CN113025707A - 生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应用、试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应用、试剂盒，涉及生物技术领域。本发明提供了一种生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应用，其中，生物标志物为长链非编码RNA RP11‑7F17.5、PARP2基因编码的PARP2 mRNA、或SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA中的至少一种。可以通过对以上三个差异表达基因的检测实现对湿热困脾型2型糖尿病患者的区分或诊断，相较于现有诊断方法具有更好的客观性、特异性和灵敏性。本发明提供的用于辅助诊断湿热困脾型2型糖尿病的试剂盒，该试剂盒在湿热困脾型2型糖尿病的诊断方面具有更好的客观性、特异性和灵敏性。

Description

生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应 用、试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应用、试剂盒。

背景技术

2型糖尿病(T2DM)是由于胰岛素分泌绝对或相对不足，和胰岛素敏感性降低，所造成的一种以高血糖为特征的代谢性疾病，是严重损害人类健康和生命安全的重大慢性疾病之一。当今社会，随着生活方式的不断变化以及生活条件的稳步提高，T2DM的患病率程逐年增高的趋势，研究表明，到2040年，全球预计会有大约642万人患T2DM。糖尿病患者一般以多饮、多食、多尿为主要表现，并且伴有消瘦和乏力的症状，其在中医学中被归为“消渴病”的范畴。消渴根据其症状不同，分为多种不同的证型，包括湿热困脾、阴虚热盛和阴阳两虚型。随着当下人民生活水平的普遍提高和生活节奏的加快，很多T2DM患者都具有饮食油腻或缺少锻炼等不良的生活习惯，因而T2DM证型中与这些因素密切相关的湿热困脾证型逐年增多。

根据2型糖尿病的类型，采取适当的治疗方案有助于及早的实现对病情的防控和治疗，然而目前对于湿热困脾型2型糖尿病患者的诊断还存在准确性低、特异性差等问题。

近年来，随着第二代测序技术的出现及飞速进步，已经能够克服传统疾病研究方法的局限性，从基因和分子层面进一步的了解疾病的发生发展机制。高通量测序技术是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的测序技术，是对传统测序的一次革命性变革。高通量测序分为多种，包括基因深度测序(genome re-sequencing)、全外显子测序(whole exon sequencing，WES)和转录组测序(transcriptome sequencing)等。

转录组测序是利用新一代测序技术进行转录组分析的技术，其对组织或细胞中所有的RNA反转录成的cDNA文库进行测序，通过对测序系列的拼接、组装以及与参考序列的对比，能够全面而快速地获得特定组织或细胞在某一状态下的几乎所有转录本序列信息和表达信息，包括编码蛋白质的mRNA和各种非编码RNA，基因选择性剪接产生的不同转录本的表达丰度等。现已有研究使用转录组测序发现了在T2DM及其他代谢性疾病中发挥作用的RNA及其可能的作用机制。

然而，通过在转录组学层面探寻T2DM湿热困脾证的疾病内涵和发病机制的研究较少，存在不足。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应用，使T2DM的临床辨证过程具有更好的客观性、特异性和灵敏性，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供一种用于辅助诊断湿热困脾型2型糖尿病的试剂盒，该试剂盒能够快速准确的实现对湿热困脾型2型糖尿病的诊断。

第一方面，本发明提供了一种生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应用，所述生物标志物为PARP2基因编码的PARP2mRNA、长链非编码RNA RP11-7F17.5或SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA中的至少一种。

作为进一步技术方案，所述PARP2基因编码的PARP2 mRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

作为进一步技术方案，所述长链非编码RNA RP11-7F17.5的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

作为进一步技术方案，所述SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

作为进一步技术方案，所述产品包括芯片、试剂盒或试纸。

第二方面，本发明提供了一种用于辅助诊断湿热困脾型2型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测PARP2基因编码的PARP2 mRNA的引物对、用于特异性检测长链非编码RNA RP11-7F17.5的引物对或用于特异性检测SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA的引物对中的至少一种。

作为进一步技术方案，所述用于特异性检测PARP2基因编码的PARP2mRNA的引物对具有如SEQ ID NO.4所示序列和具有如SEQ ID NO.5所示序列。

作为进一步技术方案，所述用于特异性检测长链非编码RNA RP11-7F17.5的引物对具有如SEQ ID NO.6所示序列和具有如SEQ ID NO.7所示序列。

作为进一步技术方案，所述用于特异性检测SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA的引物对具有如SEQ ID NO.8所示序列和具有如SEQ ID NO.9所示序列。

作为进一步技术方案，所述试剂盒的检测样本包括血液。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应用，其中，生物标志物为PARP2基因编码的PARP2 mRNA、长链非编码RNA RP11-7F17.5或SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA中的至少一种。经发明人研究发现，通过对湿热困脾型2型糖尿病患者进行转录组测序，与健康者相比，湿热困脾型2型糖尿病患者的PARP2 mRNA、长链非编码RNA RP11-7F17.5和SLC38A5 mRNA的表达量存在显著差异表达，基于此，可以通过对以上三个差异表达基因的检测实现对湿热困脾型2型糖尿病患者的区分或诊断，相较于现有诊断方法具有更好的客观性、特异性和灵敏性，为湿热困脾型2型糖尿病的发病机制研究及其治疗奠定了重要基础和理论依据，为湿热困脾型2型糖尿病的治疗提供可能的药物靶点。

本发明提供了的用于辅助诊断湿热困脾型2型糖尿病的试剂盒，包括用于特异性检测PARP2基因编码的PARP2 mRNA的引物对、用于特异性检测长链非编码RNA RP11-7F17.5的引物对或用于特异性检测SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA的引物对中的至少一种，该试剂盒在湿热困脾型2型糖尿病的诊断方面具有更好的客观性、特异性和灵敏性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例3提供的利用PCR验证PARP2、RP11-7F17.5和SLC38A5表达水平结果，图中FD为测序结果两组的差异值(Fold change,FD)，PCR为RT-PCR两组中目标基因表达的差异值。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

为了进一步阐明T2DM湿热困脾证型的本质，通过在转录组学层面的研究探寻T2DM湿热困脾证的疾病内涵和发病机制，可能为今后T2DM湿热困脾证的诊断提供分子层面的理论依据。通过转录组测序技术从分子层面了解湿热困脾型T2DM的发病机制，也有助于对该疾病进行更加合理化的治疗，同时能够从中发现该疾病特有的生物标记物，为临床辨证分型过程提供依据，有助于该疾病的诊断与治疗。

第一方面，本发明提供了一种生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应用，所述生物标志物为PARP2基因编码的PARP2mRNA、长链非编码RNA RP11-7F17.5或SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA中的至少一种。

经发明人研究发现，通过对湿热困脾型2型糖尿病患者进行转录组测序，与健康者相比，湿热困脾型2型糖尿病患者的PARP2基因、RP11-7F17.5和SLC38A5基因存在显著差异表达，基于此，可以通过对以上三个差异表达基因的检测实现对湿热困脾型2型糖尿病患者的区分或诊断，相较于现有诊断方法具有更好的客观性、特异性和灵敏性，为湿热困脾型2型糖尿病的发病机制研究及其治疗奠定了重要基础和理论依据，为湿热困脾型2型糖尿病的治疗提供可能的药物靶点。

在一些优选的实施方式中，所述PARP2基因编码的PARP2 mRNA的核苷酸序列如SEQID NO.1所示：

GGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCCATGGCGGCGCGGCGGCGACGGAGCACCGGCGGCGGCAGGGCGAGAGCATTAAATGAAAGCAAAAGAGTTAATAATGGCAACACGGCTCCAGAAGACTCTTCCCCTGCCAAGAAAACTCGTAGATGCCAGAGACAGGAGTCGAAAAAGATGCCTGTGGCTGGAGGAAAAGCTAATAAGGACAGGACAGAAGACAAGCAAGATGGTATGCCAGGAAGGTCATGGGCCAGCAAAAGGGTCTCTGAATCTGTGAAGGCCTTGCTGTTAAAGGGCAAAGCTCCTGTGGACCCAGAGTGTACAGCCAAGGTGGGGAAGGCTCATGTGTATTGTGAAGGAAATGATGTCTATGATGTCATGCTAAATCAGACCAATCTCCAGTTCAACAACAACAAGTACTATCTGATTCAGCTATTAGAAGATGATGCCCAGAGGAACTTCAGTGTTTGGATGAGATGGGGCCGAGTTGGGAAAATGGGACAGCACAGCCTGGTGGCTTGTTCAGGCAATCTCAACAAGGCCAAGGAAATCTTTCAGAAGAAATTCCTTGACAAAACGAAAAACAATTGGGAAGATCGAGAAAAGTTTGAGAAGGTGCCTGGAAAATATGATATGCTACAGATGGACTATGCCACCAATACTCAGGATGAAGAGGAAACAAAGAAAGAGGAATCTCTTAAATCTCCCTTGAAGCCAGAGTCACAGCTAGATCTTCGGGTACAGGAGTTAATAAAGTTGATCTGTAATGTTCAGGCCATGGAAGAAATGATGATGGAAATGAAGTATAATACCAAGAAAGCCCCACTTGGGAAGCTGACAGTGGCACAAATCAAGGCAGGTTACCAGTCTCTTAAGAAGATTGAGGATTGTATTCGGGCTGGCCAGCATGGACGAGCTCTCATGGAAGCATGCAATGAATTCTACACCAGGATTCCGCATGACTTTGGACTCCGTACTCCTCCACTAATCCGGACACAGAAGGAACTGTCAGAAAAAATACAATTACTAGAGGCTTTGGGAGACATTGAAATTGCTATTAAGCTGGTGAAAACAGAGCTACAAAGCCCAGAACACCCATTGGACCAACACTATAGAAACCTACATTGTGCCTTGCGCCCCCTTGACCATGAAAGTTATGAGTTCAAAGTGATTTCCCAGTACCTACAATCTACCCATGCTCCCACACACAGCGACTATACCATGACCTTGCTGGATTTGTTTGAAGTGGAGAAGGATGGTGAGAAAGAAGCCTTCAGAGAGGACCTTCATAACAGGATGCTTCTATGGCATGGTTCCAGGATGAGTAACTGGGTGGGAATCTTGAGCCATGGGCTTCGAATTGCCCCACCTGAAGCTCCCATCACAGGTTACATGTTTGGGAAAGGAATCTACTTTGCTGACATGTCTTCCAAGAGTGCCAATTACTGCTTTGCCTCTCGCCTAAAGAATACAGGACTGCTGCTCTTATCAGAGGTAGCTCTAGGTCAGTGTAATGAACTACTAGAGGCCAATCCTAAGGCCGAAGGATTGCTTCAAGGTAAACATAGCACCAAGGGGCTGGGCAAGATGGCTCCCAGTTCTGCCCACTTCGTCACCCTGAATGGGAGTACAGTGCCATTAGGACCAGCAAGTGACACAGGAATTCTGAATCCAGATGGTTATACCCTCAACTACAATGAATATATTGTATATAACCCCAACCAGGTCCGTATGCGGTACCTTTTAAAGGTTCAGTTTAATTTCCTTCAGCTGTGGTGAATGTTGATATTAAATAAACCAGAGATCTGATCTTCAAGCAAGAAAATAAGCAGTGTTGTACTTGTGAATTTTGTGATATTTTATGTAATAAAAACTGTACAGGTCTA。

在一些优选的实施方式中，所述长链非编码RNA RP11-7F17.5的核苷酸序列如SEQID NO.2所示：

ATCCATCTTGGGGAGAGTGGTGGCGGGTCCTTTCCTTGTTCTCTTGCTCCCTGCCGCCTACCTGAGACCGCAGGAAATCTGGGTCTTTCTGAAGGCATCTTCTTGTGGTGTAGTCCCCTTGGAACCGCGGCCTTTAGAATGAACATGACATCACCTTGGGCAACAACGACAGAGGGTGTGTTCCTGTAGGAGACAAGACACGGGGAGATCCAAGGTTGGTCAGCGGGTCATGGCAAGCAGGAGACACAATGCTAATGACTCCGGCTCCACGTGGCGACCATTCAGGAAAAAGCTGCAATGTTCTCTCTGCCACATTAATCAGAGAAACACATCAAGAGTTGTTGCGTGGAGACAGCTTTCCTCCCAGTACTCGCCCTGCATACTAATCACCACCCCCTCCTGGCGAGATGCGGTTTCACTCTGTTGCCCAGGCTAGAGTGCACTAATACAATCATAGCTTACTGCACCCTCAACCTCCTGGGCTCAAGCAATCCTCCTGCCTCAGCCTCATGAGTAGCTGGGACTACAGGCACCACTGTGGACCCCTGCTCTGCACCCCCAGGAGGAGTGGGACTGCTTCAAGGGCAGCCTGGAGGAAAGAGGTGTGGTGTGAACACATACAACATGTTCCTTAACCAGGAAGGCGACTGGAGTCTTTACCTGGTTTCAAAGCAGCCAAGCCTAGAGGCCCCCACCCCTTGTTCTTTATTATGATTGCCCTTTGACCCCAACCCCCCAATTCTTTCCTCTCCAGATCCCCAGCCATGCATACTCCAACTTGGTTCTGCAAAGAATACCCAGCCACAGCTGTGAACTTGGGGAAACACATTTTTTCTTTTTCTTTTCTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTGAGAGGGAGTCTCACTCTGTTGCCCAGGCTGAGGTACAGTGGCGTGATCTTGACTCACTGCAACCTCCACCTCCCAGGTTCAAGCAATTCTTCTGCCTAAGCCTCCTGAGTAGCTAGGACTACAGGCATGTGCCACCACCCCCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACCATGCTGGCCAGGCTGGGCTTGAACTCCTGGCCTCAAGCAGTCCTCTCACCTTGCCTCCCAAGGTGCTAGGATTATAGGCTTGAGCCACCATGCATGTGCACGGCCAGCACATTCATTTTCTATACATAACTGTCTCCCAGCTCTTCAGGCCAACTTACCTGATAATGATAAAAATAACTAAGCTGCCATGGATTGGGCAGTGTGCCAAGTGCTCCATGTATATTACCTTACTTAGTTTTCACAAACTCTATGAGGTAGGTACCACTATTATTTACAGGTGAGGAAATGGAGGCTCAGAGAGGTTAAGTGAATTGATCCAGGCCACACAGCTGGTAAGCGCCAGAGCCACTAGTGGACGCCAGGTCCAGCCAGCCCCCAGAGCCCATGTGCTGAGCCACTGTGCTATACTGACTCCCACTTAATTCTCTCTTCTGGGTTGTCCCAAAGACCAAGTTCGGCTGGCCAATTTTCCAGGACCATCTCTCATGGCACCTGGAGGCTTGTAGGTTCCTGGAGGACTCTCACACCTCCTTCCCACCCTTCTCCAGATTCTCCAACTCCCTCTTGAGCAGACCCGGCCCCACTCTGGGGCACCCTGCCTTCCTGGGACCTGTCGTAACAGTCACCCACTCTGCCAGGGCCTGGCTGACCCAGGCTGGGGACCGTGGGACCCCTCTGGGCAGTGCCCCCCTACCTGGGCCCAGGTGGGTATGGATTTCTTTCTTCTGGGCCATTGCACCCGCCAGAAGGTGCGGTGGGAGAGGCAGGCCCACATTTCAGAGGGCCTTGCTGCCCCCATGTGGCATGAGGCTGTAGCGGCTGCAGCCTCCTCTTCCCTCCCTCCTGCCACTGCTCCCGAAGCCAAGGCTTTTGCAGGGTTGAAAAGGAAGAGAAAGAGGAGAAGCAGGAATGTGAGAGAAATGAGGCAGAGGGATGGGCTAGGGAAGAGAGAAGCCCTTCTGCGTTACCTGGAAATGCAGCAACAATAATAACAAAGCCAATGTTAGGAATGTTTAAAGGCAGCTGCCACATAGCACTTTTTATAGCTTGTAGACTCTCTCATTTAATCCTGGCACTTACATCAATCTGATTAGTAGCTATTATTAGTTTTATAGGTGATGATCCAAGGCGCAATTATTTGTTCCCCAGCTAGTAGGTGACAGAGCCCAGATTGAATCTGACTCCAGAACCCTAACCACGATATTCCCCTGTCTAGAAGGAGCCAGTTCTCTCCTGCAACCCCCACTGCTCAGCCTCTAGGAGTTCCAGCCACCAGCCACCTGCACCCTCCCTTCCATGTGGCTTTGCCCTCTGTTCTTCTCCTCTCCACTCTCTCTCCAAGGTCCAAGTGGTCAAGGTCATCCCAAGGGTCTGCTGGGACCGTGTGTCCTTATTCTGTGCCTTGCTGGTCGCCAACCTTCCCCATCTGCCAAGGACTGATGTCCAGCCCAGGCCCAGGTGCAGGTGCCCAGGTCATTTTTGCCACTGAGTAAAGGGAGACAGAATGACAGGGTAAATTACCAACCACCAGAACACCATGGAGCCAATAGCATCAATGCAAGTGAAGTATATTTATCTGTTGGCCTGAAAACATGTCCTAGTATATTGTCCCATTAAGCAAAAAGCAGGTTATAAAGCTGTGTACATTAAGAAACATTTTATAAGTGAAACAAAAGTATTCTCCGTTTCTATGCAGAGAAAAAGGATATTTGCCAAGATGTTAACAGATTATTTTTGCTGTCTTCTCTTGGCTTATTTTTGTTTTCTCTTTTTCAATGAACACCAATTAGTCACATGATTTTAAAAAGCAATAAAAATAAACCAATCCCAGACGGATTGTACTTCTTCCTGTCCTCATTTCTACCCCGAGTCTCC。

在一些优选的实施方式中，所述SLC38A5基因编码的SLC38A5mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

CCGCTCTTCGGCCCAGTGACTGCCCTCCCTGGCTGCTCCCCTCCCGGCCTGCCTTTCTCCTCCAGCTGTTCTTCCTCCTCCAGCACTCCCCATCCTCAGCCTATCCCCACCCGCAGCGTCTCCCCTCCCCAGCTGTTTTACCTCTGGTGGCTGCTTCACCCTCCCCCGGTCCTCTCCACTTCCAGCTGCTCCCTCCAAAGTTTGTCCTAGTTTCCCCCTTCCCAGCTCTCCCCATTCGCAGCCTCTTCCATCTTCAACTCTTCTTCCCTGCTAGCCTCTTCCCTCCTCCGATGGTCTCTCCTTGGCTTCTCTCCACCCCGCTTGCTTCTTCTCTAGTCTTTCCCTGGCCCTGGCATTAGTCTCCTTACCCTGTGCCCTGTCCCAATGTGTGCCCGGGCTTTGCTCCTTGCGTGCAGTTCGAGGGGAAGACATCGTTTGGAATGTCAGTGTTCAACCTCAGCAACGCCATCATGGGCAGCGGCATCCTGGGGCTGGCCTATGCCATGGCCCACACGGGGGTCATCTTCTTCCTGGCCCTGCTGCTGTGCATTGCGCTTCTGTCGTCCTACTCCATCCACCTCCTGCTGACCTGTGCTGGTATTGCAGGCATCCGAGCCTATGAGCAGCTGGGACAGAGGGCATTCGGGCCTGCGGGGAAGGTAGTGGTGGCCACAGTCATCTGTCTGCACAATGTTGGGGCCATGTCCAGTTACCTGTTCATCATCAAATCTGAGCTCCCCCTGGTTATCGGCACCTTCCTGTACATGGACCCCGAGGGGGACTGGTTCTTGAAGGGAAACCTCCTCATCATCATCGTCAGTGTGTTAATCATCCTGCCCCTCGCCCTCATGAAACACTTGGGCTACCTGGGGTACACCAGTGGTCTCTCTCTGACCTGCATGCTGTTTTTCCTTGTTTCGGTCATCTACAAGAAGTTCCAACTTGGCTGTGCTATAGGCCACAATGAAACAGCAATGGAGAGTGAAGCTCTCGTGGGACTCCCCAGCCAAGGACTCAACAGCAGCTGTGAGGCCCAGATGTTCACAGTTGACTCACAGATGTCCTACACAGTGCCCATTATGGCTTTTGCTTTTGTCTGCCACCCTGAGGTGCTGCCCATCTATACGGAGCTCTGCCGGCCCTCCAAGCGCAGGATGCAGGCCGTGGCCAACGTGTCCATTGGGGCCATGTTCTGCATGTATGGGCTCACAGCAACCTTTGGATACCTCACCTTCTACAGCAGTGTGAAGGCGGAGATGCTGCACATGTACAGCCAGAAGGACCCGCTCATCCTCTGTGTGCGCCTGGCCGTGCTGCTCGCGGTGACCCTCACTGTGCCAGTCGTGCTGTTCCCTATCCGCCGGGCCCTGCAGCAGCTGCTTTTCCCAGGCAAGGCCTTCAGCTGGCCACGACATGTGGCCATAGCTCTGATCCTGCTTGTTTTGGTCAATGTCCTTGTCATCTGTGTGCCAACCATCCGGGATATCTTTGGAGTTATCGGGTCCACCTCAGCCCCCAGCCTCATCTTCATCCTCCCCAGCATCTTCTACCTCCGCATTGTACCCTCTGAGGTGGAGCCTTTCTTATCCTGGCCCAAGATCCAGGCCCTGTGCTTTGGAGTCCTGGGAGTCCTCTTCATGGCCGTCAGTCTAGGCTTTATGTTTGCCAACTGGGCCACAGGCCAGAGCCGCATGTCTGGACACTGATCAGGCCCTGCTGGCCCAGGTCCCTGTGCGCATGCACATGGAGGGGTCAGGGCCGCTCCCTAGGGTCCCTCCTGCCCAACATGTGGAGGTGGCTGGTTCCCATGAACGTGGTTGTCAGAGGCGGGGGACAGCAGAGGCTGCAGACTGGCCCACTTCCCTCCTCCCCAGGGATGCCAAGCTTGGATCATGGCCCTAATCCCAACCCCAACCCCATGGGAGGAGGAGGAGGAGGAAGAAGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGCCAGGTCCTGGTGGAGCCTTTGCCCAGCCCAGTCCTCTCTGCCTCCTCCTGGCTGAAGCTGTTTGTCAGGATTACCCTCGGGCTAAAGAGGAAAAATAAAGATGTTGAGCTACCACTCTG。

在一些优选的实施方式中，所述产品包括但不限于芯片、试剂盒或试纸。

第二方面，本发明提供了一种用于辅助诊断湿热困脾型2型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测PARP2基因编码的PARP2 mRNA的引物对、用于特异性检测长链非编码RNA RP11-7F17.5的引物对或用于特异性检测SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA的引物对中的至少一种。

应用本发明提供的试剂盒对湿热困脾型2型糖尿病进行诊断，诊断结果准确、灵敏、可靠。

在一些优选的实施方式中，所述用于特异性检测PARP2基因编码的PARP2 mRNA的引物对具有如SEQ ID NO.4所示序列和具有如SEQ ID NO.5所示序列。

在一些优选的实施方式中，所述用于特异性检测长链非编码RNA RP11-7F17.5的引物对具有如SEQ ID NO.6所示序列和具有如SEQ ID NO.7所示序列。

在一些优选的实施方式中，所述用于特异性检测SLC38A5基因编码的SLC38A5mRNA的引物对具有如SEQ ID NO.8所示序列和具有如SEQ ID NO.9所示序列。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒的检测样本包括但不限于血液，或者本领域技术人员所熟知的其他样本。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1样本获取

1、研究对象

湿热困脾型T2DM组：随机抽取医院内分泌科收治的6例湿热困脾型T2DM患者。

纳入标准：在医院入院诊断时被诊断为二型糖尿病；年龄40-65岁；距第一次确诊二型糖尿病后时间超过3个月；经过3名职称在副主任医师以上的专家共同辨证，均辨证为湿热困脾型T2DM的患者。

排除标准：一型糖尿病和妊娠糖尿病等非二型糖尿病患者；合并出现高血压三期或心肌梗塞患者；二型糖尿病合并其他器官如心、肺、肝、肾、脑严重原发病症的患者；合并严重并发症的患者，包括糖尿病感染或酮症酸中毒等。

正常对照组：选取并纳入健康受试者6例。

纳入标准：年龄40-65岁；空腹血糖低于7.0mmol/L；糖化血红蛋白低于5.7％。

排除标准：有糖尿病家族史者；患有高血压或心脑血管系统疾病者；目前正在服用药物者。

湿热困脾型T2DM组和正常对照组之间，年龄、性别差异无统计学显著性，具有可比性。

所有研究对象在参与研究之前，均已充分了解本研究的详细情况，包括研究目的、研究内容、参与研究过程中应注意的事项，在研究过程中需要承担的义务、可能出现的风险，以及在研究过程中能够获得的权益。且均签署了知情同意书以及保密协议。

2、血样采集

在同一天采集所有分组受试者的血样。采集其清晨空腹静脉血，每人共采集静脉血7-8ml，分装于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，并经过轻微震荡，使血样与EDTA充分接触，混匀后置保存于液氮中。

实施例2转录组测序

1、RNA提取与检测

采用标准提取方法从血样中提取RNA，随后对RNA样品进行严格质控，质控标准主要包括以下4个方面：

(1)琼脂糖凝胶电泳：分析样品RNA完整性及是否存在DNA污染；

(2)NanoPhotometer spectrophotometer：检测RNA纯度(OD260/280及OD260/230比值)；

(3)Qubit2.0 Fluorometer：RNA浓度精确定量；

(4)Agilent 2100bioanalyzer：精确检测RNA完整性。

2、文库构建与质检

使用rRNA去除试剂盒去除核糖体RNA，并使用乙醇去除不含rRNA的残基，从而得到mRNA。然后，在NEB Fragmentation Buffer中用二价阳离子随机将上一步中得到的mRNA进行打断。随后，分别在M-MuLV逆转录酶体系及DNA聚合酶I体系中，合成双链cDNA。再将合成后的双链DNA进行纯化、末端修复、加polyA尾并连接测序接头。在DNA聚合酶PCR引物和Index Primer体系中进行PCR扩增。最后再次使用AMPure XP系统将扩增产物进行进一步纯化，从而获得测序文库。随后按标准程序进行文库质检。

3、测序与数据分析

(1)比对分析：使用Illumina Hiseq 2500平台对文库进行测序，随后去除低质量reads后进行比对。比对过程使用STAR(v2.5.1b)软件，采用Maximal Mappable Prefix(MMP)方法，将测序数据与基因组网站下载的参考基因组进行比对。

(2)定量分析：使用HTSeq v0.6.0计算比对到每一个参考基因的reads的读数，并计算每个基因的FPKM，以估计基因表达水平。

(3)差异分析：使用edgeR R pachage(3.12.1)进行差异表达分析，并使用Benjamini&Hochberg方法进行P值校正，最后将显著差异表达的阈值调整为：校正后的P值为0.05，FoldChange的绝对值为2。

4、结果

如表1转录组测序结果显示，与正常对照组相比，湿热困脾型T2DM组患者空腹外周血中PARP2和RP11-7F17.5表达水平显著上调，SLC38A5基因表达水平显著下调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1湿热困脾型T2DM患者和正常受试者PARP2基因、RP11-7F17.5和SLC38A5基因差异表达水平

实施例3

1、引物设计

根据PARP2基因编码的PARP2 mRNA、RP11-7F17.5和SLC38A5基因编码的SLC38A5mRNA设计引物。

引物对1：用于特异性检测PARP2基因编码的PARP2 mRNA的引物对；

F:5'-AAGGCCGAAGGATTGCTTCAAGG-3'(SEQ ID NO.4)；

R:5’-GCTGGTCCTAATGGCACTGTACTC-3’(SEQ ID NO.5)。

引物对2：用于特异性检测长链非编码RNA RP11-7F17.5的引物对；

F:5'-AGAGGCAGCAGAAGAGGAGGAAG-3'(SEQ ID NO.6)；

R:5'-TTGGCGATGGTCTTGACTGAATCC-3'(SEQ ID NO.7)。

引物对3：用于特异性检测SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA的引物对；

F:5'-TTGACTCACAGATGTCCTACAC-3'(SEQ ID NO.8)；

R:5'-CTGCTGTAGAAGGTGAGGTAT-3'(SEQ ID NO.9)。

引物对4：参照物β-active；

F:5'-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3'(SEQ ID NO.10)；

R:5'-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3'(SEQ ID NO.11)。

2、样本获取

样本获取同实施例1，同样采用6例湿热困脾型T2DM受试者(实验组)和6例健康受试者(对照组)，与之不同的是，本实施例的纳入的受试者与实施例1不是同一受试者。

3、PCR结果

分别提取实验组和对照组样本的mRNA，分别采用引物对1-3对提取得到的mRNA进行PCR，结果如图1所示，相较于对照组，实验组的外周血中PARP2和RP11-7F17.5表达水平显著上调，SLC38A5基因表达水平显著下调，与实施例2的结果一致，说明采用本发明提供的引物对1-3能够实现对以上三个目的mRNA的特异性扩增，并且，根据PCR结果实现对湿热困脾型T2DM患者的区分和辅助诊断。

实施例4基于差异表达基因的湿热困脾型T2DM诊断试剂盒

1、试剂盒组成：引物；Taq酶；缓冲液；dNTP。

2、使用方法：

(1)基因组RNA提取：按照标准流程提取外周血样本中总RNA。

(2)逆转录：使用逆转录缓冲液对总RNA进行逆转录合成cDNA。

(3)PCR扩增：采用1所述试剂盒对cDNA进行PCR扩增。

(4)使用统计软件对基因表达量进行统计。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京中医药大学

<120> 生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应用、试剂盒

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1886

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

ggttgatgac gtcagcgttc gaattccatg gcggcgcggc ggcgacggag caccggcggc 60

ggcagggcga gagcattaaa tgaaagcaaa agagttaata atggcaacac ggctccagaa 120

gactcttccc ctgccaagaa aactcgtaga tgccagagac aggagtcgaa aaagatgcct 180

gtggctggag gaaaagctaa taaggacagg acagaagaca agcaagatgg tatgccagga 240

aggtcatggg ccagcaaaag ggtctctgaa tctgtgaagg ccttgctgtt aaagggcaaa 300

gctcctgtgg acccagagtg tacagccaag gtggggaagg ctcatgtgta ttgtgaagga 360

aatgatgtct atgatgtcat gctaaatcag accaatctcc agttcaacaa caacaagtac 420

tatctgattc agctattaga agatgatgcc cagaggaact tcagtgtttg gatgagatgg 480

ggccgagttg ggaaaatggg acagcacagc ctggtggctt gttcaggcaa tctcaacaag 540

gccaaggaaa tctttcagaa gaaattcctt gacaaaacga aaaacaattg ggaagatcga 600

gaaaagtttg agaaggtgcc tggaaaatat gatatgctac agatggacta tgccaccaat 660

actcaggatg aagaggaaac aaagaaagag gaatctctta aatctccctt gaagccagag 720

tcacagctag atcttcgggt acaggagtta ataaagttga tctgtaatgt tcaggccatg 780

gaagaaatga tgatggaaat gaagtataat accaagaaag ccccacttgg gaagctgaca 840

gtggcacaaa tcaaggcagg ttaccagtct cttaagaaga ttgaggattg tattcgggct 900

ggccagcatg gacgagctct catggaagca tgcaatgaat tctacaccag gattccgcat 960

gactttggac tccgtactcc tccactaatc cggacacaga aggaactgtc agaaaaaata 1020

caattactag aggctttggg agacattgaa attgctatta agctggtgaa aacagagcta 1080

caaagcccag aacacccatt ggaccaacac tatagaaacc tacattgtgc cttgcgcccc 1140

cttgaccatg aaagttatga gttcaaagtg atttcccagt acctacaatc tacccatgct 1200

cccacacaca gcgactatac catgaccttg ctggatttgt ttgaagtgga gaaggatggt 1260

gagaaagaag ccttcagaga ggaccttcat aacaggatgc ttctatggca tggttccagg 1320

atgagtaact gggtgggaat cttgagccat gggcttcgaa ttgccccacc tgaagctccc 1380

atcacaggtt acatgtttgg gaaaggaatc tactttgctg acatgtcttc caagagtgcc 1440

aattactgct ttgcctctcg cctaaagaat acaggactgc tgctcttatc agaggtagct 1500

ctaggtcagt gtaatgaact actagaggcc aatcctaagg ccgaaggatt gcttcaaggt 1560

aaacatagca ccaaggggct gggcaagatg gctcccagtt ctgcccactt cgtcaccctg 1620

aatgggagta cagtgccatt aggaccagca agtgacacag gaattctgaa tccagatggt 1680

tataccctca actacaatga atatattgta tataacccca accaggtccg tatgcggtac 1740

cttttaaagg ttcagtttaa tttccttcag ctgtggtgaa tgttgatatt aaataaacca 1800

gagatctgat cttcaagcaa gaaaataagc agtgttgtac ttgtgaattt tgtgatattt 1860

tatgtaataa aaactgtaca ggtcta 1886

<210> 2

<211> 2924

<212> DNA

<213> 人源

<400> 2

atccatcttg gggagagtgg tggcgggtcc tttccttgtt ctcttgctcc ctgccgccta 60

cctgagaccg caggaaatct gggtctttct gaaggcatct tcttgtggtg tagtcccctt 120

ggaaccgcgg cctttagaat gaacatgaca tcaccttggg caacaacgac agagggtgtg 180

ttcctgtagg agacaagaca cggggagatc caaggttggt cagcgggtca tggcaagcag 240

gagacacaat gctaatgact ccggctccac gtggcgacca ttcaggaaaa agctgcaatg 300

ttctctctgc cacattaatc agagaaacac atcaagagtt gttgcgtgga gacagctttc 360

ctcccagtac tcgccctgca tactaatcac caccccctcc tggcgagatg cggtttcact 420

ctgttgccca ggctagagtg cactaataca atcatagctt actgcaccct caacctcctg 480

ggctcaagca atcctcctgc ctcagcctca tgagtagctg ggactacagg caccactgtg 540

gacccctgct ctgcaccccc aggaggagtg ggactgcttc aagggcagcc tggaggaaag 600

aggtgtggtg tgaacacata caacatgttc cttaaccagg aaggcgactg gagtctttac 660

ctggtttcaa agcagccaag cctagaggcc cccacccctt gttctttatt atgattgccc 720

tttgacccca accccccaat tctttcctct ccagatcccc agccatgcat actccaactt 780

ggttctgcaa agaataccca gccacagctg tgaacttggg gaaacacatt ttttcttttt 840

cttttctttt cttttttttt tttttttgag agggagtctc actctgttgc ccaggctgag 900

gtacagtggc gtgatcttga ctcactgcaa cctccacctc ccaggttcaa gcaattcttc 960

tgcctaagcc tcctgagtag ctaggactac aggcatgtgc caccaccccc agctaatttt 1020

tgtattttta gtagagatgg ggtttcacca tgctggccag gctgggcttg aactcctggc 1080

ctcaagcagt cctctcacct tgcctcccaa ggtgctagga ttataggctt gagccaccat 1140

gcatgtgcac ggccagcaca ttcattttct atacataact gtctcccagc tcttcaggcc 1200

aacttacctg ataatgataa aaataactaa gctgccatgg attgggcagt gtgccaagtg 1260

ctccatgtat attaccttac ttagttttca caaactctat gaggtaggta ccactattat 1320

ttacaggtga ggaaatggag gctcagagag gttaagtgaa ttgatccagg ccacacagct 1380

ggtaagcgcc agagccacta gtggacgcca ggtccagcca gcccccagag cccatgtgct 1440

gagccactgt gctatactga ctcccactta attctctctt ctgggttgtc ccaaagacca 1500

agttcggctg gccaattttc caggaccatc tctcatggca cctggaggct tgtaggttcc 1560

tggaggactc tcacacctcc ttcccaccct tctccagatt ctccaactcc ctcttgagca 1620

gacccggccc cactctgggg caccctgcct tcctgggacc tgtcgtaaca gtcacccact 1680

ctgccagggc ctggctgacc caggctgggg accgtgggac ccctctgggc agtgcccccc 1740

tacctgggcc caggtgggta tggatttctt tcttctgggc cattgcaccc gccagaaggt 1800

gcggtgggag aggcaggccc acatttcaga gggccttgct gcccccatgt ggcatgaggc 1860

tgtagcggct gcagcctcct cttccctccc tcctgccact gctcccgaag ccaaggcttt 1920

tgcagggttg aaaaggaaga gaaagaggag aagcaggaat gtgagagaaa tgaggcagag 1980

ggatgggcta gggaagagag aagcccttct gcgttacctg gaaatgcagc aacaataata 2040

acaaagccaa tgttaggaat gtttaaaggc agctgccaca tagcactttt tatagcttgt 2100

agactctctc atttaatcct ggcacttaca tcaatctgat tagtagctat tattagtttt 2160

ataggtgatg atccaaggcg caattatttg ttccccagct agtaggtgac agagcccaga 2220

ttgaatctga ctccagaacc ctaaccacga tattcccctg tctagaagga gccagttctc 2280

tcctgcaacc cccactgctc agcctctagg agttccagcc accagccacc tgcaccctcc 2340

cttccatgtg gctttgccct ctgttcttct cctctccact ctctctccaa ggtccaagtg 2400

gtcaaggtca tcccaagggt ctgctgggac cgtgtgtcct tattctgtgc cttgctggtc 2460

gccaaccttc cccatctgcc aaggactgat gtccagccca ggcccaggtg caggtgccca 2520

ggtcattttt gccactgagt aaagggagac agaatgacag ggtaaattac caaccaccag 2580

aacaccatgg agccaatagc atcaatgcaa gtgaagtata tttatctgtt ggcctgaaaa 2640

catgtcctag tatattgtcc cattaagcaa aaagcaggtt ataaagctgt gtacattaag 2700

aaacatttta taagtgaaac aaaagtattc tccgtttcta tgcagagaaa aaggatattt 2760

gccaagatgt taacagatta tttttgctgt cttctcttgg cttatttttg ttttctcttt 2820

ttcaatgaac accaattagt cacatgattt taaaaagcaa taaaaataaa ccaatcccag 2880

acggattgta cttcttcctg tcctcatttc taccccgagt ctcc 2924

<210> 3

<211> 2103

<212> DNA

<213> 人源

<400> 3

ccgctcttcg gcccagtgac tgccctccct ggctgctccc ctcccggcct gcctttctcc 60

tccagctgtt cttcctcctc cagcactccc catcctcagc ctatccccac ccgcagcgtc 120

tcccctcccc agctgtttta cctctggtgg ctgcttcacc ctcccccggt cctctccact 180

tccagctgct ccctccaaag tttgtcctag tttccccctt cccagctctc cccattcgca 240

gcctcttcca tcttcaactc ttcttccctg ctagcctctt ccctcctccg atggtctctc 300

cttggcttct ctccaccccg cttgcttctt ctctagtctt tccctggccc tggcattagt 360

ctccttaccc tgtgccctgt cccaatgtgt gcccgggctt tgctccttgc gtgcagttcg 420

aggggaagac atcgtttgga atgtcagtgt tcaacctcag caacgccatc atgggcagcg 480

gcatcctggg gctggcctat gccatggccc acacgggggt catcttcttc ctggccctgc 540

tgctgtgcat tgcgcttctg tcgtcctact ccatccacct cctgctgacc tgtgctggta 600

ttgcaggcat ccgagcctat gagcagctgg gacagagggc attcgggcct gcggggaagg 660

tagtggtggc cacagtcatc tgtctgcaca atgttggggc catgtccagt tacctgttca 720

tcatcaaatc tgagctcccc ctggttatcg gcaccttcct gtacatggac cccgaggggg 780

actggttctt gaagggaaac ctcctcatca tcatcgtcag tgtgttaatc atcctgcccc 840

tcgccctcat gaaacacttg ggctacctgg ggtacaccag tggtctctct ctgacctgca 900

tgctgttttt ccttgtttcg gtcatctaca agaagttcca acttggctgt gctataggcc 960

acaatgaaac agcaatggag agtgaagctc tcgtgggact ccccagccaa ggactcaaca 1020

gcagctgtga ggcccagatg ttcacagttg actcacagat gtcctacaca gtgcccatta 1080

tggcttttgc ttttgtctgc caccctgagg tgctgcccat ctatacggag ctctgccggc 1140

cctccaagcg caggatgcag gccgtggcca acgtgtccat tggggccatg ttctgcatgt 1200

atgggctcac agcaaccttt ggatacctca ccttctacag cagtgtgaag gcggagatgc 1260

tgcacatgta cagccagaag gacccgctca tcctctgtgt gcgcctggcc gtgctgctcg 1320

cggtgaccct cactgtgcca gtcgtgctgt tccctatccg ccgggccctg cagcagctgc 1380

ttttcccagg caaggccttc agctggccac gacatgtggc catagctctg atcctgcttg 1440

ttttggtcaa tgtccttgtc atctgtgtgc caaccatccg ggatatcttt ggagttatcg 1500

ggtccacctc agcccccagc ctcatcttca tcctccccag catcttctac ctccgcattg 1560

taccctctga ggtggagcct ttcttatcct ggcccaagat ccaggccctg tgctttggag 1620

tcctgggagt cctcttcatg gccgtcagtc taggctttat gtttgccaac tgggccacag 1680

gccagagccg catgtctgga cactgatcag gccctgctgg cccaggtccc tgtgcgcatg 1740

cacatggagg ggtcagggcc gctccctagg gtccctcctg cccaacatgt ggaggtggct 1800

ggttcccatg aacgtggttg tcagaggcgg gggacagcag aggctgcaga ctggcccact 1860

tccctcctcc ccagggatgc caagcttgga tcatggccct aatcccaacc ccaaccccat 1920

gggaggagga ggaggaggaa gaagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg 1980

aggccaggtc ctggtggagc ctttgcccag cccagtcctc tctgcctcct cctggctgaa 2040

gctgtttgtc aggattaccc tcgggctaaa gaggaaaaat aaagatgttg agctaccact 2100

ctg 2103

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaggccgaag gattgcttca agg 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctggtccta atggcactgt actc 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agaggcagca gaagaggagg aag 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttggcgatgg tcttgactga atcc 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttgactcaca gatgtcctac ac 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctgctgtaga aggtgaggta t 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtggccgagg actttgattg 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cctgtaacaa cgcatctcat att 23

Claims (10)

1.一种生物标志物在制备诊断湿热困脾型2型糖尿病的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物为长链非编码RNA RP11-7F17.5、PARP2基因编码的PARP2 mRNA或SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PARP2基因编码的PARP2 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA RP11-7F17.5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒或试纸。

6.一种用于辅助诊断湿热困脾型1型糖尿病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性检测PARP2基因编码的PARP2 mRNA的引物对、用于特异性检测长链非编码RNARP11-7F17.5的引物对或用于特异性检测SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA的引物对中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性检测PARP2基因编码的PARP2 mRNA的引物对具有如SEQ ID NO.4所示序列和具有如SEQ ID NO.5所示序列。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性检测长链非编码RNARP11-7F17.5的引物对具有如SEQ ID NO.6所示序列和具有如SEQ ID NO.7所示序列。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性检测SLC38A5基因编码的SLC38A5 mRNA的引物对具有如SEQ ID NO.8所示序列和具有如SEQ ID NO.9所示序列。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本包括血液。

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