CN110066876A - 一种用于癌症诊断的分子标志物 - Google Patents

一种用于癌症诊断的分子标志物 Download PDF

Info

Publication number
CN110066876A
CN110066876A CN201910490076.XA CN201910490076A CN110066876A CN 110066876 A CN110066876 A CN 110066876A CN 201910490076 A CN201910490076 A CN 201910490076A CN 110066876 A CN110066876 A CN 110066876A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reagent
expression
gene
stomach
sdenocarcinoma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910490076.XA
Other languages
English (en)
Inventor
董东
郑骏年
李曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xuzhou Medical University
Original Assignee
Xuzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xuzhou Medical University filed Critical Xuzhou Medical University
Priority to CN201910490076.XA priority Critical patent/CN110066876A/zh
Publication of CN110066876A publication Critical patent/CN110066876A/zh
Priority to CN202010499066.5A priority patent/CN111471772B/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Abstract

本发明公开了一种用于癌症诊断的分子标志物，本发明通过高通量测序技术首先发现了RP11‑576I22.2在胃腺癌中表达上调，即通过检测RP11‑576I22.2的表达水平可以判断受试者是否患有胃腺癌。

Description

一种用于癌症诊断的分子标志物
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种用于癌症诊断的分子标志物，所述分子标志物为RP11-576I22.2。
背景技术
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率在所有恶性肿瘤中居第4位，病死率居第2位。每年全球范围新发胃癌近百万例，其中接近50.0％发生在中国。在我国，最近年新发胃癌病例67.9万，在所有肿瘤发病中位于第二，每年胃癌死亡病例49.8万，仅于肝癌，位于第三(W Chen,R Zheng,PD Baade,et al.Cancer statistics in China,2015.CACancer J Clin 2016.)。胃癌最有效的治疗手段为根治性手术，然而，我国早期胃癌诊治率较低，绝大多数病人往往在就诊时已经是进展期，这部分病人即使接受了根治性手术，术后仍有40.0％～70.0％会复发(J Deng,H Liang,D Wang,et al.Investigation of therecurrence patterns of gastric cancer following a curative resection.SURGTODAY 2011，41(2):210-215.)。近年来，由于放疗化疗等多种治疗方法的参与，我国胃癌患者生存略有改善，但远不理想，5年生存率仍徘徊在20％～30％左右(L Yang:Incidenceand mortality of gastric cancer in Ghina.World J Gastroentero12006,12(1):17-20.)。因此，胃癌仍旧是危及我国人民生命健康的主要问题之一，不断深入研究胃癌的发生发展机制，寻求有效分子靶标，为预防、治疗胃癌提供新思路、新方法刻不容缓。
同其它肿瘤一样，胃癌的发生是一个多基因改变、多种信号参与的复杂演变过程。癌基因或抑癌基因可能通过突变或表观遗传学改变激活相关信号传递，进而一步步引发癌变。基因改变如突变、扩增、缺失、等位基因丧失以及染色体转位等都可能使癌基因激活或抑癌基因失去功能，最终引发肿瘤。同时，胃癌的发生也有基因表观遗传学方面的改变，如异常甲基化，组蛋白的重塑以及非编码RNA的参与(J Shi,YP Qu,P Hou:Pathogeneticmechanisms in gastric cancer.World J Gastroenterol 2014,20(38):13804-13819.)。过往对肿瘤发生发展的研究主要关注在蛋白编码基因，然而在基因转录产物中编码蛋白的只占基因组2％，剩下绝大部分为非编码RNA(ncRNAs)。按照长度的不同，ncRNAs分为小分子ncRNA(<200nt)，和长链ncRNA(>200nt)。近年来研究发现，原被认为是转录垃圾的非编码RNA有着各种生物学功能，并在肿瘤的发生发展中起着重要的促进或抑制作用。如miRNA通过与靶基因相互作用下调抑癌基因的表达或增强癌基因的表达，从而参与肿瘤的发生、发展(XY Fang,HF Pan,RX Leng,et al.Long noncoding RNAs:novel insights intogastric cancer.CANCER LETT 2015,356(2Pt B):357-366.)。随着1ncRNA在代谢、发育、分化等生理过程中所展现的基因表达调节作用被发现，其引起了研究者们的高度关注。众多研究表明，1ncRNA可通过促进细胞增殖、消除生长抑制、诱导血管生成及抑制调亡等调节作用在肿瘤发生、发展过程中扮演着重要的角色。
目前，lncRNA在胃癌发生、发展中的具体作用与主从关系还不清楚，更有众多胃癌相关1ncRNA作用不明。更好地利用1ncRNA这一新的调控体系解析胃癌病理机制并将其应用具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序的方法，检测胃腺癌标本中lncRNA在肿瘤组织和正常组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与胃腺癌的发生之间的关系，从而为胃腺癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测RP11-576I22.2的试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的应用。
进一步，所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测RP11-576I22.2表达水平的试剂。
进一步，通过反转录PCR检测RP11-576I22.2表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-576I22.2的引物，通过实时定量PCR检测RP11-576I22.2表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-576I22.2的引物，通过原位杂交检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2的探针，通过芯片技术检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2的探针。
进一步，通过实时定量PCR检测RP11-576I22.2表达水平的特异性扩增RP11-576I22.2的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
进一步，所述产品包括芯片、试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的特异性识别RP11-576I22.2的寡核苷酸探针，所述试剂盒包括特异性扩增RP11-576I22.2的引物、特异性识别RP11-576I22.2的寡核苷酸探针或芯片。
特异性识别RP11-576I22.2的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
许多表达检测方法使用分离的RNA。起始材料典型地是从生物样品，例如分别从肿瘤或肿瘤细胞系，以及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如果RNA的来源是原发性肿瘤，则可以从冷冻的或保存的石蜡包埋并固定的(例如福尔马林固定的)组织样品(例如病理学家指导的组织核心样品)中提取RNA(例如mRNA)。
RNA提取的一般方法是本领域熟知的。特别地，可以使用来自商业制造商，例如TIANGEN的纯化试剂盒、缓冲剂套组和蛋白酶进行RNA分离，按照制造商的说明进行。其它可商购的RNA分离试剂盒可包括MASTERPURETM Complete DNA和RNA纯化试剂盒(Epicentre,Madison,Wis.)和Paraffin Block RNA分离试剂盒(Ambion,Austin,TX)。例如，可以使用RNA Stat-60(Tel-Test,Friendswood,TX)从组织样品中分离总RNA。例如，可以使用高纯FFPE RNA Microkit,货号04823125001(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)从FFPE中分离总RNA。例如，可以通过氯化铯密度梯度离心分离从肿瘤制备的RNA。此外，可以通过使用本领域技术人员熟知的技术容易地处理大量组织样品。
分离的RNA可用于杂交或扩增测定中，包括，但不限于PCR分析和探针阵列。用于检测RNA水平的一种方法包括使分离的RNA与能与由被检测基因杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是，例如，全长cDNA，或其部分，例如长度为至少7,15,30,60,100,250或500个核苷酸并且在严谨条件下足以与本发明公开的内在基因，或任何衍生的DNA或RNA特异性杂交的寡核苷酸。RNA与探针的杂交表示所述的内在基因正在表达。
在一个实施方案中，RNA被固定在固体表面上并与探针接触，例如通过使分离的RNA在琼脂糖凝胶上运行，并将RNA从胶上转移至膜，例如硝酸纤维素膜。在替代的实施方案中，探针被固定在固体表面上，RNA例如在Agilent的基因芯片阵列中与探针接触。技术人员可以容易地改变已知的RNA检测方法以适用于检测本公开的内在基因的表达水平。
在本发明的实施方案中，通过定量RT-PCR评价内在基因表达。许多不同的PCR或QPCR方案是本领域已知的，并可以直接应用它们或者对其进行改变以适用于使用当前所述的组合物来检测和/或定量本发明中所列的内在基因。通常，在PCR中，用至少一种寡核苷酸引物或一对寡核苷酸引物进行反应扩增靶核苷酸序列。一个或多个引物与靶核酸的互补区域杂交，并且DNA聚合酶延伸一个或多个引物以扩增靶序列。在足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物的条件下，单一大小的核酸片段在反应产物(靶多核苷酸序列，其是扩增产物)中占优势。重复扩增循环以增加单个靶多核苷酸序列的浓度。可以在任何通常用于PCR的热循环仪中进行反应。但是，优选的是具有实时荧光测量能力的循环仪，例如，(Cepheid,Sunnyvale,CA)、ABI PRISM (Applied Biosystems,Foster City,Calif.)、ROTOR-GENETM(Corbett Research,Sydney,Australia)、(Roche Diagnostics Corp,Indianapolis,Ind.)、(BioradLaboratories,Hercules,Calif.)和(Stratagene,La Jolla,Calif.)。
本发明提供了一种诊断胃腺癌的产品，所述产品包括检测RP11-576I22.2表达水平的试剂。
进一步，所述产品包括芯片或试剂盒，芯片中检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2基因的探针；试剂盒中检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性扩增RP11-576I22.2基因的引物或特异性识别RP11-576I22.2基因的探针。
作为一种实施方案，试剂盒包含一组寡核苷酸引物，所述引物足以检测和/或定量本发明所述的内在基因。寡核苷酸引物可以以冻干或重构的形式提供，或者可以作为一组核苷酸序列提供。在一个实施方案中，以微孔板(microplate)的形式提供引物，其中每一个引物组占用微孔板中的一个孔(或多个孔，如在重复的情况下)。微孔板可以进一步包含足以检测如下所述的一个或多个看家基因的引物。试剂盒可以进一步包含足以扩增本发明所述的基因的表达产物的试剂和说明。
为了便于快速访问，例如为进行比较、检查、恢复、和/或修改，分子特征/表达概况典型地记录在数据库中。最典型地，数据库是可由计算机设备访问的关系数据库，虽然可以使用其它形式，例如作为照片、模拟或数字成像读数、电子表格等的表达概况的手动访问索引文件。无论最初记录的表达模式本质上是模拟的或数字的，表达模式、表达概况(集合的表达模式)和分子特征(相关表达模式)以数字形式储存并通过数据库访问。典型地，数据库在中央设备编辑并维持，可以在本地和/或远程访问。
进一步，特异性扩增RP11-576I22.2基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明提供了RP11-576I22.2在构建预测胃腺癌的计算模型中的应用。
本发明提供了RP11-576I22.2在制备治疗胃腺癌的药物组合物中的应用。
在本发明中，术语“RP11-576I22.2”位于1号染色体上，基因号为ENSG00000231407，包括RP11-576I22.2基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的RP11-576I22.2，以及源自细胞中加工的任何形式的RP11-576I22.2。该术语涵盖RP11-576I22.2的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。目前RP11-576I22.2存在四个转录本，转录本ID分别为ENST00000416416.1、ENST00000446102.1、ENST00000421020.1、ENST00000456083.1。一种代表性的RP11-576I22.2的序列如ENST00000416416.1所示。
本领域技术人员知道，在对原始测序结果进行生物信息学分析时，通常会将测序结果和已知的基因进行比对，只要测序片段可以比对到相关基因上，就可以看做是该基因的表达，因此，在提及差异表达的基因时，该基因的不同的转录本同时包含在本发明中。
在本发明的一个实施方案中，通过评价一个或多个主体样品中本发明所述的内在基因的表达模式或表达概况来评估胃腺癌亚型。为了讨论的目的，术语主体，或主体样品，指个体，不管其健康和/或疾病状态。主体可以是受试者、研究参与者、对照主体、筛选主体、或任何由其获得样品的并在本发明的背景下被评估的其他类别的个体。相应地，主体可以被诊断为患有胃腺癌，可以呈现出胃腺癌的一种或几种症状，或者对于胃腺癌的诱发因素，例如家族(遗传)或医疗史(医疗)因素，可以正在接受胃腺癌的治疗或疗法，等等。或者，就任何上述因素或标准而言，主体可以是健康的。应当理解本文使用的术语“健康”是相对于胃腺癌状态而言的，因为术语“健康”不能定义为相应于任何绝对的评价或状态。因此，对于任何特定疾病或疾病标准来说，被定义为健康的个体可以实际上被诊断为患有任何其它一种或多种疾病，或者表现出任何其它一种或多种疾病标准，包括一种或多种除胃腺癌以外的癌症。但是，健康对照优选没有任何癌症。
在特定的实施方案中，预测胃腺癌内在亚型的方法包括收集包含癌细胞或组织的生物样品，例如乳腺组织样品或原发乳腺肿瘤组织样品。“生物样品”意指任何在其中可以检测内在基因表达的细胞、组织、或体液的取样。这种生物样品的实例包括，但不限于活组织检查和涂片。可用于本发明的体液包括血液、淋巴液、尿液、唾液、乳头抽吸液、妇科液体、或任何其它身体分泌液或其衍生物。血液可以包括全血、血浆、血清或任何血液衍生物。在一些实施方案中，生物样品包括乳腺细胞，特别是来自活组织检查的乳腺组织，例如乳腺肿瘤组织样品。可以通过多种技术从主体获得生物样品，包括，例如通过刮擦或擦抹一个区域、通过使用针抽吸细胞或体液、或者通过移除组织样品(即活组织检查)。收集各种生物样品的方法是本领域熟知的。在一些实施方案中，通过，例如，细针抽吸活检，穿刺活检，或切除活检获得乳腺组织样品。可以对细胞或组织应用固定剂和染色液以保存样本并便于检查。生物样品，特别是乳腺组织样品，可以转移至载玻片以进行放大观察。在一个实施方案中，生物样品是福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺组织样品，特别是原发乳腺肿瘤样品。在不同的实施方案中，从病理学家指导的组织核心样品获得组织样品。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了RP11-576I22.2基因的表达水平与胃腺癌相关，通过检测受试者样本中RP11-576I22.2的表达水平，可以判断受试者是否患有胃腺癌，以及患胃腺癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种与胃腺癌相关的RP11-576I22.2基因分子标记物，采用分子标记物进行诊断，相比传统诊断手段，更及时、更灵敏、更特异。
附图说明
图1是利用QPCR检测RP11-576I22.2基因在胃腺癌组织中的表达情况图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与胃腺癌相关的基因标志物
1、样品收集
分别收集4例胃腺癌的癌组织及相对应的癌旁组织样本，进行高通量测序，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗。
2、RNA样品的制备及质量分析
使用天根的动物组织总RNA提取试剂盒(目录号为DP431)进行总RNA的提取，步骤详见说明书。
1)匀浆处理
每10-20mg组织加300μl裂解液RL，用研磨杵将组织彻底研磨；随后向匀浆液中加入590μl RNase-Free ddH2O和10μl Proteinase K，混匀后56℃处理10-20min。
2)12,000rpm离心2-5min，取上清进行以下操作。
3)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
5)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。
6)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
7)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
8)重复步骤7)。
9)12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液。
11)RNA的质量检测
用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性(电泳条件：胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15min)检测完整性。28S rRNA是18S rRNA的两倍时，说明RNA的完整性较好。
用分光光度计检测RNA的浓度及纯度，OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，RNA的质量较高。
3、cDNA文库的构建及测序
cDNA文库的构建及测序由华大基因完成，步骤如下：
1)总RNA DNase I消化：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水；
2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；
3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到140-160nt；
4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；
5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成带有dUTP的二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收；
6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复，末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；
7)cDNA 3’末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；
8)cDNA5’adapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；
9)UNG消化cDNA二链：配制UNG消化反应体系，通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；
10)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增，对PCR产物进行磁珠纯化回收，回收产物溶于EB溶液中，贴上标签。
11)文库质量检测：使用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库质量进行检测；
12)上机测序：检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，最后使用Illumina Hiseq x-ten平台进行测序。
4、生物信息学分析
1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
2)tophat比对到参考基因组上，参考基因组版本为GRCh37.p13；
3)cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；
4)cuffdiff包比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异。
5、结果
测序结果显示，RP11-576I22.2在胃腺癌患者中表达显著上调，提示RP11-576I22.2可能作为检测靶标应用于胃腺癌的早期诊断。
实施例2QPCR测序验证RP11-576I22.2基因的差异表达
1、按照实施例1的收集方式收集的31例胃腺癌患者癌组织样本和癌旁组织样本对RP11-576I22.2基因差异表达进行大样本QPCR验证。
2、RNA提取
使用天根的动物组织总RNA提取试剂盒(目录号为DP431)进行总RNA的提取，具体步骤参见实施例1。
3、QPCR
根据RP11-576I22.2和GADPH的基因序列设计引物，引物序列如下：
RP11-576I22.2：
正向引物：5′-AGTATGAGGTAGCCAACA-3′(SEQ ID NO.1)
反向引物：5′-AACTTGACTTCTGACATCTT-3′(SEQ ID NO.2)
GAPDH：
正向引物：5′-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3′(SEQ ID NO.3)
反向引物：5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′(SEQ ID NO.4)
使用天根公司的Quant一步法反转录-荧光定量试剂盒(SYBR Green)试剂盒(目录号：NG105)进行PCR反应，反应体系和反应条件如表1所示。在Thermal Cycler RealTime System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。
表1 QPCR反应体系和反应条件
4、结果
QPCR结果如图1所示，与癌旁组织相比，RP11-576I22.2在胃腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示可通过检测RP11-576I22.2的水平判断受试者是否患有胃腺癌，当RP11-576I22.2的水平显著增加时，受试者患有胃腺癌或者存在患有胃腺癌的风险，通过RP11-576I22.2与胃腺癌之间的关系可以设计靶向RP11-576I22.2的干扰RNA从而治疗胃腺癌。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> 一种用于癌症诊断的分子标志物
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtatgaggt agccaaca 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacttgactt ctgacatctt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagccccagc cttctccat 19

Claims (10)

1.检测RP11-576I22.2的试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的应用。
2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测RP11-576I22.2表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过反转录PCR检测RP11-576I22.2表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-576I22.2的引物，通过实时定量PCR检测RP11-576I22.2表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-576I22.2的引物，通过原位杂交检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2的探针，通过芯片技术检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过实时定量PCR检测RP11-576I22.2表达水平的特异性扩增RP11-576I22.2的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒。
6.一种诊断胃腺癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测RP11-576I22.2表达水平的试剂。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒，芯片中检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性识别RP11-576I22.2基因的探针；试剂盒中检测RP11-576I22.2表达水平的试剂包括特异性扩增RP11-576I22.2基因的引物或特异性识别RP11-576I22.2基因的探针。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，特异性扩增RP11-576I22.2基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
9.RP11-576I22.2在构建预测胃腺癌的计算模型中的应用。
10.RP11-576I22.2在制备治疗胃腺癌的药物组合物中的应用。
CN201910490076.XA 2019-06-06 2019-06-06 一种用于癌症诊断的分子标志物 Pending CN110066876A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910490076.XA CN110066876A (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种用于癌症诊断的分子标志物
CN202010499066.5A CN111471772B (zh) 2019-06-06 2020-06-04 一种用于癌症诊断的分子标志物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910490076.XA CN110066876A (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种用于癌症诊断的分子标志物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110066876A true CN110066876A (zh) 2019-07-30

Family

ID=67372603

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910490076.XA Pending CN110066876A (zh) 2019-06-06 2019-06-06 一种用于癌症诊断的分子标志物
CN202010499066.5A Active CN111471772B (zh) 2019-06-06 2020-06-04 一种用于癌症诊断的分子标志物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010499066.5A Active CN111471772B (zh) 2019-06-06 2020-06-04 一种用于癌症诊断的分子标志物

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN110066876A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112837749A (zh) * 2021-02-01 2021-05-25 北京百奥纳芯生物科技有限公司 一种癌症筛查用基因芯片探针的优选方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110110923A1 (en) * 2008-02-12 2011-05-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Fish assay for eml4 and alk fusion in lung cancer
US9410206B2 (en) * 2011-11-30 2016-08-09 John Wayne Cancer Institute Long noncoding RNA (lncRNA) as a biomarker and therapeutic marker in cancer
CN103937796A (zh) * 2014-04-16 2014-07-23 宁波大学 一对胃癌发生相关的竞争性内源rna
CN104878008B (zh) * 2015-05-13 2018-03-30 中国人民解放军总医院 长链非编码rna以及检测细胞系及组织中该长链非编码rna表达水平的引物对及试剂盒
CN107419004A (zh) * 2017-04-28 2017-12-01 青岛大学 lncRNA‑RP11‑290F20.3及其小干扰RNA的应用
WO2019067210A1 (en) * 2017-09-13 2019-04-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF AR AND / OR LNCRNA MEDIATION DISEASES
CN109609648B (zh) * 2019-01-31 2022-01-18 泰山医学院 与肝癌相关的lncRNA标志物及其检测引物和应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112837749A (zh) * 2021-02-01 2021-05-25 北京百奥纳芯生物科技有限公司 一种癌症筛查用基因芯片探针的优选方法
CN112837749B (zh) * 2021-02-01 2021-11-26 北京百奥纳芯生物科技有限公司 一种癌症筛查用基因芯片探针的优选方法
US11710537B2 (en) 2021-02-01 2023-07-25 Beijing Bionaxin Biotech Co., Ltd Optimal selection method of gene chip probes for cancer screening

Also Published As

Publication number Publication date
CN111471772A (zh) 2020-07-31
CN111471772B (zh) 2020-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6966508B2 (ja) 尿バイオマーカーコホート、遺伝子発現特性、およびその使用の方法
EP2215261B1 (en) A method of diagnosing neoplasms
CN104745679B (zh) 一种无创检测egfr基因突变的方法及试剂盒
ES2691404T3 (es) Diagnóstico no invasivo del cáncer
CN109182521B (zh) circRNA作为甲状腺乳头状癌标志物的应用
EP2800820A1 (en) Methods and kits for detecting subjects at risk of having cancer
CN108949992B (zh) 一种与食管鳞癌及其分级相关的生物标志物
CN107312770A (zh) 一种用于高通量测序检测的肿瘤brca1/2基因变异文库的构建方法及其应用
CN106350600A (zh) Loc80054在胰腺癌诊断或预后中的用途
CN108660209B (zh) 基于bmp3基因甲基化制备结直肠癌早期检测的产品
CN110157808A (zh) 一种与喉鳞癌发生发展相关的非编码rna的应用
CN110257516A (zh) 用于开发胃癌诊断产品的分子标志物及应用
CN108624693A (zh) miR-577在制备肾病诊断标志物中的应用
CN110066876A (zh) 一种用于癌症诊断的分子标志物
CN110592221B (zh) 一种早期结直肠癌诊断标志物circ4953及其应用
CN110592220B (zh) 一种早期结直肠癌诊断标志物circ3823及其应用
CN111424096B (zh) 一种与胃腺癌发生发展相关的生物标志物
CN115927614A (zh) 基于Alu重复原件的肠癌早期筛查检测引物、检测方法和试剂盒
CN111073981B (zh) 环状RNA circEMB_003作为结直肠癌标志物的应用
CN110541034B (zh) Linc01992在乳腺癌诊疗中的应用
CN113373229B (zh) 胃癌相关生物标志物及其应用
CN109628585A (zh) 非编码rna在诊断脓毒症中的应用
CN108342488A (zh) 一种用于检测胃癌的试剂盒
CN115747217B (zh) 长链非编码rna pdxdc1-as1及其应用
CN106591307A (zh) 肾上腺醛固酮腺瘤相关上调lncRNA及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190730

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication