CN113881760A - 一种基于ngs技术检测四种类型129个分子遗传标记的复合扩增体系 - Google Patents
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Abstract
本发明属于法医学新技术创新研究应用领域，具体涉及公开一种基于二代测序平台检测多种分子遗传标记的复合扩增体系。本发明基于HGDP‑CPEH数据库筛选用于不同洲际和国内群体法医学始祖推断分析的48个AISNP位点；基于千人基因组计划筛选在国内群体中具有较高多态性分布的18个多等位基因InDel位点；基于既往的研究报道筛选在国内群体中具有较高应用价值的27个微单倍型；选择用于男性个体单倍群分布研究的34个Y‑SNP位点和2个Y‑InDel；基于二代测序平台，采用多重PCR的方法实现以上多种遗传标记的同步扩增检测分析。本发明可针对一份现场物证检材，同时实现法医学的个体识别、亲缘关系鉴识、混合样本解晰、法医学始祖分析以及男性个体单倍群分布研究，可为法医学应用研究提供更全面、更有价值的生物信息。
Description
技术领域
本发明属于法医学新技术研究应用领域，具体涉及公开一种基于二代测序检测平台（Next generation sequencing, NGS），建立的四种类型新的129个分子遗传标记的复合扩增体系，包括系统甄选的始祖信息单核苷酸多态性（ancestry informative singlenucleotide polymorphism, AISNP）、多等位基因缺失/插入多态性（insertion/deletionpolymorphism, InDel）、微单倍型和Y染色体SNP/InDel分子遗传标记的复合扩增体系及其分析检测方法。
背景技术
法医学的始祖信息分析有利于揭示未知名个体的生物地理起源，有助于通过缩小调查范围，来协助司法侦查工作。目前，法医学中常用的始祖信息分析体系多是针对不同洲际群体，这些体系不适于国内群体的鉴别研究。因此，筛选一些用于国内群体法医学始祖分析的位点，不仅可进一步优化现有的始祖分析体系，也有利于我国不同族群的鉴别研究，进而为法医学应用提供更有价值的信息。
短串联重复序列（short tandem repeats, STR）是法医学个体识别和亲缘关系鉴识研究中常用的遗传标记。不过，STR存在扩增子较长和突变率较高的不足，尤其是在检测高度降解的检材或分析疑难亲缘关系时应用受限。SNP和InDel遗传标记作为第三代遗传标记，相比STR，具有较低突变率和易获得较小扩增子的优势，近几年在法医学研究中得到了广泛的应用。然而，目前常用的SNP和InDel多为二等位基因变异，它们的多态性较低，也不利于混合样本的解晰研究。对此，法医学者开始筛选多等位基因SNP位点以求获得更高的多态性。这种类型的SNP可表现出多个等位基因变异，但理论上最多存在四个等位基因。相比多等位基因SNP位点，多等位基因InDel位点理论上可提供更多的等位基因变异，因此，它们有望获得更高的法医学应用价值，尤其是对于混合样本的解晰研究。
微单倍型作为一种新型分子遗传标记，相比常用的STR位点，其由一段较短的DNA序列区域内两个或者两个以上的SNP位点组成，其具有可获得较小的扩增子、拥有较低的突变率和PCR过程中无stutter峰的优势。此外，微单倍型的等位基因是一个区域内的多个SNP组成的单倍型，在群体中可表现出多个单倍型的变异，因此，它们可表现出更高的多态性和更好的法医学系统效能，在法医学司法实践中具有很好的应用价值。
Y-SNP位点拥有极低的突变率，且Y染色体表现出父系遗传的特征。据此，可采用Y-SNP位点推测男性个体的父系起源。采用Y-SNP位点推测个体的单倍群分布信息，可为法医学、群体遗传学、人类学等研究提供有价值的信息。Y-InDel位点可用于性别鉴定。
NGS技术可通过检测待测片段的碱基序列实现位点的序列分型检测；其对遗传标记的检测不受标记的荧光物质的限制，故可实现大量位点的同步分型检测分析。此外，NGS具有极好的兼容性，可实现多种类型分子遗传标记的同步检测分析。因此，NGS技术在法医学研究中具有极好的应用前景，可为法医学研究提供更有价值的信息。
本发明采用NGS技术，通过多重PCR的方法，实现AISNP、多等位基因InDel、微单倍型和Y-SNP/InDel在内的四种类型分子遗传标记共计129个位点的同步检测分析，可通过检测一份现场检材实现法医学的个体识别、亲缘关系鉴识、混合样本解晰和法医学始祖分析以及男性个体单倍群的分布研究。。
发明内容
在此处。本发明的目的是提供一种包含AISNP、多等位基因InDel、微单倍型和Y-SNP/InDel在内的多种遗传标记的复合扩增体系及其分型检测方法。
为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：
1. 四种类型129个分子遗传标记的甄选
1）AISNP位点的筛选。首先，我们以HGDP-CEPH报道的东亚、欧洲、非洲和美洲群体的数据集为基础，采用以下原则筛选适于不同洲际群体鉴别研究的AISNP位点：a. SNP位点在不同洲际群体间的频率差异在0.3以上；b. SNP位点位于不同染色体上或在同一染色体上的物理距离大于10Mb；c. SNP位点位于内含子区域；d. 选择的SNP位点在所有参考群体中符合哈迪温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium, HWE）；e. SNP位点为二等位基因变异。然后，对选出来的位点进一步甄选，筛选出那些在国内汉族、维吾尔族和蒙古族群体间的频率差异在0.3以上的位点。根据以上原则，共筛选出48个AISNP位点。这48个AISNP位点的引物信息（Seq1-Seq96）见表1.
表1：48个AISNP位点的引物信息
2）多等位基因InDel位点的筛选。基于千人基因组计划中报道的不同洲际群体的遗传数据筛选多等位基因InDel位点，位点的筛选原则如下：a. 多等位基因InDel位点在东亚群体中的最小等位基因频率大于0.1；b. 多等位基因InDel位点位于不同染色体上或在同一染色体上物理距离大于10Mb；c. 多等位基因InDel位点插入/缺失的片段大小在30bp以内；d. 多等位基因InDel位点在东亚群体中符合HWE；e. 多等位基因InDel位点在东亚群体中表现为多等位基因（>2）变异。基于以上原则，确定18个多等位基因InDel位点，这些位点的引物信息（Seq97-Seq132）见表2。
表2:18个多等位基因InDel位点的引物序列
3）微单倍型位点的筛选。对于微单倍型位点，基于我们课题组和其他人的研究报道，筛选出那些在国内群体中表现出较高多态性的微单倍型位点，共确定27个微单倍型位点，这些位点的引物信息（Seq191-Seq300）见表3。
表3： 27个微单倍型位点的引物信息
4）Y-SNP/InDel位点的筛选。基于既往的研究报道，我们选择34个Y-SNP位点用于男性个体单倍群的分布研究。此外，我们也选择两个Y-InDel位点用以男性个体的鉴别研究。36个Y染色体遗传标记的引物信息（Seq301-Seq372）见表4。
表4： 36个Y-SNP/InDel位点的引物信息
2. 筛选的位点复合扩增体系的构建。本发明采用Primer Premier 6.0软件对48个AISNP、18个多等位基因InDel、27个微单倍型和36个Y-SNP/InDel位点进行引物设计。基于获得的引物序列，通过调整引物的浓度、不断优化体系，实现以上所有分子遗传标记的复合扩增。接下来，采用多重PCR方法构建测序文库，具体操作如下：
1）第一轮PCR混合液包括12.5µL PCR Enzyme Mix、4µL PCR Primer Pool和3.5µL的样本DNA。PCR反应条件为95℃变性5min；98℃变性15s，64℃和60℃各1min，72℃延伸30s，共14个循环；72℃终延伸2min，然后4℃保存。
在完成第一轮PCR后，需对所获得的PCR产物进行纯化处理。具体操作如下：吸取26µL磁珠加入第一轮PCR产物中，用移液器快速吹打使其混合均匀，室温孵育5 min。然后，将PCR产物置于磁力架上，静置5 min至液体澄清，用移液器小心移弃上清。加入100µL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁，轻轻吹打后吸弃上清，重复该步骤1-2次，吸干管内液体，室温干燥至磁珠表面无反光、无开裂。最后，从磁力架上取下PCR产物，加入6.5µL TE Buffer进行DNA洗脱。
第二轮PCR混合液包括12.5μL PCR Enzyme Mix、2μL PCR Block、2μL PCR DualBarcode Primer F、2μL PCR Dual Barcode Primer R和纯化后的第一轮PCR产物。PCR反应条件为98℃变性5min；98℃变性15s，64℃、60℃和72℃各30s，共16个循环；72℃反应2min，4℃保存。
然后，采用相同的纯化方法对第二轮PCR产物进行纯化处理，不同的是最后加入23μL TE Buffer进行DNA洗脱。将洗脱液放置在磁力架上，待液体澄清后，取21μL转移至新的离心管。
2）文库的定量。采用Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit双链DNA荧光定量试剂盒，对纯化后的第二轮PCR产物进行定量。根据定量结果将待测样本混合在一个孔内，混合总量为500 ng。
3）文库的环化及酶切消化。将构建好的文库移至新的0.2 mL离心管中，用TEBuffer补充总体积至48µL；将离心管置于PCR仪上，95℃变性3min，立即置于冰上静置2 min后瞬时离心。将11.6µL Dual Barocde Splint Buffer和0.5µL DNA Rapid Ligase加至上一步变性后的溶液中，放置于PCR仪中，37℃反应10 min。
配置酶切消化液，包括1.4µL Digestion Buffer和2.6µL Digestion Enzyme，加入反应后的溶液中，瞬时离心，然后放置于PCR仪中，37℃反应30 min。反应结束后，向离心管内加入7.5µL Digestion Stop Buffer，瞬时离心后，将所有反应液转移至新的离心管中。吸取170µL DNA Clean Beads加至上一步的溶液中，用移液器轻轻吹打至完全混匀，室温孵育5 min；将离心管置于磁力架，静置5 min至液体澄清，用移液器吸取、丢弃上清。保持离心管于磁力架上，加入500µL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30 s后吸取、丢弃上清，重复该步骤1-2次。保持离心管固定于磁力架上，室温干燥至磁珠表面无反光和开裂。将离心管从磁力架上取下，加入25µL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至完全混匀。室温下孵育5 min，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置至液体澄清，将23µL上清液转移到新的离心管中。采用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光定量试剂盒，对上一步纯化后产物进行定量，最后取10 ng产物制备DNA Nano Ball。
4）将制备好的DNB放置于MGISEQ-2000RS基因测序仪上进行测序反应。在完成测序反应后，采用Soapnuke软件对原始数据进行预处理；然后，采用BWA软件将质控后的序列和人类参考基因组进行比对；最后，采用FreeBayes软件确定遗传标记的等位基因分型。
本发明提供一种可同时检测AISNP、多等位基因InDel、微单倍型和Y-SNP/InDel的分型检测体系，具体包括48个AISNP、18个多等位基因InDel、27个微单倍型和36个Y-SNP/InDel位点的基本信息，两轮PCR的体系组分、热循环反应参数，文库定量、上机测序以及后续数据分析等操作步骤。本发明基于NGS技术实现对选择的AISNP、多等位基因InDel、微单倍型和Y-SNP/InDel的同步检测分析，可应用一份检材同时实现法医学个体识别、亲缘关系鉴识、混合样本解晰、法医学始祖分析以及男性个体的单倍群分布研究，进而为法医学应用研究提供更有价值的信息。
具体实施方式
下面以一个样本为例，进一步说明本发明的操作流程。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
本发明中所用的试剂：PCR Enzyme Mix、PCR Primer Pool、PCR Block、PCR DualBarcode Primer F、PCR Dual Barcode Primer R、磁珠DNA纯化试剂盒、Quant-iTTMPicoGreen® dsDNA Assay Kit双链DNA荧光定量试剂盒、MGIEasy双barcode环化试剂盒和Qubit® ssDNA Assay Kit荧光定量试剂盒。
检测方法：
1)测序文库的构建和纯化。取一个个体样本的DNA 3.5µL，采用本发明给出的PCR反应体系，如下：
PCR条件如下：
在完成第一轮PCR反应后，对PCR产物进行纯化处理，吸取26µL磁珠加入第一轮PCR产物中，用移液器快速吹打使其混合均匀，室温孵育5 min。然后，将PCR产物置于磁力架上，静置5 min至液体澄清，用移液器小心移弃上清。加入100µL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁，轻轻吹打后吸弃上清，重复该步骤1-2次，吸干管内液体，室温干燥至磁珠表面无反光、无开裂。最后，从磁力架上取下PCR产物，加入6.5µL TE Buffer进行DNA洗脱。
接下来，进行第二轮PCR反应。第二轮PCR反应溶液的配比如下：
第二轮的PCR条件如下：
然后，对第二轮PCR产物进行纯化处理，具体操作如下：吸取26µL磁珠加入第一轮PCR产物中，用移液器快速吹打使其混合均匀，室温孵育5 min。然后，将PCR产物置于磁力架，静置至液体澄清，用移液器小心移弃上清。加入100µL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁，轻轻吹打后吸弃上清，重复该步骤1-2次，吸干管内液体，室温干燥至磁珠表面无反光、无开裂。从磁力架上取下PCR产物，加入23µL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器吹打均匀后放置于磁力架上，静置至液体澄清，然后采用移液器转移21µL上清液至新的离心管中。
2)文库的定量。采用Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit双链DNA荧光定量试剂盒，
对纯化后的第二轮PCR产物进行定量。
3)文库的环化及酶切消化。将构建好的文库移至新的离心管中，用TE Buffer补充总体积至48µL；将离心管置于PCR仪上，95℃变性3min，置于冰上静置2 min后瞬时离心。将11.6µL Dual Barocde Splint Buffer和0.5µL DNA Rapid Ligase加至上一步变性后的溶液中，放置于PCR仪中，37℃反应10 min。配置酶切消化液，包括1.4µL Digestion Buffer和2.6µL Digestion Enzyme，加入反应后的溶液中，瞬时离心，然后放置于PCR仪中，37℃反应30 min。反应结束后，向离心管内加入7.5µL Digestion Stop Buffer，瞬时离心后，将所有反应液转移至新的离心管中。吸取170µL DNA Clean Beads加至上一步的溶液中，用移液器轻轻吹打至完全混匀，室温孵育5 min；将离心管置于磁力架，静置5 min至液体澄清，用移液器吸取、丢弃上清。保持离心管于磁力架上，加入500µL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30 s后吸取、丢弃上清，重复该步骤1-2次。保持离心管固定于磁力架上，室温干燥至磁珠表面无反光和开裂。将离心管从磁力架上取下，加入25µL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至完全混匀。室温下孵育5 min，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置至液体澄清，将23µL上清液转移到新的离心管中。采用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光定量试剂盒，对上一步纯化后产物进行定量，最后取10 ng产物制备DNA Nano Ball。
4)将制备好的DNB放置于MGISEQ-2000RS基因测序仪上进行测序反应，测序类型为PE150+10+10。完成测序反应后，采用Soapnuke软件对原始数据进行预处理，过滤参数为“-l10 -q 0.2 -n 0.05 -Q 2 -T 1”；然后，采用BWA软件将质控后的序列和人类参考基因组进行比对；最后，采用FreeBayes软件确定各种遗传标记的等位基因分型。
序列表
<110> 朱波峰
<120> 一种基于NGS技术检测四种类型129个分子遗传标记的复合扩增体系
<141> 2021-08-25
<160> 372
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
gaacttacag tctcatgtct gagattattt c 31
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 2
gaaaacagag cttctgtcct tgtct 25
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gtgtctaaag ggtgtacaag aaggtatac 29
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gaaaacagag cttctgtcct tgtct 25
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<212> DNA
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agctcacacc tgccttataa cag 23
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gtttttacaa ctttcttcgg cccttag 27
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aataaaatat atagtcaccc tatcactatg gctag 35
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atagaaagat gctagtctta gagcttgatt ag 32
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tctctaagaa tgggtggttt attttattat cttag 35
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cgcacacagc ttacaaatat tttatgttaa taag 34
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ttatgttgtt actacccata tcaaacttag gtata 35
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ctcttttaga atctgggagc actatttga 29
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taatgggact ttcctggatt ctttagttc 29
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gtaggaaata gcttcatagg tgtaagagc 29
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ctatatggta ttttacaaat gaagaagcag aact 34
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tttccaattc cctcaagctg tacg 24
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<213> 人类(Homo sapiens)
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ctctttgctt atgatgaatt agtggttaca tac 33
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 26
ctgaataaaa atacttcaat attttgataa ttggc 35
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 27
taaaattatg tctttcaatc taagtatggc atacc 35
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ccaagaatta ccaaaatgta acaccga 27
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aaactcttcc tattccattt attaactgtt tgac 34
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agagaacaaa tataaaacaa atcaaccgat atg 33
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gggaaacaag gtcatttaag gtacga 26
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gtatgttgaa tgtatctgct agttatatgt tagtc 35
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gctgagataa tatatttaaa atattgctca ctgtt 35
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attcttattt ctctgctctc tactgttaca tac 33
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 35
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caatcaatca tctggggacc tacg 24
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gaatcagtcc tctcatatat cattaaagta ctacc 35
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ttgaattgat ttggaaaatc acttagtata ggag 34
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acttagttta ccaagggagt aagcac 26
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<213> 人类(Homo sapiens)
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gcttttatgg ctgtttctag ataagtcatc 30
<210> 43
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<212> DNA
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ctagttttct ctaccaacca gaagagtaaa 30
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gctgagtaac tatgatttaa atgaaatgtc gta 33
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cctaattatt agtgttggcc gtgttaag 28
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atgtacaatt ctaatatcta aacatgatta tgaca 35
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ctcctaatct tttcatgatt cagtattgca tc 32
<210> 50
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<400> 50
cttcaaatat gaggtctaag gagtatctag ttg 33
<210> 51
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 51
cagtcacttg tctacactct atttgagag 29
<210> 52
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taattataca ttcaagttta tgaacccacc g 31
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ccagttgtgg ttaaacgggt attta 25
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aagtctctat atcccaaagg aaaatcgttt a 31
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gttctggaat gggagaatta aaaatgagta g 31
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aaaaataaac ccctaatttg tttaaaccat tgg 33
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gtagaacttg ggagtcatct ttgattctt 29
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<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 58
aatttaaaca gatcattttt gttagccatg tg 32
<210> 59
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<213> 人类(Homo sapiens)
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ctaatgatgt tgaaatatat gaagtcccac ttaag 35
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ctagtagcag acccatctat ggagaatat 29
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gtgagcctac ccagatagtg c 21
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aaaatcttgc tacctttaaa agagttaacc tg 32
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attattatta aatttagaga ccctacactc catac 35
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
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tttttaaaaa gtgaagagca tacacatata atatc 35
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<213> 人类(Homo sapiens)
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<212> DNA
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<400> 104
tattccttta aaacactttc ctttcagtat tattc 35
<210> 105
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 105
caaacaaaca caattttaaa ctctggtata atgt 34
<210> 106
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 106
cgaatggcta aaatttacct caaaatgatt attta 35
<210> 107
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 107
ctctttcttc atagtgtcac atttaatgaa aatac 35
<210> 108
<211> 32
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 108
gatgatttcc cctttaacaa aacatgtttt ag 32
<210> 109
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 109
gaacctagaa atatgcagtg ttaacacac 29
<210> 110
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 110
catctccaaa aaggccatac aaagc 25
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 111
ttactagaaa caatcatctc ttttatccct tgta 34
<210> 112
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 112
gaattatagc tacttacaac tataggtgta tatg 34
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 113
ttagtctcaa tttaatttat ttctgctcta atc 33
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
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aatagtatta agagggaagt ttggagcaat aa 32
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
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<211> 34
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<212> DNA
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<211> 35
<212> DNA
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ctttactagt atctttcaaa gaaaagaaga attta 35
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<211> 35
<212> DNA
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<400> 120
gtctaaatat taatgctaac ttttagataa catgc 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
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<212> DNA
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<400> 122
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<212> DNA
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<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
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caagtacaca accaaaccat attacaac 28
<210> 127
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 127
gtatcaagta attgctcaat tccatttata tattg 35
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 128
ggcaggagaa ttgctttaac tcg 23
<210> 129
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 129
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 130
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<210> 131
<211> 31
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 131
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 132
ggttcagttg aaatggacaa taaggc 26
<210> 133
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 133
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 134
cagaggagga ataaagggat tgcag 25
<210> 135
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 135
cccacaaaat gagaggaagg ttact 25
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 136
cagaggagga ataaagggat tgcag 25
<210> 137
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 137
cactcccact ccggtgaata a 21
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 138
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 139
cactcccact ccggtgaata a 21
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 140
aatttgtcct tggcagggat gtaat 25
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 143
agtacttttg tggcactgga gaac 24
<210> 144
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 144
gtccttgagg ctcgtagata tg 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 145
agtacttttg tggcactgga gaac 24
<210> 146
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 146
gtccttgagg ctcgtagata tg 22
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 148
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<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 149
agaatctgtg ctttggagta atcagac 27
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 150
gaaacaaagg ttaaagagat atagggttca ttatc 35
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 151
agaatctgtg ctttggagta atcagac 27
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 152
gaaacaaagg ttaaagagat atagggttca ttatc 35
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 153
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<210> 154
<211> 30
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<213> 人类(Homo sapiens)
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 155
tatttgagct tgagcttttc agttgtttag 30
<210> 156
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<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 156
actaaaagat ttcaacatat gacactctgc 30
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<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 157
tatttgagct tgagcttttc agttgtttag 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 158
actaaaagat ttcaacatat gacactctgc 30
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 159
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<210> 160
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<212> DNA
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<211> 33
<212> DNA
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<400> 161
gacaaaagtg aacttgattt tcttaacaaa act 33
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 162
ctggtgatga caagtgagat gtc 23
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<211> 33
<212> DNA
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<400> 163
gacaaaagtg aacttgattt tcttaacaaa act 33
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<212> DNA
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<400> 164
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<212> DNA
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<400> 166
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<211> 34
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<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 167
gtttattatt tttatggatg acaacatagt gcat 34
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 168
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<211> 34
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<400> 169
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<211> 21
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<400> 170
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<211> 34
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<400> 171
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<211> 21
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<400> 172
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 173
gtttattatt tttatggatg acaacatagt gcat 34
<210> 174
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 174
gacacacaca ctctgcctag g 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 175
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<212> DNA
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<400> 176
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<211> 24
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<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 177
ctcctgagtt tgggaggtaa gact 24
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 178
gtctccatag taaccattcc tgtttatata tattg 35
<210> 179
<211> 24
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<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 179
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<400> 180
gtctccatag taaccattcc tgtttatata tattg 35
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<211> 24
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<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 181
ctcctgagtt tgggaggtaa gact 24
<210> 182
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 182
gtctccatag taaccattcc tgtttatata tattg 35
<210> 183
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 183
ctcctgagtt tgggaggtaa gact 24
<210> 184
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 184
gtctccatag taaccattcc tgtttatata tattg 35
<210> 185
<211> 30
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 185
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<211> 33
<212> DNA
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<400> 186
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<211> 30
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<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 187
gtcttaactc actgctttct atcgtttatg 30
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<211> 33
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<400> 188
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 189
gtcttaactc actgctttct atcgtttatg 30
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<211> 33
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<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 190
gatttttcct agcatatcac attgttattg atg 33
<210> 191
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 191
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 192
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<210> 193
<211> 26
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 193
ccctgtcctt tacaaggtcc tatttg 26
<210> 194
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 194
gacccacacc cgtatccttc 20
<210> 195
<211> 26
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 195
ccctgtcctt tacaaggtcc tatttg 26
<210> 196
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 196
gacccacacc cgtatccttc 20
<210> 197
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 197
cttttaattt aggagtgagg taataagatg taagc 35
<210> 198
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 198
gtgtcccagc agatatttcc aattagata 29
<210> 199
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 199
cttttaattt aggagtgagg taataagatg taagc 35
<210> 200
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 200
gtgtcccagc agatatttcc aattagata 29
<210> 201
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 201
aggtatatcc tttataataa aactggaatc ataag 35
<210> 202
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 202
cacaagagta ccttcatttc agttaacag 29
<210> 203
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 203
aggtatatcc tttataataa aactggaatc ataag 35
<210> 204
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 204
cacaagagta ccttcatttc agttaacag 29
<210> 205
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 205
aggtatatcc tttataataa aactggaatc ataag 35
<210> 206
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 206
cacaagagta ccttcatttc agttaacag 29
<210> 207
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 207
ataaaataaa actagtgata gtttctctac taaga 35
<210> 208
<211> 27
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 208
gaaaagggaa gtggaaaaca cacatag 27
<210> 209
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 209
ataaaataaa actagtgata gtttctctac taaga 35
<210> 210
<211> 27
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 210
gaaaagggaa gtggaaaaca cacatag 27
<210> 211
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 211
ataaaataaa actagtgata gtttctctac taaga 35
<210> 212
<211> 27
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 212
gaaaagggaa gtggaaaaca cacatag 27
<210> 213
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 213
agatttctca aaagtagggt ccgac 25
<210> 214
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 214
aaatcttacc tgccaacata ttcaccata 29
<210> 215
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 215
agatttctca aaagtagggt ccgac 25
<210> 216
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 216
aaatcttacc tgccaacata ttcaccata 29
<210> 217
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 217
gtgatttcat ccaggccctt atg 23
<210> 218
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 218
ctcatgcatt atgtatgatg gaaattaatt tatcc 35
<210> 219
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 219
gtgatttcat ccaggccctt atg 23
<210> 220
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 220
ctcatgcatt atgtatgatg gaaattaatt tatcc 35
<210> 221
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 221
gtgatttcat ccaggccctt atg 23
<210> 222
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 222
ctcatgcatt atgtatgatg gaaattaatt tatcc 35
<210> 223
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 223
cacattggtt taagcccaga gatc 24
<210> 224
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 224
agtcccagga acaaatgtaa tgcc 24
<210> 225
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 225
cacattggtt taagcccaga gatc 24
<210> 226
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 226
agtcccagga acaaatgtaa tgcc 24
<210> 227
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 227
cacattggtt taagcccaga gatc 24
<210> 228
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 228
agtcccagga acaaatgtaa tgcc 24
<210> 229
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 229
cacattggtt taagcccaga gatc 24
<210> 230
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 230
agtcccagga acaaatgtaa tgcc 24
<210> 231
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 231
cacattggtt taagcccaga gatc 24
<210> 232
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 232
agtcccagga acaaatgtaa tgcc 24
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 233
ccagagaacc cgtgttcaac 20
<210> 234
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 234
gagccagtag atgtctatgg tcttc 25
<210> 235
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 235
ccagagaacc cgtgttcaac 20
<210> 236
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 236
gagccagtag atgtctatgg tcttc 25
<210> 237
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 237
gaaaaagaaa atgcattagt tcatgtaatt aaagc 35
<210> 238
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 238
ttaaataaca acaacaaaag cacaaagcc 29
<210> 239
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 239
gaaaaagaaa atgcattagt tcatgtaatt aaagc 35
<210> 240
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 240
ttaaataaca acaacaaaag cacaaagcc 29
<210> 241
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 241
gaaaaagaaa atgcattagt tcatgtaatt aaagc 35
<210> 242
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 242
ttaaataaca acaacaaaag cacaaagcc 29
<210> 243
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 243
cagggcaaca gaatgagatt ct 22
<210> 244
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 244
ccgatatttt actactagaa acaatactgt cata 34
<210> 245
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 245
cagggcaaca gaatgagatt ct 22
<210> 246
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 246
ccgatatttt actactagaa acaatactgt cata 34
<210> 247
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 247
cagggcaaca gaatgagatt ct 22
<210> 248
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 248
ccgatatttt actactagaa acaatactgt cata 34
<210> 249
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 249
cagggcaaca gaatgagatt ct 22
<210> 250
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 250
ccgatatttt actactagaa acaatactgt cata 34
<210> 251
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 251
ggaaagtacc agatgggtca gattc 25
<210> 252
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 252
gatcctaatc aaggctatgg atacctatc 29
<210> 253
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 253
ggaaagtacc agatgggtca gattc 25
<210> 254
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 254
gatcctaatc aaggctatgg atacctatc 29
<210> 255
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 255
ggaaagtacc agatgggtca gattc 25
<210> 256
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 256
gatcctaatc aaggctatgg atacctatc 29
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 257
ccaaaggaag aagggcctga aaa 23
<210> 258
<211> 31
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 258
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<210> 259
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 259
ccaaaggaag aagggcctga aaa 23
<210> 260
<211> 31
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 260
taaactatat tgtttcaaat accagctggt g 31
<210> 261
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 261
ccaaaggaag aagggcctga aaa 23
<210> 262
<211> 31
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 262
taaactatat tgtttcaaat accagctggt g 31
<210> 263
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 263
ccaaaggaag aagggcctga aaa 23
<210> 264
<211> 31
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 264
taaactatat tgtttcaaat accagctggt g 31
<210> 265
<211> 19
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 265
ggccaggcat atagctggt 19
<210> 266
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 266
atgaagtgaa accatctcca agtcc 25
<210> 267
<211> 19
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 267
ggccaggcat atagctggt 19
<210> 268
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 268
atgaagtgaa accatctcca agtcc 25
<210> 269
<211> 19
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 269
ggccaggcat atagctggt 19
<210> 270
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 270
atgaagtgaa accatctcca agtcc 25
<210> 271
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 271
cacgtgtcct ggtgtaccaa c 21
<210> 272
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 272
aacacacatc atctgactgt cgc 23
<210> 273
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 273
cacgtgtcct ggtgtaccaa c 21
<210> 274
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 274
aacacacatc atctgactgt cgc 23
<210> 275
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 275
cacgtgtcct ggtgtaccaa c 21
<210> 276
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 276
aacacacatc atctgactgt cgc 23
<210> 277
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 277
cacgtgtcct ggtgtaccaa c 21
<210> 279
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 279
aacacacatc atctgactgt cgc 23
<210> 280
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 280
cacgtgtcct ggtgtaccaa c 21
<210> 281
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 281
aacacacatc atctgactgt cgc 23
<210> 282
<211> 26
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 282
cctaaaagaa ggtcacagac ctatag 26
<210> 283
<211> 19
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 283
cccctgcctg aacactttg 19
<210> 284
<211> 26
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 284
cctaaaagaa ggtcacagac ctatag 26
<210> 285
<211> 19
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 285
cccctgcctg aacactttg 19
<210> 286
<211> 33
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 286
atttcatcct cattgtggaa tttcataaac tac 33
<210> 287
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 287
tattatatac agatacaaga ttcaaatcca acctc 35
<210> 288
<211> 33
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 288
atttcatcct cattgtggaa tttcataaac tac 33
<210> 289
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 289
tattatatac agatacaaga ttcaaatcca acctc 35
<210> 289
<211> 33
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 289
atttcatcct cattgtggaa tttcataaac tac 33
<210> 290
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 290
tattatatac agatacaaga ttcaaatcca acctc 35
<210> 291
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 291
gaggagaggt gagactgtcg g 21
<210> 292
<211> 30
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 292
gttaatcaaa agtgaaggaa ctaagaacgg 30
<210> 293
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 293
gaggagaggt gagactgtcg g 21
<210> 294
<211> 30
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 294
gttaatcaaa agtgaaggaa ctaagaacgg 30
<210> 295
<211> 26
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 295
atgaatgcac gaacaaaaca taggtc 26
<210> 296
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 296
caaacctttg ctgaatgcct caag 24
<210> 297
<211> 26
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 297
atgaatgcac gaacaaaaca taggtc 26
<210> 298
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 298
caaacctttg ctgaatgcct caag 24
<210> 299
<211> 26
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 299
atgaatgcac gaacaaaaca taggtc 26
<210> 300
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 300
caaacctttg ctgaatgcct caag 24
<210> 301
<211> 33
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 301
tagatggtta ataatcatct gcttactcta cag 33
<210> 302
<211> 31
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 302
ttacctttat gtcataaagc agaagttctg a 31
<210> 303
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 303
tcttagaaag gaaacgagat aaaatattaa acgac 35
<210> 304
<211> 31
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 304
aaaaattgtt ttcaatttac caggattaac c 31
<210> 305
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 305
ctagaggtgc cttcggacct ag 22
<210> 306
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 306
tattcaaatt gaaatgtgga aataatagaa ttttc 35
<210> 307
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 307
ttatacaaat ccagaaaatt gcatgtctat gaat 34
<210> 308
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 308
gaatcagcac aactcgagtg tatc 24
<210> 309
<211> 26
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 309
ctatgagatg acacttcacc ttcgac 26
<210> 310
<211> 32
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 310
gtttttaagg tttctgcatt tgatagaatc aa 32
<210> 311
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 311
ctattagttc tgttttatcc tgagtaatac atcag 35
<210> 312
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 312
ctctctgctc ataagtttta taacagacat aaatg 35
<210> 313
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 313
aatcatttct acagttatca aataataata ctgac 35
<210> 314
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 314
tgaaatactt ttgagtaaag aatattaatg atacc 35
<210> 315
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 315
ttaataacac atgagttaca ctttatttta gtctg 35
<210> 316
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 316
aaaaaccaac ctctgttagg tatagaact 29
<210> 317
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 317
ttttcctttt aaaagaaagg attcatgatg aaatc 35
<210> 318
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 318
tttattccac aaaacatttc tgtaaacatc tctta 35
<210> 319
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 319
cggggtgtgg actttacgaa c 21
<210> 320
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 320
gtttttgttt gtttgtttct taaatcctac tatc 34
<210> 321
<211> 35
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 321
caatagttac tacttgagtt actatattag tgcaa 35
<210> 322
<211> 31
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 322
catagtatct tgttcaacta tacgacgtat c 31
<210> 323
<211> 27
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 323
ttcagctctc ttcctaaggt tatgtac 27
<210> 324
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 324
cctcatgatc ccacttcact aagg 24
<210> 325
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 325
cagttgtatt tttattattt atttacttag aggc 34
<210> 326
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 326
gtttacaata tattccttag cctttctctc taaa 34
<210> 327
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 327
gaatagatca ataacaagtt ctgaaattaa ggct 34
<210> 328
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 328
atgctggcct tataaaatga cttagagag 29
<210> 329
<211> 31
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 329
tacttacttt tatctcctct tctattgcag g 31
<210> 330
<211> 33
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 330
cacattaaga aacgagaatt cactgtttat ttg 33
<210> 331
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 331
ctcctttttg gatcatggtt cttgattag 29
<210> 332
<211> 31
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 332
ctgcacattg ataaatttac ttacagtcgt a 31
<210> 333
<211> 32
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 333
ctgggcaatt taaaacttac cttaagtagt ac 32
<210> 334
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 334
ctatgtaaag agttgttatg ctgtatggtt taag 34
<210> 335
<211> 32
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 335
gaacttatat atgtaagctt tctacggcat ag 32
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<213> 人类(Homo sapiens)
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ctaagccgca gagacttatt gttag 25
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<213> 人类(Homo sapiens)
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ccaggagtgt gaaaaataaa tgtctctttt 30
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<213> 人类(Homo sapiens)
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ctggcttatc atttctgaat attaacagat gac 33
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cctttaatat gcaaatgcca gcgtta 26
Claims (4)
1.一种基于二代测序平台（Next generation sequencing, NGS）检测四种类型129个分子遗传标记的复合扩增体系，其特征在于位于常染色体上的48个始祖信息单核苷酸多态性（ancestry informative single nucleotide polymorphism, AISNP）、18个多等位基因缺失/插入多态性（insertion/deletion polymorphism, InDel）、27个微单倍型和位于Y染色体上的36个SNP/InDel位点的引物信息；检测体系的试剂组分；文库构建和测序数据分析的流程。
2.根据权利要求1所述，所述体系中包含的48个AISNP、18个多等位基因InDel、27个微单倍型和36个Y-SNP/InDel的引物信息；48个AISNP的引物序列为Seq1-Seq96，18个多等位基因InDel的引物序列为Seq97-Seq132，27个微单倍型的引物序列为Seq133-Seq300，36个Y-SNP/InDel的引物序列为Seq301-Seq372。
3.根据权利要求1所述，研发的试剂中所包含的组分PCR Enzyme Mix、PCR PrimerPool、PCR Block、PCR Dual Barcode Primer F和PCR Dual Barcode Primer R试剂。
4.根据权利要1所述，研发的体系的操作步骤如下所示：
1）测序文库构建和纯化；第一轮PCR混合液包括12.5µL PCR Enzyme Mix、4µL PCRPrimer Pool和3.5µL的样本DNA；PCR反应条件为95℃变性5min；98℃变性15s，64℃和60℃各1min，72℃延伸30s，共14个循环；72℃终延伸2min，然后4℃保存；
在完成第一轮PCR后，需对其进行纯化处理；具体操作如下：吸取26µL磁珠加入第一轮PCR产物中，用移液器快速吹打使其混合均匀，室温孵育5 min；然后，将PCR产物置于磁力架，静置5 min至液体澄清，用移液器小心移弃上清；加入100µL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁，轻轻吹打后吸弃上清，重复该步骤1-2次，吸干管内液体，室温干燥至磁珠表面无反光、无开裂；最后，从磁力架上取下PCR产物，加入6.5µL TE Buffer进行DNA洗脱；
第二轮PCR混合液包括12.5μL PCR Enzyme Mix，2μL PCR Block，2μL PCR DualBarcode Primer F，2μL PCR Dual Barcode Primer R和纯化后的第一轮PCR产物；PCR反应条件为98℃变性5min；98℃变性15s，64℃、60℃和72℃各30s，共16个循环；72℃反应2min，4℃保存；
然后，采样相同的纯化方法对第二轮PCR产物进行纯化处理，不同的是最后加入23μLTE Buffer进行DNA洗脱；将洗脱液放置在磁力架上，待液体澄清后，取21μL转移至新的离心管；
2）测序文库的定量；采用Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit双链DNA荧光定量
试剂盒，对纯化后的第二轮PCR产物进行定量；根据定量结果将待测样本混合在一个孔内，混合总量为500 ng；
3）测序文库的环化及酶切消化；将构建好的文库移至新的0.2 mL离心管中，用TEBuffer
补充总体积至48µL；将离心管置于PCR仪上，95℃变性3min，立即置于冰上静置2 min后瞬时离心；将11.6µL Dual Barocde Splint Buffer和0.5µL DNA Rapid Ligase加至上一步变性后的溶液中，放置于PCR仪中，37℃反应10 min；配置酶切消化液，包括1.4µLDigestion Buffer和2.6µL Digestion Enzyme，加入反应后的溶液中，瞬时离心，然后放置于PCR仪中，37℃反应30 min；反应结束后，向离心管内加入7.5µL Digestion StopBuffer，瞬时离心后，将所有反应液转移至新的离心管中；吸取170µL DNA Clean Beads加至上一步的溶液中，用移液器轻轻吹打至完全混匀，室温孵育5 min；将离心管置于磁力架，静置5 min至液体澄清，用移液器吸取、丢弃上清；保持离心管于磁力架上，加入500µL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30 s后吸取、丢弃上清，重复该步骤1-2次；保持离心管固定于磁力架上，室温干燥至磁珠表面无反光和开裂；将离心管从磁力架上取下，加入25µL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至完全混匀；室温下孵育5 min，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置至液体澄清，将23µL上清液转移到新的离心管中；采用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光定量试剂盒，对上一步纯化后产物进行定量，最后取10 ng产物制备DNA Nano Ball；
4）测序反应和数据分析；将制备好的DNB放置于MGISEQ-2000RS基因测序仪上进行测序反应；在完成测序反应后，采用Soapnuke软件对原始数据进行预处理；然后，采用BWA软件将质控后的序列和人类参考基因组进行比对；最后，采用FreeBayes软件确定遗传标记的等位基因分型。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111090160.6A CN113881760A (zh) | 2021-09-17 | 2021-09-17 | 一种基于ngs技术检测四种类型129个分子遗传标记的复合扩增体系 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111090160.6A CN113881760A (zh) | 2021-09-17 | 2021-09-17 | 一种基于ngs技术检测四种类型129个分子遗传标记的复合扩增体系 |
Publications (1)
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Family
ID=79009406
Family Applications (1)
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|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114438233A (zh) * | 2022-03-17 | 2022-05-06 | 贵州医科大学 | 一组用于亲缘关系鉴识的X染色体Multi-DIP的同步分型检测体系 |
| CN114574595A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-06-03 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 人染色体InDel基因座的应用、引物组及其产品、检材的个体识别方法 |
| CN114774409A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-07-22 | 南方医科大学 | 基于224个InDel和57个SNP位点的二代测序检测体系 |
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2021
- 2021-09-17 CN CN202111090160.6A patent/CN113881760A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114574595A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-06-03 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 人染色体InDel基因座的应用、引物组及其产品、检材的个体识别方法 |
| CN114574595B (zh) * | 2022-03-08 | 2022-12-02 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 人染色体InDel基因座的应用、引物组及其产品、检材的个体识别方法 |
| CN114774409A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-07-22 | 南方医科大学 | 基于224个InDel和57个SNP位点的二代测序检测体系 |
| CN114438233A (zh) * | 2022-03-17 | 2022-05-06 | 贵州医科大学 | 一组用于亲缘关系鉴识的X染色体Multi-DIP的同步分型检测体系 |
| CN114438233B (zh) * | 2022-03-17 | 2023-09-12 | 贵州医科大学 | 一组用于亲缘关系鉴识的X染色体Multi-DIP的同步分型检测体系 |
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