 유전자형 분석용 키트를 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 분석대상으로부터 생물학적 시료를 수득하는 1단계; 상기 생물학적 시료로부터 유전체(genome DNA)를 추출하는 2단계; 상기 유전체(genome DNA)의 서열정보를 수득하는 3단계; 상기 서열정보로부터 HLA-DRB1 type 관련 단일염기다형성(SNP)에 대한 유전자형을 분석(genotyping)하여 분석대상의 SNP 데이터를 수집하는 4단계; 및 상기 분석대상의 SNP 데이터를 분석하여 HLA 대립유전자를 결정하는 5단계;를 포함하는 HLA-DRB1 유전자형 분석 방법을 제공한다.

본 발명의 855개의 SNP 정보를 기반으로 HLA-DRB1 type을 분석하는 방법은 한국인 특이적인 SNP 정보 및 최적화된 분석 파이프라인을 제공함으로써 장기이식 대상자 및 공여자에 대해 사전 검사 등에 유용하게 활용 할 수 있으며, 낮은 비용과 적은 소요 시간으로 HLA type을 제공함으로써 약물유전학, 면역 질환, 관련 만성질환 등 다양한 분야에서 연구에 활용 할 수 있다.

도 1은 한국인칩 유전체정보 정도관리 흐름도 및 HLA typing 정확도 측정 파이프라인을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 한국인 특이적 SNP 정보를 이용한 HLA-DRB1 유전자형 분석 방법의 예시를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명에서 사용되는 용어를 상세히 설명한다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 (terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “다형성 (polymorphism)”이란 하나의 유전자 좌위 (locus)에 두 가지 이상의 대립 유전자 (allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생 빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립 유전자를 가진다. 따라서, 다형성 마커에 대한 유전적 연관 (genetic association)은 특정한 다형성 마커의 하나 이상의 특정한 대립형질에 대해 연관이 있다는 것을 의미한다. 마커는 단일 염기 다형성 (SNP), 마이크로새틀라이트 (microsatellite), 삽입, 결실, 중복 및 전위 (translocation)를 포함한, 게놈에서 발견되는 임의의 변이 형태의 대립형질을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “대립 유전자 (allele)” 또는 “대립형질”이란 상동 염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립 유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립 인자 (biallele)를 갖는다.

본 발명에서 사용되는 용어 “rs_id”란 1998년부터 SNP 정보를 축적하기 시작한 NCBI가 초기에 등록되는 모든 SNP에 대하여 부여한 독립된 표지자인 rs-ID를 의미한다. 본 발명에서는 rs831571와 같은 형태로 기재하였다. 이와 같은 표에 기재된 rs_id는 본 발명의 다형성 마커인 SNP 마커를 의미한다. 당업자라면 상기 rs_id를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. NCBI의 dbSNP (The Single Nucleotide Polymorphism Database) 번호인 rs_id에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 약간 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

본 발명은 HLA-DRB1 type 관련 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 HLA-DRB1 유전자형 판별용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 상기 HLA-DRB1 type 관련 단일염기다형성(SNP)은 인간 6번 염색체상에 존재하는 단일염기다형성(SNP)일 수 있으며, 바람직하게는 인간 6번 염색체의 31546552 ~ 33557625 지역(Genome Reference Consortium : GRCh37.p13, hg19 version, Genbank sequence: CM000668.1, RefSeq sequence: NC_000006.11)에 존재하는 단일염기다형성(SNP)일수 있으며, 더욱 바람직하게는 rs3093672, rs3093561, rs769177, rs769176, rs3093553, rs77974900, rs2256965, rs2256974, rs1052248, rs986475, rs11575839, rs77107611, rs2736191, rs2844480, rs2857595, rs2736186, rs9348876, rs2857609, rs2280801, rs2736171, rs75044749, rs2242657, rs1046089, rs2261033, rs11229, rs2736155, rs1046756, rs2178899, rs115247800, rs755714, rs1077394, rs7770976, rs760293, rs3130048, rs2242656, rs2844463, rs3130617, rs707974, rs28732158, rs141943810, rs9469032, rs9267536, rs79515906, rs11552113, rs150576099, rs805281, rs805273, rs145012921, rs805295, rs9267547, rs2242653, rs805287, rs118062293, rs1065356, rs376510, rs805293, rs805292, rs453098, rs2272592, rs409558, rs3749953, rs116847602, rs17201144, rs707937, rs707928, rs2736426, rs707927, rs34585796, rs181542871, rs75155700, rs11751198, rs2075800, rs2227955, rs2075799, rs9469057, rs34791928, rs16867582, rs117317180, rs35294112, rs2763979, rs6457452, rs6921489, rs117792332, rs9501157, rs574914, rs494620, rs3130482, rs614549, rs12661281, rs2736428, rs6907185, rs115646381, rs555007, rs652888, rs2844458, rs486416, rs113973079, rs13194087, rs9267661, rs7887, rs116606947, rs116078299, rs2844452, rs9267673, rs644045, rs7746553, rs12614, rs117314762, rs13194698, rs1048709, rs4151669, rs17201431, rs537160, rs2072634, rs4151657, rs149101394, rs116928087, rs2072633, rs4151672, rs760070, rs4151664, rs9501161, rs16867755, rs440454, rs2734331, rs429608, rs9296003, rs474534, rs6941112, rs389883, rs116851612, rs9267796, rs2066982, rs9469079, rs150876029, rs7766862, rs181025235, rs3130286, rs9267798, rs185819, rs1150754, rs2239688, rs204900, rs115461385, rs41270461, rs117767511, rs41268899, rs3134954, rs429150, rs2269426, rs3807039, rs17207986, rs8283, rs3830076, rs117160266, 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rs13198486, rs11964507, rs1367731, rs4713605, rs6911659, rs3130607, rs148588346, rs10456417, rs9296068, rs2082261, rs3097648, rs3129300, rs6933319, rs6933546, rs443623, rs6920606, rs77523675, rs1431396, rs449676, rs13205699, rs439852, rs34381517, rs7774158, rs441576, rs116004308, rs3130176, rs430620, rs117905160, rs440841, rs3128952, rs7738815, rs3097662, rs193006674, rs3097669, rs9277193, rs79341334, rs1367728, rs1042434, rs2308931, rs4582419, rs3135020, rs2856830, rs2071350, rs115910061, rs2856816, rs3135021, rs2567279, rs1126511, rs9277348, rs1042153, rs9500928, rs9501259, rs3091283, rs2295119, rs3128918, rs16868789, rs3117236, rs2064476, rs3128927, rs3128928, rs3130216, rs6937061, rs9366814, rs11751659, rs1810472, rs6457715, rs9277641, rs3129294, rs4711314, rs1883414, rs3117034, rs3117032, rs118075662, rs72500566, rs9277753, rs3129274, rs3117016, rs28361079, rs9277767, rs3130236, rs3129269, rs115501779, rs9277769, rs3116993, rs2294478, rs2294477, rs9277771, rs4582368, rs3129250, rs112394499, rs3129231, rs1003979, rs113455765, rs3129215, rs117971261, rs3130159, rs3129207, rs9277916, rs9296088, rs4713614, rs734181, rs1799912, rs986522, rs986521, rs2229784, rs2855448, rs1799910, rs970901, rs2254287, rs16868943, rs3129200, rs12526336, rs141430703, rs9469378, rs9277935, rs1547387, rs138620921, rs110662, rs383711, rs213209, rs2854028, rs75993808, rs1567464, rs7759943, rs213195, rs9277952, rs213226, rs147664765, rs460568, rs213201, rs151191108, rs117128327, rs7771361, rs115924940, rs2282850, rs75980332, rs15604, rs117689709, rs12664430, rs9277972, rs146304558, rs2239839, rs2073525, rs3130270, rs3130014, rs211476, rs77925168, rs143935191, rs117889830, rs465223, rs143651041, rs114485144, rs2235982, rs761583, rs1705003, rs118174945, rs116940550, rs211456, rs75086869, rs10807124, rs7759963, rs139759084 및 rs3119025으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)일 수 있다.

또한, 상기 HLA-DRB1 유전자형 판별용 마커는 한국인 특이적인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 HLA-DRB1 유전자형 분석용 조성물은 한국인 대상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 마커 조성물을 검출할 수 있는 제제는 SNP 마커를 포함하는 10개 이상의 연속적인 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적 (allele-specific)이다.

상기 "프라이머"란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플리트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플리트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

상기 "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.

또한, 상기 프로브는 검출 가능한 물질 예를 들면, 적합한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 방사성 표지로 표지할 수 있다. 표지된 프로브는 문헌 (Sambook et al., Molecular Cloning, A LaboratoryMannual, 1989)에 공지된 바와 같은 고체 지지체 상의 핵산에 혼성화시킬 수 있다.

또한, 상기 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 하나의 대립유전자를 포함한 핵산 단편에는 혼성화하지만, 다른 대립유전자를 포함한 핵산 단편에는 혼성화하지 않을 수 있다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 프라이머를 이용한 특정 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 목적 유전자의 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 또한, 프로브를 이용한 특정 핵산의 검출은 적합한 조건하에서 시료 핵산을 프로브와 접촉시킨 후 혼성화되는 핵산의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

또한, 상기 프로브나 프라이머를 이용하여 특정 핵산을 검출할 수 있는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 중합효소 연쇄반응 (PCR), DNA 시퀀싱, RT-PCR, 프라이머 연장법 (Nikiforeov et al., Nucl Acids Res 22, 4167-4175, 1994), 올리고뉴클레오타이드 연장 분석 (Nickerson et al., Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927, 1990), 대립형질 특이적 PCR법 (Rust et al., Nucl Acids Res, 6, 3623-3629, 1993), RNase 불일치절단 (RNase mismatch cleavage, Myers et al., Science, 230, 1242-1246, 1985), 단일가닥 입체 다형화 (single strand conformation lymorphism, Orita et al., Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770, 1989), SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법 (Lee et al., Mol Cells, 5:668-672, 1995), 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Cariello et al., Am J Hum Genet, 42, 726-734, 1988), 변성 고압 액체 크로마토그래피 (Underhill et al., Genome Res, 7, 996-1005, 1997), 혼성화 반응, DNA 칩 등이 있다. 상기 혼성화 반응의 예로는 노던 하이브리다이제이션 (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, NY, 1982), 인시츄 하이브리다이제이션 (Jacquemier et al., Bull Cancer, 90:31-8, 2003) 및 마이크로어레이 (Macgregor, Expert, Rev Mol Diagn 3:185-200, 2003) 방법 등이 있다.

또한, HLA-DRB1 유전자형 분석용 조성물은 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP (deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소 (polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제 (sequenase) 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 다형성 마커 중 1종 이상의 마커를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 다형성 마커에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 생물학적 시료는 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 소변 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 방법은 2자리(digit) 또는 4자리(digit) 대립유전자 해상도로 HLA-DRB1 유전자형을 결정하는 것일 수 있고, 바람직하게는 2자리(digit) 대립유전자 해상도로 HLA-DRB1 유전자형을 결정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 방법은 한국인을 대상으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 5단계는 분석대상의 SNP 데이터와 참조 패널(reference panel)과 비교분석하여 HLA 대립유전자를 결정하는 것일 수 있다.

상기 참조 패널(reference panel)은 유전자형의 연관성에 대한 사전 정보(predetermined information)를 제공하는 레퍼런스(reference) 데이터로서, 당업계에 알려진 Han(Chinese) MHC reference panel, Pan-Asian MHC reference panel, Korean MHC reference panel 등을 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화 하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.

<실시예 1> 유전체정보의 정도관리

도 1을 참조하여 134,721명의 유전체역학조사사업 참여자를 대상으로 한국인칩을 이용하여 유전체정보를 생산하였다. 상기 한국인 칩은 국립보건연구원에서 개발된 약 83만개의 유전변이 정보를 포함하고 있는 korea biobank array를 사용하였다 (Moon et al. Scientific Reports 2019).

생산된 유전체정보는 도 1을 참조하여 정도관리 파이프라인에 따라서 genotype calling, low quality 유전변이 제거, low quality 샘플 제거, MDS (Multi-dimensional scaling)/PCA (Principal Component Analysis)를 통한 이상치 제거 등을 수행하여 정제하였다.

정제 후 Minor allele frequency가 0.01 이상, HWE 1e-6 미만, genotype call rate가 0.05 미만인 SNP을 선정하여 HLA-DRB1 region QC 분석을 진행하였으며, 염색체 6번, 31546552 ~ 33557625 지역(Genome Reference Consortium : GRCh37.p13, hg19 version, Genbank sequence: CM000668.1, RefSeq sequence: NC_000006.11)의 SNP 추출하였다.

<실시예 2> SNP 정보 기반 HLA-DRB1 typing 정보 생산

실시예 1에서 정제된 유전체정보의 phasing 분석은 Eagle 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, HLA imputation(HLA type 분석)은 Impute v4 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. reference panel은 Han(Chinese) MHC reference panel을 이용하였으며, Han(Chinese) MHC reference panel은 10,689명 시퀀싱 정보를 사용하여 구성되었다 (Zhou et al. Nature Genetics 2016).

구체적으로, HLA-DRB1 type 분석을 위해 Han Chinese HLA reference panel과 QC(quality-control)된 한국인칩 유전체정보에서 공통된 HLA-DRB1 type 관련 855개의 SNP 마커 추출하였다 (Genome Reference Consortium : GRCh37.p13, hg19 version, Genbank sequence: CM000668.1, RefSeq sequence: NC_000006.11, Chromosome 6, 31546552 ~ 33557625 지역). 상기 HLA-DRB1 type 관련 SNP 마커 정보는 표 1에 나타내었다.

그 후, 실시예 1에서 정제된 유전체정보는 Eagle 소프트웨어를 사용하여 phasing 분석하였다. 또한, HLA imputation은 한국인 칩(Moon et al. Scientific Reports 2019)에서 장기이식코호트 참여자의 genome data를 이용하였으며, genome DNA로부터 표 1의 SNP 마커를 검출할 수 있는 프로브(probe)를 사용하여 SNP 데이터를 수집하고, 상기 SNP 데이터는 reference panel과 표 1의 SNP 마커에 대한 유전자형 비교분석을 통해 HLA 대립유전자를 결정하였다(도 2 참조).

No.	rs_ID	Chromosome	Position	REF.Allele	ALT.Allele	SEQ
1	rs3093672	6	31547420	C	T	GAGTTCGGAAA
2	rs3093561	6	31547474	G	A	CATGTGGTAGG
3	rs769177	6	31547611	C	T	ACCCACACTTA
4	rs769176	6	31547689	C	T	GGACACCCTAA
5	rs3093553	6	31549556	T	G	GAGGGTCTGAA
6	rs77974900	6	31552768	C	A	TAGAGCCAGGT
7	rs2256965	6	31555130	A	G	GAGAGAGTCCT
8	rs2256974	6	31555392	C	A	GCTTCCTAACC
9	rs1052248	6	31556581	T	A	TCAAATTGATC
10	rs986475	6	31556709	A	G	AATTTATTGGG
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408	rs58667488	6	32431785	A	C	AGGAAAGCTTC
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459	rs17212846	6	32675581	A	T	CAGGGATCTCT
460	rs9275580	6	32679462	A	G	CATGAATGTGA
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687	rs1075893	6	32976540	A	C	GGGAGAGGCAA
688	rs743771	6	32976909	C	A	ATTCCCGGCCA
689	rs403414	6	32977315	A	G	CCATTACACTC
690	rs6911639	6	32978178	T	C	CCATGTGTCAA
691	rs3763342	6	32978997	C	T	TATTACGGTTT
692	rs447088	6	32979980	A	C	ATGGCACTGTC
693	rs13198486	6	32983632	T	C	CGTGCTGGCTG
694	rs11964507	6	32983765	C	T	CCTGACGAAGG
695	rs1367731	6	32985199	C	T	GTAAACGAGGA
696	rs4713605	6	32985992	T	A	CTTTATCTTTG
697	rs6911659	6	32987160	G	A	GAGAGGCCAAG
698	rs3130607	6	32987277	A	G	GACACAAGGAA
699	rs148588346	6	32987298	G	A	TGTAGGGGACT
700	rs10456417	6	32988651	T	C	ATATATGGTGC
701	rs9296068	6	32988695	T	G	TAATCTTGTTC
702	rs2082261	6	32990506	G	A	TGTGCGGGCAT
703	rs3097648	6	32990970	A	T	GCTGGAGAGCA
704	rs3129300	6	32991777	T	G	CTTGTTGGCTA
705	rs6933319	6	32995863	C	T	TGTCACAGGCC
706	rs6933546	6	32996014	C	T	TCTTACCACTT
707	rs443623	6	32996350	A	T	AACTGATGTAG
708	rs6920606	6	32997674	T	C	CTTCCTATTGC
709	rs77523675	6	32998549	T	C	TTAACTATAAC
710	rs1431396	6	32998564	C	T	TATTGCCTCAT
711	rs449676	6	33002162	C	T	GTGTCCTTTCA
712	rs13205699	6	33004287	G	A	GCACCGGGCAA
713	rs439852	6	33005208	C	T	GTTATCTTCTT
714	rs34381517	6	33006796	C	T	GGTCCCGAATA
715	rs7774158	6	33007752	C	A	CATTACTTTCT
716	rs441576	6	33008546	A	G	ACTGAAGTCTA
717	rs116004308	6	33015535	G	T	CTCAGGTATTG
718	rs3130176	6	33017457	A	G	TCTGTAGGTCA
719	rs430620	6	33017486	G	A	CCCGCGTGAGG
720	rs117905160	6	33017602	C	T	AAGTTCGGGGC
721	rs440841	6	33019643	T	G	AAAATTGTCTG
722	rs3128952	6	33019973	A	T	CTATTAGTCCT
723	rs7738815	6	33020387	G	C	ACAGAGCCAAT
724	rs3097662	6	33020777	C	T	TTATTCCATCC
725	rs193006674	6	33022419	G	A	GTCCCGGATGA
726	rs3097669	6	33023792	A	C	AGGGTATAGAG
727	rs9277193	6	33023880	T	C	ACTGGTATTCT
728	rs79341334	6	33033420	C	A	GAGGGCAGAGA
729	rs1367728	6	33034815	G	A	CTCCAGCAACC
730	rs1042434	6	33036505	G	C	ATGCCGACTAG
731	rs2308931	6	33036950	C	T	GTGACCAGCTC
732	rs4582419	6	33040138	G	A	AGTTGGTTTGC
733	rs3135020	6	33041064	C	A	AGAAACTATGC
734	rs2856830	6	33041734	T	C	ATCTTTGATGT
735	rs2071350	6	33043526	C	T	CCAAACATCAT
736	rs115910061	6	33044015	G	T	TGCGGGGGCTC
737	rs2856816	6	33045500	T	C	TCCACTTTTCC
738	rs3135021	6	33045558	G	A	ACCTAGAAGGT
739	rs2567279	6	33046662	T	C	GGCAATTGAAC
740	rs1126511	6	33048466	G	T	TCCAGGGACGG
741	rs9277348	6	33048538	T	C	AGGAGTTCGCG
742	rs1042153	6	33048663	G	A	AGGATGTGCAG
743	rs9500928	6	33049694	C	T	GTGAACTTGTG
744	rs9501259	6	33055551	G	A	TGGGCGTCACT
745	rs3091283	6	33057213	C	T	CTGCTCATCAT
746	rs2295119	6	33060870	G	T	AGAGGGTCTGT
747	rs3128918	6	33061098	T	C	CGATATAGGTT
748	rs16868789	6	33072598	A	G	AGCTCACGGGT
749	rs3117236	6	33073068	A	G	AATACATGGTT
750	rs2064476	6	33073322	A	G	GAGTCATTAAG
751	rs3128927	6	33074288	C	T	TAGAGCGTACA
752	rs3128928	6	33074612	C	A	GCCACCACCCC
753	rs3130216	6	33077271	G	A	AGAATGTCTAA
754	rs6937061	6	33079812	A	G	GATGGATACTC
755	rs9366814	6	33080799	T	G	ACAAGTATCAC
756	rs11751659	6	33081632	A	G	ACGCCATGGAA
757	rs1810472	6	33083121	T	C	GGCACTAGGAG
758	rs6457715	6	33083188	A	G	AAACTACAGGC
759	rs9277641	6	33083458	G	A	CTGCCGGACAC
760	rs3129294	6	33084671	A	C	TAGCTAATATT
761	rs4711314	6	33085947	G	C	GAACCGCCATA
762	rs1883414	6	33086448	G	A	CTATGGCAGTA
763	rs3117034	6	33087358	T	A	TAGGATTGGCG
764	rs3117032	6	33088592	C	T	ACTCACGCTAT
765	rs118075662	6	33092017	T	C	TGAAGTTCTCC
766	rs72500566	6	33093114	T	C	CGACATGGCAG
767	rs9277753	6	33094809	C	T	TAGGACGATTT
768	rs3129274	6	33094869	C	T	AGTCACGTCAA
769	rs3117016	6	33095516	G	A	ATCTAGAAATC
770	rs28361079	6	33096523	T	G	AAAGGTGAGAA
771	rs9277767	6	33097306	C	G	TCTATCATTCT
772	rs3130236	6	33097464	A	G	GTTTTAGCAAA
773	rs3129269	6	33097614	C	A	CCATCCTCATG
774	rs115501779	6	33098559	T	G	AACTCTGGGAT
775	rs9277769	6	33098596	C	T	AAGGTCCCTGA
776	rs3116993	6	33098828	G	A	AGACCGAAGCT
777	rs2294478	6	33098966	C	A	TTCTGCCCCTC
778	rs2294477	6	33098988	C	G	AAACTCTCACA
779	rs9277771	6	33099371	C	A	TAACACTGAAC
780	rs4582368	6	33101346	C	A	ACCATCGCCCT
781	rs3129250	6	33109397	G	C	GTTTGGAGGGG
782	rs112394499	6	33111148	C	T	GGCGGCGCAGG
783	rs3129231	6	33112218	A	G	TCACCATAGCC
784	rs1003979	6	33114171	T	C	AATATTGTCTA
785	rs113455765	6	33116886	G	A	GTTCTGCTGTT
786	rs3129215	6	33117094	C	A	GCTAACGTGTA
787	rs117971261	6	33122335	C	G	AACAGCTATTA
788	rs3130159	6	33124693	G	C	ACAAAGGAGTC
789	rs3129207	6	33125312	G	C	TGTCAGTAAAG
790	rs9277916	6	33125436	C	G	GAGAACTCTCA
791	rs9296088	6	33125742	A	G	TTATAAGAAAT
792	rs4713614	6	33127987	C	A	ACAGGCCAGAG
793	rs734181	6	33130208	C	G	ACACCCAGAAG
794	rs1799912	6	33132693	C	T	AAACTCGGAAG
795	rs986522	6	33135962	C	G	GTAACCACCAC
796	rs986521	6	33136145	G	A	CACACGCCCTT
797	rs2229784	6	33136310	G	T	AAGTGGCCCTG
798	rs2855448	6	33136575	C	T	CCAACCTGGCT
799	rs1799910	6	33139328	C	T	CCAGTCGGGCC
800	rs970901	6	33141475	C	T	ACACTCACCCT
801	rs2254287	6	33143948	C	G	CTGGACGGCAG
802	rs16868943	6	33147727	G	A	TTAGAGGATTC
803	rs3129200	6	33153833	A	G	AGCCTATCTGT
804	rs12526336	6	33154049	G	A	ATCCCGACTGC
805	rs141430703	6	33154514	C	A	GCCCCCCTCGC
806	rs9469378	6	33159664	T	C	AGGACTCAAGA
807	rs9277935	6	33160425	G	T	TCAACGGCCTG
808	rs1547387	6	33169895	C	G	CACTCCCACAG
809	rs138620921	6	33172479	G	T	GCTCCGCACTG
810	rs110662	6	33172932	G	A	GCTCTGATATT
811	rs383711	6	33173998	G	A	TGAATGAAGAG
812	rs213209	6	33176958	C	T	GTGCACATAAG
813	rs2854028	6	33179689	C	T	GGTGACGGTCC
814	rs75993808	6	33179869	A	G	TCATCAGCACT
815	rs1567464	6	33182870	G	A	CTGGGGAAGGA
816	rs7759943	6	33195154	A	G	TATACAGCAGT
817	rs213195	6	33196005	G	A	TGTGTGTATTC
818	rs9277952	6	33204274	G	A	GAACTGGCTGC
819	rs213226	6	33209310	A	G	AATATAAGCAG
820	rs147664765	6	33222194	G	A	GTGATGTGATT
821	rs460568	6	33232025	C	T	AGTTTCACCAC
822	rs213201	6	33232521	C	T	GAGTTCGTGGC
823	rs151191108	6	33241420	G	A	GTGAGGCTTAA
824	rs117128327	6	33241546	C	A	CTTTTCACTTG
825	rs7771361	6	33242881	A	G	GCCCAATACCT
826	rs115924940	6	33260065	A	G	AATACATTAGC
827	rs2282850	6	33267103	C	T	CCGGTCACTCC
828	rs75980332	6	33267331	C	T	TTGAGCGCATC
829	rs15604	6	33267715	A	G	CAGGCATTTAA
830	rs117689709	6	33268042	C	T	TGGCCCTAGAG
831	rs12664430	6	33272677	C	T	AGGCACCCTCT
832	rs9277972	6	33276770	A	T	AGGTTAAACTG
833	rs146304558	6	33287796	G	C	CTGCTGCTTCT
834	rs2239839	6	33288075	C	A	ATGCTCCCCCA
835	rs2073525	6	33290825	A	G	AGGTGACAGTA
836	rs3130270	6	33308221	A	G	AAACTATAATA
837	rs3130014	6	33312308	A	G	ACTGCAGCCAA
838	rs211476	6	33319596	G	T	AAGCCGTCTGG
839	rs77925168	6	33351297	T	C	CTCTATCAAAG
840	rs143935191	6	33358223	T	C	TTCCATTGTTG
841	rs117889830	6	33359567	T	G	CTGCGTGCAGA
842	rs465223	6	33359716	G	C	ACCCAGTTCTC
843	rs143651041	6	33362591	T	G	CAGTATAGGTG
844	rs114485144	6	33376436	T	C	TATCCTAGCAG
845	rs2235982	6	33380804	A	G	CGGACAAGTCC
846	rs761583	6	33381459	A	G	TTGGGACAGTT
847	rs1705003	6	33385953	A	G	TCCCGACCCTA
848	rs118174945	6	33386243	G	A	CCAGAGACCCC
849	rs116940550	6	33389324	C	T	ATTATCATTTC
850	rs211456	6	33389381	G	T	ACAAAGACACA
851	rs75086869	6	33397796	G	A	TTCTTGGTAAT
852	rs10807124	6	33404064	G	A	CTTGTGCTCAA
853	rs7759963	6	33406556	A	G	GGAGAATTCAT
854	rs139759084	6	33411463	C	G	GCCAGCCCCCT
855	rs3119025	6	33422976	T	G	TCGTCTCTGCT

<실시예 3> HLA-DRB1 typing 정보 제공

상기 실시예 2의 방법으로 HLA typing을 수행하고 HLA-DRB1 유전자에 대한 HLA typing 정보를 저해상도인 2 digit 및 고해상도인 4 digit 정보로 정리하였다. 결과는 각 HLA type 및 digit 별 확률값 형태로 나타나며, 그 중 가장 높은 확률을 보이는 HLA allele을 HLA type 정보로 제공한다.

<실시예 4> HLA-DRB1 typing 정확도 검증

NGS 기반 HLA typing 방법과 SNP 정보 기반 HLA typing 방법의 정확도 비교를 위해, 장기이식코호트 참여자 중에서 상기 한국인칩 유전체정보 중 254명을 선별하여 실시예 3의 SNP 정보 기반 HLA typing 정보와 실제 HLA typing 정보와 비교하여 정확도 검증을 수행하였다.

HLA-DRB1 유전자형으로 판별된 샘플의 HLA allele 정확도를 비교해본 결과, SNP 정보 기반 HLA typing 방법을 통해 HLA-DRB1 유전자형으로 결정하는 경우 2 digit 기준은 96.91%, 4 digit 기준 93.49%의 정확도를 보였다. 정확도는 하기 수학식 1의 계산식으로 도출하였다.

이러한 결과를 통해 본 발명의 855개의 SNP 정보를 기반으로 HLA-DRB1 type을 분석하는 방법은 한국인 특이적인 SNP 정보 및 최적화된 분석 파이프라인을 제공함으로써 4일 이내에 기존 방법 대비 20배 낮은 가격(약 5만원 미만)에 96.9% 수준 정확도(2-digit 기준)의 HLA type을 제공 할 수 있다는 것을 확인하였다. HLA-DRB1 type은 장기이식 시 공여자, 수여자간 장기 적합여부를 판단할 때 보는 주요 유전자이다. 따라서 본 발명의 방법을 이용하여 장기이식 대상자 및 공여자에 대해 사전 검사 등에 유용하게 활용 할 수 있으며, 낮은 비용과 적은 소요 시간으로 HLA type을 제공함으로써 약물유전학, 면역 질환, 관련 만성질환 등 다양한 분야에서 연구에 활용 할 수 있을 것으로 예상된다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

표 1(문단식별번호 [0063])의 HLA-DRB1 type 관련 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 HLA-DRB1 유전자형 판별용 마커 세트 조성물.
분석대상으로부터 수득된 생물학적 시료에서 유전체(genome DNA)를 추출하는 1단계;
상기 유전체(genome DNA)의 서열정보를 수득하는 2단계;
상기 서열정보로부터 표 1(문단식별번호 [0063])에 기재된 855개의 단일염기다형성(SNP)에 대한 유전자형을 분석(genotyping)하여 분석대상의 SNP 데이터를 수집하는 3단계; 및
상기 분석대상의 SNP 데이터를 분석하여 HLA 대립유전자를 결정하는 4단계;를 포함하는, HLA-DRB1 유전자형 분석 방법.
제2항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, HLA-DRB1 유전자형 분석 방법.
제2항에 있어서,
상기 방법은 2자리(digit) 또는 4자리(digit) 대립유전자 해상도로 HLA-DRB1 유전자형을 결정하는 것을 특징으로 하는, HLA-DRB1 유전자형 분석 방법.
제2항에 있어서,
상기 분석대상은 한국인인 것을 특징으로 하는, HLA-DRB1 유전자형 분석 방법.
제2항에 있어서,
상기 4단계는 분석대상의 SNP 데이터와 참조 패널(reference panel)과 비교분석하여 HLA 대립유전자를 결정하는 것을 특징으로 하는, HLA-DRB1 유전자형 분석 방법.
제6항에 있어서,
상기 참조 패널(reference panel)은 Han(Chinese) MHC reference panel, Pan-Asian MHC reference panel 및 Korean MHC reference panel으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, HLA-DRB1 유전자형 분석 방법.
제1항의 마커 세트 조성물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, HLA-DRB1 유전자형 분석용 조성물.
제8항의 HLA-DRB1 유전자형 분석용 조성물을 포함하는, HLA-DRB1 유전자형 분석용 키트.