CN104630368A - 一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于体外核酸检测技术领域，具体为一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒。本发明分别设计了SMN1、SMN2基因第7和第8外显子和内参基因RPP40的特异性引物和探针。同时设计SMN1基因Y272C、11bp-DUP、4bp-DEL三个热点突变的定性检测引物和探针。试剂盒包括含有检测引物探针组合物的容器、对照品容器和PCR反应液容器。通过5个独立的PCR反应分别对SMN1第7和第8外显子（第1、第2PCR反应）、SMN2基因第7和第8外显子（第3、第4PCR反应）进行拷贝数相对定量，并对Y272C、11bp-DUP、4bp-DEL三个热点突变进行定性检测（第5PCR反应）。本发明特异性强、灵敏度高、简便、快速，适于大规模推广应用。

Description

一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于人核酸体外检测技术领域，具体涉及一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及检测试剂盒。

背景技术

位于人5号染色体上的运动神经元存活基因（Survival of Motor Neuron，SMN）包括端粒端的运动神经元存活基因1（SMN1）和着丝粒端的运动神经元存活基因2（SMN2），二者均有8个外显子，分别为外显子1、外显子2a、外显子2b以及外显子3?8。SMN1与SMN2高度同源，仅相差5个核苷酸（内含子6：-45G→A, 外显子7：+6C→T, 内含子7：+100A→G和+214A→G, 外显子8：+245G→A）。SMN蛋白正常表达与人脊髓前角α运动神经元的功能密切相关。当缺失SMN蛋白或SMN蛋白功能异常时，将导致脊髓前角α运动神经元功能退化，出现进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力、萎缩，进而死亡，这一疾病被称为脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy, SMA）。目前的研究已表明，导致SMA的主要原因为SMN1基因缺陷，而SMN2基因与SMA临床表现的轻重相关。原因是，SMN1基因表达的蛋白是维持脊髓前角α运动神经元功能的主要蛋白，而SMN2基因所表达蛋白的功能仅相当于SMN1基因所表达蛋白功能的约10%。SMA是一种常见的神经系统常染色体隐性遗传病，群体发病率高达1:6 000?1:10 000，居神经系统致死性常染色体隐性遗传病的第二位。最近的研究表明，SMN的拷贝数可能还与散发性肌萎缩侧索硬化症的预后和表型相关。因此，对人SMN基因拷贝数进行相对定量检测，无论是对临床相关疾病的辅助诊断或是对新生儿SMA出生缺陷预防都是具有参考价值的指标之一。

人细胞为二倍体细胞，正常人细胞中2条染色体上各有一个正常的SMN1基因，即每个正常细胞有2个拷贝的SMN1基因，携带者由于1条染色体上的SMN1基因突变导致功能缺失则仅有1个拷贝的SMN1基因，SMA患者则无正常的SMN1基因，即为0拷贝。SMN2基因的拷贝数对SMA的疾病表型有重要影响，SMN2拷贝数越多，SMA的临床表现越轻，患者存活时间也越长。研突变表明，正常人每细胞中的SMN2的拷贝数可以从0-3个拷贝不等，多数为1个拷贝或2个拷贝。

在导致SMA的SMN1基因突变中，最常见的是SMN1基因第7和/或第8外显子的缺失，这两个位点的突变占SMN1基因突变谱的95%以上，其它的突变类型多为点突变或小片段的缺失或重复，其中在欧美人群中发现SMN1 基因外显子6 的815 (A > G)错意突变（即Y272C）、768-778 dup[TGCTGATGCTT]移码突变(即11bp-DUP)及外显子3 的399-402 del [AGAG]移码突变（即4bp-DEL）是最为常见的三个热点突变。在不同人群中对SMN1基因突变进行的研究发现，在全球范围内，SMN1基因携带者频率为1：40?1：60。

然而，目前临床上尚无方便的可对SMN1和SMN2基因拷贝数相对定量的检测方法。临床上对SMA的辅助分子检测，目前常用的是聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性法，即PCR-RFLP法（李秀玲等，中国妇幼保健，2011，26:2220-2223）。这一方法仅可对SMN1基因第7外显子、第8外显子缺失纯合（即0拷贝）的SMA病例进行定性检测，无法对SMN1基因缺失突变携带者进行检测。另一常用的方法是多重连接探针扩增技术，即MPLA法，（Passon N, et al. Mol Cell Probes. 2010, 24(5):310-314）。目前，荷兰MRC公司已推出仅用于科学研究的基于MLPA技术的SMA检测试剂。其它的方法还包括变性高效液相色谱法，即DHPLC法（Su YN, et al. PLoS One. 2011, 6(2):e17067）。无论是DHPLC法还是MLPA法，虽然可以对SMN1和SMN2基因第7外显子和第8外显子缺失携带者进行检测，但这些方法均需要在PCR反应结束后，开管对PCR产物进行后处理，在操作过程中易发生实验室污染，且费时、费力，无法实现大通量的批量检测。另外，无论是DHPLC法还是MLPA法，对于SMN1和SMN2基因第7外显子和第8外显子的拷贝数定量只是在PCR反应终点半定量，其结果判断更多的是依据经验而无法形成标准化的结果判定方法。近年来，已有学者在研究基于实时荧光定量聚合酶链式反应技术的SMA检测方法，即Real-Time PCR法（曾骥孟等, 发明专利申请：201310509147.9；江雨等，中华医学遗传学杂志，2014，31(2):180-184）。Real-time PCR的方法可以有效地避免PCR-RFLP、DHPLC、MLPA等技术的缺陷。然而对目前采用Real-Time PCR技术进行SMA检测的一些文献进行分析发现，这些技术均是基于SMN1与SMN2基因间的有限核苷酸差异（外显子7与外显子8各有一个核苷酸的差异），采用传统的扩增阻抗原理设计相应的引物与探针。以第7外显子为例，即将SMN1基因与SMN2的差异碱基置于PCR引物3’端最后一位（SMN1第7外显子为C，SMN2第7外显子为T），而检测探针采用SMN1与SMN2公用探针。然而，研究表明，这样的设计并足以有效区别SMN1第7外显子和SMN2第7外显子。从而使对SMN1或SMN2基因拷贝数的相对定量出现偏差，影响其结果的临床参考价值。Real-Time PCR法的另一设计策略是，依据SMN1与SMN2的差异碱基（如第7外显子的C和T、第8外显子的G和A），在差异碱基位置设计特异性的探针，但这一设计无法避免的是SMN1与SMN2的PCR扩增引物将是公用的。大样本的研究表明，在携带者群体中，SMN2基因拷贝数可多达4个以上，对于只有1个拷贝SMN1的携带者而言，当SMN1与SMN2采用公用引物进行扩增时，将无法避免多拷贝SMN2基因优势扩增对单拷贝SMN1基因的影响（因为此时二者的PCR引物相同），同样会导致相对定量结果的偏差。另外，这些技术所关注的也仅是SMN1外显子7和外显子8的缺失突变，而未能对SMN1基因外显子6 的Y272C、11bp-DUP及外显子3 的4bp-DEL等常见热点突变进行检测。

因此，现有技术方法的可靠性无法满足对于人运动神经元基因拷贝数相对定量的需要，迫切需要一种可靠的、可对SMN1基因和SMN2基因第7、第8外显子拷贝数进行相对定量的检测方法。

发明内容

本发明的目的就是针对目前人运动神经元基因拷贝数定量检测方法存在的问题与不足，提供一种检测快速、简便，检测结果可靠的人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及检测试剂盒。

本发明提供的人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒，是针对人运动神经元基因（包括SMN1和SMN2基因）第7、第8外显子拷贝数进行相对定量检测，并同时对SMN1第6外显子Y272C、11bp-DUP和第3外显子4bp-DEL 三个热点突变的基因型进行定性检测。本发明设计巧妙，采用闭管检测，避免样本污染，同时可有效避免现有扩增阻方法中SMN1与SMN2高度同源性导致的相互干扰，检测快速、简便，相对定量检测结果可靠，适于大规模推广应用。

本发明提供的人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法，是采用四个PCR反应分别对SMN1基因第7和第8外显子、SMN2基因第7和第8外显子进行拷贝数相对定量检测，并采用第五PCR反应对SMN1第6和第3外显子上三个热点突变进行定性检测，其中：

1、第一PCR反应，是针对SMN1基因第7外显子的相对定量检测PCR反应，采用如下引物与探针：

公用上游引物P1（为SEQ ID No.1所示核苷酸序列）、公用引物P2（为SEQ ID No.2所示核苷酸序列）、RPP40上游引物P3（为SEQ ID No.3所示核苷酸序列）、RPP40下游引物P4（为SEQ ID No.4所示核苷酸序列）、RPP40检测探针P5（为SEQ ID No.5所示核苷酸序列）、SMN1第7外显子上游引物PE7-1F（为SEQ ID No.6所示核苷酸序列）、SMN1第7外显子下游引物PE7-1R（为SEQ ID No.7所示核苷酸序列）、SMN1第7外显子检测探针PE7-1D（为SEQ ID No.8所示核苷酸序列）、SMN2第7外显子封闭探针PE7-2A （为SEQ ID No.9所示核苷酸序列）。

其中，P1、P2、P3、P4、P5、PE7-1F、PE7-1R、PE7-1D、PE7-2A工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L。

2、第二PCR反应，是针对SMN1基因第8外显子的相对定量检测PCR反应，采用如下引物与探针：

公用上游引物P1（SEQ ID No.1所示核苷酸序列）、公用引物P2（SEQ ID No.2所示核苷酸序列）、RPP40上游引物P3（SEQ ID No.3所示核苷酸序列）、RPP40下游引物P4（SEQ ID No.4所示核苷酸序列）、RPP40检测探针P5（SEQ ID No.5所示核苷酸序列）、SMN1第8外显子上游引物PE8-1F（为SEQ ID No.10所示核苷酸序列）、SMN1第8外显子下游引物PE8-1R（为SEQ ID No.11所示核苷酸序列）、SMN1第8外显子检测探针PE8-1D（为SEQ ID No.12所示核苷酸序列）、SMN2第8外显子封闭探针PE8-2A （为SEQ ID No.13所示核苷酸序列）。

其中，P1、P2、P3、P4、P5、PE8-1F、PE8-1R、PE8-1D、PE8-2A工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L。

3、第三PCR反应，是针对SMN2基因第7外显子的相对定量检测PCR反应，采用如下引物与探针：

公用上游引物P1（SEQ ID No.1所示核苷酸序列）、公用引物P2（SEQ ID No.2所示核苷酸序列）、RPP40上游引物P3（SEQ ID No.3所示核苷酸序列）、RPP40下游引物P4（SEQ ID No.4所示核苷酸序列）、RPP40检测探针P5（SEQ ID No.5所示核苷酸序列）、SMN2第7外显子上游引物PE7-2F（为SEQ ID No.14所示核苷酸序列）、SMN2第7外显子下游引物PE7-2R（为SEQ ID No.15所示核苷酸序列）、SMN2第7外显子检测探针PE7-2D（为SEQ ID No.16所示核苷酸序列）、SMN1第7外显子封闭探针PE7-1A （为SEQ ID No.17所示核苷酸序列）。

其中，P1、P2、P3、P4、P5、PE7-2F、PE7-2R、PE7-2D、PE7-1A工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L。

4、第四PCR反应，是针对SMN2基因第8外显子的相对定量检测PCR反应，采用如下引物与探针：

公用上游引物P1（SEQ ID No.1所示核苷酸序列）、公用引物P2（SEQ ID No.2所示核苷酸序列）、RPP40上游引物P3（SEQ ID No.3所示核苷酸序列）、RPP40下游引物P4（SEQ ID No.4所示核苷酸序列）、RPP40检测探针P5（SEQ ID No.5所示核苷酸序列）、SMN2第8外显子上游引物PE8-2F（为SEQ ID No.18所示核苷酸序列）、SMN2第8外显子下游引物PE8-2R（为SEQ ID No.19所示核苷酸序列）、SMN2第8外显子检测探针PE8-2D（为SEQ ID No.20所示核苷酸序列）、SMN1第8外显子封闭探针PE8-1A （为SEQ ID No.21所示核苷酸序列）。

其中，P1、P2、P3、P4、P5、PE8-2F、PE8-2R、PE8-2D、PE8-1A工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L。

5、第五PCR反应，是针对SMN1第6外显子和第3外显子3个热点突变检测的反应，采用如下引物与探针：

公用上游引物P1（SEQ ID No.1所示核苷酸序列）、公用引物P2（SEQ ID No.2所示核苷酸序列）、RPP40上游引物P3（SEQ ID No.3所示核苷酸序列）、RPP40下游引物P4（SEQ ID No.4所示核苷酸序列）、RPP40检测探针P5（SEQ ID No.5所示核苷酸序列）、SMN1第6外显子Y272C上游引物P272-F（为SEQ ID No.22所示核苷酸序列）、SMN1第6外显子11bp-DUP上游引物P11-F（为SEQ ID No.23所示核苷酸序列）、SMN1第6外显子下游引物PE6-R（为SEQ ID No.24所示核苷酸序列）、SMN1第6外显子Y272C检测探针P272-D（为SEQ ID No.25所示核苷酸序列）、SMN1第6外显子Y272C竞争探针P272-A（为SEQ ID No.26所示核苷酸序列）、SMN1第6外显子11bp-DUP检测探针P11-D（为SEQ ID No.27所示核苷酸序列）、SMN1第3外显子4bp-DEL上游引物PE3-4F（为SEQ ID No.28所示核苷酸序列）、SMN1第3外显子4bp-DEL下游引物PE3-4R（为SEQ ID No.29所示核苷酸序列）、SMN1第3外显子4bp-DEL检测探针PE3-4D（为SEQ ID No.30所示核苷酸序列）。

其中，P1、P2、P3、P4、P5、P272-F、P11-F、PE6-R、P272-D、P272-A、P11-D、PE3-4F、PE3-4R、PE3-4D工作浓度范围依次为：500?700nmol/L、500?700nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、20?40nmol/L、20?40nmol/L、40?60nmol/L、100?200nmol/L、50?100nmol/L、100?200nmol/L、20?40nmol/L、20?40nmol/L、100?200nmol/L。

P1、P2、P3、P4、P5、PE7-1F、PE7-1R、PE7-1D、PE7-2A、PE8-1F、PE8-1R、PE8-1D、PE8-2A、PE7-2F、PE7-2R、PE7-2D、PE7-1A、PE8-2F、PE8-2R、PE8-2D、PE8-1A、P272-F、P11-F、PE6-R、P272-D、P272-A、P11-D、PE3-4F、PE3-4R、PE3-4D核苷酸序列及修饰特征见表1。

表1、 SEQ ID No.1至SEQ ID No.30核苷酸序列与修饰特征

本发明特别涉及下述各组引物与探针组合物：

用于本发明检测方法的如下公用引物与探针：公用上游引物P1（为SEQ ID No.1所示核苷酸序列）、公用引物P2（为SEQ ID No.2所示核苷酸序列）、RPP40上游引物P3（为SEQ ID No.3所示核苷酸序列）、RPP40下游引物P4（为SEQ ID No.4所示核苷酸序列）、RPP40检测探针P5（为SEQ ID No.5所示核苷酸序列）；

用于检测SMN1基因第7外显子的上游引物PE7-1F（为SEQ ID No.6所示核苷酸序列）、下游引物PE7-1R（为SEQ ID No.7所示核苷酸序列）、检测探针PE7-1D（为SEQ ID No.8所示核苷酸序列）、封闭探针PE7-2A （为SEQ ID No.9所示核苷酸序列）；

用于检测SMN1第8外显子的上游引物PE8-1F（为SEQ ID No.10所示核苷酸序列）、下游引物PE8-1R（为SEQ ID No.11所示核苷酸序列）、检测探针PE8-1D（为SEQ ID No.12所示核苷酸序列）、SMN2第8外显子封闭探针PE8-2A （为SEQ ID No.13所示核苷酸序列）；

用于检测SMN2第7外显子的上游引物PE7-2F（为SEQ ID No.14所示核苷酸序列）、下游引物PE7-2R（为SEQ ID No.15所示核苷酸序列）、检测探针PE7-2D（为SEQ ID No.16所示核苷酸序列）、封闭探针PE7-1A （为SEQ ID No.17所示核苷酸序列）；

用于检测SMN2第8外显子的上游引物PE8-2F（为SEQ ID No.18所示核苷酸序列）、下游引物PE8-2R（为SEQ ID No.19所示核苷酸序列）、检测探针PE8-2D（为SEQ ID No.20所示核苷酸序列）、封闭探针PE8-1A （为SEQ ID No.21所示核苷酸序列）；

用于检测SMN1第6外显子两个热点突变的、 SMN1第6外显子Y272C上游引物P272-F（为SEQ ID No.22所示核苷酸序列）、SMN1第6外显子11bp-DUP上游引物P11-F（为SEQ ID No.23所示核苷酸序列）、SMN1第6外显子下游引物PE6-R（为SEQ ID No.24所示核苷酸序列）、SMN1第6外显子Y272C检测探针P272-D（为SEQ ID No.25所示核苷酸序列）、SMN1第6外显子Y272C竞争探针P272-A（为SEQ ID No.26所示核苷酸序列）、SMN1第6外显子11bp-DUP检测探针P11-D（为SEQ ID No.27所示核苷酸序列）；用第3外显子一个热点突变的SMN1第3外显子4bp-DEL上游引物PE3-4F（为SEQ ID No.28所示核苷酸序列）、SMN1第3外显子4bp-DEL下游引物PE3-4R（为SEQ ID No.29所示核苷酸序列）、SMN1第3外显子4bp-DEL检测探针PE3-4D（为SEQ ID No.30所示核苷酸序列）。

本发明中，在检测SMN1基因第7外显子时，为避免SMN2第7外显子对SMN1第7外显子的影响，除改良的扩增阻抗设计外，引入与SMN2完全匹配的竞争性封闭探针PE7-2A，该探针相对于SMN1第7外显子优先结合SMN2第7外显子，但3’端经终止修饰不扩增，同时将SMN1第7外显子检测反应特异性探针设计在公用引物P1之后而非SMN1基因第7外显子特异性引物之后，该探针仅与SMN1第7外显子特异性引物扩增产物结合，而不与SMN1和SMN2第7外显子结合，进一步避免了SMN2基因第7外显子对SMN1第7外显子检测结果的影响。依据与SMN1第7外显子检测引物探针相似的设计策略，在SMN1第8外显子检测反应中引入能够与SMN2第8外显子完全匹配的竞争性封闭探针PE8-2A，在SMN2第7外显子检测反应中引入能够与SMN1基因第7外显子完全匹配的竞争性封闭探针PE7-1A，在SMN2第8外显子检测反应中引入能够与SMN1基因第8外显子完全匹配的竞争性封闭探针PE8-1A。

本发明还涉及人运动神经元基因拷贝数相对定量检测试剂盒，包括：引物与探针容器1、引物与探针容器2、引物与探针容器3、引物与探针容器4、对照品容器1、对照品容器2、对照品容器3、对照品容器4、对照品容器5。其中：

引物与探针容器1含有下列引物与探针干粉或溶液：P1、P2、P3、P4、P5、PE7-1F、PE7-1R、PE7-1D、PE7-2A，设计浓度为10倍工作浓度。

引物与探针容器2含有下列引物与探针干粉或溶液：P1、P2、P3、P4、P5、PE8-1F、PE8-1R、PE8-1D、PE8-2A，设计浓度为10倍工作浓度。

引物与探针容器3含有下列引物与探针干粉或溶液：P1、P2、P3、P4、P5、PE7-2F、PE7-2R、PE7-2D、PE7-1A，设计浓度为10倍工作浓度。

引物与探针容器4含有下列引物与探针干粉或溶液：P1、P2、P3、P4、P5、PE8-2F、PE8-2R、PE8-2D、PE8-1A，设计浓度为10倍工作浓度。

引物与探针容器5含有下列引物与探针干粉或溶液：P1、P2、P3、P4、P5、P272-F、P11-F、PE6-R、P272-D、P272-A、P11-D、PE3-4F、PE3-4R、PE3-4D，设计浓度为10倍工作浓度。

对照品容器1含有第一PCR反应对照品CON1（SEQ IN No. 31所示核苷酸序列），为SMN1第7外显子与RPP40人工合成DNA序列溶液，二者拷贝数之比为1:2；浓度为3pg/μL；

对照品容器2含有第二PCR反应对照品CON2（SEQ IN No. 32所示核苷酸序列），为SMN1第8外显子与RPP40人工合成DNA序列溶液，二者拷贝数之比为1:2；浓度为3pg/μL；

对照品容器3含有第三PCR反应对照品CON3（SEQ IN No. 33所示核苷酸序列），为SMN2第7外显子与RPP40人工合成DNA序列溶液，二者拷贝数之比为1:2；浓度为3pg/μL；

对照品容器4含有第四PCR反应对照品CON4（SEQ IN No. 34所示核苷酸序列），为SMN2第8外显子与RPP40人工合成DNA序列溶液，二者拷贝数之比为1:2；浓度为3pg/μL；

对照品容器5含有第五PCR反应对照品CON5（SEQ IN No. 35所示核苷酸序列），各热点突变的突变后标准序列与RPP40人工合成DNA序列溶液，Y227C、11bp-DUP、4bp-DEL与RPP40基因拷贝数之比为1:1:1:1，浓度为1pg/μL。

本发明还涉及上述试剂盒，在人SMN1基因与SMN2基因第7外显子、第8外显子拷贝数相对定量检测与SMN1第6和第3外显子中三个热点突变检测中的使用方法。具体步骤如下：

（1）提取人细胞基因组DNA，紫外分光定量基因组DNA浓度为1?10ng/μL。

（2）对照品准备：将CON1、CON2、CON3、CON4均分别建立1:5:25三个浓度梯度备用。CON5不做梯度稀释。ddH₂O替代DNA作为阴性模板对照。

（3）多重PCR扩增：总反应体系为20μL，反应体系组成如下：

2×PCR缓冲液(含热启动Taq酶、dNTP等)         10μL

引物与探针组合物                                                   2μL

样本DNA模板                                                         4μL

ddH₂O                                                                        4μL

对于对照品反应，分别取1:5:25三个梯度稀释的对照品4μL替换样本DNA模板，对于不同的PCR反应应采用对应的对照品。阴性对照反应不加DNA模板，相应地，ddH₂O体积为8μL。

PCR条件如下：95℃10分钟启动后，95℃ 30秒、65℃ 60秒共10个循环，然后95℃ 30秒、60℃ 40秒共30个循环。

PCR反应在多通道实时荧光PCR仪上进行，每一循环实时采集FAM和HEX荧光信号。

（4）结果分析：

（A）第一至第四PCR反应结果分析的通用要求：a、各PCR反应对照品反应的1:5:25三个稀释度均取以2为底的对数，与对应的Ct值的相关系数应大于0.99；b、对照品反应与样本反应中，HEX通道Ct值均应小于或等于30；c、阴性对应品FAM通道和HEX通道Ct值均应大于35；d、计算对照品反应1:5:25三个稀释度中FAM通道与HEX通道Ct值之差，并取其平均值，计作ΔCt_ac；e、计算样本中FAM通道与HEX通道Ct值之差，计作ΔCt_s；f、计算ΔΔCt = ΔCt_s - Ct_ac；

（B）第五PCR反应结果分析要求：a、阴性对应品FAM通道和HEX通道Ct值均应大于35；b、阳性对照品FAM通道Ct值小于HEX通道Ct值，且均应小于30；c、样本中HEX通道Ct值小于30；

（C）第一PCR反应：

FAM通道无信号或ΔΔCt ≥ 0.8：SMN1基因第7外显子为0拷贝；

-0.5≤ ΔΔCt ≤ 0.5：SMN1基因第7外显子为1拷贝；

ΔΔCt ≤ -0.8：SMN1基因第7外显子为2拷贝；

（D）第二PCR反应：

FAM通道无信号或ΔΔCt ≥ 0.8：SMN1基因第8外显子为0拷贝；

-0.5 ≤ ΔΔCt ≤ 0.5：SMN1基因第8外显子为1拷贝；

ΔΔCt ≤ -0.8：SMN1基因第8外显子为2拷贝；

（E）第三PCR反应：

FAM通道无信号或ΔΔCt ≥ 0.8：SMN2基因第7外显子为0拷贝；

-0.5 ≤ ΔΔCt ≤ 0.5：SMN2基因第7外显子为1拷贝；

-1.5 ≤ ΔΔCt ≤ -0.8：SMN2基因第7外显子为2拷贝；

-2.5 ≤ ΔΔCt ≤ -1.8：SMN2基因第7外显子为3拷贝；

ΔΔCt ≤ -2.8：SMN2基因第7外显子不低于4拷贝；

（F）第四PCR反应：

FAM通道无信号或ΔΔCt≥0.8：SMN2基因第8外显子为0拷贝；

-0.5 ≤ ΔΔCt ≤ 0.5：SMN2基因第8外显子为1拷贝；

-1.5 ≤ ΔΔCt ≤ -0.8：SMN2基因第8外显子为2拷贝；

-2.5 ≤ ΔΔCt ≤ -1.8：SMN2基因第8外显子为3拷贝；

ΔΔCt ≤ -2.8：SMN2基因第8外显子不低于4拷贝；

（G）第五PCR反应：

仅做定性分析，在HEX通道Ct值均应小于或等于30的情况下，FAM通道Ct值大于或等于35提示所检测样本不存在Y272C、11bp-DUP、4bp-DEL，小于35提示存在上述1个或多个热点突变。

本发明的有益效果是：

（1）对SMN1第7外显子，在其特异性扩增阻抗引物设计中，除利用SMN1第7外显子特征性碱基C外，同时也利用了该位点上游第6内含子中的SMN1基因特异性碱基G，相对于传统的SMN1第7外显子扩增引物设计，可显著减少SMN2对SMN1第7外显子拷贝数定量结果的影响。同样地，对于SMN2第7外显子PCR反应中，这样的设计也可显著减少SMN1第7外显子对SMN2第7外显子拷贝数定量检测结果的影响。

（2）为进一步减少SMN1和SMN2在各自拷贝数定量检测中的相互影响，在检测SMN1基因第7、第8外显子PCR反应中分别引入了能够与SMN2第7外显子、第8外显子完全匹配的竞争性封闭探针，这些竞争性封闭探针可优先与SMN2相应序列结合，但其3’端均经终止修饰。同样地，在检测SMN2第7、第8外显子PCR反应中分别引入了能够与SMN1第7、第8外显子完全匹配的3’端终止修饰的竞争性封闭探针。

（3）在第－、第二、第三、第四PCR反应中，所有的检测探针均位于公用引物SEQ ID No.5之后而非靶特异性引物之后，即检测探针均仅在以相应特异性引物扩增产物为模板的PCR反应中产生信号，而不与起始的模板中SMN1或SMN2的任何序列结合，进一步减少了SMN1与SMN2之间的相互干扰。

（4）涵盖了SMN1第6外显子中的Y272C、11bp-DUP以及第3外显子中的4bp-DEL三个热点突变的定性检测，因而本发明对SMN1突变的覆盖率高于传统的仅检测SMN1第7和/或第8外显子缺失的方法。

（5）在第一、第二、第三、第四PCR反应，内参基因与目标位点均采用相同的公用引物进行扩增，保证了扩增效率的致性，进一步减少了扩增效率差异导致的相对定量结果的偏差。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，下列具体实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。

实施例1：DNA制备

临床诊断为SMA的患儿20例以及其父母，另外包括160名孕妇，在知情同意下按医疗常规采外周静脉血1ml，EDTA抗凝。采用QIAGEN公司的人外周血基因组抽提试剂盒抽提基因组DNA，洗脱体积为100微升，采用紫外分光定量仪定量，稀释基因组DNA浓度至5ng/μL。

实施例2：对照品梯度稀释

对照品容器1、对照品容器2、对照品容器3、对照品容器4中各取300μL分别加入4只2.0mL离心管，再加入ddH₂O 1200μL，混匀后分别得到4种5倍稀释对照品；在4种5倍稀释对照品溶液中，分别取300μL加入4只新的2.0mL离心管，再加入ddH₂O 1200μL，混匀后分别得到4种25倍稀释对照品。对照品容器5中的试剂不做梯度稀释，直接取用。

实施例3：PCR体系配制

按以下体系配制PCR反应体系（总反应体系为20μL）：

2×PCR缓冲液(含热启动Taq酶、dNTP等)         10μL

引物与探针组合物                                                   2μL

样本DNA模板                                                         4μL

ddH₂O                                                                        4μL

对于第一、第二、第三、第四和第五PCR反应，反应体系中的引物与探针组合物分别取自相应的引物与探针组合物容器。对照品均按独立样本进行检测，即以不同稀释度对照品代替反应体系中的样本DNA模板，对于不同的PCR反应采用对应的对照品。阴性对照反应不加DNA模板，相应地，ddH₂O体积为8μL。

实施例4：PCR反应

采用ABI 7500实时荧光PCR仪进行PCR反应。

PCR条件如下：95℃10分钟启动后，95℃ 30秒、65℃ 60秒共10个循环，然后95℃ 30秒、60℃ 40秒共30个循环。每一循环PCR仪实时采集FAM通道和HEX通道荧光信号。

实施例5：结果分析

第一、第二、第三、第四和第五PCR反应中的阴性对照Ct值均在35以上。相应PCR反应中，对照品3个稀释度取以2为底的对数，与对应的Ct值的相关系数应均大于0.99。对照品反应与样本反应中，HEX通道Ct值均应小于或等于30，实验结果满足数据分析通用要求。

SMN1、SMN2第7和第8外显子拷贝数相对定量检测结果：

20例SMA患儿检测结果见表2，在SMN1检测中，有14例SMN1第7外显子和第8外显子同时完全缺失（拷贝数均为0），4例仅第7外显子完全缺失（拷贝数为0）、第8外显子无缺失（拷贝数为2），1例仅第8外显子完全缺失（拷贝数为0）、第7外显子无缺失（拷贝数为2），1例第7外显子和第8外显子均提示单拷贝缺失（拷贝数均为1），检测其父为第7外显子单拷贝缺失（拷贝数为1）、第8外显子正常（拷贝数为2），其母为第7外显子正常（拷贝数为2）而第8外显子单拷贝缺失（拷贝数为1）。20例SMA患儿父母的检测结果见表3。20例SMA患儿检测结果与其父母检测结果吻合常染色体隐性遗传规律。160名孕妇的检测结果见表4。

第五PCR反应结果：本组样本中未出SMN1第6外显子Y272C、11bp-DUP和第3外显子4bp-DEL突变样本。

表2、 20例SMA患儿检测结果（例数）

表3、 20例SMA患儿父母检测结果（例数）

表4、 160例孕妇外周血检测结果（例数）

。

实施例6：结果验证

采用荷兰MRC公司的P060 SMA probemix 100rxn检测试剂盒（技术原理为MLPA，Cat. No. P060-100R，）对检测结果进行验证。操作按试剂盒说明书进行。产物采用ABI 3500遗传分析仪进行检测。

20例SMA患儿、20例SMA患儿父母以及160名孕妇检测结果与本发明试剂盒检测结果一致率100%。

本发明通过上述引物对和Taqman MGB探针组合物可以实现SMN1与SMN2基因第7和第8外显子的相对拷贝数定量，同时可以对SMN1基因第6外显子和第3外显子上共三个热点突变进行定性检测。

本发明提出的引物与探针组合物中，目标基因和内参基因Taqman MGB探针分别用FAM和HEX标记，显然可以选用其它合适荧光标记。在对SMN1和SMN2第7和第8外显子进行拷贝数相对定量时，单拷贝内参基因仅仅是作为拷贝数相对定量的内参标记，显然选择其它的单拷贝内参基因并不影响目的基因的拷贝数相对定量结果。

本发明提出的引物与探针组合物，其工作浓度已依据相应的PCR缓冲液及PCR循环参数进行优化。显然依据其它合适的PCR缓冲液及PCR循环参数同样可以获得理想的目的基因拷贝数相对定量检测结果。另外，更改引物与探针组合物的储存液浓度并不影响本发明的性质。

本发明所提出的一种运动神经元基因拷贝数相对定量试剂盒及其应用可在具有定量PCR仪的实验室稳定实施，检测时间为2-3小时，5个独立的PCR反应均闭管操作，可避免高浓度PCR产物模板的的污染风险。

因此，本发明所提供的试剂可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于检测，具备产业化推广的条件。

综上所述，本发明所提出的一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测试剂盒及其应用，设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，适于大规模推广应用。

本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，本说明书被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110>  上海五色石医学研究有限公司

<120>  一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒

<160>  35

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(22)

<223>  公用上游引物

<400>  1

ccatctcatc  cctgcgtgtc  tc  22

 

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(23)

<223>  公用下游引物

<400>  2

cctctctatg  ggcagtcggt  gat     23

 

<210>  3

<211>  57

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(57)

<223>  内参基因RPP40的PCR反应上游引物

<400>  3

ccatctcatc  cctgcgtgtc  tcgtagacta  gagttcctct  gacgttttgt  tctacct     57

 

<210>  4

<211>  47

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(47)

<223>  内参基因RPP40的PCR反应下游引物

<400>  4

cctctctatg  ggcagtcggt  gatagtgggt  aaactgagtg  ggaagat     47

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(21)

<223>  内参基因RPP40检测探针，5’端HEX标记，3’端MGB标记

<400>  5

tagactagag  ttcctctgac  g   21

 

<210>  6

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(59)

<223>  SMN1第7外显子PCR反应上游引物

<400>  6

cctctctatg  ggcagtcggt  gatcatccat  ataaagctat  ctatatatag  ctatctgtg   59

  

<210>  7

<211>  64

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(64)

<223>  SMN1第7外显子PCR反应下游引物

<400>  7

ccatctcatc  cctgcgtgtc  tcacgtagac  tagacgctcc  cttccttctt  tttgattttg  60

tgtg    64

 

<210>  8

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(17)

<223>  SMN1基因第7外显子检测探针，5’端FAM标记，3’端MGB标记

<400>  8

actagacgct  cccttcc     17

 

<210>  9

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(27)

<223>  用于第一PCR反应的SMN2基因第7外显子探针，3’端MGB标记

<400>  9

gctatctata  tatagctatc  tatatct 27

 

<210>  10

<211>  63

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(63)

<223>  SMN1基因第8外显子PCR反应上游引物

<400>  10

ccatctcatc  cctgcgtgtc  tcacgtagac  tagacgctcg  acaaaccatc  tgtaaaagac  60

ggg     63

 

<210>  11

<211>  51

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(51)

<223>  SMN1基因第8外显子PCR反应下游引物

<400>  11

cctctctatg  ggcagtcggt  gatctaatcc  acattcaaat  tttctcaagt  g   51

 

<210>  12

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(21)

<223>  SMN1基因第8外显子检测探针，5’端FAM标记，3’端MGB标记

<400>  12

cgtagactag  acgctcgaca  a   21

 

<210>  13

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(20)

<223>  用于第二PCR反应的SMN2基因第8外显子探针，3’端MGB标记

<400>  13

ccatctgtaa  aagactgagg  20

 

<210>  14

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(59)

<223>  SMN2第7外显子PCR反应上游引物

<400>  14

cctctctatg  ggcagtcggt  gatcatccat  ataaagctat  ctatatatag  ctatctgta   59

 

<210>  15

<211>  64

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(64)

<223>  SMN2第7外显子PCR反应下游引物

<400>  15

ccatctcatc  cctgcgtgtc  tcacgtagac  tagacgctcc  cgtccttctt  tttgattttg  60

tgta    64

 

<210>  16

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(17)

<223>  SMN2基因第7外显子检测探针，5’端FAM标记，3’端MGB标记

<400>  16

actagacgct  cccgtcc     17

 

<210>  17

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(27)

<223>  用于第三PCR反应的SMN1基因第7外显子探针，3’端MGB标记

<400>  17

gctatctata  tatagctatc  tatgtct     27

 

<210>  18

<211>  63

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(63)

<223>  SMN2基因第8外显子PCR反应上游引物

<400>  18

ccatctcatc  cctgcgtgtc  tcacgtagac  tagacgctcg  agaaaccatc  tgtaaaagac  60

gga     63

 

<210>  19

<211>  51

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(51)

<223>  SMN2基因第8外显子PCR反应下游引物

<400>  19

cctctctatg  ggcagtcggt  gatctaatcc  acattcaaat  tttctcaagt  g   51

 

<210>  20

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(21)

<223>  SMN2基因第8外显子检测探针，5’端FAM标记，3’端MGB标记

<400>  20

cgtagactag  acgctcgaga  a   21

 

<210>  21

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(19)

<223>  用于第四PCR反应的SMN1基因第8外显子探针，3’端MGB标记

<400>  21

ccatctgtaa  aagactggg   19

 

<210>  22

<211>  57

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(57)

<223>  SMN1基因第6外显子Y272C上游PCR引物

<400>  22

ccatctcatc  cctgcgtgtc  tcgtagacta  gataatttca  tggtacatga  gtgggtg 57

 

<210>  23

<211>  53

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(53)

<223>  SMN1基因第6外显子11bp-DUP上游PCR引物

<400>  23

ccatctcatc  cctgcgtgtc  tcgtagacta  gaatgctgat  gctttgctga  tgc 53

 

<210>  24

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(50)

<223>  SMN1基因第6外显子下游PCR引物

<400>  24

cctctctatg  ggcagtcggt  gatgaaaaga  tgctgagtga  ttacttacca  50

 

<210>  25

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(26)

<223>  SMN1基因第6外显子Y272C检测探针，5’端FAM标记，3’端MGB标记

<400>  25

tagactagat  aatttcatgg  tacatg  26

 

<210>  26

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(18)

<223>  SMN1基因第6外显子Y272C竞争探针，3’端MGB标记

<400>  26

ccagtatgaa  agccactc    18

 

<210>  27

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(20)

<223>  SMN1基因第6外显子11bp-DUP检测探针，5’端FAM标记，3’端MGB标记

<400>  27

tagactagaa  tgctgatgct  20

 

<210>  28

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(59)

<223>  SMN1基因第3外显子4bp-DEL上游引物

<400>  28

ccatctcatc  cctgcgtgtc  tcgtagacta  gaggtttaca  ctggatatgg  aaataggag   59

 

<210>  29

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(45)

<223>  SMN1基因第3外显子4bp-DEL下游引物

<400>  29

cctctctatg  ggcagtcggt  gattggggaa  agtagatcgg  acaga   45

 

<210>  30

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(22)

<223>  SMN1基因第3外显子4bp-DEL检测探针，5’端FAM标记，3’端MGB标记

<400>  30

tagactagag  gtttacactg  ga  22

 

<210>  31

<211>  618

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(618)

<223>  第一PCR反应对照品，SMN1基因第7外显子与RPP40基因拷贝数之比为1:2

<400>  31

aagcttaagg  gcaggggaag  aagggagtcc  cagctccaag  ggacagcgaa  ttcactgttc  60

ctctgacgtt  ttgttctacc  tggggcccta  gccgggtaga  tggtgccacc  cacagtgagg  120

gcagatcttc  ccactcagtt  tacccactca  cctgccagtc  tcctccagaa  acaccctcac  180

agacacacct  agaaataaaa  gcttaagggc  aggggaagaa  gggagtccca  gctccaaggg  240

acagcgaatt  cactgttcct  ctgacgtttt  gttctacctg  gggccctagc  cgggtagatg  300

gtgccaccca  cagtgaggga  tccagatctt  cccactcagt  ttacccactc  acctgccagt  360

ctcctccaga  aacaccctca  cagacacacc  tagaaataaa  agctttgttg  aataaaataa  420

gtaaaatgtc  ttgtgaaaca  aaatgctttt  taacatccat  ataaagctat  ctatatatag  480

ctatctatgt  ctatatagct  atttttttta  acttccttta  ttttccttac  agggtttcag  540

acaaaatcaa  aaagaaggaa  ggtgctcaca  ttccttaaat  taaggagtaa  gtctgccagc  600

attatgaaag  tgaagctt    618

 

<210>  32

<211>  615

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(615)

<223>  第二PCR反应对照品，SMN1基因第8外显子与RPP40基因拷贝数之比为1:2

<400>  32

aagcttaagg  gcaggggaag  aagggagtcc  cagctccaag  ggacagcgaa  ttcactgttc   60

ctctgacgtt  ttgttctacc  tggggcccta  gccgggtaga  tggtgccacc  cacagtgagg  120

gcagatcttc  ccactcagtt  tacccactca  cctgccagtc  tcctccagaa  acaccctcac  180

agacacacct  agaaataaaa  gcttaagggc  aggggaagaa  gggagtccca  gctccaaggg  240

acagcgaatt  cactgttcct  ctgacgtttt  gttctacctg  gggccctagc  cgggtagatg  300

gtgccaccca  cagtgaggga  tccagatctt  cccactcagt  ttacccactc  acctgccagt  360

ctcctccaga  aacaccctca  cagacacacc  tagaaataaa  agcttttgat  taaaagttat  420

gtaataacca  aatgcaatgt  gaaatatttt  actggactct  attttgaaaa  accatctgta  480

aaagactggg  gtgggggtgg  gaggccagca  cggtggtgag  gcagttgaga  aaatttgaat  540

gtggattaga  ttttgaatga  tattggataa  ttattggtaa  ttttatgagc  tgtgagaagg  600

gtgttgtaga  agctt   615

 

<210>  33

<211>  618

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(618)

<223>  第三PCR反应对照品，SMN2基因第7外显子与RPP40基因拷贝数之比为1:2

<400>  33

aagcttaagg  gcaggggaag  aagggagtcc  cagctccaag  ggacagcgaa  ttcactgttc  60

ctctgacgtt  ttgttctacc  tggggcccta  gccgggtaga  tggtgccacc  cacagtgagg  120

gcagatcttc  ccactcagtt  tacccactca  cctgccagtc  tcctccagaa  acaccctcac  180

agacacacct  agaaataaaa  gcttaagggc  aggggaagaa  gggagtccca  gctccaaggg  240

acagcgaatt  cactgttcct  ctgacgtttt  gttctacctg  gggccctagc  cgggtagatg  300

gtgccaccca  cagtgaggga  tccagatctt  cccactcagt  ttacccactc  acctgccagt  360

ctcctccaga  aacaccctca  cagacacacc  tagaaataaa  agctttgttg  aataaaataa  420

gtaaaatgtc  ttgtgaaaca  aaatgctttt  taacatccat  ataaagctat  ctatatatag  480

ctatctatat  ctatatagct  atttttttta  acttccttta  ttttccttac  agggttttag  540

acaaaatcaa  aaagaaggaa  ggtgctcaca  ttccttaaat  taaggagtaa  gtctgccagc  600

attatgaaag  tgaagctt    618

 

<210>  34

<211>  615

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(615)

<223>  第四PCR反应对照品，SMN2基因第8外显子与RPP40基因拷贝数之比为1:2

<400>  34

aagcttaagg  gcaggggaag  aagggagtcc  cagctccaag  ggacagcgaa  ttcactgttc  60

ctctgacgtt  ttgttctacc  tggggcccta  gccgggtaga  tggtgccacc  cacagtgagg  120

gcagatcttc  ccactcagtt  tacccactca  cctgccagtc  tcctccagaa  acaccctcac  180

agacacacct  agaaataaaa  gcttaagggc  aggggaagaa  gggagtccca  gctccaaggg  240

acagcgaatt  cactgttcct  ctgacgtttt  gttctacctg  gggccctagc  cgggtagatg  300

gtgccaccca  cagtgaggga  tccagatctt  cccactcagt  ttacccactc  acctgccagt  360

ctcctccaga  aacaccctca  cagacacacc  tagaaataaa  agcttttgat  taaaagttat  420

gtaataacca  aatgcaatgt  gaaatatttt  actggactct  attttgaaaa  accatctgta  480

aaagactgag  gtgggggtgg  gaggccagca  cggtggtgag  gcagttgaga  aaatttgaat  540

gtggattaga  ttttgaatga  tattggataa  ttattggtaa  ttttatgagc  tgtgagaagg  600

gtgttgtaga  agctt   615

 

<210>  35

<211>  610

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(610)

<223>  第五PCR反应对照品，SMN1基因第6外显子Y272C、11bp-DUP、第3外显子4bp-DEL、RPP40基因拷贝数之比为1:1:1:1

<400>  35

aagcttaagg  gcaggggaag  aagggagtcc  cagctccaag  ggacagcgaa  ttcactgttc  60

ctctgacgtt  ttgttctacc  tggggcccta  gccgggtaga  tggtgccacc  cacagtgagg  120

gcagatcttc  ccactcagtt  tacccactca  cctgccagtc  tcctccagaa  acaccctcac  180

agacacacct  agaaataaaa  gcttgtttac  tggatataaa  caatatcttt  ttctgtctcc  240

agataattcc  cccaccacct  cccatatgtc  cagattctct  tgatgatgct  gatgctttgc  300

tgatgctttg  ggaagtatgt  taatttcatg  gtacatgagt  ggctgtcata  ctggctatta  360

tatggtaagt  aatcactcag  catcttttcc  tgacaattaa  gctttgggga  caaatgttct  420

gccatttggt  cagaagacgg  ttgcatttac  ccagctacca  ttgcttcaat  tgattttaag  480

agagaaacct  gtgttgtggt  ttacactgga  tatggaaata  ggagcaaaat  ctgtccgatc  540

tactttcccc  aatctgtgaa  gtagctaata  atatagaaca  aaatgctcaa  gaggtaagga  600

tacaaagctt  610

Claims (8)

1.一种人运动神经元拷贝数相对定量检测方法，其特征在于：是采用四个PCR反应分别对SMN1基因第7和第8外显子、SMN2基因第7和第8外显子进行拷贝数相对定量检测，并采用第五PCR反应对SMN1第6和第3外显子上三个热点突变进行定性检测，其中：

（1）第一PCR反应，是针对SMN1基因第7外显子的相对定量检测PCR反应；采用如下引物与探针：

公用上游引物P1、公用引物P2、RPP40上游引物P3、RPP40下游引物P4、RPP40检测探针P5、SMN1第7外显子上游引物PE7-1F、SMN1第7外显子下游引物PE7-1R、SMN1第7外显子检测探针PE7-1D、SMN2第7外显子封闭探针PE7-2A；

（2）第二PCR反应，是针对SMN1基因第8外显子的相对定量检测PCR反应，采用如下引物与探针：

公用上游引物P1、公用引物P2、RPP40上游引物P3、RPP40下游引物P4、RPP40检测探针P5、SMN1第8外显子上游引物PE8-1F、SMN1第8外显子下游引物PE8-1R、SMN1第8外显子检测探针PE8-1D、SMN2第8外显子封闭探针PE8-2A；

（3）第三PCR反应，是针对SMN2基因第7外显子的相对定量检测PCR反应；采用如下引物与探针：

公用上游引物P1、公用引物P2、RPP40上游引物P3、RPP40下游引物P4、RPP40检测探针P5、SMN2第7外显子上游引物PE7-2F、SMN2第7外显子下游引物PE7-2R、SMN2第7外显子检测探针PE7-2D、SMN1第7外显子封闭探针PE7-1A；

（4）第四PCR反应，是针对SMN2基因第8外显子的相对定量检测PCR反应；采用如下引物与探针：

公用上游引物P1、公用引物P2、RPP40上游引物P3、RPP40下游引物P4、RPP40检测探针P5、SMN2第8外显子上游引物PE8-2F、SMN2第8外显子下游引物PE8-2R、SMN2第8外显子检测探针PE8-2D、SMN1第8外显子封闭探针PE8-1A；

（5）第五PCR反应，是针对SMN1第6外显子和第3外显子3个热点突变检测的反应，采用如下引物与探针：

公用上游引物P1、公用引物P2、RPP40上游引物P3、RPP40下游引物P4、RPP40检测探针P5、SMN1第6外显子Y272C上游引物P272-F、SMN1第6外显子11bp-DUP上游引物P11-F、SMN1第6外显子下游引物PE6-R、SMN1第6外显子Y272C检测探针P272-D、SMN1第6外显子Y272C竞争探针P272-A、SMN1第6外显子11bp-DUP检测探针P11-D、SMN1第3外显子4bp-DEL上游引物PE3-4F、SMN1第3外显子4bp-DEL下游引物PE3-4R、SMN1第3外显子4bp-DEL检测探针PE3-4D；

其中，引物与探针所对应的核苷酸序列与修饰特征如下表

。

2.根据权利要求1所述的人运动神经元拷贝数相对定量检测方法，其特征在于：

（1）第一PCR反应中， P1、P2、P3、P4、P5、PE7-1F、PE7-1R、PE7-1D、PE7-2A工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L；

（2）第二PCR反应中， P1、P2、P3、P4、P5、PE8-1F、PE8-1R、PE8-1D、PE8-2A工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L；

（3）第三PCR反应中， P1、P2、P3、P4、P5、PE7-2F、PE7-2R、PE7-2D、PE7-1A工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L；

（4）第四PCR反应中， P1、P2、P3、P4、P5、PE8-2F、PE8-2R、PE8-2D、PE8-1A工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L；

（5）第五PCR反应中， P1、P2、P3、P4、P5、P272-F、P11-F、PE6-R、P272-D、P272-A、P11-D、PE3-4F、PE3-4R、PE3-4D工作浓度范围依次为：500?700nmol/L、500?700nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、20?40nmol/L、20?40nmol/L、40?60nmol/L、100?200nmol/L、50?100nmol/L、100?200nmol/L、20?40nmol/L、20?40nmol/L、100?200nmol/L。

3.一种用于如权利要求1所述的人运动神经元拷贝数相对定量检测方法的引物与探针组合物，其特征在于包括：

公用引物与探针组合物：公用上游引物P1、公用引物P2、RPP40上游引物P3、RPP40下游引物P4、RPP40检测探针P5；其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示；

用于检测SMN1基因第7外显子的上游引物PE7-1F、下游引物PE7-1R、检测探针PE7-1D、封闭探针PE7-2A组合物；其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9所示；

用于检测SMN1第8外显子的上游引物PE8-1F、下游引物PE8-1R、检测探针PE8-1D、SMN2第8外显子封闭探针PE8-2A组合物；其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13所示；

用于检测SMN2第7外显子的上游引物PE7-2F、下游引物PE7-2R、检测探针PE7-2D、封闭探针PE7-1A组合物；其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17所示；

用于检测SMN2第8外显子的上游引物PE8-2F、下游引物PE8-2R、检测探针PE8-2D、封闭探针PE8-1A组合物；其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21所示。

4.根据权利要求3所述的引物与探针组合物，其特征在于还包括下述引物与探针组合物：

用于检测SMN1第6外显子和第3外显子3个热点突变的， SMN1第6外显子Y272C上游引物P272-F、SMN1第6外显子11bp-DUP上游引物P11-F、SMN1第6外显子下游引物PE6-R、SMN1第6外显子Y272C检测探针P272-D、SMN1第6外显子Y272C竞争探针P272-A、SMN1第6外显子11bp-DUP检测探针P11-D、SMN1第3外显子4bp-DEL上游引物PE3-4F、SMN1第3外显子4bp-DEL下游引物PE3-4R、SMN1第3外显子4bp-DEL检测探针PE3-4D；其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30。

5.一种人运动神经元拷贝数相对定量检测试剂盒，其特征在于，包括：第一引物与探针容器、第二引物与探针容器、第三引物与探针容器、第四引物与探针容器、第五引物与探针容器、第一对照品容器、第二对照品容器、第三对照品容器、第四对照品容器、第五对照品容器；其中：

第一引物与探针容器内含有用于SMN1基因第7外显子拷贝数相对定量检测的PCR引物与探针：公用上游引物P1、公用引物P2、RPP40上游引物P3、RPP40下游引物P4、RPP40检测探针P5、SMN1第7外显子上游引物PE7-1F、SMN1第7外显子下游引物PE7-1R、SMN1第7外显子检测探针PE7-1D、SMN2第7外显子封闭探针PE7-2A；

第二引物与探针容器内含有用于SMN1基因第8外显子拷贝数相对定量检测的PCR引物与探针：公用上游引物P1、公用引物P2、RPP40上游引物P3、RPP40下游引物P4、RPP40检测探针P5、SMN1第8外显子上游引物PE8-1F、SMN1第8外显子下游引物PE8-1R、SMN1第8外显子检测探针PE8-1D、SMN2第8外显子封闭探针PE8-2A；

第三引物与探针容器内含有用于SMN2基因第7外显子拷贝数相对定量检测的PCR引物与探针：公用上游引物P1、公用引物P2、RPP40上游引物P3、RPP40下游引物P4、RPP40检测探针P5、SMN2第7外显子上游引物PE7-2F、SMN2第7外显子下游引物PE7-2R、SMN2第7外显子检测探针PE7-2D、SMN1第7外显子封闭探针PE7-1A；

第四引物与探针容器内含用于有SMN2基因第8外显子拷贝数相对定量检测的PCR引物与探针：公用上游引物P1、公用引物P2、RPP40上游引物P3、RPP40下游引物P4、RPP40检测探针P5、SMN2第8外显子上游引物PE8-2F、SMN2第8外显子下游引物PE8-2R、SMN2第8外显子检测探针PE8-2D、SMN1第8外显子封闭探针PE8-1A；

第五引物与探针容器内含有用于SMN1第6外显子和第3外显子热点突变检测的PCR引物与探针：公用上游引物P1、公用引物P2、RPP40上游引物P3、RPP40下游引物P4、RPP40检测探针P5、SMN1第6外显子Y272C上游引物P272-F、SMN1第6外显子11bp-DUP上游引物P11-F、SMN1第6外显子下游引物PE6-R、SMN1第6外显子Y272C检测探针P272-D、SMN1第6外显子Y272C竞争探针P272-A、SMN1第6外显子11bp-DUP检测探针P11-D、SMN1第3外显子4bp-DEL上游引物PE3-4F、SMN1第3外显子4bp-DEL下游引物PE3-4R、SMN1第3外显子4bp-DEL检测探针PE3-4D；

第一对照品容器含有SMN1第7外显子与RPP40人工合成DNA序列，即第一PCR反应对照品CON1，其核苷酸序列为SEQ IN No. 31所示；

第二对照品容器2含有SMN1第8外显子与RPP40人工合成DNA序列，即第二PCR反应对照品CON2，其核苷酸序列为SEQ IN No. 32所示；

第三对照品容器3含有SMN2第7外显子与RPP40人工合成DNA序列，即第三PCR反应对照品CON3，其核苷酸序列为SEQ IN No. 33所示；

第四对照品容器4含有SMN2第8外显子与RPP40人工合成DNA序列，即第四PCR反应对照品CON4，其核苷酸序列为SEQ IN No. 34所示；

第五对照品容器5含有Y272C、11bp-DUP、4bp-DEL等3个热点突变标准序列与RPP40人工合成DNA序列，即第五PCR反应对照品CON5，其核苷酸序列为SEQ IN No. 35所示；

其中，引物与探针所对应的核苷酸序列与修饰特征如下表

引物名称 SEQ ID No. 核苷酸序列(5`-3`)与修饰特征 P1 SEQ ID No.1 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTC P2 SEQ ID No.2 CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT P3 SEQ ID No.3 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCGTAGACTAGAGTTCCTCTGACGTTTTGTTCTACCT P4 SEQ ID No.4 CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATAGTGGGTAAACTGAGTGGGAAGAT P5 SEQ ID No.5 HEX-TAGACTAGAGTTCCTCTGACG-MGB PE7-1F SEQ ID No.6 CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATCATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTGTG PE7-1R SEQ ID No.7 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCACGTAGACTAGACGCTCCCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTGTG PE7-1D SEQ ID No.8 FAM-ACTAGACGCTCCCTTCC-MGB PE7-2A SEQ ID No.9 GCTATCTATATATAGCTATCTATATCT-MGB PE8-1F SEQ ID No.10 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCACGTAGACTAGACGCTCGACAAACCATCTGTAAAAGACGGG PE8-1R SEQ ID No.11 CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATCTAATCCACATTCAAATTTTCTCAAGTG PE8-1D SEQ ID No.12 FAM-CGTAGACTAGACGCTCGACAA-MGB PE8-2A SEQ ID No.13 CCATCTGTAAAAGACTGAGG-MGB PE7-2F SEQ ID No.14 CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATCATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTGTA PE7-2R SEQ ID No.15 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCACGTAGACTAGACGCTCCCGTCCTTCTTTTTGATTTTGTGTA PE7-2D SEQ ID No.16 FAM-ACTAGACGCTCCCGTCC-MGB PE7-1A SEQ ID No.17 GCTATCTATATATAGCTATCTATGTCT-MGB PE8-2F SEQ ID No.18 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCACGTAGACTAGACGCTCGAGAAACCATCTGTAAAAGACGGA PE8-2R SEQ ID No.19 CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATCTAATCCACATTCAAATTTTCTCAAGTG PE8-2D SEQ ID No.20 FAM-CGTAGACTAGACGCTCGAGAA-MGB PE8-1A SEQ ID No.21 CCATCTGTAAAAGACTGGG-MGB P272-F SEQ ID No.22 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCGTAGACTAGATAATTTCATGGTACATGAGTGGGTG P11-F SEQ ID No.23 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCGTAGACTAGAATGCTGATGCTTTGCTGATGC PE6-R SEQ ID No.24 CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATGAAAAGATGCTGAGTGATTACTTACCA P272-D SEQ ID No.25 FAM-TAGACTAGATAATTTCATGGTACATG-MGB P272-A SEQ ID No.26 CCAGTATGAAAGCCACTC-MGB P11-D SEQ ID No.27 FAM-TAGACTAGAATGCTGATGCT-MGB PE3-4F SEQ ID No.28 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCGTAGACTAGAGGTTTACACTGGATATGGAAATAGGAG PE3-4R SEQ ID No.29 CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATTGGGGAAAGTAGATCGGACAGA PE3-4D SEQ ID No.30 FAM-TAGACTAGAGGTTTACACTGGA-MGB

。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于包括5个多重PCR反应：

第一PCR反应包括P1、P2、P3、P4、P5、PE7-1F、PE7-1R、PE7-1D、PE7-2A，其工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L；

第二PCR反应包括P1、P2、P3、P4、P5、PE8-1F、PE8-1R、PE8-1D、PE8-2A，其工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L；

第三PCR反应包括P1、P2、P3、P4、P5、PE7-2F、PE7-2R、PE7-2D、PE7-1A，其工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L；

第四PCR反应包括P1、P2、P3、P4、P5、PE8-2F、PE8-2R、PE8-2D、PE8-1A，其工作浓度范围依次为：300?600nmol/L、300?600nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、30?60nmol/L、30?60nmol/L、100?200nmol/L、100?400nmol/L；

第五PCR反应包括P1、P2、P3、P4、P5、P272-F、P11-F、PE6-R、P272-D、P272-A、P11-D、PE3-4F、PE3-4R、PE3-4D，其工作浓度范围依次为：500?700nmol/L、500?700nmol/L、20?60nmol/L、20?60nmol/L、100?200nmol/L、20?40nmol/L、20?40nmol/L、40?60nmol/L、100?200nmol/L、50?100nmol/L、100?200nmol/L、20?40nmol/L、20?40nmol/L、100?200nmol/L。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：第一PCR反应对照品CON1中SMN1基因第7外显子与RPP40基因拷贝数之比为1:2；第二PCR反应对照品CON2中SMN1第8外显子与RPP40基因拷贝数之比为1:2；第三PCR反应对照品CON3中SMN2基因第7外显子与RPP40基因拷贝数之比为1:2；第四PCR反应对照品CON4中SMN2基因第8外显子与RPP40基因拷贝数之比为1:2；第五PCR反应对照品CON5中Y272C、11bp-DUP、4bp-DEL与RPP40基因拷贝数之比为1:1:1:1。

8.一种如权利要求5所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于具体步骤如下：

（一）提取人细胞基因组DNA，紫外分光定量基因组DNA浓度为1?10ng/μL；

（二）对照品准备：将CON1、CON2、CON3、CON4所示对照品均分别建立1:5:25三个浓度梯度备用，CON5所示对照品不做梯度稀释；ddH₂O替代DNA作为阴性模板对照；

（三）多重PCR扩增：总反应体系为20μL，反应体系组成如下：

2×PCR缓冲液，含热启动Taq酶、dNTP                10μL

引物探针组合物                                                               2μL

样本DNA模板                                                          4μL

ddH₂O                                                                         4μL

对于对照品反应，分别取1:5:25三个梯度稀释的对照品4μL替换样本DNA模板，对于不同的PCR反应采用对应的对照品；第五PCR反应为定性反应，不做梯度稀释；阴性对照反应采用ddH₂O替换样本DNA模板；

PCR反应在多通道实时荧光PCR仪上进行，每一循环实时采集FAM和HEX荧光信号；

（四）结果分析：

（1）第一至第四PCR反应结果分析的通用要求：a、各PCR反应对照品反应的1:5:25三个稀释度均取以2为底的对数，与对应的Ct值的相关系数应大于0.99；b、对照品反应与样本反应中，HEX通道Ct值均应小于或等于30；c、阴性对应品FAM通道和HEX通道Ct值均应大于35；d、计算对照品反应1:5:25三个稀释度中FAM通道与HEX通道Ct值之差，并取其平均值，计作ΔCt_ac；e、计算样本中FAM通道与HEX通道Ct值之差，计作ΔCt_s；f、计算ΔΔCt=ΔCt_s - Ct_ac；

（2）第五PCR反应结果分析要求：a、阴性对应品FAM通道和HEX通道Ct值均应大于35；b、阳性对照品FAM通道Ct值小于HEX通道Ct值，且均应小于30；c、样本中HEX通道Ct值小于30；

（3）第一PCR反应：

FAM通道无信号或ΔΔCt ≥ 0.8：SMN1基因第7外显子为0拷贝；

-0.5≤ ΔΔCt ≤0.5：SMN1基因第7外显子为1拷贝；

ΔΔCt ≤ - 0.8：SMN1基因第7外显子为2拷贝；

（4）第二PCR反应：

FAM通道无信号或ΔΔCt ≥ 0.8：SMN1基因第8外显子为0拷贝；

-0.5 ≤ ΔΔCt ≤ 0.5：SMN1基因第8外显子为1拷贝；

ΔΔCt ≤ - 0.8：SMN1基因第8外显子为2拷贝；

（5）第三PCR反应：

FAM通道无信号或ΔΔCt ≥ 0.8：SMN2基因第7外显子为0拷贝；

-0.5 ≤ ΔΔCt ≤ 0.5：SMN2基因第7外显子为1拷贝；

-1.5 ≤ ΔΔCt ≤ -0.8：SMN2基因第7外显子为2拷贝；

-2.5 ≤ ΔΔCt ≤ -1.8：SMN2基因第7外显子为3拷贝；

ΔΔCt ≤ -2.8：SMN2基因第7外显子不低于4拷贝；

（6）第四PCR反应：

FAM通道无信号或ΔΔCt ≥ 0.8：SMN2基因第8外显子为0拷贝；

-0.5 ≤ ΔΔCt ≤ 0.5：SMN2基因第8外显子为1拷贝；

-1.5 ≤ ΔΔCt ≤ -0.8：SMN2基因第8外显子为2拷贝；

-2.5 ≤ ΔΔCt ≤ -1.8：SMN2基因第8外显子为3拷贝；

ΔΔCt ≤ -2.8：SMN2基因第8外显子不低于4拷贝；

（7）第五PCR反应：

仅做定性分析，在HEX通道Ct值均应小于或等于30的情况下，FAM通道Ct值大于或等于35提示所检测样本不存在Y272C、11bp-DUP、4bp-DEL，小于35提示存在上述1个或多个热点突变。