CN108642172A - 人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量pcr试剂盒 Download PDF

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CN108642172A CN201810480117.2A CN201810480117A CN108642172A CN 108642172 A CN108642172 A CN 108642172A CN 201810480117 A CN201810480117 A CN 201810480117A CN 108642172 A CN108642172 A CN 108642172A
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方月
曾骥孟
龚剑
唐乃平
蒙明慧
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开一种人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒采用Taqman探针的荧光定量PCR法。该试剂盒分别设计了SMN1基因第7和第8外显子，以及内参基因RPP40的特异性引物和探针。本试剂盒可以直观、准确、快速地对SMN1基因的第7和第8外显子进行检测，从而实现SMA正常人和患者的区分，作为人类脊髓性肌萎缩症的辅助诊断，适合推广应用。

Description

人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试 剂盒
技术领域
本发明涉及分子检测领域，是一种用于检测人类脊髓性肌萎缩症SMN1基因第7和第8外显子缺失检测的引物探针组、试剂盒及方法。
背景技术
脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）是常见的染色体隐性遗传病，脊髓前角细胞变性导致肌无力和肌萎缩，临床表现为进行性、对称性的四肢和躯干肌肉无力、萎缩，患者最终死于呼吸衰竭和肺部感染，居致死性常染色体遗传病第二位。该病在新生婴儿中的发病率约1/6000至1/10000，正常人群的携带率约1/40至1/50。根据患者的发病年龄和病情症状将SMA分为急性婴儿型（Ⅰ型）、慢性婴儿型（Ⅱ型）、少年型（Ⅲ型）、成人型（Ⅳ型）。Ⅰ型是SMA中最严重的一种，通常在出生后6个月内发病，患儿不能独坐和站立，多数患儿在2岁前死亡。Ⅱ型患儿中等严重程度，出生后6~18个月内发病，患儿能独坐，但不能独自站立和行走，其生命一般在2年以上。Ⅲ型患者是慢性SMA，病情较轻，一般18岁内发病，可以独立行走，但比健康儿童晚且不能跑，可存活至成年。Ⅳ型患者的发病年龄约37岁，病情较轻，基本不影响生存。
研究发现，该病的主要致病基因是运动神经元存活基因1（survival motorneuron, SMN1），定位于5号染色体长臂1区3带。SMN基因在全身组织中普遍表达，大部分细胞可以耐受低水平的SMN蛋白，但脊髓前角细胞（脊髓运动神经元）无法耐受低水平的SMN蛋白。90%~95%的SMA患者存在SMN1基因的纯合缺失，5%~10%的患者存在SMN1基因的复合杂合突变，即一条染色体上的SMN1基因缺失，另一条染色体上的SMN1基因存在点突变。人类基因组存在一个和SMN1高度同源的SMN2基因，两者的外显子只存在两个碱基的差异，分别是7号外显子上的C/T和8号外显子上的G/A。SMN1基因的缺失与SMA的临床表型的严重性不相关，SMN2基因的缺失不造成SMA表型，但其拷贝数的对少与SMA表型的轻重呈负相关，即SMN2的拷贝数越多，产生的功能SMN蛋白也越多，病情自然越轻。SMN1基因点突变的类型和分布与SMA的临床表型严重程度密切相关，突变类型有错义突变、移码突变、无义突变和剪接位点突变等。
SMA的常规辅助检查包括肌电图、肌酸磷酸激酶、肌肉活检等，但是SMA的临床变异性大，肌电图在儿童患者易出现不配合检查，活检为有创检查，缺乏特异性易出现误诊。基因诊断能够无创检测致病基因SMN1基因的改变，可以作为SMA很好的辅助诊断。该研究项目即可以适用于SMN1基因纯合缺失，也适用于SMN1基因杂合缺失及检测SMN1基因部分的点突变。因此，该项目可以较广泛地用于不同类型SMA的诊断，且操作简便、特异性强，适用于SMA患者的辅助诊断。虽然大部分患者是由于SMN1基因纯合缺失，但是仍有一部分SMA患者是由于SMN1基因复合杂合突变所致。目前，用于SMA基因检测的方法有限制性片段长度多态性、实时定量PCR、变性高效液相色谱技术、MLPA、Sanger测序等，这些方法多数只用于纯合缺失的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的引物探针组、试剂盒及方法，该基因缺失为SMN1基因第7和第8外显子缺失突变。
本发明的目的可以通过如下技术方案实现：
一种用于人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的引物探针组，其特征在于，所述的人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失为人类脊髓性肌萎缩症SMN1基因第7和第8外显子缺失，该引物探针组包括3对引物和3条探针，所述的3对引物分别为：
引物EX7F，其序列为：TTCCTTTATTTTGCTTACAGGGTTAC
引物EX7R，其序列为：AAAACATTTGTTTTCCACAAACCATAAA
引物EX8F，其序列为：TGAAAAACCATCTGTAAAAGAGTCG
引物EX8R，其序列为：CCTTCTCACAGCTCATAAAATTACC
内参引物RPP40F，其序列为：CGAATTCACTGTTCCTCTGACGT
内参引物RPP40R，其序列为：ACTGGCAGGTGAGTGGGTAAA
所述的3条探针分别为：
探针EX7P，其序列为：AATGCTGGCAGACTTACTCCT
探针EX8P，其序列为：AGCACGGTGGTGAGGCAG
内参探针RPP40P，其序列为：TTGTTCTACCTGGGGCCCT。
上述3条探针的5’端分别设有荧光基团，3’端分别设有荧光淬灭基团，具体如下：
探针EX7P，其序列为：FAM-AATGCTGGCAGACTTACTCCT-MGB
探针EX8P，其序列为：FAM-AGCACGGTGGTGAGGCAG-MGB
内参探针RPP40P，其序列为：ROX-TTGTTCTACCTGGGGCCCT-MGB。
上述的引物探针组在人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测或制备用于人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒中的应用。
一种人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括上述的引物探针组。
该试剂盒还包括PCR技术常用试剂，所述的PCR技术常用试剂与所述的引物和探针共同组成PCR反应液。作为一种优选技术方案，所述PCR反应液总反应体系的体积为25μl，所述反应体系包含以下组分：10×PCR buffer（不含热启动Taq酶和MgCl2）、热启动Taq酶、dNTP、MgCl2、引物探针组合物、样本DNA模板和ddH2O。进一步优选的，该试剂盒还含有SMN1基因第7和第8外显子阳性对照品、阴性对照品和空白对照。所述的阳性对照品为SMN1基因突变型质粒，所述阴性对照品为SMN1基因野生型质粒，所述空白对照为无核酶水。
上述的荧光定量PCR试剂盒在人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测中的应用。
一种人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的方法，包括以下步骤：
步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板；
步骤二：采用权利要求4~8中任一所述的试剂盒对所述的PCR模板进行扩增；
步骤三：扩增反应条件：95℃预变性5min；40cycles，95℃ 20s；57℃ 30s；
步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品、阴性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到PCR反应体系的Ct值及扩增曲线的有无判定SMN1基因第7和第8外显子的缺失突变。
本发明引物探针组合物是针对SMN1基因的7号和8号外显子的保守区域，在缺失的保守位置设计PCR的正向和反向引物，同时在正向引物上人为的引入错配碱基，提高引物的特异性，在正反向引物之间设计一条荧光探针。一对特异性扩增参比序列RPP40的引物，一条特异性检测内参序列RPP40的荧光探针。所述引物探针组合物中各序列的具体组合为：一对特异性扩增SMN1第7外显子的引物序列为：
正向引物：TTCCTTTATTTTGCTTACAGGGTTAC
反向引物：AAAACATTTGTTTTCCACAAACCATAAA
所述的特异性扩增SMN1第7外显子的荧光探针序列为：
探针序列：FAM-AATGCTGGCAGACTTACTCCT-MGB
所述的一对特异性扩增SMN1第8外显子的引物序列为：
正向引物：TGAAAAACCATCTGTAAAAGAGTCG
反向引物：CCTTCTCACAGCTCATAAAATTACC
所述的特异性扩增SMN1第8外显子的荧光探针序列为：
探针序列：FAM-AGCACGGTGGTGAGGCAG-MGB
所述的一对特异性扩增内参RPP40的引物序列为：
正向引物：CGAATTCACTGTTCCTCTGACGT
反向引物：ACTGGCAGGTGAGTGGGTAAA
所述的特异性扩增内参RPP40的荧光探针序列为：
探针序列：ROX-TTGTTCTACCTGGGGCCCT-MGB。
相较于现有技术，本发明提供的用于检测SMN1基因第7和第8外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法的优点在于：本发明针对SMN1基因第7和第8外显子区域，在缺失位点设计特异性引物，避免了SMN2基因外显子7和8对检测的干扰。
附图说明
图1是用SMN1基因第7外显子野生型质粒标准品为模板的扩增曲线图；
图2是用SMN1基因第7外显子突变型质粒标准品为模板的扩增曲线图；
图3是用SMN1基因第8外显子野生型质粒标准品为模板的扩增曲线图；
图4是用SMN1基因第8外显子突变型质粒标准品为模板的扩增曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例进行进一步地详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中，DNA聚合酶购自Takara公司（PCR缓冲液、dNTP、MgCl2均随酶一起提供），所用引物、探针及质粒均由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成，血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。
在下列实施例中使用血液基因组DNA提取试剂盒制备样本DNA。
在实施例1中，本发明在常规的PCR引物设计的基础上，人为设置了一个错配碱基，增强了引物的特异性，有效阻止了非特异扩增。
一、扩增引物对、探针的设计与合成
本发明针对SMN1基因第7和第8外显子区域，在缺失突变位点设计特异性PCR引物并引入错配碱基，以此提高引物的特异性，同时设计一条探针，引物和探针由专业的公司合成。相关参数为：Tm值在55.0℃~60.0℃之间，GC在25%~60%之间，其中探针为Taqman MGB探针（Tm值会提高5.0℃~10.0℃），引物和探针序列如下面的表格：
序列名称 寡核苷酸序列 碱基长度（bp）
EX7F 5’-TTCCTTTATTTTGCTTACAGGGTTAC-3’ 26
EX7R 5’-AAAACATTTGTTTTCCACAAACCATAAA-3’ 28
EX7P FAM-AATGCTGGCAGACTTACTCCT-MGB 21
EX8F 5’-TGAAAAACCATCTGTAAAAGAGTCG-3’ 25
EX8R 5’-CCTTCTCACAGCTCATAAAATTACC-3’ 25
EX8P FAM-AGCACGGTGGTGAGGCAG-MGB 18
本发明的内参引物为单拷贝的基因序列RPP40，其引物探针序列分别为：
序列名称 寡核苷酸序列 碱基长度（bp）
RPP40F 5’-CGAATTCACTGTTCCTCTGACGT-3’ 23
RPP40R 5’-ACTGGCAGGTGAGTGGGTAAA-3’ 21
RPP40P ROX-TTGTTCTACCTGGGGCCCT-MGB 19
二、对照品的制备
阳性对照品的制备：根据目的基因SMN1和内参基因RPP40序列，人工合成SMN1第7和第8外显子缺失突变，以及内参RPP40序列，分别以质粒为载体，将SMN1第7外显子缺失突变质粒和内参序列按1:1浓度比例混匀，其终浓度为104拷贝数/μL；将SMN1第8外显子缺失突变质粒和内参序列按1:1浓度比例混匀，其终浓度为104拷贝数/μL。
阴性对照品的制备：根据目的基因SMN1和内参基因RPP40序列，人工合成SMN1第7和第8外显子野生型，以及内参RPP40序列，分别以质粒为载体，将SMN1第7外显子野生型质粒和内参质粒按1:1浓度比例混匀，其终浓度为104拷贝数/μL；将SMN1第8外显子野生型质粒和内参质粒按1:1浓度比例混匀，其终浓度为104拷贝数/μL。
空白对照为无核酶水。
三、正常人基因组DNA的制备
抽提正常人的血液基因组DNA。
四、PCR反应体系组成成分
1）SMN1第7外显子
PCR反应体系包括10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl2 2.5μL，dNTP 2.0μL，热启动Taq酶0.3μL，引物探针组合物3.1μL，DNA模板5μL，ddH2O补足到25μL。 2）SMN1第8外显子
PCR反应体系包括10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl2 2.0μL，dNTP 2.0μL，热启动Taq酶0.3μL，引物探针组合物3.2μL，DNA模板5μL，ddH2O补足到25μL。
五、PCR扩增条件
荧光定量PCR仪：美国安捷伦 Stratagene Mx3005P
95℃预变性5min；40cycles，95℃20sec，57℃30sec，采集荧光信号。
六、结果读取
1）SMN1第7外显子验证结果读取：
参见图1和图2，检测到ROX信号确定为扩增成功，FAM无扩增确定为第7外显子缺失，正常人基因组检测到FAM和ROX信号，SMA第7外显子缺失患者FAM信号检测不到。
2）SMN1第8外显子验证结果读取：
参见图3和图4，检测到ROX信号确定为扩增成功，FAM无扩增确定为第8外显子缺失，正常人基因组检测到FAM和ROX信号，SMA第8外显子缺失患者FAM信号检测不到。
本发明通过使用上述引物对和Taqman MGB探针可以检测外显子7和8的缺失情况，结合临床数据可以确定个体是否为SMA患者。
本发明提供的试剂可以在具有荧光定量PCR的实验室完成，检测时间3到5个小时，在实验室全闭管完成，避免了样本的污染。
综上所述，本发明的脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法设计巧妙，采用闭管检测，有效避免了样本的污染，检测快速简便，可作为SMA的临床辅助诊断，但不作为唯一诊断。
序列表
<110> 江苏医诺万细胞诊疗有限公司
<120> 人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcctttatt ttgcttacag ggttac 26
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaacatttg ttttccacaa accataaa 28
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaaaaacca tctgtaaaag agtcg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccttctcaca gctcataaaa ttacc 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgaattcact gttcctctga cgt 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actggcaggt gagtgggtaa a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatgctggca gacttactcc t 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcacggtgg tgaggcag 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttgttctacc tggggccct 19

Claims (10)

1.用于人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的引物探针组，其特征在于，所述的人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失为人类脊髓性肌萎缩症SMN1基因第7和第8外显子缺失，该引物探针组包括3对引物和3条探针，所述的3对引物分别为：
引物EX7F，其序列为：TTCCTTTATTTTGCTTACAGGGTTAC
引物EX7R，其序列为：AAAACATTTGTTTTCCACAAACCATAAA
引物EX8F，其序列为：TGAAAAACCATCTGTAAAAGAGTCG
引物EX8R，其序列为：CCTTCTCACAGCTCATAAAATTACC
内参引物RPP40F，其序列为：CGAATTCACTGTTCCTCTGACGT
内参引物RPP40R，其序列为：ACTGGCAGGTGAGTGGGTAAA
所述的3条探针分别为：
探针EX7P，其序列为：AATGCTGGCAGACTTACTCCT
探针EX8P，其序列为：AGCACGGTGGTGAGGCAG
内参探针RPP40P，其序列为：TTGTTCTACCTGGGGCCCT。
2.根据权利要求1所述的用于人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的引物探针组，其特征在于，所述3条探针的5’端分别设有荧光基团，3’端分别设有荧光淬灭基团，具体如下：
探针EX7P，其序列为：FAM-AATGCTGGCAGACTTACTCCT-MGB
探针EX8P，其序列为：FAM-AGCACGGTGGTGAGGCAG-MGB
内参探针RPP40P，其序列为：ROX-TTGTTCTACCTGGGGCCCT-MGB。
3.权利要求1或2所述的引物探针组在人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测或制备用于人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒中的应用。
4.一种人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失为人类脊髓性肌萎缩症SMN1基因第7和第8外显子缺失，该试剂盒包括3对引物和3条探针，所述的3对引物分别为：
引物EX7F，其序列为：TTCCTTTATTTTGCTTACAGGGTTAC
引物EX7R，其序列为：AAAACATTTGTTTTCCACAAACCATAAA
引物EX8F，其序列为：TGAAAAACCATCTGTAAAAGAGTCG
引物EX8R，其序列为：CCTTCTCACAGCTCATAAAATTACC
内参引物RPP40F，其序列为：CGAATTCACTGTTCCTCTGACGT
内参引物RPP40R，其序列为：ACTGGCAGGTGAGTGGGTAAA
所述的3条探针分别为：
探针EX7P，其序列为：AATGCTGGCAGACTTACTCCT
探针EX8P，其序列为：AGCACGGTGGTGAGGCAG
内参探针RPP40P，其序列为：TTGTTCTACCTGGGGCCCT。
5.根据权利要求4所述的人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述3条探针的5’端分别设有荧光基团，3’端分别设有荧光淬灭基团，具体如下：
探针EX7P，其序列为：FAM-AATGCTGGCAGACTTACTCCT-MGB
探针EX8P，其序列为：FAM-AGCACGGTGGTGAGGCAG-MGB
内参探针RPP40P，其序列为：ROX-TTGTTCTACCTGGGGCCCT-MGB。
6.根据权利要求4或5所述的人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括PCR技术常用试剂，所述的PCR技术常用试剂与所述的引物和探针共同组成PCR反应液。
7.根据权利要求6所述的人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液总反应体系的体积为25μl，所述反应体系包含以下组分：10×PCR buffer、热启动Taq酶、dNTP、MgCl2、引物探针组合物、样本DNA模板和ddH2O。
8.根据权利要求4~7中任一所述的人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有阳性对照品、阴性对照品和空白对照。
9.权利要求4~8中任一所述的荧光定量PCR试剂盒在人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测中的应用。
10.一种人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板；
步骤二：采用权利要求4~8中任一所述的试剂盒对所述的PCR模板进行扩增；
步骤三：扩增反应条件：95℃预变性5min；40cycles，95℃ 20s；57℃ 30s；
步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品、阴性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到PCR反应体系的Ct值及扩增曲线的有无判定SMN1基因第7和第8外显子的缺失突变。
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