CN107287283B - 一种与儿童易感疾病相关多snp位点的高通量检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与儿童易感疾病相关多SNP位点的高通量检测试剂盒及其使用方法。所述检测试剂盒包括优选出的31个SNP位点的31种PCR延伸引物，所述延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.31。本发明通过对每组位点进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，同时获取所有SNP位点的基因型后进行生物信息学解读，得到更为全面的儿童基本生理信息。本发明操作简单，成本低，通量高，检测结果直接可靠，适用于各种规模的儿童基本健康信息的筛查。

Description

一种与儿童易感疾病相关多SNP位点的高通量检测试剂盒及 其使用方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域中SNP分型检测，具体涉及一组与儿童健康相关SNP分型试剂盒及其使用方法。

背景技术

儿童处于生长发育的关键阶段，是成长为一个健康个体的基础，不少成年后出现的躯体疾病、心理异常和性格行为等问题，都与儿童时期的身心健康有关，然而这个阶段缺乏自卫与自控能力，其健康易受营养、疾病和外界环境各种因素的影响，是最易受伤害的人群，因此，为保证儿童身心健康，防治各种疾病，可以在基因层面进行筛查，确定每个儿童潜在的健康风险与无限的潜能和天赋，并有针对性的进行早期预防、早期纠正和早期引导，从而确保每个儿童都拥有健康充实的人生。

目前对新生儿及儿童进行的健康检查主要是生理指标的检测，包括身高体重等基本生理信息，这些指标可以确定新生儿及儿童在当前是否有存在异常，但是缺乏对每个孩子在未来生活中发挥最大潜力的指导意义。

人类基因组测序计划的完成，标志着人类已步入后基因组时代，该时代以基因组中个体遗传差异的研究为重点。个体遗传差异最常见形式为单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphisms，SNP)，正是这些SNP的变异造成人类在身体、体型、肤色、对疾病的易感性、疾病表型和对药物治疗反应等诸多方面的差异。在众多导致疾病的基因突变、病原亚型及耐药基因突变中，单碱基突变占相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题。目前国内常规用于健康基因变异的主要检测方法是限制性片段长度多态性法(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)，其原理是当变异影响到某一限制性内切酶的酶切位点时，简单地通过酶切处理受试者的PCR产物继而电泳检测是否有变异的方法。然而，这种方法存在耗时长，操作繁琐，准确度不高等缺点；也有利用PCR结合DNA测序方法进行基因多态性位点的检测，但是这种方法在大规模人群筛查或检测多个基因多个位点的应用受到一定限制。

因此有必要建立一种高通量、高效能、低成本的易感基因SNP分型检测手段和方法，以实现多样本高通量的快速检测。

发明内容

本发明的目的是针对上述健康基因变异检测方法中存在的难题，提供一种能高效检测与儿童易感疾病相关多SNP位点的高通量检测试剂盒及其使用方法。

本发明的目的在于提供以下方面：

(1)一种多SNP位点检测试剂盒，包括对应31个SNP位点的31种PCR延伸引物，所述31种PCR延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.31所示。

(2)根据上述(1)所述的多SNP位点检测试剂盒，将31个SNP位点分为3组，并将所述PCR延伸引物分为3组，其中：

A组延伸引物核苷酸序列包括：SEQ ID No.1至SEQ ID No.10；

B组延伸引物核苷酸序列包括：SEQ ID No.11至SEQ ID No.22；

C组延伸引物核苷酸序列包括：SEQ ID No.23至SEQ ID No.31。

(3)根据上述(1)所述的多SNP位点检测试剂盒，还包括PCR反应试剂，PCR扩增引物，PCR产物纯化试剂，以及SNP位点对照标本。

(4)根据上述(3)所述的多SNP位点检测试剂盒，其中，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP、和PfuDNA聚合酶。

(5)根据上述(3)所述的多SNP位点检测试剂盒，所述PCR产物纯化试剂包括核酸外切酶、虾-碱性磷酸酶，以及纯化用缓冲液。

(6)根据上述(3)所述的多SNP位点检测试剂盒，所述SNP位点对照标本，包括纯合突变的阳性对照标本、杂合突变的阳性对照标本、以及阴性对照标本。

(7)根据上述(1)至(6)之一所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)提取受试对象DNA样品；

2)进行多重PCR扩增、纯化PCR产物；

3)进行多个SNP位点的延伸反应；

4)对步骤3)中每组延伸产物进行毛细管电泳分析；

5)SNP位点分析。

(8)根据上述(7)所述的试剂盒的使用方法，其中，每组SNP位点的延伸引物同时进行延伸反应。

(9)根据上述(1)所述的多SNP位点检测试剂盒作为儿童基本健康信息的筛查试剂的用途。

(10)31个SNP位点与31种PCR延伸引物的组合用来筛查儿童基本健康信息的用途。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明试剂盒使用方便，操作简单，成本低；

2、本发明中设计的延伸引物特异性强，灵敏度高，可同时进行多个SNP位点的准确检测；

3、SNP位点的同时检测，大大缩短了多个SNP位点的检测周期，具有高通量性；

4、选取的SNP位点与儿童的多个健康指标密切相关，适用于各种规模儿童的基本信息的筛查。

附图说明

图1是实施例2中混合扩增质检电泳图。

具体实施方式

下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。

本发明针对之前的检测方法中SNP位点单一，通量低，位点之间互联性较弱等问题，通过计算优选出多个SNP位点，涉及儿童易感疾病风险、体质特征和营养吸收等基本生理特征；对所涉及的所有SNP位点的突变优化分组，同时设计出扩增引物和延伸引物，并对每组位点进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，同时获取所有SNP位点的基因型后对其进行生物信息学解读，得到更为全面的儿童基本生理信息。

本发明的目的是提供一种与儿童易感疾病相关多SNP位点的高通量检测试剂盒，包括(1)31个SNP位点的31种PCR延伸引物；(2)PCR反应试剂：包括PCR缓冲液、dNTP、PfuDNA聚合酶，SNaPshot混合液；(3)PCR扩增引物；(4)按一定浓度混合的针对各组SNP位点的PCR延伸引物；(5)PCR产物纯化试剂：包括核酸外切酶、虾-碱性磷酸酶，以及纯化用缓冲液；(6)SNP位点对照标本：包括纯合突变阳性对照标本、杂合突变阳性对照标本、阴性对照标本。

其中，所述dNTP(deoxy-ribonucleotide triphosphate)，为脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括dATP，dGTP，dTTP,dCTP，等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。在生物DNA合成中，以及各种PCR(RT-PCR(reverse transcriptionPCR)、Real-time PCR)中起原料作用。

所述PCR(Polymerase chain reaction)即聚合酶链式反应，是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。PCR扩增主要过程是，通过人类合成的一小断单链DNA片段(即引物)与模板DNA特定的区域特异性结合，进而以dNTP为底物，通过DNA聚合酶沿着引物和模板形成的双链部分的3’端聚合形成DNA片段实现DNA体外扩增的过程。

所述SNP纯合突变阳性对照标本为含有人rs1494位点人工合成C碱基的质粒。

所述SNP杂合突变阳性对照标本为rs1815739位点分别为C和T碱基的两种质粒的混合物。

所述SNP阴性对照标本为人工合成的带有随机碱基的质粒。使用三种对照标本对反应体系进行质量控制，可保证检出结果的一致性。

本发明优化组合了人类31个SNP位点，这些位点与儿童的健康指标密切相关，其中包括：儿童近视、肥胖、哮喘、药物性失聪、营养吸收以及白血病、糖尿病、高血压等重大疾病。如表1所示，为SNP位点、所在基因与其对应健康指标。一种健康指标可能对应多个基因，一个基因又可能对应多个SNP位点，这样检测多个SNP位点提高了健康信息预测的准确性。31个SNP位点的同时检测，可全面预测或诊断儿童健康状况。筛选出的SNP位点依据实验需要，将其扩增引物退火温度相近的归为一组，共分为3组，分别为A组10个，B组12个，C组9个，在一个多重PCR反应中的各个位点扩增效率相当，提高了通量与信噪比。

表1 SNP位点、基因位置及其对应健康指标

本发明中与31个SNP位点对应的31种延伸引物核苷酸序列为SEQ ID No.1至SEQID No.31所示，见表2。表2中，SNP位点编号后括号内F或R分别表示正向引物(Forwardprimer)和反向引物(Reverse primer)。延伸引物序列中，括号内碱基表示为其它可选择的碱基，如A组中SNP位点rs1815739的延伸引物核苷酸序列3’末端为T/C，表示为rs1815739的延伸引物序列有tttttttttttttttttGAACCCATCACAACCCAGCT和tttttttttttttttttGAACCCATCACAACCCAGCC两种形式，所采用的引物是两者的混合物。延伸引物的5’末端合成有不同数目的核苷酸尾，同时进行多引物延伸反应时，各引物可因核苷酸数目的差异而被区分。由于设计的延伸引物具有极强的特异性，允许每组中9-12个延伸引物同时参与延伸反应，在高检测准确性的同时，大大缩短了多个SNP位点的检测周期。

表2 SNP位点及其对应的延伸引物序列

本发明中提供的检测试剂盒的使用方法为：从人的唾液或口腔上皮细胞中提取DNA样品；配制PCR反应体系，进行多重PCR扩增、纯化PCR产物；PCR产物与多个SNP位点的延伸引物同时进行延伸反应；对每组延伸产物进行毛细管电泳分析；SNP位点分析，得到基因分型信息。

上述DNA提取方法可为常用的DNA提取法，也可用DNA提取试剂盒。

上述延伸反应中应用5种荧光染料检测，其中，第5种染料标记内标，内标用以纠正电泳时泳道间产生的迁移误差。四种双脱氧核苷酸(即ddGTP、ddATP、ddTTP与ddCTP)各标记不同的染料颜色：A(green，绿色)、G(blue，蓝色)、C(black，黑色)和T(red，红色)。因此，在毛细管电泳中一个红色峰形的出现，表明一个T(ddTTP)通过聚合酶结合在SNP位点上。在检测时，峰的颜色表示目标SNP位点DNA信息，而峰的位置与SNP遗传标记5’加尾的长度有关，显示相互区别的不同位点。纯合的等位基因以单峰形式出现，杂合的等位基因则以毗邻的两个峰显示。

上述SNP位点分析可采用但不限于ABI 3730XL自动测序仪。

实施例

实施例1

本发明中多SNP位点检测试剂盒包括以下组分：

dNTP(2.5mM)：采购自Transgene公司，AP231；

5×PCR缓冲液：采购自Transgene公司，AP231；

FastPfuDNA聚合酶(250U)：采购自Transgene公司，AP231；

SNaPshot混合液：采购自北京阅微基因公司，Invirtrogen 4323161multiplexkit；

MgSO₄溶液(50mM)；

6×DNA Loading Buffer；

PCR扩增引物：下表3所示，由北京阅微基因技术公司合成；

延伸引物：其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1至SEQ ID No.31所示，由北京阅微基因技术公司通过全自动DNA合成仪合成；

核酸外切酶(250U)：TAKARA公司，BS250；

虾-碱性磷酸酶(100U)：TAKARA公司，BS100；

纯化用缓冲液：TAKARA公司，BS251；

ddNTP：采购自北京阅微基因公司，Invirtrogen 4323161multiplex kit；

SNP位点纯合突变的阳性对照标本：含有人rs1494位点人工合成C碱基的质粒；

SNP位点杂合突变的阳性对照标本：为rs1815739位点分别为C和T碱基的两种质粒的混合物；

SNP位点阴性对照标本：人工合成的带有随机碱基的质粒。

实施例2

通过本发明的多SNP位点检测试剂盒及其使用方法，对10名儿童基本健康信息进行检测。

1、DNA提取

采集受检儿童唾液，使用人类全基因组提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，商品名KG203)提取全基因组DNA。

2、PCR扩增反应

PCR反应试剂(20μL)包括：1μL正向引物组(10μM)，1μL反向引物组(10μM)，4μL 5×PCR缓冲液，2μLdNTP(2.5mM)，0.2μL FastPfuDNA聚合酶(250U)，H₂O补充至20μL。待测DNA样品(200ng)、SNP纯合突变阳性对照标本(100ng)、SNP杂合突变阳性对照标本(100ng)、SNP阴性对照标本(100ng)与上述PCR反应试剂构成PCR反应体系。所述正向引物组和反向引物组核苷酸序列如表3所示。

Touchdown PCR反应程序：第一步：98℃变性2min；第二步：98℃变性20sec，65℃退火20sec，72℃引物延伸20sec，重复10个循环，每个循环退火温度降低1℃；第三步：98℃变性20sec，55℃退火20sec，72℃引物延伸20sec，重复25个循环，最后72℃引物延伸5min。

表3 SNP位点及对应的扩增引物

3、PCR产物鉴定与纯化

PCR扩增结束后，取PCR产物10μL和6μL相对分子质量标准DL2000，与2μL6×DNALoding Buffer混合后在TAE缓冲液环境中电泳。120V电泳30min后取出凝胶，置入凝胶成像仪内观察结果并照相，如图1所示，为混合扩增质检电泳图。图1中，1～4泳道为SNP位点A组重复组，5～8泳道为SNP位点B组重复组，9～12泳道为SNP位点C组重复组。PCR扩增产物用虾-碱性磷酸酶和核酸外切酶进行纯化处理，37℃酶切60min，80℃15min灭活虾-碱性磷酸酶和核酸外切酶。纯化体系包括：2μL终浓度虾-碱性磷酸酶(0.6U)，5μL终浓度核酸外切酶(1.2U)，50ng PCR扩增产物，和2μL纯化用缓冲液。

4、延伸反应

使用PCR产物清洁试剂盒(Transgene公司，商品名EP101-01)将混合扩增产物进行回收，之后在含有0.1mM ddNTP的体系中使用每组对应的延伸引物进行PCR扩增。反应循环条件为：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃引物延伸30sec，重复25个循环。反应完成后进行二次纯化，纯化体系包括：2μL终浓度虾-碱性磷酸酶(0.6U)，5μL终浓度核酸外切酶(1.2U)，50ng PCR扩增产物，和2μL纯化用缓冲液。

5、毛细管电泳及SNP位点分析

使用ABI 3730XL测序仪对延伸引物测序。使用GeneMapper系列软件对结果峰图进行SNP位点上脱氧核苷酸的判定，其中，绿色峰形表示A，蓝色峰形表示G，黑色峰形表示C，和红色峰形表示T。纯合的等位基因以单峰形式出现，杂合的等位基因则以毗邻的两个峰显示。SNP位点等位基因检出率高达100％，以SNP位点rs2228570、rs4795400、rs1815739，以及rs10096097为例，如表4所示。

将测序得到的其中的1组数据与我们数据库中的健康信息进行比对后，得出的检测结果如表5所示。依据表5中的信息，我们可以得出该受检儿童的基本健康信息：总体体质良好，肥胖症易感概率高于平均值，注意力方面需要父母多引导；叶酸吸收能力较弱，可能会出现乳糖不耐受。依照此信息，父母可以有针对性的进行孩子的膳食调整和生活习惯的引导形成。

表4 SNP位点等位基因检测结果

表5检测数据获得的健康信息结果

根据以上我们的设计，实验检测部分可在一个工作日完成，单机单日至少可完成96个样品的SNP分型。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种多SNP位点检测试剂盒，其特征在于，

多SNP位点检测试剂盒包括以下组分：

dNTP，2.5mM；

5×PCR缓冲液；

FastPfuDNA聚合酶，250U；

SNaPshot混合液，为Invirtrogen 4323161 multiplex kit；

MgSO₄溶液，50mM；

6×DNA Loading Buffer；

PCR扩增引物，所述引物序列如下表所示：

延伸引物：31个SNP位点对应的31种延伸引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1至SEQID No.31，将31个位点扩增引物退火温度相近的分为一组，共分为3组，分别为A组10个，B组12个，C组9个，如下表所示：

核酸外切酶，250U；

虾-碱性磷酸酶，100U；

纯化用缓冲液；

ddNTP；

SNP位点纯合突变的阳性对照标本：含有人rs1494位点人工合成C碱基的质粒；

SNP位点杂合突变的阳性对照标本：为rs1815739位点分别为C和T碱基的两种质粒的混合物；

SNP位点阴性对照标本：人工合成的带有随机碱基的质粒。

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