CN115747217B - 长链非编码rna pdxdc1-as1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA PDXDC1‑AS1，其可用作冠状动脉粥样硬化的生物标志物，用于冠状动脉粥样硬化性心脏病生物学鉴定及临床检测，应用该基因表达水平进行诊断，可以早期发现冠心病患者，降低冠心病死亡率，改善患者预后。目前冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要诊断方法存在手术危险系数高、辐射大等风险，通过收集患者外周血进行检测，具有创伤小、可重复性好等优点，更易于被接受。

Description

长链非编码RNA PDXDC1-AS1及其应用

技术领域

本发明属于分子标志物技术领域，特别涉及一种长链非编码RNA PDXDC1-AS1及其表达量检测制剂在制备冠状动脉粥样硬化诊断试剂中的应用。

背景技术

长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的内源性RNA分子，lncRNA最开始被认为是转录过程中的副产物，不具有生物学功能。然而，随着研究水平的深入及研究技术的进步，研究者们发现lncRNA会广泛参与到染色体沉默，基因组印记、染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，涉及免疫学、神经生物学、癌症和应激等生物学发展过程，可作为疾病识别和预后的生物标志物。

近来研究发现长链非编码RNA可以通过“lncRNA转录本-蛋白双重作用”参与表型转换、加重血管重构的功能和分子机制，提出lncRNA及其编码短肽/蛋白共同发挥相同生物学功能，为lncRNA研究领域提供了新的理论基础。

在人类基因组中，lncRNA数量要远多于编码RNA，目前除少数lncRNA的功能比较明确外，大部分lncRNA的功能还处于未知状态。并且，目前大部分研究集中在与癌症相关的lncRNA上，lncRNA在冠状动脉粥样硬化中的作用尚不明确。

发明内容

本发明的目的是提供一种诊断冠状动脉粥样硬化的诊断生物标志基因lncRNAPDXDC1-AS1，并提供上述基因的应用，该基因及其检测制剂可用作冠状动脉粥样硬化诊断生物标志物，可制备冠状动脉粥样硬化诊断试剂。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种长链非编码RNA基因PDXDC1-AS1，所述PDXDC1-AS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

检测长链非编码RNA基因PDXDC1-AS1表达量的制剂在制备诊断冠状动脉粥样硬化的诊断试剂中的应用，所述PDXDC1-AS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，检测制剂通过检测被试者PBMC细胞中PDXDC1-AS1的表达，与健康对照组相比较表达显著上调，以此来判断被试者有冠状动脉粥样硬化。

诊断冠状动脉粥样硬化的标志物，所述标志物为长链非编码RNA基因PDXDC1-AS1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种冠状动脉粥样硬化的诊断试剂，包括：检测长链非编码RNA基因PDXDC1-AS1表达量的制剂，所述RNA基因PDXDC1-AS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种冠状动脉粥样硬化的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中包括权利要求5所述的诊断试剂。

进一步的，诊断试剂盒采用以下步骤进行检测：

(1)从待测样品中分离PBMCs，从PBMCs中提取纯化RNA；

(2)去除步骤2中的获得产物中的gDNA，加入逆转录试剂，进行逆转录反应；

(3)以步骤2获得的cDNA为模板，加入扩增引物，进行实时荧光定量聚合酶链式反应；

(4)对步骤3扩增得到的DNA产物进行凝胶电泳分析或进行测序；

(5)根据步骤4的结果与正常对照组基因表达水平进行对比，根据基因表达水平差异，分析待测样品中是否存在该基因差异表达。

进一步的，扩增引物中正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明通过高通量转录组RNA测序研究技术，对人外周血单个核细胞进行测序，发现在冠状动脉粥样硬化过程中表达量具有显著差异的lncRNA，该lncRNA在冠状动脉粥样硬化患者及正常对照中表达差异具有显著统计学意义。该基因位于人类第16号染色体，与蛋白编码基因所在链相同并且存在部分重叠，其表达量在冠状动脉粥样硬化患者中显著上调(P<0.05)。通过比较基因组学研究，对比该基因在不同人群中的表达，可区分冠状动脉粥样硬化患者及正常人群，作为诊断的生物标志物。

本发明提供了一种适用于冠状动脉粥样硬化分子鉴定的标准基因及分子鉴定方法，该基因能有效的区分正常人和冠状动脉粥样硬化患者，应用该基因表达水平进行诊断，可以早期发现冠心病患者，降低冠心病死亡率，改善患者预后。目前冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要诊断方法存在手术危险系数高、辐射大等风险，通过收集患者外周血进行检测，具有创伤小、可重复性好等优点，更易于被接受。

附图说明

图1是实施例1中PBMCs测序两组中lncRNA表达

图2是实施例2中lncRNA PDXDC1-AS1在临床标本中表达特征。

图3是实施例2中lncRNA PDXDC1-AS1在临床标本中受试者工作特征曲线分析结果。

图4是实施例3中lncRNA PDXDC1-AS1在HCASMCs增殖迁移模型的生物学功能。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

实施例1：寻找与冠状动脉粥样硬化性心脏病相关的长链非编码RNA

应用转录组高通量测序技术，分离通过冠状动脉造影确诊的正常对照组(n＝5)及冠心病患者组(n＝5)的外周血单个核细胞，进一步提取RNA进行测序。使用rRNADepletion Kit移除总RNA中的rRNAs。使用TruSeq Stranded Total RNA Library PrepKit，以rRNA-depleted RNAs构建RNA测序文库。使用BioAnalyzer 2100仪器进行文库质控和定量。在Illumina Novaseq 6000测序仪上进行150bp双端reads测序。

使用hisat2软件，将高质量reads比对到人类参考基因组(UCSC HG19)上。然后使用HTSeq软件获得原始count数，使用edgeR进行标准化并计算两组样品间的倍数变化和p-value，以筛选差异表达LncRNA。根据临近关系，预测LncRNA的靶基因，进行靶基因的GO和KEGG通路分析。

经过数据分析，我们共发现26027个LncRNAs，在这些LncRNA中，采用倍数变化>2,p<0.05的标准进行筛选，其中2149个LncRNA存在差异表达。其中lncRNA PDXDC1-AS1表达量差异最为显著，GO分析表明PDXDC1相关的分子功能注释包括磷酸吡哆醛结合(GO:0030170)和羧基裂解酶活性(GO:0016831)，对PDXDC1基因进行全基因组关联分析检索发现其存在甘油三酯及omega-6多不饱和脂肪酸表型。

实施例2：判断lncRNA PDXDC1-AS1作为诊断标志物的效能

(1)入组患者：入组经冠脉造影证实的连续性冠心病患者270例与正常对照组患者47例。根据造影结果，选择至少一条冠状动脉狭窄>程度50％的受试者为患者组，所有冠状动脉狭窄程度均<50％的受试者为对照组。

(2)分离样品：通过密度梯度离心分离PBMCs，样品与淋巴细胞分离液体积为1：1，2000rpm*20min，分层后使用移液器插入云雾层，吸取单个核细胞，然后将其保存在TRIzol试剂中，总RNA用氯仿12000g离心15min提取，用等体积异丙醇离心12000g×10min沉淀，用75％乙醇离心7500g×5min纯化，最后溶于无RNA酶的水中。

(3)设计引物：基于如SEQ ID NO.1所示的序列设计了PCR引物，引物序列如下：

F：5’-CCCATGAGACTTCCAGACCTTG-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示

R:5’-GCCTCAAGTCATCTATGCTCCTG-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示

(4)逆转录：使用Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂进行逆转录，反应在冰上进行。

(5)扩增：以步骤(3)扩增的cDNA作为模板，qPCR SYBR Green Master Mix试剂配置反应体系，两步法进行实时定量PCR，反应程序为：95℃/5min预变性，95℃/10s变性，60℃/30s退火/延伸，40个循环重复，单个样品设置三个复孔，并通过ΔΔCt法计算相对表达量。

(6)验证结果：统计分析结果表明，lncRNA PDXDC1-AS1(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)在两组间存在显著表达差异(p<0.001)，该基因在冠心病组中存在高表达。受试者工作特征曲线分析结果，其曲线下面积大于0.5，表明该基因对于冠状动脉粥样硬化具有一定的诊断能力。

实施例3：lncRNA PDXDC1-AS1在体外的表达水平

(1)细胞造模：人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMCs)购自Sigma。氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)是低密度脂蛋白(LDL)的氧化修饰形式，在动脉粥样硬化的诱导和进展中起着关键作用，我们用不同浓度(0、50、80和100mg/L)的OX-LDL诱导HCASMCs。

(2)提取RNA：将贴壁细胞使用胰酶消化1min，离心后加入TRIzol试剂，总RNA用氯仿12000g离心15min提取，用等体积异丙醇离心12000g×10min沉淀，用75％乙醇离心7500g×5min纯化，最后溶于无RNA酶的水中。

(3)设计引物：基于如SEQ ID NO.1所示的序列设计了PCR引物，引物序列如下：

F：5’-CCCATGAGACTTCCAGACCTTG-3’

R:5’-GCCTCAAGTCATCTATGCTCCTG-3’

(4)逆转录：使用Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂进行逆转录，反应在冰上进行。

(5)扩增：以步骤(3)扩增的cDNA作为模板，qPCR SYBR Green Master Mix试剂配置反应体系，两步法进行实时定量PCR，反应程序为：95℃/5min预变性，95℃/10s变性，60℃/30s退火/延伸，40个循环重复，单个样品设置三个复孔，并通过ΔΔCt法计算相对表达量。

(6)验证结果：统计分析结果表明，lncRNA PDXDC1-AS1在OX-LDL诱导后的HCASMCs中低表达，并且在50mg/ml和80mg/ml的ox-LDL组与对照组间存在显著表达差异(p<0.05)。

上述结果表明，lncRNA PDXDC1-AS1参与了冠状动脉粥样硬化过程中，通过检测该基因表达水平诊断及鉴别冠状动脉粥样硬化患者具有可行性。

应理解，本发明仅以举例方式加以描述并可同时在本发明的范围和精神内进行修改。以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的试验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (6)

1. 检测长链非编码RNA基因PDXDC1-AS1表达量的制剂在制备诊断冠状动脉粥样硬化的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述PDXDC1-AS1的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，所述检测制剂通过检测被试者PBMC细胞中PDXDC1-AS1的表达，与健康对照组相比较表达显著上调，以此来判断被试者有冠状动脉粥样硬化。

3. 一种冠状动脉粥样硬化的诊断试剂，其特征在于包括：检测长链非编码RNA基因PDXDC1-AS1表达量的制剂，所述RNA基因PDXDC1-AS1的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示 。

4.一种冠状动脉粥样硬化的诊断试剂盒，其特征在于：所述诊断试剂盒中包括权利要求3所述的诊断试剂。

5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒，其特征在于：所述诊断试剂盒采用以下步骤进行检测：

（1）从待测样品中分离PBMCs，从PBMCs中提取纯化RNA；

（2）加入逆转录试剂，进行逆转录反应；

（3）以步骤2获得的cDNA为模板，加入扩增引物，进行实时荧光定量聚合酶链式反应；

（4）对步骤3扩增得到的DNA产物进行凝胶电泳分析或进行测序；

（5）根据步骤4的结果与正常对照组基因表达水平进行对比，根据基因表达水平差异，分析待测样品中是否存在该基因差异表达。

6.根据权利要求5所述的诊断试剂盒，其特征在于：所述扩增引物中正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。