CN104878008B

CN104878008B - 长链非编码rna以及检测细胞系及组织中该长链非编码rna表达水平的引物对及试剂盒

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Publication number: CN104878008B
Application number: CN201510242273.1A
Authority: CN
Inventors: 郭明洲; 张美英; 曹宝平; 高丹; 令狐恩强
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2015-05-13
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2018-03-30
Anticipated expiration: 2035-05-13
Also published as: CN104878008A

Abstract

本发明提供一种新发现的长链非编码RNA(Long noncoding RNA)Lnc5q21.2、检测结肠癌细胞系和组织中的该长链非编码RNA表达水平的引物对及试剂盒。本发明首次运用芯片技术发现长链非编码RNALnc5q21.2在结肠癌及癌旁组织中存在差异表达。通过5’‑RACE和3’‑RACE技术首次获得了Lnc5q21.2的全长序列。在结肠癌细胞系及20对结肠癌组织及配对癌旁组织和胃癌细胞系及20对胃癌组织及配对癌旁组织中，运用特异性引物通过半定量RT‑PCR技术检测长链非编码RNA Lnc5q21.2的表达水平，具有首创性。应用本发明试剂盒特异性检测结肠癌组织中长链非编码RNA Lnc5q21.2的表达，可以作为结肠癌及胃癌诊断、疗效观察、预后判断、残留病灶以及复发检测等的有力手段，并且操作简便、稳定性好、灵敏度高的特点，具有深远的临床意义和推广性。

Description

长链非编码RNA以及检测细胞系及组织中该长链非编码RNA表达水平的引物对及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种长链非编码RNA以及用于检测细胞系及组织中该长链非编码RNA表达水平的引物对及试剂盒。

背景技术

结肠癌是全球范围内常见肿瘤之一。结直肠癌的发生在男性中位于第三位，女性中位于第二位。2008年的一项全球癌症数据统计中，新增结肠癌病例和死亡病例分别为120万和608700例。以澳大利亚、新西兰、欧洲和北美为高发区。(AhmedinJemal,DVM,FreddieBray,Melissa M.Center.Global Cancer Statistics.CA CANCER J CLIN 2011.61:69–90)在我国，结肠癌同样是常见肿瘤之一，其发病率和死亡率均位于前五名。(WanqingChen,RongshouZheng,Siwei Zhang,Ping Zhao.The incidences and mortalities ofmajor cancers in China,2009.Chin J Cancer.2013.32(3):106-112)近年来，结肠癌的研究取得了实质性的进展。同时结肠癌早期筛查及诊断方法的研究，结肠癌病人的发病率和死亡率都有所下降，改善了结肠癌病人的预后。(Wendy S Atkin,Rob Edwards,InesKralj-Hans et al..Once-only flexiblesigmoidoscopy screening in prevention ofcolorectal cancer:a multicentrerandomised controlled trial.Lancet.2010.375:1624–33)靶向治疗结合常规化疗手段可以延长转移的结肠癌病人的生存时间。(UzmaAsghar,Eliza Hawkes,David Cunningham.Predictive and PrognosticBiomarkers for Targeted Therapy in Metastatic Colorectal Cancer.ClinColorectal Cancer.2010.9(5):274-281.)对于结肠癌分子水平的研究和理解为患者的筛查提供了方向。结直肠癌发生发展相关的分子标志物能够协助早期诊断和选择适当的化疗药物，对于提高结肠癌的早期诊断、合理治疗及预后评估都具有重要的意义。

胃癌是全球恶性肿瘤之一，2011年的全球癌症数据分析中可以看出，2008年约有989600例新生胃癌病例和738000死亡病例发生，占到了全球癌症发病总数中的8％和死亡总数的10％。同时超过70％的新发病例和死亡病例出现在发展中国家。中国胃癌的发生率和死亡率在恶性肿瘤中均位于第二位。(AhmedinJemal,DVM,Freddie Bray,MelissaM.Center.Global Cancer Statistics.CA CANCER J CLIN 2011；61:69–90.WanqingChen,RongshouZheng,Siwei Zhang,Ping Zhao.The incidences and mortalities ofmajor cancers in China,2009.Chin J Cancer.2013.32(3):106-112.)目前临床上对于胃癌的治疗主要以手术为主。TNM分期I期患者的5年生存率为60-70％，而III、IV期患者的5年生存率甚至不超过20％。(Hundahl SA,Phillips JL,Menck HR.The National CancerData Base Report on poor survival of U.S.gastric carcinoma patients treatedwith gastrectomy:Fifth Edition American Joint Committee on Cancer staging,proxima l disease,and the“different disease”hypothesis.Cancer.2000.88:921–932.)，预后较差。因此探寻胃癌的早期诊断标志物对于胃癌的早期诊断及预后评估具有重要的作用。

自1939年Waddington提出表观遗传学(Epigenetics)的概念以来，其已逐渐成为生命科学研究领域的前沿。表观遗传学是指不依赖于DNA序列改变的可遗传的基因表达变化的学科。表观遗传学包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控的范畴。近年来，越来越多的研究表明，非编码RNA调控在肿瘤发生发展中具有重要的作用。

人类基因组中研究最多最好的是编码蛋白的基因，但这部分基因只占据了人类基因组的1.5-2％。基因组中约70-90％的基因组DNA被转录但是不编码蛋白质，其转录产物被认为是“暗物质”或“垃圾”。(Johnny T.Y.Kung,David Colognori,Jeannie T.Lee.LongNoncoding RNAs:Past,Present,and Future.Genetics.2013.193:651–669.ManelEsteller.Non-coding RNAs in human disease.NATURE REVIEWS|GENETICS.2011.12:861-874.)近些年越来越多的研究发现这些转录产物可以参与到细胞分裂、分化等生命活动，具有重要的生物学功能。这些不编码蛋白的转录本被称为非编码RNA。非编码RNA包括小非编码RNA和长链非编码RNA两大部分。根据长度和生源分类，小非编码RNA包括miRNA、siRNA、piRNA等。长链非编码RNA是长度大于200nt并且不能编码功能性蛋白的一类转录本。大多数的非编码RNA具有poly(A)尾。(Tim R.Mercer,Marcel E.Dinger and JohnS.Mattick.Long non-coding RNAs:insights into functions.NATURE REVIEWS|GENETICS.2009.10(3):155-159.ManelEsteller.Non-coding RNAs in humandisease.NATURE REVIEWS|GENETICS.2011.12:861-874.Carl Ernst.CynthiaC.Morton.Identification and function of long non-coding RNA.Frontiers inCellular Neuroscience.2013.7(168):1-9.)越来越多的研究显示，长链非编码RNA参与到了染色体的修饰、转录调控、转录后调控等重要的生物学过程，同时对于疾病的发生发展有着重要的调控作用。(Tim R.Mercer,Marcel E.Dinger and John S.Mattick.Long non-coding RNAs:insights into functions.NATURE REVIEWS|GENETICS.2009.10(3):155-159.)

随着研究技术的发展，尤其是二代测序技术和芯片技术的日臻成熟。越来越多的长链非编码RNA被发现，但是其功能的研究仍不是很清楚。(John R Prensner,Matthew KIyer,O Alejandro Balbin et al.transcriptome sequencing across a prostatecancer cohort identifies PCAT-1,an unannotated lincRNA implicated in diseaseprogression.2011.29(8):742-750.Jiagen Li,1ZhaoliChen,LiqingTian.LncRNAprofile study reveals a three-lncRNA signature associated with the survivalof patients with oesophageal squamous cell carcinoma.Gut 2014.0:1–11.)有研究显示，长链非编码RNA参与到了细胞的增殖、细胞周期、细胞衰老和凋亡等生物学过程。(Maruyama,R.and H.Suzuki,Long noncoding RNA involvement in cancer.BMBRep.2012.45(11):604-611.)在疾病的发生发展过程中具有重要的作用。与肿瘤研究相关且比较成熟的LncRNA主要有PCAT-1、MALAT1、HOTAIR等。PCAT-1(prostate cancerassociated transcript-1)是在前列腺癌病例及细胞系中通过高通量转录组测序技术发现并命名。PCAT-1在前列腺癌组织中特异性高表达，可能成为临床检测的标志物。另外LncRNA PCA3(The prostate cancer antigen-3 gene)是前列腺癌研究中另一个很重要的长链非编码RNA，并且于2012年已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于前列腺癌的早期检测和预后评估。(John R Prensner,Matthew K Iyer,O Alejandro Balbin etal.transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1,an unannotatedlincRNA implicated in disease progression.2011.29(8):742-750.Porpiglia,F.,et al.,The roles of multiparametric MRI,PCA3,and PHI:whichis the best predictor of prostate cancer after a negative biopsy？Results of aprospective study.J Urol,2014.)MALAT1(Metastasis-Associated LungAdenocarcinoma Transcript 1)在多种恶性肿瘤如肝癌、子宫内膜间质肉瘤及肺癌中均表达上调，在转移的肺癌中MALAT1的表达量是非转移肺癌的三倍，是评估早期肺腺癌生存时间的独立预后指标。(Ji,P.,et al.,MALAT-1,a novel noncoding RNA,and thymosinbeta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lungcancer.Oncogene.2003.22(39):8031-8041.Yamada,K.,et al.,Phenotypiccharacterization of endometrial stromal sarcoma of the uterus.CancerSci.2006.97(2):106-112.Lin,R.,et al.,A large noncoding RNA is a marker formurine hepatocellular carcinomas and a spectrum of humancarcinomas.Oncogene.2007.26(6):851-858.)HOTAIR自2000年发现以来功能研究较明确，并且在多种恶性肿瘤如乳腺癌、结肠癌、肝癌等中表达上调并与肿瘤差的预后相关。在胰腺癌的研究中，发现HOTAIR的高表达可增强肿瘤的侵袭能力。(Chen J,Lin C,Yong W,Ye Y,Huang Z.Calycosin and Genistein Induce Apoptosis by Inactivation of HOTAIR/p-Akt Signaling Pathway in Human Breast Cancer MCF-7 Cells.Cell PhysiolBiochem.2015.35(2):722-728.Wu ZH,Wang XL,Tang HM et al.Long non-coding RNAHOTAIR is a powerful predictor of metastasis and poor prognosis and isassociated with epithelial-mesenchymal transition in colon cancer.OncolRep.2014.32(1):395-402.Ishibashi M,Kogo R,Shibata K et al.Clinicalsignificance of the expression of long non-coding RNA HOTAIR in primaryhepatocellular carcinoma.Oncol Rep.2013.29(3):946-950.K Kim,I Jutooru,GChadalapaka,G Johnson.HOTAIR is a negative prognostic factor and exhibitspro-oncogenic activity in pancreatic cancer.Oncogene.2012:1–10.)随着研究的不断进行，越来越多的LncRNA被鉴定阐述。例如新发现的反义LncRNA IRAIN在肝癌中作为印记基因涉及到长距离DNA相互作用过程。FAL1在肿瘤的形成过程中具有促癌作用。在肝癌的侵袭迁移过程中LncRNAlncRNA-ATB起到了促进的作用等等。(Jingnan Sun,Wei Li 1,Yunpeng Sun.A novel antisense long noncoding RNA within the IGF1R gene locusis imprinted in hematopoietic malignancies.Nucleic Acids Research.2014.42(15):9588–9601.Xiaowen Hu,Yi Feng,Dongmei Zhang et al.A Functional GenomicApproach Identifies FAL1 as an Oncogenic Long Noncoding RNA that Associateswith BMI1 and Represses p21 Expression in Cancer.Cancer Cell.2014.26:344–357.Ji-hang Yuan,Fu Yang,Fang Wang et al.A Long Noncoding RNA Activated byTGF-b Promotes the Invasion-Metastasis Cascade in HepatocellularCarcinoma.Cancer Cell.2014.25:666–681.)与结肠癌发生发展相关的LncRNA研究尚少，因此对结肠癌发生发展中LncRNAs的发现、作用机制及临床价值的研究具有重要的意义。

发明内容

本发明首次发现碱基序列如SEQ ID NO：1所示的长链非编码RNA(以下记作Lnc5q21.2)在结肠癌中表达升高。20对结肠癌组织及癌旁组织提取总RNA进行非编码RNA芯片检测并通过生物信息学的分析得到差异表达的新的长链非编码RNA。首次发现了长链非编码Lnc5q21.2在结肠癌组织中高表达。随后，通过5’-RACE和3’-RACE实验技术获得长链非编码RNALnc5q21.2的全长序列为663bp，并位于人类5号染色体长臂2区1亚带2次亚带。预实验的结果表明Lnc5q21.2可能作为结肠癌中新的促癌基因发挥作用，对于Lnc5q21.2的表达量检测可能成为结肠癌中新的分子标志物。同时，实验发现Lnc5q21.2的表达水平在胃癌中也有明显的升高，提示Lnc5q21.2也可以作为胃癌的早期诊断标志物。根据以上依据，本发明人利用半定量RT-PCR的方法对大量的结肠癌组织及癌旁组织标本和胃癌组织及癌旁组织标本进行检测，以明确Lnc5q21.2在结肠癌和胃癌中的表达量的改变。

本发明首次运用5’RACE和3’RACE技术鉴定长链非编码RNA Lnc5q21.2的全长序列为663bp，全长序列如SEQ ID NO：1所示，即：ATAATATTGGCCATAATATGCATCAAACATAACCAAAAAGAAAGAAAGAAGAGGGAGACAGGAGAGAGTAAAACAAAATAAAATATAGAAATGATTTTTTTCAGTAAATAACATTTAATTGTGATGCACATGTTTTCATGTAAGTACTGTATCACAGAAAAAAATACTGTAAGCTTAAATACAATCTCAAGATTGTCAGGAGAACTGATTAATTTTGCTCTCATTCCCATTTTCTCAACAATCTTTGTCTTCAGAGTGAATAAATACAGTGTCACTCTGGGTTCGCTTGGCAATCTTAAAATTGTCACAAGAATGGATTGGGTGCCGTTTCCTCTTCTTGTTACAATCTTTGTCATGAGCTCTCACAGACCTTTTAATGCCTGATATGCTCTCATTCTCATTACATATTCTCATTCCCATAACAAAGATTATAATGAAAGAAGAAAATGTCATAAAATTAATCCATTCTCATAACAGTCTGTAATGAGCGCAGAAAATTGAGCAAAATTAATCCGTTCTCATAACAATCTGAAGATTGTAATGAGAACAGAAAATGGCATGAAATTTATCCTTCTTGTGACAATCTTTAAATTGTAACAGGGCAGGAATGGGATACAAGATTAACAAGGCCCTGGGACAAAGGCTCTAACTAGAACTGAAAAA。

本发明还提供一种检测结肠癌组织和细胞系中Lnc5q21.2表达水平的特异性半定量RT-PCR的引物对，所述引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，即：TGCCTGATATGCTCTCATTCTC，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，即：TTTCTGCGCTCATTACAGACT。

本发明还提供一种用于检测结肠癌组织及细胞系的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有上述引物对。

进一步地，本发明的试剂盒还含有内参基因GAPDH的半定量RT-PCR引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，即：5’-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，即：5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

该试剂盒还可以含有长链非编码RNA高表达的结肠癌细胞系HCT116中提取总RNA后反转录得到的cDNA，作为检测上述引物对的可行性的阳性模板。

进一步地，本发明的试剂盒还可以包含RT-PCR反应所需的下列成分：5×PCRbuffer、10mM dNTPs、Hot start Taq酶、ddH₂O。

本发明还提供一种用于检测结肠癌的RT-PCR反应体系，总体积25μl计，其包括：

(1)模板：2.5μl；

(2)浓度为10μM的上述引物对以及内参基因GAPDH的半定量RT-PCR引物，其中，上游引物与下游引物各为1μl；

(3)5×PCR buffer：5ul；

(4)10mM dNTPs：0.5ul；

(5)Hot start Taq酶：0.25ul；

(6)ddH₂O：14.75ul。

本发明具有如下优点：利用本发明所述的引物及试剂盒检测结肠癌组织及细胞系。结肠癌组织和配对癌旁组织相比较，Lnc5q21.2在结肠癌组织中高表达(90％，18/20)。这表明长链非编码RNA Lnc5q21.2在结肠癌组织高表达，可能具有促癌基因的性质，可作为结肠癌检测的新的分子标志物。同时利用本发明所述引物及试剂盒检测胃癌组织及配对癌旁组织，Lnc5q21.2表达量在胃癌组织中比配对癌旁组织高(70％，14/20)。这同时也表明Lnc5q21.2在胃癌中也是扮演促癌基因的作用，可能成为胃癌检测的新的分子标志物。本试剂盒首次选用Lnc5q21.2作为检测标志物，该长链非编码RNA是本发明人首次在结肠癌和胃癌中筛选出的表达上调的LncRNA，具有首创性。因此，应用本发明提供的引物对及试剂盒来检测胃癌或结直肠癌Lnc5q21.2的表达水平可作为结直肠癌或胃癌诊断、疗效观察、预后判断、残留病灶及复发检测等的有力手段，而且，操作简便，稳定性好，灵敏度高，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

图1运用上述试剂盒中半定量RT-PCR引物对在9株结肠癌细胞系中检测Lnc5q21.2的表达水平，GAPDH为内参基因，ddH₂O为体系对照(用于评估PCR体系是否存在污染，若ddH₂O检测结果为阴性，体系可信)。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为119bp，如图所示。

图2运用上述Lnc5q21.2半定量RT-PCR引物对在8对结肠癌及配对的癌旁组织中检测Lnc5q21.2的表达水平，GAPDH为内参基因，ddH₂O为体系对照(用于评估PCR体系是否存在污染，若ddH₂O检测结果为阴性，体系可信)。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为119bp，如图所示。

图3在10株胃癌细胞系中，应用上述Lnc5q21.2半定量RT-PCR引物对检测Lnc5q21.2的表达水平，GAPDH为内参基因，ddH₂O为体系对照(用于评估PCR体系是否存在污染，若ddH₂O检测结果为阴性，体系可信)。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为119bp，如图所示。

图4运用上述Lnc5q21.2半定量RT-PCR引物对在8对胃癌及配对的癌旁组织中检测Lnc5q21.2的表达水平，GAPDH为内参基因，ddH₂O为体系对照(用于评估PCR体系是否存在污染，若ddH₂O检测结果为阴性，体系可信)。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为119bp，如图所示。

图5选取Lnc5q21.2表达量高的结肠癌细胞系HCT116制备的cDNA样本与ddH2O按比例混合，应用上述Lnc5q21.2半定量RT-PCR引物对检测Lnc5q21.2的表达水平。

结肠癌细胞系HCT116的cDNA样本稀释比例依次为100％，50％，5％，1％，0.5％，0％。ddH₂O为体系对照，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH₂O检测的结果为阴性，则体系结果可信，本体系扩增产物大小为119bp。

具体实施方式

为了更详细地了解本发明，以下通过实施对本发明作进一步的阐述。

实施例一：

1、模板的制备(总RNA的提取及反转录过程)

RNA的制备：获取结肠癌组织及配对癌旁组织样本和胃癌组织及配对癌旁组织样本。在本实施例中取8对结肠癌组织及配对癌旁组织样本分别为CC1-CC8，CN1-CN8；以及在本实施例中取8例胃癌组织及癌旁组织样本分别为GC1-GC8，GN1-GN8。运用TRIZOL提取的方法分别对上述样本进行总RNA的提取，紫外分光光度仪测定吸光值(A)确定其含量和纯度，0.8-1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量。

cDNA合成：分别将上述结肠癌组织及配对癌旁组织和胃癌组织及配对癌旁组织所提取的总RNA中5μg，应用SuperscriptIII-reversetranscriptasekit(Invitrogen)试剂盒中的随机引物反转录为第一条链cDNA，最后反应体系用去离子水稀释到100μl，25μl体系的半定量RT-PCR实验中使用2.5μl cDNA样本。

2、半定量RT-PCR

以Lnc5q21.2半定量RT-PCR引物对进行扩增的PCR反应体系，以总体积25μl计，包括：

(1)模板(cDNA)：2.5μl

(2)所述引物对(10pmol/μl)：

上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，即：TGCCTGATATGCTCTCATTCTC：1μl，

下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，即：TTTCTGCGCTCATTACAGACT：1μl；

(3)5×PCR buffer：5ul；

(4)10mM dNTPs：0.5ul；

(5)Hot start Taq酶：0.25ul；

(6)ddH₂O:14.75ul。

扩增条件：

应用上述半定量RT-PCR反应体系对已经制备的cDNA样本分别进行扩增，扩增程序如下：

95℃5min

95℃30s→59℃30s→72℃40s，35个循环；

72℃5min.

产物大小：119bp

应用半定量RT-PCR对内参基因GAPDH的检测，以25μl体系计，包括：

(1)模板(cDNA)：2.5ul；

(2)半定量RT-PCR引物(10pmol/ul)：

上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，即：5’-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3’：1ul，

下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，即：5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’：1ul；

(3)5×PCR buffer：5ul；

(4)10mM dNTPs：0.5ul；

(5)Hot start Taq酶：0.25ul；

(6)ddH₂O:14.75ul。

产物大小：454bp

扩增条件为：

反应条件:

95℃5min；

95℃30s→63℃30s→72℃45s，25个循环；

75℃5min，

产物大小：454bp。

3、PCR反应产物的检测

将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪检测并拍照记录。

4、结果分析

根据琼脂糖凝胶电泳结果显示的PCR产物条带的强弱判断组织标本中Lnc5q21.2表达水平变化。在8对结肠癌组织及配对癌旁组织和8对胃癌组织及配对癌旁组织中，Lnc5q21.2在癌组织中的表达量明显高于癌旁组织。(图2和图4)GAPDH为内参基因，ddH₂O为体系对照，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH₂O检测的结果为阴性，则体系结果可信，本体系扩增产物大小为119bp。

实施例二：临床标本检测

(1)取20对结肠癌组织及配对癌旁组织，应用RT-PCR进行Lnc5q21.2扩增，模板制备、PCR扩增体系及条件、扩增产物的检测与实施例一相同，检测Lnc5q21.2在结肠癌配对组织中的相对表达量，检测结果见下表1：

表1

(2)取20对胃癌组织及配对癌旁组织，应用RT-PCR进行Lnc5q21.2扩增，模板制备、PCR扩增体系及条件、扩增产物的检测与实施例一相同，检测Lnc5q21.2在胃癌配对组织中的相对表达量，检测结果见下表2：

表2

实施例三：敏感度实验

选取Lnc5q21.2表达量高的结肠癌细胞系HCT116制备的cDNA样本与ddH₂O按比例混合，应用上述Lnc5q21.2半定量RT-PCR引物对检测Lnc5q21.2的表达水平。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图5所示。

图5的结果显示：用本发明中检测Lnc5q21.2表达的特异性引物对及反应体系、条件，其灵敏度可达到0.5％，灵敏度高。

实施例四：检测结肠癌及胃癌细胞中Lnc5q21.2表达水平的试剂盒组成

检测结肠癌肿瘤细胞的试剂盒包括以下成分，其中进行一次半定量RT-PCR的用量为：

1、Lnc5q21.2的RT-PCR引物：上游引物核苷酸序列为Lnc5q21.2-F，下游引物核苷酸序列为Lnc5q21.2-R，各为1μl。

2、GAPDH的RT-PCR引物：上游引物核苷酸序列为GAPDH-F，下游引物核苷酸序列为GAPDH-R，各为1μl。

3、反应体系总2份，分别为Lnc5q21.2RT-PCR引物和GAPDH RT-PCR引物适用，每份反应体系包括：

5×PCR buffer：5ul；

10mM dNTPs：0.5ul；

Hot start Taq酶：0.25ul；

ddH₂O:14.75ul。

一个试剂盒可以包括上述各成分进行多次半定量RT-PCR的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具体量视情况需要而定。

为防止出现半定量RT-PCR扩增产物的假阳性和假阴性，试剂盒还包括以下几项组成：

(1)阳性对照PCR模板：高表达Lnc5q21.2的结肠癌细胞系HCT116中提取总RNA后反转录得到的cDNA样本，进行一次RT-PCR的用量为：2.5μl。

(2)阴性的体系对照：ddH₂O，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH₂O检测的结果为阴性，则体系结果可信。

Claims

1.一种长链非编码RNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种引物对，其特征在于，用于检测结肠癌细胞系和组织中的如权利要求1所述的长链非编码RNA表达水平，该引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，即：TGCCTGATATGCTCTCATTCTC，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，即：TTTCTGCGCTCATTACAGACT。

3.一种检测结肠癌的试剂盒，其特征在于：包含权利要求2所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还含有内参基因GAPDH的半定量RT-PCR引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，即：5’-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，即：5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：还含有长链非编码RNA高表达的结肠癌细胞系HCT116中提取总RNA后反转录得到的cDNA，作为检测权利要求2中所述的引物对的可行性的阳性模板。

6.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：还包含RT-PCR反应所需的下列成分：5×PCR buffer、10mM dNTPs、Hot start Taq酶、ddH₂O。

7.一种用于检测结肠癌的RT-PCR反应试剂盒，其包括：

权利要求2所述的引物对以及权利要求4中所述的内参基因GAPDH的半定量RT-PCR引物。