CN114438233B - 一组用于亲缘关系鉴识的X染色体Multi-DIP的同步分型检测体系 - Google Patents
一组用于亲缘关系鉴识的X染色体Multi-DIP的同步分型检测体系 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一组用于亲缘关系鉴识的X染色体Multi‑DIP的同步分型检测体系，涉及生物技术领域；该同步分型检测体系，包含17个位于X染色体上的Multi‑DIP分子遗传标记。本发明以Multi‑DIP分子遗传标记为研究对象，系统甄选在国内群体中具有高度遗传多态性的X染色体Multi‑DIP分子遗传标记用于我国群体的疑难、复杂亲缘关系的鉴识研究；采用NGS技术，将甄选的Multi‑DIP分子遗传标记研发成一个同步并行检测体系，用于我国群体疑难、复杂亲缘关系鉴识的应用研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一组用于亲缘关系鉴识的X染色体Multi-DIP的同步分型检测体系。
背景技术
亲权鉴定是指应用医学、分子生物学、遗传学以及其他学科的理论和技术来判断待鉴定的个体之间是否存在某种生物学亲缘关系。近年来涉及疑难、复杂案件的亲缘关系鉴定是长期困扰法医工作者的难题。既往检测的遗传标记较少、多态性较低，这导致体系的系统效能不足。此外，遗传标记发生突变，往往是造成许多亲缘关系鉴定形成疑难案件的原因。全同胞、半同胞、旁系及隔代等复杂亲缘关系鉴定也是法医工作者经常面临的棘手问题。性染色体遗传标记，如位于X染色体上的遗传标记，表现为伴性遗传的模式，即父亲的X染色体只能传递给其女性后代，这种遗传模式使X染色体遗传标记在疑难、复杂亲缘关系(隔代的祖孙、姑侄女和姨外甥等)鉴识中拥有独特的应用价值。因此，X染色体上高度多态性分子遗传标记的甄选，对于疑难、复杂亲缘关系的鉴识研究具有重要意义。
目前，法医学家通常采用X染色体短串联重复序列(short tandem repeat，STR)用于复杂亲缘关系的鉴识研究，但是STR在实际应用中存在以下问题：1)STR的突变率比较高，约为8.4×10-4，这可能导致鉴定结果的误判。2)STR在PCR过程中存在stutter等伪峰，这对分型结果会产生干扰。3)常用的STR扩增子比较大，不利于陈旧降解检材的分析检测。4)性染色体STR研究较少，特别是可以复合扩增的性染色体STR基因座更少，这不利于复杂亲缘关系的鉴定。因此，甄选具有更高效能和更低突变率的分子遗传标记对于疑难、复杂亲缘关系的鉴识研究具有重要意义。
缺失/插入多态性(deletion/insertion polymorphism，DIP)作为新一代遗传标记，它兼具STR和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的优势，近几年在法医学研究中表现出极好的应用前景，国内外学者也研发了多个检测体系用于法医学的亲缘关系鉴识研究。然而，目前法医学中常用的DIP多为二等位基因变异，它们相比STR具有较低的多态性，往往需要更多的位点才能达到目前常用的STR遗传标记的法医学应用效能。对此，我国学者提出一种新型分子遗传标记，Multi-DIP，其类似于微单倍型，由一段DNA区域内的多个DIP位点构成；相比单一的DIP位点，Multi-DIP可表现出更多的等位基因变异，具有更高的多态性，可在法医学亲缘关系鉴识研究中提供更高的价值。
新一代测序(next generation sequencing，NGS)作为近几年新兴的检测技术，相比毛细管电泳平台，其不受可标记的荧光物质的限制，可用于多个遗传标记的分型检测。更为重要的是，NGS可以检测遗传标记中存在的序列变异，这可进一步提高遗传标记的遗传多态性，使其表现出更好的法医学应用效能。因此，可基于NGS平台研发用于法医学应用研究的各种遗传标记的分型检测体系。
发明内容
本发明的目的是提供一组用于亲缘关系鉴识的X染色体Multi-DIP的同步分型检测体系，以解决上述现有技术存在的问题，本发明以Multi-DIP分子遗传标记为研究对象，系统甄选在国内群体中具有高度遗传多态性的X染色体Multi-DIP分子遗传标记用于我国群体的疑难、复杂亲缘关系的鉴识研究；采用NGS技术，将甄选的Multi-DIP分子遗传标记研发成一个同步并行检测体系，用于我国群体的亲缘关系鉴识。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一组用于亲缘关系鉴识的X染色体Multi-DIP的同步分型检测体系，包含17个位于X染色体上的Multi-DIP分子遗传标记，所述17个位于X染色体上的Multi-DIP分子遗传标记的位点信息如下表所示：
进一步地，所述同步分型检测体系中各位点的引物序列如下表所示：
本发明还提供一种对以上位点进行同时检测的分型方法，包括以下步骤：
(1)筛选位于X染色体上的Multi-DIP分子遗传标记，并根据Multi-DIP分子遗传标记的位点信息设计引物；
(2)根据步骤(1)设计的引物，采用多重PCR技术扩增构建基因文库；
(3)对步骤(2)构建的基因文库测序，并进行数据分析。
进一步地，构建所述的基因文库通过两轮PCR获得，在第一轮PCR中，扩增体系为：PCR Enzyme Mix 12.5μL，引物混合液4μL，DNA样本1μL，ddH2O 7.5μL；扩增程序为：98℃预变性5min；98℃变性15s，64和60℃各1min，72℃延伸30s，共14个循环；72℃终延伸2min；在第二轮PCR中，扩增体系为：PCR Enzyme Mix 12.5μL，PCR Block 2μL，PCR Dual BarcodePrimer F 2μL，PCR Dual Barcode Primer R 2μL；扩增程序为：98℃预变性5min；98℃变性15s，64和60℃各30s，72℃延伸30s，共16个循环；72℃终延伸2min。
本发明可用于不同群体的亲缘关系以及个体识别应用研究。
本发明公开了以下技术效果：
1.本发明提供一组基于NGS平台同步检测17个位于X染色体上的Multi-DIP分子遗传标记的检测体系，这些遗传标记在国内群体中具有较高的多态性，可很好的用于国内群体的法医学个体识别和亲缘关系鉴识研究。
2.本发明研发的体系可同时检测遗传标记中的长度多态性和序列多态性，相比毛细管电泳平台，可进一步提高遗传标记的法医学应用效能。
3.相比那些位于常染色体上的遗传标记，本发明选择的Multi-DIP分子遗传标记位于X染色体上，其伴性遗传的特征可为一些疑难、复杂亲缘关系的鉴识案例提供更有价值的信息。
4.本发明研发的体系可直接对常见的检材样本进行检测分析，无需DNA提取步骤，这可以简化实验流程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为17个位点在检测的汉族群体中的测序深度；
图2为17个位点在检测的汉族群体中的法医学参数。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中所使用的试剂包括PCR Enzyme Mix、引物混合物、PCR Block、PCR DualBarcode Primer F、PCR Dual Barcode Primer R、磁珠DNA纯化试剂盒、Quant-iTTM dsDNA Assay Kit双链DNA荧光定量试剂盒和DNB制备试剂盒。
实施例1
本发明提供一个基于NGS平台的包含17个位于X染色体上的Multi-DIP分子遗传标记的复合扩增体系及其分型检测方法。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：
1、X染色体上Multi-DIP分子遗传标记的甄选
首先，基于既往报道的北京汉族和南方汉族的全基因组数据，采用VCFTOOLS工具搜索位于X染色体上的DIP分子遗传标记，提取那些在汉族群体中最小等位基因频率在0.01以上的DIP分子遗传标记；然后，采用以下原则对这些DIP分子遗传标记进行再次筛选：
1)同一个DNA区域内的DIP位点相距在50bp以内；
2)DIP位点的插入/缺失片段大小在30bp以内；
3)DIP位点在国内汉族群体中的最小等位基因频率在0.1以上；
4)剔除完全处于连锁不平衡的DIP位点；
5)不同区域相距在1Mb以上。
采用以上原则，我们共确定17个分子遗传标记(15个DIP构成的微单倍型，1个二等位基因DIP和1个多等位基因DIP分子遗传标记)，位点信息见表1。
表1 17个位于X染色体上DIP分子遗传标记的基本信息
2.基于NGS的17个Multi-DIP分子遗传标记同步分型检测体系的构建
基于甄选的17个Multi-DIP分子遗传标记，通过NCBI数据库查找每个位点的序列信息，然后采用ATOPlex在线工具设计每个区域的引物，具体的引物信息见表2。
表2 17个位于X染色体上DIP分子遗传标记的引物信息
本发明通过不断调整位点间引物的浓度和混合比例，实现17个分子遗传标记的同步扩增，所涉及的反应试剂包括PCR Enzyme Mix和引物混合物。
检测方法如下：
1)文库构建。
取一个个体DNA样本1μL，配置第一轮PCR体系，具体如下：
| 组分 | 体积 |
| PCR Enzyme Mix | 12.5μL |
| 引物混合液 | 4μL |
| DNA样本 | 1μL |
| ddH2O | 7.5μL |
PCR条件如下：
在完成第一轮PCR后，采用磁珠DNA纯化试剂盒对第一轮扩增产物进行纯化处理。具体操作如下：将第一轮的扩增产物20μL转移至新的96孔板，每个孔加入24μL的磁珠，移液器快速吹打，室温放置5min。然后，将96孔板置于磁力架直至液体澄清，移液器吸弃上清液。接下来，加入80％乙醇100μL，漂洗磁珠和管壁，重复该步骤3次，吸干管内液体，室温干燥至磁珠表面无反光、无开裂。最后，从磁力架上取下PCR产物，加入6.5μL TE Buffer进行DNA洗脱。
配置第二轮PCR体系，如下：
| 组分 | 体积 |
| PCR Enzyme Mix | 12.5μL |
| PCR Block | 2μL |
| PCR Dual Barcode Primer F | 2μL |
| PCR Dual Barcode Primer R | 2μL |
将以上混合液加至纯化后的PCR产物中，进行第二轮PCR，反应条件如下：
2)文库的纯化、定量和DNB制备：采用磁珠DNA纯化试剂盒对第二轮的PCR产物进行纯化处理。采用Quant-iTTM dsDNA Assay Kit双链DNA荧光定量试剂盒对纯化产物进行定量，根据获得的定量结果，将待测样本混合在一个孔内(混合总量为30ng)。然后，采用DNB制备试剂盒制备DNA纳米球，具体操作如下：首先，制备DNB体系1，包含构建的测序文库，DNB制备缓冲液20μL，TE缓冲液补至40μL；将以上混合液放置于PCR仪中，95℃和40℃各3min；制备DNB体系2，分别将40μL DNB聚合酶混合液I和4μL DNB聚合酶混合液II加至DNB体系1中，低速离心5s后，放置于PCR仪中，30℃反应25min；反应结束后，加入20μLDNB终止缓冲液，均匀吹打5-8次，置于4℃保存。
3)测序及数据分析。将制备的DNB放置于MGISEQ-2000RS基因测序仪上进行测序反应，测序模式为“SE400+10+10”。
本发明提供一种基于NGS平台的位于X染色体上17个DIP分子遗传标记的同步并行分型检测体系，具体包括17个分子遗传标记的位点信息、引物序列，测序文库构建的实验流程和上机测序等操作步骤。本发明基于既往报道的汉族群体的全基因组测序数据，系统甄选出在国内群体中具有较高遗传多态性的位于X染色体上的Multi-DIP分子遗传标记，相比X-STR遗传标记，Multi-DIP分子遗传标记具有突变率低、PCR过程中无stutter峰的优势，这更有利于疑难、复杂亲缘关系的鉴识研究。
实施例2
本实施例为采用实施例构建的检测体系对中国一个汉族群体(约200多例)进行检测分析，具体步骤如下：
(1)采用打孔器，每个样本取1.2mm的血痕卡，采用25μL Clean Buffer对样本进行预处理；然后采用实施例1中的文库构建、纯化和测序步骤对每个样本进行检测分析。
采用Soapnuke软件对下机后的原始数据进行处理。质控后的数据和hs37d5人类参考基因组进行比对，运用GATK HaplotypeCaller软件确定每个区域内各个位点组成的微单倍型信息。
17个位点在检测的汉族群体中的测序深度如图1所示。17个位点表现出相对较高和均衡的测序深度，表明该体系具有较好的扩增均衡性。
17个位点在检测的汉族群体中的法医学参数如图2所示。通过本发明的检测方法，相比基于长度多态性的检测方法，这些位点表现出更高的多态性。17个位点在检测汉族群体中的累积个体识别力(女性)和累积非父排除概率(三联体)为0.999999999999972,和0.9999999288，相比既往的17个常染色体multi-DIPs，13个X染色体multi-DIPs和38个X-DIPs，本发明中的17个位点拥有更高的累积法医学应用效能，表明这些位点可更好的用于我国群体的法医学个体识别和亲缘关系鉴识的应用研究。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 贵州医科大学
<120> 一组用于亲缘关系鉴识的X染色体Multi-DIP的同步分型检测体系
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatcaatcat atatatcatc taccggtcat ct 32
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacaggtagg tagatagatg cattga 26
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 5
<211> 32
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<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
taattctatc ttctaaattc ctcttaattc tggtc 35
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<211> 35
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<400> 30
gttagtcaaa taaaaatgag ataattagca actcg 35
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
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<211> 34
<212> DNA
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attgttcact aattctgata gttttatagt ggac 34
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tattcaacat tgtactggaa gttctcga 28
Claims (3)
1.一组用于亲缘关系鉴识的X染色体Multi-DIP的同步分型检测体系，其特征在于，包含检测17个位于X染色体上的Multi-DIP分子遗传标记的引物，所述17个位于X染色体上的Multi-DIP分子遗传标记的位点信息如下表所示：
检测17个位于X染色体上的Multi-DIP分子遗传标记的引物如下表所示：
2.一种根据权利要求1所述的同步分型检测体系进行同步分型检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用权利要求1所述的同步分型检测体系中各位点的引物，采用多重PCR技术扩增构建基因文库；
(2)对步骤(1)构建的基因文库测序，并进行数据分析。
3.一种如权利要求1所述的同步分型检测体系在个体识别或亲缘关系鉴识中的应用。
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