CN104651516B - 新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系及试剂盒 - Google Patents

新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104651516B
CN104651516B CN201510091951.9A CN201510091951A CN104651516B CN 104651516 B CN104651516 B CN 104651516B CN 201510091951 A CN201510091951 A CN 201510091951A CN 104651516 B CN104651516 B CN 104651516B
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
sequence
primer
site
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510091951.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104651516A (zh
Inventor
李海波
刘德远
李红
王挺
姜纬
张建林
李琼
王玮
刘敏娟
张丽丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genesky Diagnostics (suzhou)inc
Suzhou Municipal Hospital
Original Assignee
Genesky Diagnostics (suzhou)inc
Suzhou Municipal Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genesky Diagnostics (suzhou)inc, Suzhou Municipal Hospital filed Critical Genesky Diagnostics (suzhou)inc
Priority to CN201510091951.9A priority Critical patent/CN104651516B/zh
Publication of CN104651516A publication Critical patent/CN104651516A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104651516B publication Critical patent/CN104651516B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系，主要包括643对探针，多重PCR扩增引物及相关检测反应试剂。检测步骤包括：将探针组与样本中的目标核酸杂交；连接杂交的探针；扩增连接的探针；和检测扩增产物以确定样本中目标核酸是否存在或量。本平台通过优化的探针组和反应体系可实现一次性针对24条染色体非整倍体、24条染色体端粒异常、70余种染色体微缺失/微重复综合征、多个单基因病突变热点进行系统筛查检测。相比现有如MLPA等同类检测技术，本检测体系覆盖了DECIPHER数据库中已明确致病的几乎所有拷贝数异常区域，检测范围广，检测精度高，且操作简便，成本低廉。

Description

新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系及试剂盒
技术领域
本发明涉及染色体检测领域，具体而言，涉及一种新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系及试剂盒。
背景技术
2006年美国发布的“全球出生缺陷报告”中估计全球每年新增加出生缺陷人数超过800万，90％发生在中低收入国家。我国是出生缺陷高发国家，每年出生缺陷儿童高达80-120万人，约占全年出生人口的4-6％。成为影响中华民族素质的公共卫生和社会问题，出生缺陷预防的基础性和应用性研究已成为人口健康科学研究优先考虑的重大课题。
随着医疗技术的进步，一些非遗传因素的疾病已逐渐得以攻克，而遗传性疾病大多病情复杂，难于治疗，已经成为新生儿死亡和出生缺陷的首要原因。临床上对遗传性疾病尚缺乏有效治疗措施，孕前筛查和产前筛查/诊断，以阻止缺陷儿出生成为最为有效地干预措施。目前产前超声学筛查、孕妇血清学筛查和胎儿染色体的侵入性产前诊断作为主要检测技术手段，超声可检出近80％的胎儿畸形，但对微小的结构异常或影像学难于发现的单基因遗传病等并不能检出；孕妇血清学筛查和无创产前检测也主要是针对胎儿常见染色体的非整倍体进行检测，单基因病及染色体亚显微结构异常尚不能检出，筛查和诊断的效能十分有限；抽取胎儿羊水、脐血等进行染色体分析是目前产前诊断的主要手段，但同样面临上述问题，染色体亚显微结构异常的微缺失、微重复等基因组拷贝数变异(copy numbervariations，CNVs)、单基因遗传病同样无法检测。随着人类基因组计划、单体型计划等生命科学工程的完成，近些年基于整个基因组的微阵列比较基因组杂交(Array-comparativegenomic hybridization，aCGH)芯片得以在遗传学诊断中应用，随之发现了越来越多的基因组微小的病理性结构异常。美国医学遗传学会(American College of MedicalGenetics，ACMG)、美国妇产科学会(American Congress of Obstetricians andGynecologists，ACOG)等已经将aCGH作为不明原因智力低下、孤独症、精神分裂症等病因学检测的一线手段，同时也在产前诊断中建议采用。目前已发现了越来越多的已知或新发基因组病理学改变，较之超声和细胞遗传学染色体亦有更高的检出效能。但aCGH基因组芯片分析成本昂贵，技术要求高，不利于常规临床应用，结果分析也复杂，一些未知功能的CNVs可能会影响临床病理学分析与判断。且阳性结果均需要荧光原位杂交(FISH)、qPCR等进行验证实验，对于单基因病的检测能力则更为有限。因此基于aCGH的广泛筛查结果的基础上，针对已知致病突变目标位点(Targetedsite)的检测芯片越来越受到研究人员重视，也成为临床应用型研究的转化方向。因此2012年细胞遗传学芯片国际标准联合会(Internationalstandards for Cytogenomic Arrays Consortium,ISCA)、国际产前诊断协会(Internationalsociety for Prenatal Diagnosis,ISPD)对此均有推荐，也成为临床和生物技术公司产品近年研发的热点领域。
本着集成创新的理念，本专利检测体系根据连接酶反应和多重PCR扩增原理进行设计和优化，囊括了近年经细胞遗传学、aCGH、FISH、MLPA、测序等技术研究发现的明确致病的CNVs、单核苷酸变异、多核苷酸动态突变等相关、且高发病率的遗传性疾病百余种，基因组范围的检测位点600余个，并借鉴MLPA的技术优势进行创新型开发，仅通过常规毛细管电泳仪即可实现一次性、高通量、高精度、低成本筛查检测。遗传学诊断应用中除对24条染色体非整倍体、端粒异常检测外，还能实现近百种已报道的染色体微缺失、微重复综合征的检测，且包含几十种发病率高、影像学和血清学均不能有效检出的遗传性耳聋、无精症、进行性肌营养不良、智力低下、精神分裂症等单基因和部分多基因病的突变热点。较之aCGH几千元的检测成本，本检测体系检测成本仅为几百元，虽然在基因组CNVs的检测数量上有所降低，但对已知致病突变和基因病检测上具有更高的敏感性和性价优势，遗传学检测中可完全代替MLPA，并有望代替细胞遗传学核型分析实现快速遗传学诊断/筛查，成为包含测序精度和aCGH通量的新型遗传学检测技术平台。目前针对已知遗传学病因的高通量、高精度、低成本、自动化的筛查检测技术尚十分缺乏，本专利以缓解临床应用的当务之急。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系及试剂盒，建立一次性针对24条染色体非整倍体、24条染色体端粒异常、70余例常见染色体微缺失/微重复综合征、多种高发病率单基因病的检测技术，实现高通量、高精度、低成本、自动化的遗传病筛查检测技术的临床转化。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
本检测体系使用以下技术来实现单个碱基突变/SNP的多重分型：该技术基本原理是采用连接酶连接反应的高特异性实现对SNP位点等位基因的识别，然后通过在连接探针末段引入不同长度的非特异序列以及通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物，利用标记荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增，通过荧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离，最后通过对电泳图谱的分析获取各个SNP位点的基因型，具体流程见图1所示。
本检测体系通过以下技术来实现拷贝数变异(CNV)的多重检测：该技术基本原理是采用连接酶连接反应的高特异性对目的区域进行杂交、连接，然后通过在连接探针末段引入不同长度的非特异序列以及通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物，利用标记荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增，通过荧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离，最后通过对电泳图谱的分析获取各个位点的峰高，具体流程见图2所示。
1)针对每个位点设计2条探针：1条5’端探针和1条3’端探针，其5’端探针序列由一段通用引物序列(图中蓝色标记)、位点鉴别连接序列(图中红色部分，该序列加在5’端探针上用于从长度上区分不同位点的连接产物)、位点5’侧特异性序列，3’端探针序列由位点3’侧特异性序列、位点鉴别连接序列(图中红色部分，用于从长度上区分不同位点的连接产物)、3’端通用引物序列(图中黑色或绿色粗体部分)或加接连接反应特异探针序列(图中橙色标记与位点3’侧特异性序列相连部分)；
2)将高温处理后的短片段基因组DNA与探针混合物变性复性，各探针与对应模板进行配对；
3)加入连接酶反应体系，配对在同一模板上的紧邻探针在连接酶作用下进行特异性连接，产生连接产物；
4)利用带荧光标记的通用引物对连接产物进行PCR扩增，不同长度的扩增产物利用荧光毛细管电泳获得分离；
5)通过对荧光毛细管电泳数据文件中不同长度的连接产物峰谱的分析确定不同位点的峰高；
6)多重位点分型的实现：通过改变位点鉴别序连接序列的长度来获取不同连接长度的连接产物，实现多个位点的检测；通过加接连接反应可进一步增加连接产物长度的范围从而实现更多位点的检测；通过改变探针中通用引物序列，随后采用不同荧光标记的通用PCR引物进行扩增从而进一步增加检测位点的数目。
一种新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系，包括以下步骤：
a)将探针组添加到样本中以形成混合物，各探针组包括：
i)第一探针，所述第一探针具有与样本中目标核酸的第一区域至少部分互补的第一部分和形成第一引物结合位点的第二部分；
ii)第二探针，所述第二探针具有与样本中目标核酸的第二区域至少部分互补的第一部分和用于形成第二引物结合位点的第二部分，其中，当两个探针均与所述目标核酸杂交时，所述第一探针的5’端基本上毗邻所述第二探针的3’端；
b)将所述混合物中的核酸变性；
c)将所述探针组与所述目标核酸的互补区域杂交；
d)在杂交的探针组上实施连接反应以连接基本上毗邻的所述第一探针的5’端和所述第二探针的3’端，从而形成第三探针；
e)用引物组扩增所述第三探针，从而获得扩增产物，各引物组包括：
i)第一引物，所述第一引物与所述第一引物结合位点至少部分互补；
ii)第二引物，所述第二引物与所述第二引物结合位点至少部分互补；
f)通过测得扩增产物中所述第三探针是否存在或量，来测定所述样本中目标核酸是否存在或量。
进一步的，所述探针组序列如SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:1286所示。
一种新的染色体微缺失/微重复综合征检测试剂盒，包括：
热启动Taq酶，
探针混合液，
PCR反应缓冲液，
MgCl2，
dNTP，
琼脂糖，
溴化乙啶，
溴酚兰，
10×Taq DNA裂解液，
Taq DNA连接酶，
4×DNA裂解液，
HI-DI，
GeneScanTM-500。
进一步的，所述探针混合液为643对多重PCR探针，分别测定样本中643种目标核酸是否存在或量，所述的探针对的序列如SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:1286所示。
本发明的有益效果是:
1、本试剂盒在筛查的遗传性疾病涵盖上有所突破。以往基于已知致病突变的目标检测技术，如MLPA一次最多只能检测25种微缺失/微重复综合征。本平台通过优化的技术体系可实现一次性针对24条染色体非整倍体、24条染色体端粒异常、70余种染色体微缺失/微重复综合征、十余种高发病率单基因病及突变热点，合计近200个致病位点的系统筛查检测。涉及病种多，覆盖精度高。
2、本技术采用精心优化的探针序列设计和反应条件，使检测的精度更高、通量更大，而成本却更加低廉。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为SNPscan技术流程示意图；
图2为CNVplex技术流程示意图；
图3为9406-A总峰图；
图4为9406-A蓝色(FAM)荧光峰图；
图5为9406-A绿色(VIC)荧光峰图；
图6为9406-A黄色(NED)荧光峰图；
图7为9406-A红色(PET)荧光峰图；
图8为9406-B总峰图；
图9为9406-B蓝色(FAM)荧光峰图；
图10为9406-B绿色(VIC)荧光峰图；
图11为9406-B黄色(NED)荧光峰图；
图12为9406-B红色(PET)荧光峰图；
图13为9406-C总峰图；
图14为9406-C蓝色(FAM)荧光峰图；
图15为9406-C绿色(VIC)荧光峰图；
图16为9406-C黄色(NED)荧光峰图；
图17为9406-C红色(PET)荧光峰图；
图18为9406-D总峰图；
图19为9406-D蓝色(FAM)荧光峰图；
图20为9406-D绿色(VIC)荧光峰图；
图21为9406-D黄色(NED)荧光峰图；
图22为9406-D红色(PET)荧光峰图；
图23为A9442-A总峰图；
图24为A9442-A蓝色(FAM)荧光峰图；
图25为A9442-A绿色(VIC)荧光峰图；
图26为A9442-A黄色(NED)荧光峰图；
图27为A9442-A红色(PET)荧光峰图；
图28为A9442-B总峰图；
图29为A9442-B蓝色(FAM)荧光峰图；
图30为A9442-B绿色(VIC)荧光峰图；
图31为A9442-B黄色(NED)荧光峰图；
图32为A9442-B红色(PET)荧光峰图；
图33为A9442-C总峰图；
图34为A9442-C蓝色(FAM)荧光峰图；
图35为A9442-C绿色(VIC)荧光峰图；
图36为A9442-C黄色(NED)荧光峰图；
图37为A9442-C红色(PET)荧光峰图；
图38为A9442-D总峰图；
图39为A9442-D蓝色(FAM)荧光峰图；
图40为A9442-D绿色(VIC)荧光峰图；
图41为A9442-D黄色(NED)荧光峰图；
图42为A9442-D红色(PET)荧光峰图。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
本实施例中使用该微缺失微重复试剂盒对2个样本的3个突变位点和640个CNV位点进行检测。该试剂盒采用多重SNP分型技术和多重CNV分型技术，主要检测染色体微缺失、微重复以及重要点突变。
主要器材：
QT-1漩涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)
Mini-4lc微型离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)
TD5A-WS台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)
凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)
FR-110紫外分析装置(上海复日科技有限公司)
FR-250电泳仪(上海复日科技有限公司)
多用途水平电泳槽(北京百晶生物科技有限公司)
YXQ-LS-30II立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)
2720Thermal Cycler(ABI)
1-10ul 12道移液器(discovery)
5-50ul 8道移液器(discovery)
3130xl genetic analyze(ABI)
Milli-Q Academic(Millipore)
BCD-239VC冰箱(河南新飞电器有限公司)
HC-TP11-10架盘药物天平(上海精密科学仪器有限公司)
微量加样器(Eppendorf,德国)
96孔板(AXYGEN)
Mct-150-c离心管(AXYGEN)
具体实验操作步骤：
1)DNA样本取1μl 1％agarose电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，由于大部分样本DNA浓度在30-50ng/ul，DNA不做稀释。
2)连接反应预混合液配制
按下表配制预混合液配制，考虑到分装时枪头的吸附造成损失等因素，建议96个样本按100个进行配制。
体系1：
成分 1× 100×
4×DNA Ligase Buffer 1.25ul 125ul
DNA样本 2ul /
Probe Mix 1ul 100ul
DNA稀释液 5.75ul 575ul
体系2：
Figure GDA0001449129180000061
3)连接反应
将体系2加入体系1中(最好在冰盒上进行)，盖上96孔橡胶盖垫3500rpm离心1分钟，将离心后96孔板放置PCR仪上，，盖好PCR仪热盖，按以下程序运行：
98℃2min，5 Cycles x(95℃30s，60℃for 3h)，94℃2min，72℃forever
反应结束后加入20ul20mMEDTA终止反应。
4)多重荧光PCR反应(按下表配制PCR预混合液，考虑到分装时枪头的吸附造成损失等因素，建议96个样本按100个进行配制。
Figure GDA0001449129180000062
然后取新96孔板，每孔分装19μl PCR预混合液，然后将上述连接产物每孔取1μl加入该96孔板的对应位置，盖上96孔橡胶盖垫3500rpm离心1分钟，将离心后96孔板放置PCR仪上，盖好PCR仪热盖，按以下程序运行：
95℃for 2 mins
5x(94℃20s，62℃-1℃/cycle 40s，72℃1.5min)
27x(94℃20s，57℃40s，72℃1.5min)
68℃1hr
4℃forever
5)PCR产物上ABI3130XL测序仪
PCR产物稀释5倍后，取1μl与0.1μl Liz500size standard,8.9μl Hi-Di混匀，95℃变性5分钟后上ABI3130XL测序仪。
6)ABI3130XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.0(Applied Biosystems，USA)来分析。
如图3至图42所示，测定中得到的扩增产物可以通过毛细管电泳分离，可以单独鉴定色谱图上的峰。图3、图8、图13、图18分别示出对照样本集合A，B，C和D所有扩增产物的色谱图。图23、图8、图13、图18分别示出对照样本集合A，B，C和D所有扩增产物的色谱图。各集合代表一个PCR反应的扩增产物的分析。各峰代表对应于各目标位点的一种扩增产物。
图4及图9分别示出集合A中对照样本和患者样本用蓝色荧光染料标记的扩增产物的色谱图。图5及图25分别示出集合B中对照样本和患者样本用绿色荧光染料标记的扩增产物的色谱图。可以基于不同的片段大小鉴定采用相同荧光染料标记的扩增产物的峰。通过比较对照样本和患者样本的色谱图，可测定片段大小相似的峰是否存在。或者，在分析电泳数据的另一方法中，通过将相同组中目标位点的峰强度值除以其他目标位点的峰强度平均值或中位值获得各目标位点(本文也称作基因目标位点)的测试样本比例(Rtest)。相同组是指相同的PCR反应集合中对应的荧光基团和通用PCR引物都相同的PCR扩增产物组。相同的PCR引物对应于同组中的各目标位点和参照目标位点。
类似地，获得对照样本中各基因目标位点的比例(Rcontrol)。假设对照样本中的目标核酸的拷贝数(Ccontrol)是1，然后根据下式计算各基因目标位点的拷贝数(Ctest)：Ctest＝Ccontrol×Rtest/Rcontrol。
假定对照样本中目标核酸的拷贝数是1(例如，男性患者有一个X染色体)，测试样本中的基因目标位点的拷贝数等于Rtest与Rcontrol之比。由于为各基因目标位点引入四个对照目标位点，获得各基因目标位点的四个Rtest和由此获得的四个Ctest。四个Ctest的中位值视为测试样本中该基因目标位点的拷贝数。这样计算出的各基因目标位点的拷贝数示于表1(正常值已略去)。根据微缺失疾病及位点信息表，对应于18号染色体和Y染色体AZFc区域DAZ基因和CDY基因的目标位点的拷贝数都在3以上，表明该患者可能为18-三体患者且AZFc区域DAZ基因重复，CDY基因重复。
表1
Figure GDA0001449129180000071
Figure GDA0001449129180000081
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0000676320280000011
Figure IDA0000676320280000021
Figure IDA0000676320280000031
Figure IDA0000676320280000041
Figure IDA0000676320280000051
Figure IDA0000676320280000061
Figure IDA0000676320280000071
Figure IDA0000676320280000081
Figure IDA0000676320280000091
Figure IDA0000676320280000101
Figure IDA0000676320280000111
Figure IDA0000676320280000121
Figure IDA0000676320280000131
Figure IDA0000676320280000141
Figure IDA0000676320280000151
Figure IDA0000676320280000161
Figure IDA0000676320280000171
Figure IDA0000676320280000181
Figure IDA0000676320280000191
Figure IDA0000676320280000201
Figure IDA0000676320280000211
Figure IDA0000676320280000221
Figure IDA0000676320280000231
Figure IDA0000676320280000241
Figure IDA0000676320280000251
Figure IDA0000676320280000261
Figure IDA0000676320280000271
Figure IDA0000676320280000281
Figure IDA0000676320280000291
Figure IDA0000676320280000301
Figure IDA0000676320280000311
Figure IDA0000676320280000321
Figure IDA0000676320280000331
Figure IDA0000676320280000341
Figure IDA0000676320280000351
Figure IDA0000676320280000361
Figure IDA0000676320280000371
Figure IDA0000676320280000381
Figure IDA0000676320280000391
Figure IDA0000676320280000401
Figure IDA0000676320280000411
Figure IDA0000676320280000421
Figure IDA0000676320280000431
Figure IDA0000676320280000441
Figure IDA0000676320280000451
Figure IDA0000676320280000461
Figure IDA0000676320280000471
Figure IDA0000676320280000481
Figure IDA0000676320280000491
Figure IDA0000676320280000501
Figure IDA0000676320280000511
Figure IDA0000676320280000521
Figure IDA0000676320280000531
Figure IDA0000676320280000541
Figure IDA0000676320280000551
Figure IDA0000676320280000561
Figure IDA0000676320280000571
Figure IDA0000676320280000581
Figure IDA0000676320280000591
Figure IDA0000676320280000601
Figure IDA0000676320280000611
Figure IDA0000676320280000621
Figure IDA0000676320280000631
Figure IDA0000676320280000641
Figure IDA0000676320280000651
Figure IDA0000676320280000661
Figure IDA0000676320280000671
Figure IDA0000676320280000681
Figure IDA0000676320280000691
Figure IDA0000676320280000701
Figure IDA0000676320280000711
Figure IDA0000676320280000721
Figure IDA0000676320280000731
Figure IDA0000676320280000741
Figure IDA0000676320280000751
Figure IDA0000676320280000761
Figure IDA0000676320280000771
Figure IDA0000676320280000781
Figure IDA0000676320280000791
Figure IDA0000676320280000801
Figure IDA0000676320280000811
Figure IDA0000676320280000821
Figure IDA0000676320280000831
Figure IDA0000676320280000841
Figure IDA0000676320280000851
Figure IDA0000676320280000861
Figure IDA0000676320280000871
Figure IDA0000676320280000881
Figure IDA0000676320280000891
Figure IDA0000676320280000901
Figure IDA0000676320280000911
Figure IDA0000676320280000921
Figure IDA0000676320280000931
Figure IDA0000676320280000941
Figure IDA0000676320280000951
Figure IDA0000676320280000961
Figure IDA0000676320280000971
Figure IDA0000676320280000981
Figure IDA0000676320280000991
Figure IDA0000676320280001001
Figure IDA0000676320280001011
Figure IDA0000676320280001021
Figure IDA0000676320280001031
Figure IDA0000676320280001041
Figure IDA0000676320280001051
Figure IDA0000676320280001061
Figure IDA0000676320280001071
Figure IDA0000676320280001081
Figure IDA0000676320280001091
Figure IDA0000676320280001101
Figure IDA0000676320280001111
Figure IDA0000676320280001121
Figure IDA0000676320280001131
Figure IDA0000676320280001141
Figure IDA0000676320280001151
Figure IDA0000676320280001161
Figure IDA0000676320280001171
Figure IDA0000676320280001181
Figure IDA0000676320280001191
Figure IDA0000676320280001201
Figure IDA0000676320280001211
Figure IDA0000676320280001221
Figure IDA0000676320280001231
Figure IDA0000676320280001241
Figure IDA0000676320280001251
Figure IDA0000676320280001261
Figure IDA0000676320280001271
Figure IDA0000676320280001281
Figure IDA0000676320280001291
Figure IDA0000676320280001301
Figure IDA0000676320280001311
Figure IDA0000676320280001321
Figure IDA0000676320280001331
Figure IDA0000676320280001341
Figure IDA0000676320280001351
Figure IDA0000676320280001361
Figure IDA0000676320280001371
Figure IDA0000676320280001381
Figure IDA0000676320280001391
Figure IDA0000676320280001401
Figure IDA0000676320280001411
Figure IDA0000676320280001421
Figure IDA0000676320280001431
Figure IDA0000676320280001441
Figure IDA0000676320280001451
Figure IDA0000676320280001461

Claims (3)

1.一种非治疗和非诊断的检测染色体微缺失/微重复综合征的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将探针组添加到样本中以形成混合物，各探针组包括：
i)第一探针，所述第一探针具有与样本中目标核酸的第一区域至少部分互补的第一部分和形成第一引物结合位点的第二部分；
ii)第二探针，所述第二探针具有与样本中目标核酸的第二区域至少部分互补的第一部分和用于形成第二引物结合位点的第二部分，其中，当两个探针均与所述目标核酸杂交时，所述第一探针的5’端毗邻所述第二探针的3’端；
其中，对于每个位点有一条5’端探针和一条3’端探针，其中5’端探针的序列由一段通用引物序列、位点鉴别连接序列、位点5’侧特异性序列构成；3’端探针的序列由位点3’侧特异性序列、位点鉴别连接序列、3’端通用引物序列或加接连接反应特异探针序列构成；
b)将所述混合物中的核酸变性；
c)将所述探针组与所述目标核酸的互补区域杂交；
d)在杂交的探针组上实施连接反应以连接基本上毗邻的所述第一探针的5’端和所述第二探针的3’端，从而形成第三探针，其中所述的连接反应还包括加接连接反应；
e)用引物组扩增所述第三探针，从而获得扩增产物，各引物组包括：
i)第一引物，所述第一引物与所述第一引物结合位点至少部分互补；
ii)第二引物，所述第二引物与所述第二引物结合位点至少部分互补；
f)通过测得扩增产物中所述第三探针是否存在或量，来测定所述样本中目标核酸是否存在或量，
其中，所述探针组包括序列如SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:1284所示的探针，并且所述引物组包含采用不同荧光标记的通用PCR引物，其中，所述的荧光标记包括蓝色FAM荧光标记、绿色VIC荧光标记、黄色NED荧光标记、和红色PET荧光标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤f)中，通过荧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离，并最后通过对电泳图谱进行分析。
3.一种新的染色体微缺失/微重复综合征检测试剂盒，其特征在于，包括：
热启动Taq酶，
探针混合液，其中所述探针混合液含有探针组，
PCR反应缓冲液，
MgCl2，
dNTP，
琼脂糖，
溴化乙啶，
溴酚兰，
10×Taq DNA裂解液，
Taq DNA连接酶，
4×DNA裂解液，
HI-DI，
GeneScanTM-500，
和引物组；
其中各探针组包括：
i)第一探针，所述第一探针具有与样本中目标核酸的第一区域至少部分互补的第一部分和形成第一引物结合位点的第二部分；
ii)第二探针，所述第二探针具有与样本中目标核酸的第二区域至少部分互补的第一部分和用于形成第二引物结合位点的第二部分，其中，当两个探针均与所述目标核酸杂交时，所述第一探针的5’端毗邻所述第二探针的3’端；
其中，对于每个位点有一条5’端探针和一条3’端探针，其中5’端探针的序列由一段通用引物序列、位点鉴别连接序列、位点5’侧特异性序列构成；3’端探针的序列由位点3’侧特异性序列、位点鉴别连接序列、3’端通用引物序列或加接连接反应特异探针序列构成；
其中所述探针组包括序列如SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:1284所示的探针，
并且所述引物组包含采用不同荧光标记的通用PCR引物，其中，所述的荧光标记包括蓝色FAM荧光标记、绿色VIC荧光标记、黄色NED荧光标记、和红色PET荧光标记。
CN201510091951.9A 2015-03-02 2015-03-02 新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系及试剂盒 Active CN104651516B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510091951.9A CN104651516B (zh) 2015-03-02 2015-03-02 新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510091951.9A CN104651516B (zh) 2015-03-02 2015-03-02 新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104651516A CN104651516A (zh) 2015-05-27
CN104651516B true CN104651516B (zh) 2020-04-10

Family

ID=53243155

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510091951.9A Active CN104651516B (zh) 2015-03-02 2015-03-02 新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104651516B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106566880A (zh) * 2016-11-02 2017-04-19 哈尔滨星云生物信息技术开发有限公司 遗传性耳聋基因突变检测试剂盒
CN106755434B (zh) * 2016-12-28 2018-03-09 海南波莲水稻基因科技有限公司 一种水稻粒长基因qGL3的分子标记及其应用
CN107841552B (zh) * 2017-10-17 2021-04-30 国家卫生计生委科学技术研究所 一种检测先天性心脏病微缺失或/和微重复的引物组合、mlpa探针、基因芯片及试剂盒
CN112553310A (zh) * 2020-08-07 2021-03-26 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 应用mlpa检测细胞遗传学异常的方法及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN104651516A (zh) 2015-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8574842B2 (en) Direct molecular diagnosis of fetal aneuploidy
CN101921834B (zh) 一种abo血型基因分型的pcr-sbt方法及试剂
CN106755329B (zh) 基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒
Tynan et al. Multiplexed analysis of circulating cell-free fetal nucleic acids for noninvasive prenatal diagnostic RHD testing
CN104651516B (zh) 新的染色体微缺失/微重复综合征检测体系及试剂盒
CN110628891B (zh) 一种对胚胎进行基因异常筛查的方法
CN109554448B (zh) 一种人类红细胞血型系统abo抗原的多重pcr-sbt基因分型方法及试剂
CN105969879B (zh) 一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法
CN103555849B (zh) 一种单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒
CN106939334B (zh) 一种孕妇血浆中胎儿dna含量的检测方法
Harteveld et al. Prenatal diagnosis of hemoglobin disorders: present and future strategies
CN109182493B (zh) 人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法
CN107338287B (zh) Taqman-MGB探针检测绵羊BMPR-IB基因A746G突变的试剂盒和方法
CN106319079B (zh) 一种检测22q11.2拷贝数缺失的方法
CN107287283B (zh) 一种与儿童易感疾病相关多snp位点的高通量检测试剂盒及其使用方法
CN107841552B (zh) 一种检测先天性心脏病微缺失或/和微重复的引物组合、mlpa探针、基因芯片及试剂盒
CN115216539A (zh) 一种母体细胞污染检测试剂盒及其应用
CN105586392A (zh) 评估胎儿样本中母体细胞污染程度的方法
CN111172248B (zh) 一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒
CN111334568A (zh) 一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选的多重连接探针扩增探针组合及试剂盒
CN112779322A (zh) 一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用
CN108642190B (zh) 基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN111909990A (zh) 单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光pcr检测方法
CN112342297B (zh) 用于同时分析多个dip和str位点的复合扩增系统、方法、试剂盒及其用途
CN114196749B (zh) 核酸产品和用于α-地中海贫血单体型分析的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Li Haibo

Inventor after: Zhang Lili

Inventor after: Liu Deyuan

Inventor after: Li Hong

Inventor after: Wang Ting

Inventor after: Jiang Wei

Inventor after: Zhang Jianlin

Inventor after: Li Qiong

Inventor after: Wang Wei

Inventor after: Liu Minjuan

Inventor before: Li Haibo

Inventor before: Liu Deyuan

Inventor before: Li Hong

Inventor before: Wang Ting

Inventor before: Jiang Wei

Inventor before: Zhang Jianlin

Inventor before: Li Qiong

Inventor before: Wang Wei

Inventor before: Liu Minjuan

COR Change of bibliographic data
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant