CN110669833B

CN110669833B - 一组用单管检测人运动神经元基因的引物及试剂盒

Info

Publication number: CN110669833B
Application number: CN201910944785.0A
Authority: CN
Inventors: 吴英松; 周其伟; 康小龙; 李明; 杨学习
Original assignee: Darui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Darui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: CN110669833A

Abstract

本发明公开了一组用单管检测人运动神经元基因的引物及试剂盒。本试剂盒含有一组用单管检测人运动神经元基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示。本发明的引物设计合理、特异性高，避免普通单向单碱基错配的扩增阻滞引物特异性不足；合理地设计不同扩增子长度、引入通用引物并采用两次循环的同步扩增、减少了扩增偏倚性低，保证定量准确；合理引入识别序列，实现对SMN1和SMN2第7号外显子相互转换情况辨识，提供更多拷贝数信息；体系中引入了UDG酶、扩增程序中加入UDG酶酶切步骤能够有效切割扩增产物，避免污染。本方法和试剂盒检测快速、结果准确、成本适宜，其适用仪器在临床占有率高，非常适宜在临床中广泛应用。

Description

一组用单管检测人运动神经元基因的引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，更具体地，涉及一组用单管检测人运动神经元基因的引物及试剂盒。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(SMA)以脊髓前角细胞(即下运动神经元)和脑干细胞核的进行性退变和丢失导致的肌无力、肌萎缩为特征的隐性遗传病。在针对SMA的多种族研究表明，SMA的总体携带率频率为1/40～1/100，发病率约为1/11000，中国人群的携带率则约为1/50。根据SMA患者的发病年龄和临床表现，SMA患者可分为4型：I型为严重型(OMIM#253300)，占SMA的60％～70％，患儿一般无法独立站立，2岁内会死于呼吸衰竭；II型为中间型(OMIM#253550)，患儿能独自站立，单不能独立行走，生存时间可超过2岁；III型为轻型(OMIM#253400)，患儿或成人可独立行走，可存活至成年；IV型为成年型(OMIM#221750)，表型较轻，成年起病，会出现四肢无力症状，但生存时间与正常人无差别。

SMA致病机制为运动神经元基因(SMN1)因缺失、转换以及点突变等原因导致SMN蛋白的功能缺陷；疾病临床表型的轻重则与SMN2基因拷贝数相关。运动神经元存活基因(SMN,NCBI#6606)位于人5号染色体的5q13位置，包括端粒侧的运动神经元存活基因1(SMN1)和着丝粒侧的运动神经元存活基因2(SMN1)。SMN1和SMN2高度同源，均含有9个外显子，仅存在5个碱基的差异。SMN1为主要功能基因，而SMN2为修饰基因。主要是因为SMN2与SMN1在第7号外显子差异，其编码序列(840C＞T)导致mRNA发生截短，编码的其蛋白功能约为SMN1的10％。根据美国ACMG在2011发布的关于《SMA检测的技术标准和指导原则》说明，95％的SMA患者为SMN1基因第7号外显子纯合缺失(包括缺失、SMN1转换为SMN2等突变类型)导致；5％为一条染色体上SMN1基因第7号外显子缺失，另一条染色体上SMN1基因发生点突变导致；其他的为复杂杂合突变导致，发生率极低。根据NCBI提供序列，SMN基因终止密码子位于第7号外显子末端。因此，SMA的诊断和携带者(“1+0”型和“2+0”型)筛查的关键在于对SMN1基因第7号外显子拷贝数的定量检测；另外SMA患者的表型分型的分子诊断则依赖于SMN2基因拷贝数的定量检测。因此，对于SMA检测诊断，确定SMN1和SMN2的第7号外显子的拷贝数情况，即能满足大多SMA患者诊断或携带者筛查的需求，经济、有效。

随着技术发展，越来越多的技术可以应用至SMN基因检测，其中主要包括：聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragmentlength polymorphism，PCR-RFLP)、实时荧光定量PCR技术(real-time PCR)、多重连接依赖性探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amp lification，MLPA)、基质辅助激光解析电离时间质谱技术(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Timeof Flight,MALDI-TOF)、高通量测序技术(High-throughput sequencing,NGS)、数字PCR技术(Digital PCR)以及定量荧光PCR(Quantitative Fluorescenc-Polymerase chainreaction,QF-PCR)和毛细管电泳技术(Capillary electrophoresis,CE)结合。上述技术中，PCR-RELP技术仅能检测SMN1的纯化突变，技术限制了其对携带者筛选和SMA表型分型的临床应用范围；qPCR技术成本低廉、检出周期短，仪器也被广泛应用，因而针对其开发的产品比较多(专利号CN201310616780、CN201510066921、CN201510362673、CN201610969688等)，但是上述基于qPCR开发的产品会出现单管检测通量不足(单管只能最多三种靶标且一般只能针对SMN1基因或SMN2基因)、相对定量不准确(每管反应均要内参、且不同管反应的内参与靶标扩增效率不一致；qPCR检测灵敏度高，单基于传统的扩增阻滞原理设计的引物不能有效区分SMN1和SMN2基因；SMN1和SMN2的引物公用时，靶标起始拷贝数差异会导致定量偏差；探针设计在SMN1和SMN2相同序列则需严重依赖引物特异性，影响结果)；MLPA技术为荷兰MRC公司全球独家专利技术，需设计多对内参基因、试剂成本高、耗时长，多应用于科学研究，不适用于临床上诊断及筛查应用；MALDI-TOF技术检出周期短、单管检测通量高，但目前仪器、试剂均为封闭系统其成本高昂，从而限制临床应用；NGS技术通量高，但检测成本高、周期长，因而针对其开发产品只能针对能提供高昂医疗费用领域，如胚胎植入前筛查临床受限(专利号201510605049.4)或者主要是针对算法、数据分析优化(专利号CN201710129136)；数字PCR技术为绝对定量方法，但其针对SMN基因检测也需设计内参基因进行相对定量，检测荧光有限，如一般单管只能检测双靶标(只能检测单个目的基因和内参，如专利号CN201810874063)会导致通量不足，临床上仪器占有率也远远不及荧光PCR仪和基因分析仪，从而会限制其在临床上的应用；QF-PCR和CE技术结合，半自动化、检测周期短、单管检测通中等且在临床上基因分析仪占有率高，但目前文献报道(Chun-Chi Wang等Electrophoresis 2009,30,1102–1110)基于贝克曼P/ACE MDQ系统分析，其仪器成本在临床上应用并不广泛、而部分开发的产品(专利号CN201710120076、CN201610559028、)针对了临床占有率高ABI的基因分析系统开发，但其只是针对SMN1第7号外显子检测且引物未引入通用序列会导致定量不准确，不检测SMN2的第7号外显子拷贝数无法协助对临床表型进行分析，另外开发的产品(专利号CN201811119369)只是针对突变频率极低点突变情况进行基因分型。

因此，目前现有方法无法同时满足对于人脊髓型肌萎缩症相关基因患者诊断及携带者筛查的要求，急需一种临床应用便利、成本适宜、检测快速、结果准确可靠的人运动神经元基因检测方法及试剂盒。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术针对目前人运动神经元基因拷贝数定量检测技术存在不足，提供一组用单管检测人运动神经元基因的引物及试剂盒。试剂盒基于QF-PCR技术和CE技术结合的单管检测人运动神经元基因方法，能够在单管中同时检测SMN1和SMN2基因的第7号外显子拷贝数情况及其相互转换情况。

本发明的第一个目的是提供一组用单管检测人运动神经元基因的引物。

本发明的第二个目的是提供所述的引物在检测人运动神经元基因中的应用。

本发明的第三个目的是提供一个单管检测人运动神经元基因的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明的提供一种单管检测人运动神经元基因方法和试剂盒，是针对人运动元存活基因1(SMN1)和人运动元存活基因2(SMN1)的第7号外显子开发设计，能同时检测SMN1和SMN2基因的第7号外显子的拷贝数情况及其相互转换情况。

本单管检测人运动神经元基因方法和试剂盒是基于PCR技术的，包含了如下引物对：公用上游引物P1、公用下游引物P2；SMN1第7号外显子的上游引物P3-E7-1F、SMN1第7号内含子的下游引物P4-I7-1R；SMN2第7号外显子的上游引物P5-E7-2F、SMN2第7号内含子的下游引物P6-I7-2R；内参基因KRIT1的上游引物P7-KRIT1-F、下游引物P8-KRIT1-R，具体的引物序列见表1。

针对SMN1的第7号外显子和第7号内含子设计引物序列，含有两段序列，：(1)通用序列，与通用引物P1和P2碱基序列一致。用于实现使用通用引物扩增；(2)识别序列，能SMN2的第7号外显子和第7号内含子碱基互补配对、结合。

针对SMN2的第7号外显子和第7号内含子设计引物序列，含有三段序列：(1)通用序列，与通用引物P1和P2碱基序列一致。用于实现使用通用引物扩增；(2)特异序列，对比SMN1的引物，设计了含有0～8不等的不数量和组合核苷酸序列，从而区分SMN1的第7号外显子和第7号内含子与SMN2的第7号外显子和第7号内含子相互转换情况；(3)识别序列，能SMN2的第7号外显子和第7号内含子碱基互补配对、结合。

针对SMN1的第7号外显子和第7号内含子和SMN2的第7号外显子和第7号内含的设计引物长度不同，其中针对SMN1的第7号外显子设计的引物长度比SMN1的第7号外显子多出4～8bp，优选为8bp；其中针对SMN1的第7号内含子设计的引物长度比SMN1的第7号内多出4～8bp，优选为4bp。

表1为各引物对的核苷酸序列和修饰碱基(下划线为通序列、序列的中间的小写字母为特异性序列、3’端处的小写字母为引入的错配碱基序列)：

本试剂盒采用如下方法减少扩增偏倚性及相对定量的准确性：(1)先利用识别序列实现对内参基因、SMN1、SMN2的识别、扩增、引入通用序列，再利用正反向通用引物序列实现同步扩增内参基因、SMN1第7外显子以及SMN2基因第7外显子；(2)通过控制扩增子长度减少扩增的偏倚性：相近大小扩增子长度差异为±4bp，且最大和最小的扩增子长度差异不超过50bp。

同时，本试剂盒采用如下方法增加扩增产物的特异性：(1)针对SMN1和SMN2的第7外显子和第7内含子上的差异碱基，按照ARMS引物设计原则进行设计引物，且正反向引物均为ARMS引物；(2)引物除了3’末端设计了错配碱基外，在接近3’末端处引入了小于等于3个的错配碱基，进一步提高引物特异性。

因此本发明要求保护一组用单管检测人运动神经元基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示。

进一步，本发明要求保护所述引物在单管检测人运动神经元基因中的应用。

本发明还要求保护一个单管检测人运动神经元基因的试剂盒，包括所述引物。

还包括PCR反应混合液、引物混合液、PCR酶混合液、SMN校准品、SMN质控品、ROXSize(片段大小分布如下140、160、180、200、214 220、240、250、260、280、300、314、320、340、360)以及稀释液；

稀释液可以为TE缓冲液、Tris缓冲液、无核酸酶水等中的其中一种。

本发明的提供的单管检测人运动神经元基因方法，其扩增程序采用两次循环扩增，具体为：第1次循环，采用低于第二次循环扩增的Tm，循环数少于等于5次，实现识别序列对模板的识别和扩增，同时引入通用序列；第2次循环，采用较高Tm，主要通用引物结合延伸，且循环数控制少于等于30次，实现通用引物的同步低偏倚扩增。

因此，对于引物混合液，本发明通过不同引物浓度配比实现扩增程序中两轮循环中不同目的：(1)通用引物序列P1和P2的工作浓度是P3-E7-1F、P4-I7-1R、P5-E7-2F、P6-I7-2R的2～6倍，是P7-KRIT1-F、P8-KRIT1-R的2～15倍；(2)第一次循环扩增，首先是P3-E7-1F、P4-I7-1R、P5-E7-2F、P6-I7-2R、P7-KRIT1-F、P8-KRIT1-R实现识别序列对基因组DNA模板的识别和扩增；(3)第二轮循环扩增，上述引物在第一轮循环减少且其浓度远低于通用引物P1和P2，因而可以实现主要通用引物扩增，减少扩增偏倚性。引物工作浓度，即的PCR体系终浓度范围如表2：

表2引物的工作浓度范围：

引物	工作浓度范围(μmol/L)
		P1(SEQ ID NO.1)	0.2～0.3
P2(SEQ ID NO.2)	0.2～0.3
		P3-E7-1F(SEQ ID NO.5)	0.05～0.1
P4-I7-1R(SEQ ID NO.6)	0.05～0.1
		P5-E7-2F(SEQ ID NO.7)	0.05～0.1
P6-I7-2R(SEQ ID NO.8)	0.05～0.1
		P7-KRIT1-F(SEQ ID NO.3)	0.02～0.1
P8-KRIT1-R(SEQ ID NO.4)	0.02～0.1

优选地，在引物混合液中，包括所述引物，按照10×工作浓度进行储存。

优选地，SEQ ID NO.1～2所示引物的工作浓度为0.2～0.3μmol/L，SEQ ID NO.3～4所示引物的工作浓度为0.02～0.1μmol/L，SEQ ID NO.5～8所示引物的工作浓度为0.05～0.1μmol/L。

优选地，SEQ ID NO.1所示引物的工作浓度为0.25μM，SEQ ID NO.2所示引物的工作浓度为0.3μM，SEQ ID NO.3所示引物的工作浓度为0.1μM，SEQ ID NO.4所示引物的工作浓度为0.1μM，SEQ ID NO.5所示引物的工作浓度为0.1μM，SEQ ID NO.6所示引物的工作浓度为0.1μM，SEQ ID NO.7所示引物的工作浓度为0.05μM，SEQ ID NO.8所示引物的工作浓度为0.05μM。

优选地，PCR反应混合液按照5×工作浓度进行储存，包括Tris-Hcl缓冲液、氯化钾、硫酸铵、小牛血清蛋白、明胶、吐温-20以及二硫苏糖醇、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，其工作浓度依次为10～50mmol/L、20～45mmol/L、16.6mmol/L、100μg/mL、0.01％、0.05％～01％、5mmol/L、200nM、200nM、200nM、100nM、200nM。

优选地，PCR反应混合液按照5×工作浓度进行储存，包括PCR反应混合液中各组分Tris-Hcl缓冲液、氯化钾、硫酸铵、小牛血清蛋白、明胶、吐温-20以及二硫苏糖醇、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，其工作浓度为30mmol/L、35mmol/L、16.6mmol/L、100μg/mL、0.01％、0.8％、5mmol/L、200nM、200nM、200nM、67nM、133nM。

优选地，PCR酶混合液包括Taq Hs聚合酶和UDG酶，其工作酶活性比例配比为TaqHs聚合酶:UDG酶范围＝10:1～5:1；

更优选地，PCR酶混合液体中Taq Hs聚合酶:UDG酶的酶活比例为5:1，具体地，PCR酶混合液中Taq Hs聚合酶酶活为5U/μL，UDG酶酶活为1U/μL；

更优选地，Taq HS酶在25μL的反应体系中工作酶活总量为2.5U，UDG酶在25μL的反应体系中工作酶活总量为0.5U。

优选地，其SMN校准品为SMN1和SMN2的第7号外显子以及内参基因的拷贝数均为2的正常人样本基因组DNA，其工作浓度为10ng/μL，上样量范围为20ng～50ng，用于均一化待检样本的检测峰。

优选地，其SMN质控品为SMN1基因的第7号外显子拷贝数≤1，且SMN2基因的第7号外显子拷贝数≥1的人基因组DNA，用于实验操作的质控。

更优选地，其SMN质控品为SMN1基因的第7号外显子拷贝数为1，且SMN2基因的第7号外显子拷贝数为3，且KRIT1的拷贝数为2的人基因组DNA。

优选地，本试剂盒的PCR扩增体系包括：PCR反应混合液、引物混合液、模板、PCR酶混合液、稀释液；每次检测，建议需针对SMN校准品、SMN质控品以及待测样本分别检测，NTC则只需每批单独设置一组验证即可。

更优选地，本试剂盒的PCR扩增体系为PCR反应混合液5μL；引物混合液2.5μL；SMN校准品、SMN质控品、待测样本或NTC(20ng～50ng)2～5μL；PCR酶混合液0.5μL；稀释液补足25μL。

更优选地，本试剂盒的PCR扩增程序包括了两次不同退火温度、循环数的扩增循环：37℃10min；95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，5个循环；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃7min；10℃恒温。

优选地，各检测峰的计算方法如下：

(1)样本SMN1第7号外显子检测峰比值

(2)样本SMN2第7号外显子检测峰比值

(3)样本SMN2第7号外显子转换为SMN1第7号外显子的检测峰比值

比值

比值

(4)样本SMN1第7号外显子转换为SMN2第7号外显子的检测峰比值

比值

比值

优选地，SMN1和SMN2基因第7号外显子拷贝数判定方法按照拷贝数量进行划分，其中按照拷贝数为0、1、2、3、≥4的标准进行判定，具体判断方法为：

对于SMN1第7号外显子：比值S1≤0.250，拷贝数为0；比值S1在0.300～0.650，拷贝数为1；比值S1在0.700～1.050，拷贝数为2；比值S1在1.100～1.800，拷贝数为3；比值S1≥1.850，拷贝数为4；

对于SMN2第7号外显子：比值S2≤0.250，拷贝数为0；比值S2在0.300～0.650，拷贝数为1；比值S2在0.700～1.050，拷贝数为2；比值S2在1.100～1.800，拷贝数为3；比值S2≥1.850，拷贝数为4。

当SMN1和SMN2基因第7号外显子发生相互转换时，按照拷贝数为0、1、≥2的标准进行判定分析，具体判断方法为：比值ST1或ST2＜0.350，拷贝数为0；比值ST1或ST2在0.350～0.770，拷贝数为1；比值ST1或ST2>0.770，拷贝数为2及2以上。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的引物设计合理，避免普通单向单碱基错配的扩增阻滞引物特异性不足，特异性高；合理地设计不同扩增子长度、引入通用引物并采用两次循环的同步扩增、减少了扩增偏倚性低，保证定量准确；合理引入识别序列，实现对SMN1和SMN2第7号外显子相互转换情况辨识，提供更多拷贝数信息；体系中引入了UDG酶、扩增程序中加入UDG酶酶切步骤能够有效切割扩增产物，避免污染。本方法和试剂盒检测快速、结果准确、成本适宜，其适用仪器在临床占有率高，非常适宜在临床中广泛应用。

附图说明

附图1为扩增阻滞引物组合电泳图示例。

附图2为梯度PCR验证识别引物、通用引物。

附图3基因组DNA梯度PCR验证内参、SMN1及SMN2的识别引物、通用引物退火温度

附图4为SMN校准品检测峰图。

附图5为SMN质控品检测峰图。

附图6为含SMN1转换子的样本检测峰图。

附图7为含SMN2转换子的样本检测峰图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1一种单管检测人运动神经元的引物的设计

1、针对SMN1、SMN2的exon7拷贝数检测引物的设计

SMN1与SMN2高度同源，仅相差5个核苷酸，分别在内含子6(-45G→A)、外显子7(+6C→T)、内含子7(+100A→G和+214A→G)、外显子8(+245G→A)存在碱基差异。针对SMN1、SMN2的exon7拷贝情况检测，除了在SMN1或SMN2的外显子7(+6C→T)设计其中的一条引物外，另一条引物的设计有一下三种思路：

思路一，在外显子7的上游或者下游的非差异核苷酸的位置设计另一条引物；思路二，或在上游的内含子6(-45G→A)的差异碱基位置设计另一条引物；思路三，或在下游的内含子7(+100A→G和+214A→G)位置设计另一条引物。

针对思路一，扩增产物的特异性完全依赖于在外显子7的差异核苷酸的扩增阻滞引物的设计，无法更好地避免引物特异性不足导致对SMN1和SMN2的识别、扩增错误，因此不采用此方法。

针对思路二，则可以通过双向扩增阻滞引物设计，进一步提高扩增产物特异性，避免对SMN1和SMN2间的错误识别、扩增；基于此，在内含子6(-45G→A)处设计正向引物，如下所示：正向引物1(5’→3’)TCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATA、正向引物2(5’→3’)TCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTGTA，经引物设计软件分析发现，此位置的引物质量较差，容易产生错配、二聚体以及发夹结果等，且其多组模板、同一扩增程序下扩增产物经琼脂糖电泳结果显示，引物扩增效率低，产物量少。因此不采用此方法。

针对思路三，同时具备了思路二的优点，在外显子7的差异核苷酸位置设计正向的扩增阻滞引物，而其在内含子7(+100A→G和+214A→G)位置可以分别设置不同扩增阻滞引物。如下例举的不同反向扩增阻滞引物：针对内含子7(+100A→G)的差异核苷酸序列位置设计的反向扩增阻滞引物，反向引物1(5’→3’)GATTGTTTTACATTAACCTTTCAACTTTT、反向引物2(5’→3’)GATTGTTTTACATTAACCTTTCAACCTCT；针对内含子7(+214A→G)的差异核苷酸序列位置设计的反向扩增阻滞引物，反向引物3(5’→3’)TTATTGTGAAAGTATGTTTCTTCCACAC、反向引物4(5’→3’)TTATTGTGAAAGTATGTTTCTTCAATTAC。经引物设计软件，分析内含子7(+100A→G和+214A→G)位置处的引物质量评分接近，能够设计扩增阻滞引物，其同一模板、同一扩增程序下的多组扩增产物经琼脂糖电泳分析，产物量均接近。基于扩增子长度越短，扩增耗时越少，扩增效率也相对较高考虑，优选采用内含子7(+100A→G)处进行实验设计。

2、识别序列扩增引物的设计

采用通用序列、特异序列以及识别序列结合的方式设计引物，其中通用引物用于实现不同扩增子的同步扩增，能与特异性和特异性序列的扩增产物结合，延伸，实现扩增程序上Tm值更高第二次循环扩增；特异序列，类似于标签序列，含有不同数量的核苷酸，用于不同扩增引物的识别和长度上区分引物及其扩增子；识别序列，能特异性分别于SMN1或SMN2的第7号外显子和第7号内含子结合、延伸、扩增。

引物中的识别序列能够与SMN基因特异性结果，其序列的3’末端采用扩增阻滞设计，不同于一般扩增阻滞设计只在3’末端能够针对模板匹配而与同源模板错配，本发明在3’末端倒2～5个碱基中引入额外的1～3个不等错配碱基。基于碱基匹配的强弱，同时确保引物质量(尽量避免引物二聚体、错配、发夹结构等)，引入额外错配碱基，如下为不同引物实例：(1)在SMN1的第7号内含子(+100A→G)的差异碱基设计引物，除了引物的3’末端为T，能与SMN1模板错配，而与SMN2模板错配外，在倒数第3个碱基处引入错配碱基G；(2)同理，在SMN2的第7号内含子(+100A→G)的差异碱基设计引物，除了引物的3’末端为C外，在倒数第2位置引入了A、倒数第4位置引入了C。这样设计，除了能够增强引物特异性外，保证了引物质量，如附图1所示，为不同扩增阻滞引物的扩增产物的琼脂糖电泳图，其中1和2泳道分别为上述(1)(2)示例的经上述优化的引物的对应电泳结果，可以看出引物特异性强(无杂带)、扩增效率高(条带明亮)。其中泳道1的扩增引物序列包括正向引物TCCTTTATTTTCCTTACAGGGTgTC、反向引物GATTGTTTTACATTAACCTTTCAACTgTT；泳道2的扩增引物序列包括正向引物TCCTTTATTTTCCTTACAGGGTgTT、反向引物TTGTTTTACATTAACCTTTCAACcTaC。

引物中特异序列可以添加至正向引物或反向引物处，可以添加入针对SMN1模板设计的引物或针对SMN1模板设计的，特异序列的核苷酸序列可以0～8bp不等。此实施例，设计将特异序列引入基于SMN2第7号外显子和第7内含子设计的引物，且正向引物的识别序列核苷酸长度较短，在正向引物引入了8个核苷酸序列，可以为A/G/C/T碱基的多种组合，此实施例中为GTTCCTGA；此实施例中反向引物则引入6个核苷酸的特异序列，可以为A/G/C/T碱基的多种组合，此实施例中为针对SMN2第7号外显子的上游引物引入的特异序列为GTTCCTGA；针对SMN2的第7号内含子的下游引物引入的特异序列为GAGTAC；

引物中通用序列，用于同步扩增不同的扩增子，包括SMN1、SMN2以及内参基因(包括并不局限于任何人基因组中拷贝数稳定的基因，可以在空间距离接近SMN基因的其他基因，如NAIP基因；甚至是SMN基因中的不同外显子，本实施例中优选了KRIT1基因)，本实施例选择了的上游通用序列为CTCCAGACGCAGATGACCAACG，下游通用序列为TCGCTCGCCCAAGATAGCAGAC。通用引物序列的退火温度比特异序列的退火温度高3～8℃不等，本实施例选择为高5℃，本实施例中，在第一轮循环中正反向识别序列的反应Tm优选为55℃，相应第二轮循环中，通用引物P1和P2(和通用序列的核苷酸序列一样)反应Tm优选为60℃。如附图2所示，为不同梯度的退火温度下的识别序列扩增产物以及通用引物的扩增产物的琼脂糖电泳图，其中S1～S5为识别序列扩增产物结果，可以看出Tm在61℃时，无扩增产物；T1～T5为通用序列扩增产物结果，通用引物在Tm为61℃，扩增效率高，条带明显。

实施例2一种单管检测人运动神经元的扩增程序的优化

利用人基因组DNA做PCR扩增体系的的模板，针对SMN1和SMN2以及内参基因KRIT1的识别序列(引物)P3～P8(SEQ ID NO.3～8)，分别设置Tm范围为53～60℃的梯度PCR验证；以人基因组DNA作为模板，在Tm值范围为55～60℃里进行通用引物的梯度PCR验证。

上述退火温度优化结果如附图3所示：电泳图中S11～S13泳道分别为针对SMN1的P3/P4引物识别序列在55℃、58℃、60℃的扩增产物电泳结果；S21-S23泳道分别为针对SMN2的P5/P6引物识别序列的在55℃、58℃、60℃的扩增产物电泳结果；K1～K3泳道分别为针对KRIT1的P7/P8引物识别序列的在55℃58℃、60℃的扩增产物电泳结果；说明上述基因的识别引物在55℃时，各扩增子的特异性最佳(无杂带)、效率高(条带明亮)，60℃时，无扩增产物；U1～U3泳道分别为针对通用引物P1/P2在55℃58℃、60℃的扩增产物电泳结果，说明得出在60℃时，扩增产物特异性好，扩增效率高。

最后采用正交法验证。

具体正交实验的方法：收集50例已知SMN1、SMN2拷贝数样本，通过PCR产物量、判定方法(CE信号值范围、判读范围、灰度范围等)、耗时、成本等综合因素评分(1～5分，最佳5分)。结果如表3所示，优选出最佳搭配为：第一轮循环的循环数为5(Tm＝55℃)、第二轮循环的循环数为30(Tm＝60℃)。

表3：

最终确定第一轮循环的循环数为5，第二轮循环的循环数为30。

实施例3一种单管检测人运动神经元的扩增试剂的优化

1、分别对PCR反应混合液中组成成分、各组分的工作浓度、PCR反应总体积、DNA样本量等因素进行优化选择。

PCR反应混合液包括Tris-Hcl缓冲液、氯化钾、硫酸铵、小牛血清蛋白、明胶、吐温-20以及二硫苏糖醇、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP。

PCR反应混合液中各组分Tris-Hcl缓冲液、氯化钾、硫酸铵、小牛血清蛋白、明胶、吐温-20以及二硫苏糖醇、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP的工作浓度为30mmol/L、35mmol/L、16.6mmol/L、100μg/mL、0.01％、0.8％、5mmol/L、200nM、200nM、200nM、67nM、133nM。

设计重复实验进行验证，分别采用P3～P8引物(SEQ ID NO.3～8)针对SMN1、SMN2、内参KRIT1基因进行扩增，采用实施例2确认的扩增程序，通过该10次实验扩增产物量及其变异系数进行评价，结果如表4所示，针对SMN1、SMN2、KRIT1基因的设计的扩增引物均能有效扩增，且扩增产物量的变异系数少于10％，表明上述反应体系能够有效扩增所需的基因，且扩增效果均衡，可以采用上述反应体系组分和组分浓度。

表4：

2、dNTPs的各组分的浓度配比的优化

另外通过UDG酶酶解不同扩增子效率对比确定dNTPs的各组分的浓度配比，具体设计如下：分别采用配比一(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP浓度为200nM、200nM、200nM、67nM、133nM)；配比二(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP浓度为200nM、200nM、200nM、100nM、200nM)的dNTPs分别进行PCR，每种配比设计10组平行实验，即10组的PCR产物，通过UDG酶在37℃反应10分钟，经琼脂糖凝胶电泳分析反应产物.

结果如表5所示：采用配比二电泳结果中有部分的UDG酶的酶切产物仍部分结果有电泳条带，而采用配比一的UDG酶酶切产物均无电泳条带，故采用配比一作为本实施例的优选配比。

表5：

3、引物工作浓度的优化

设置20ng～50ng的人基因组DNA模板量下，设置公用上游引物P1(SEQ ID NO.1)、公用下游引物P2(SEQ ID NO.2)；SMN1第7号外显子的上游引物P3-E7-1F(SEQ ID NO.3)、SMN1第7号内含子的下游引物P4-I7-1R(SEQ ID NO.4)；SMN2第7号外显子的上游引物P5-E7-2F(SEQ ID NO.5)、SMN2第7号内含子的下游引物P6-I7-2R(SEQ ID NO.6)；内参基因KRIT1的上游引物P7-KRIT1-F(SEQ ID NO.7)、下游引物P8-KRIT1-R(SEQ ID NO.8)的工作浓度依次为0.25μM、0.3μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.05μM、0.05μM的引物量进行验证，单管同时扩增SMN1、SMN2模板、内参基因以及通用引物的进行实验。

具体设置如下：收集经MLPA验证的8例或8例以上的正常人基因组DNA样本(本实施例设置8例进行验证，正常人的SMN1 SMN2内参KTIR1基因的拷贝数均为2)，分别在20ng、30ng、40ng、50ng的模板量下，采用实施例2的确认的扩增程序，通过基因分析仪，如3500DX的检测峰面比较均衡。

结果如表6所示：在不同模板量下，上述的引物配比的SMN1 SMN2以及内参KRIT1的检测峰峰面积均差异较小，实施例优选上述的引物用量。

表6：

4、体积的反应体系的优化

采用实施例2和本实施例优选的PCR反应混合液、引物浓度、DNA模板量等条件上，研究不同体积的反应体系的扩增效果。

具体设置如下：收集经MLPA验证的正常人gDNA样本，选择50μL、25μL反应体系下(其中50μL和25μL反应体系各组分加入量等比例放大或缩小)，通过对比不同反应体系的基因分析仪的检测峰峰面积、拷贝判定结果进行对比。

实验结果如表7所示：采用50μL、25μL反应体系下进行基因分析仪片段分析，50μL反应体系的检测峰峰面积高于25μL，但无明显差异，且采用选25μL的扩增体系下，拷贝数判定符合预期结果，因此本实施例优选25μL扩增体系以进一步节省检测试剂成本。

表7：

实施例4一种单管检测人运动神经元的试剂盒

一、组成

PCR反应混合液1管(275μL/管)、含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示的引物混合液1管(138μL/管)、PCR酶混合液1管(28μL/管)、SMN校准品1管(275μL/管)、SMN质控品1管(275μL/管)、片段大小分布为140bp、160bp、180bp、200bp、214bp、220bp、240bp、250bp、260bp、280bp、300bp、314bp、320bp、340bp、360bp的DNA片段，其中某一单链的5’端经ROX荧光标记修饰的ROX Size(66μL/管)及用于稀释样本gDNA或SMN校准品或SMN质控品或作为NTC模板的稀释液1管(1000μL/管)，其中稀释液可以为TE缓冲液、Tris缓冲液、无核酸酶水等中的其中一种，本实施例采用Tris缓冲液。

其中，SEQ ID NO.1：FAM-CTCCAGACGCAGATGACCAACG；

SEQ ID NO.2：TCGCTCGCCCAAGATAGCAGAC；

SEQ ID NO.3：

CTCCAGACGCAGATGACCAACGTAAAAACTAATGTCATAAATCCTGC；

SEQ ID NO.4：

TCGCTCGCCCAAGATAGCAGACTTCATTCAACTCTTACCCGATT；

SEQ ID NO.5；

CTCCAGACGCAGATGACCAACGTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTgTC；

SEQ ID NO.6：

TCGCTCGCCCAAGATAGCAGACGATTGTTTTACATTAACCTTTCAACTgTT；

SEQ ID NO.7：

CTCCAGACGCAGATGACCAACGgttcctgaTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTgTT；

SEQ ID NO.8：

TCGCTCGCCCAAGATAGCAGACgagtacTTGTTTTACATTAACCTTTCAACcTaC。

PCR反应混合液为包括Tris-Hcl缓冲液、氯化钾、硫酸铵、小牛血清蛋白、明胶、吐温-20以及二硫苏糖醇、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，其工作浓度依次为10～50mmol/L、20～45mmol/L、16.6mmol/L、100μg/mL、0.01％、0.05％～01％、5mmol/L、200nM、200nM、200nM、100nM、200nM，其按照5×工作浓度进行储存，

引物混合液，按照10×工作浓度进行储存，SEQ ID NO.1～2所示引物的工作浓度为0.2～0.3μmol/L，SEQ ID NO.3～4所示引物的工作浓度为0.02～0.1μmol/L，SEQ IDNO.5～8所示引物的工作浓度为0.05～0.1μmol/L。

PCR酶混合液包括Taq Hs聚合酶和UDG酶，更优选地，在25μL的反应体系中Taq HS酶工作酶活总量为2.5U，UDG酶工作酶活总量为0.5U。

其SMN校准品为SMN1和SMN2的第7号外显子以及内参基因KRIT1的拷贝数均为2的正常人样本基因组DNA，其工作浓度为10ng/μL，上样量范围为20ng～50ng。

SMN质控品为SMN1基因的第7号外显子拷贝数为1，且SMN2基因的第7号外显子拷贝数为3，且KRIT1的拷贝数为2的人基因组DNA。

二、使用方法

1、样本采集

标本可为血卡、血液、羊水、绒毛组织等。血卡≥2cm，血液为常规取静脉血2mL或者胎儿脐带血0.5-1mL，EDTA抗凝处理；经穿刺获羊水2-5mL或者绒毛组织数条(≥20mg)。

标本可立即检测，4℃保存一周，-20±5℃保存期可达一年。

标本应在2～8℃条件下运送，运输时间不超过5天。

2、DNA提取：按照市售的适用核酸提取试剂盒说明书进行操作，收集到体积≥20μL，经紫外分光光度计定量，要求浓度≥10ng/uL，将DNA溶液并稀释成10ng/μL，DNA纯度要求为OD260/OD280在1.6-2.0之间。

3、多重PCR反应

对于每管PCR反应体系，按照下表进行配制，涡旋混匀，并瞬时离心，以使液体聚集在管底

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

同一批次进行的PCR反应中必须有一个SMN校准品、一个SMN质控品、待测样本。

4、扩增产物电泳

(1)上样操作

每份检测取1μL PCR产物和13.5μL甲酰胺、0.5μL GeneScanTM 600

Sizestandard v2.0(内标)混合。将混合物95℃加热变性5分钟。放置冰上至少1分钟，瞬时离心混合物。在ABI 3500Dx基因分析仪上样进行毛细管电泳，具体操作参照ABI 3500Dx基因分析仪用户手册进行。

(2)质控标准

(i)GeneScan^TM 600

Size standard v2.0在ABI 3500Dx电泳后显示36条均匀的橙色荧光峰，说明毛细管电泳成功。

(ii)SMN校准品：校准品的SMN1第7号外显子、SMN2第7号外显子与内参基因的拷贝数均为2。

SMN质控品：本实施例采用SMN1第7号外显子拷贝数为1、SMN2第7号外显子拷贝数为3的情况质控品，其比值范围符合表8所示范围。

表8：

注：①本试剂盒根据第7号外显子和第7号内含子差异碱基设计引物，PCR产物一般为“SMN1的第7号外显子+SMN1第7号内含子部分序列”或“SMN2的第7号外显子+SMN2第7号内含子部分序列”；②如下对SMN1转换子和SMN2转换子定义：SMN1转换子，即为“SMN1的第7号外显子+SMN2的第7号内含子部分序列”；SMN2转换子，即为“SMN2的第7号外显子+SMN1的第7号内含子部分序列”；

以上标准(i)、(ii)需要同时满足，否则需重新实验。

4、计算

各检测峰的计算方法如下：

(1)样本SMN1第7号外显子检测峰比值

(2)样本SMN2第7号外显子检测峰比值

(3)样本SMN2第7号外显子转换为SMN1第7号外显子的检测峰比值

比值

比值

(4)样本SMN1第7号外显子转换为SMN2第7号外显子的检测峰比值

比值

比值

4、结果判读

SMN1和SMN2基因第7号外显子拷贝数判定方法按照拷贝数量进行划分，其中按照拷贝数为0、1、2、3、≥4的标准进行判定，具体判断方法为：

当SMN1和SMN2基因第7号外显子发生相互转换时，按照拷贝数为0、1、≥2的标准进行判定分析，具体判断方法为：比值ST1或ST2＜0.350，判定对应转换子的拷贝数为0；比值ST1或ST2为0.350～0.770，判定对应转换子的拷贝数为1；比值ST1或ST2>0.770，判定对应转换子的拷贝数为2及2以上。

实施例5一种单管检测人运动神经元的试剂盒的使用

一、实验方法

使用实施例4的试剂盒检测SMN校准品、SMN质控品、SMN1转换子的样本和SMN2转换子的样本。

二、实验结果

如附图4所示为本实施例中的SMN校准品的检测峰图，附图5所示为SMN质控品的检测峰图；附图6所示为出现SMN1转换子的样本1的检测峰图；附图7所示为出现SMN2转换子的样本2的检测峰图。SMN1和SMN2基因第7号外显子的拷贝数判定如下：①当比值范围为≤0.250，判定拷贝数为0；②当比值范围为0.300～0.650，判定拷贝数为1；③当比值范围为1.100～1.800，判定拷贝数为3；④当比值范围为≥1.850，判定拷贝数为4或4以上；当SMN1和SMN2基因第7号号外显子发生相互转换时，其检测峰判定分析情况如下：①当比值范围为≤0.350，判定拷贝数为0；②当比值范围为0.300～0.770，判定拷贝数为1；③当比值范围为＞0.770，判定拷贝数为2或2以上。最终，SMN校准品、SMN质控品、样本1以及样本2的峰面积以及峰面积比值、以及拷贝数判定依次如表9到表11所示。

表9：

表10：

表11：

实施例5一种单管检测人运动神经元的检测试剂盒的比较

选取市售SMA基因检测产品荷兰MRC-Holland P021-100R、美国的Asuragen

PCR/CE SMN1/2Kit以及国内上海五色石的运动神经元存活基因1(SMN1)外显子缺失检测试剂盒和本发明实施例4试剂盒关于技术原理、检测范围、通量、检测周期、成本等因素进行对比分析。

如表12所示，相比MRC-Holland P021-100R，本发明的检测周期更短、检测成本更低，且能检测SMN1和SMN2的第7号外显子的转换情况；相比美国的Asuragen

PCR/CE SMN1/2Kit，本发明成本更低，因采用通用引物和两轮循环，其检测特异性更高、相对定量准确性也更高；相比上海五色石的运动神经元存活基因1(SMN1)外显子缺失检测试剂盒，本发明能够同时检测SMN1/2的第7号外显子的拷贝数情况以及SMN1和SMN2的第7号外显子的转换情况，且针对靶基因能够单管检测。

本发明具备检测成本低、通量高、检测周期短、特异性高、相对定量准确等优点，具备市场应用价值和创新性。

表12：

收集120例临床样本，利用实施例4的试剂盒和上述三款产品进行检测验证，以MLPA法检测拷贝数量作为对照，结果如表13所示，一致性比较中，本发明和MLPA法的一致性最高，其一致性为100％；SMN1和SMN2转换情况验证，实施例4的试剂盒和Asuragen

PCR/CE SMN1/2Kit的一致性也达到100％，说明本试剂盒相比其他市售的定量准确高，具备明显优势。

表13：

注：①本试剂盒根据第7号外显子和第7号内含子差异碱基设计引物，PCR产物一般为“SMN1的第7号外显子+第7号内含子部分序列”或“SMN2的第7号外显子+第7号内含子部分序列”；②如下对SMN1转换子和SMN2转换子定义：SMN1转换子，即为“SMN1的第7号外显子+SMN2的第7号内含子部分序列”；SMN2转换子，即为“SMN2的第7号外显子+SMN1的第7号内含子部分序列”。

序列表

<110> 广州市达瑞生物技术股份有限公司

<120> 一组用单管检测人运动神经元基因的引物及试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctccagacgc agatgaccaa cg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgctcgccc aagatagcag ac 22

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctccagacgc agatgaccaa cgtaaaaact aatgtcataa atcctgc 47

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgctcgccc aagatagcag acttcattca actcttaccc gatt 44

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctccagacgc agatgaccaa cgtcctttat tttccttaca gggtgtc 47

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgctcgccc aagatagcag acgattgttt tacattaacc tttcaactgt t 51

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctccagacgc agatgaccaa cggttcctga tcctttattt tccttacagg gtgtt 55

<210> 8

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcgctcgccc aagatagcag acgagtactt gttttacatt aacctttcaa cctac 55

Claims

1.一组用单管检测人运动神经元基因的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1～8所示。

2.权利要求1所述的引物在制备检测人运动神经元基因的试剂盒中的应用。

3.一个单管检测人运动神经元基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还含有PCR 反应混合液、引物混合液、PCR酶混合液、SMN校准品、SMN质控品、ROX Size以及稀释液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，权利要求1所述的引物以引物混合液的形式存在，引物混合液中各引物按照10×工作浓度进行储存，SEQ ID NO.1～2所示引物的工作浓度为0.2～0.3μmol/L，SEQ ID NO. 3～4所示引物的工作浓度为0.02～0.1μmol/L，SEQ ID NO.5～8所示引物的工作浓度为0.05～0.1μmol/L。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，PCR反应混合液按照5×工作浓度进行储存，包括Tris-Hcl缓冲液、氯化钾、硫酸铵、小牛血清蛋白、明胶、吐温-20以及二硫苏糖醇、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，其工作浓度依次为10～50mmol/L、20～45mmol/L、16.6 mmol/L、100μg/mL、0.01%、0.05%～01%、5 mmol/L、200nM、200nM、200nM、100nM、200nM。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，PCR酶混合液包括TaqHs聚合酶和UDG酶，其工作酶活性比例配比为TaqHs聚合酶:UDG酶的范围=10：1～5：1。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其SMN校准品为SMN1和SMN2的第7号外显子以及内参基因的拷贝数均为2的正常人样本基因组DNA，其工作浓度为10ng/μL，上样量范围为20ng～50ng，用于均一化待检样本的检测峰。

9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，SMN质控品为SMN1基因的第7号外显子拷贝数≤1，且SMN2基因的第7号外显子拷贝数≥1的人基因组DNA。