CN109628585A - 非编码rna在诊断脓毒症中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了非编码RNA在诊断脓毒症中的应用,具体地该非编码RNA为LOC105371028,gene ID为105371028,本发明首次发现了LOC105371028在脓毒症患者中表达上调,基于此,提供了一种诊断脓毒症的新产品和手段。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及非编码RNA在诊断脓毒症中的应用,具体地所述非编码RNA为LOC105371028。
背景技术
脓毒症是指由感染或者高度可疑感染灶引发全身炎症反应综合征(Systemicinflammatory response syndrome,SIRS),继而组织器官损伤的病理过程及临床症候群。脓毒症是住院患者,尤其老年人最常见的死亡原因之一,而且其死亡率有随着人口老龄化增加的趋势(Angus DC,Linde-Zwirble WT,Lidicker J,et al.Epidemiology of severesepsis in the United States:analysis of incidence,outcome,and associatedcosts of care.Crit Care Med 2001,29:1303-1310.)。脓毒症可以引起多脏器功能衰竭(严重脓毒症)和低血压(脓毒性体克),此时患者的预后更差。以前将脓毒症定义为感染引发的SIRS和一系列器官功能障碍,然而该定义诊断特异性较差,而且SIRS是否合并感染在临床上也不易辨别。因此,明确是否为感染导致的一系列炎性反应成为诊断脓毒症的关键。后来从发病原因、炎性指标、机体反应、器官功能障碍等方面对脓毒症的定义进行了修订,阐述了它的特征并就其严重程度进行了分级。
然而脓毒症目前主要靠临床资料诊断,没有确切的诊断指标,因此人们致力于寻找一种或一类能够有效诊断脓毒症的生物标志物。近年来临床或研究中常用的脓毒症标志物主要有C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PcT)、白介素-6(IL-6),可溶性髓系细胞触发受体-1(sTREM-1)等。C反应蛋白(CRP)是一种急性时相蛋白,受IL-6和其他细胞因子刺激时由肝脏产生,它间接清除病原体,抑制内皮细胞和白细胞之间的相互作用,CRP常被作为感染的诊断指标,然而其区分脓毒症与否的作用却有限,而且不能够预测预后,不能反映感染的严重程度,轻微感染或创伤手术等非感染性炎症均会使其升高(Su L,Han B,Liu C,etal.Value of soluble TREM-1,procalcitonin,and C-reactive protein serum levelsas biomarkers for detecting bacteremia among sepsis patients with new feverin intensive care units:a prospective cohort study.BMC Infect Dis 2012,12:157.)。降钙素原(PCT)是无激素活性的降钙素前体,峰浓度与感染严重程度和病原体类型相关,下降速率与预后相关,但是特异性较差,在一些严重创伤、手术、热休克等非感染性疾病中其表达水平也会升高。白介素-6在脓毒症的病理生理过程中发挥了重要作用,但其识别脓毒症的能力远不如CRP、PCT,仍没有证据证实这种细胞因子可以作为脓毒症早期诊断的生物标志物(Reinhart K,Bauer M,Riedemann NC,Hartog CS.New approaches tosepsis:molecular diagnostics and biomarkers.Clin Microbiol2012,25:609-634.)。sTREM-1辨别脓毒症与SIRS的准确性不高。截止到目前,尚无一种生物标志物或分子生物学技术可以快速准确诊断脓毒症。
人类基因组DNA核苷酸序列中只有不到2%的基因用于编码蛋白质,至少75%的基因转录为非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)。而根据核苷酸序列的长度,又可以将其分为两类,大于200nt的为长链非编码RNA(long non-coding RNAs,1ncRNAs),小于200nt者为短链非编码RNA。根据1ncRNAs相对于编码基因的位置关系将其分为正义、反义、双向、基因内、基因间五种类型。它们种类丰富而且活跃于细胞生物功能的各个水平,如细胞分化、细胞增殖、DNA损伤应答、剂量补偿、染色体印记等。研究结果显示它们确实在机体的基因表达调控等生理过程中发挥着重要的作用,多种疾病中lncRNA表达谱的改变奠定了其作为新兴疾病诊断治疗靶点的地位,研究脓毒症中的lncRNA表达谱的改变对于脓毒症的诊断和治疗具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的之一,提供一种脓毒症的诊断标志物及其在制备脓毒症的诊断产品中的应用;
本发明的目的之二在于提供与脓毒症相关的在标志物在构建预测脓毒症的计算模型中的应用。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了检测LOC105371028的试剂在制备诊断脓毒症的产品中的应用,所述LOC105371028在脓毒症患者中表达上调。
进一步,所述诊断脓毒症的产品包括:通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交或微阵列芯片诊断脓毒症的产品。
进一步,所述通过反转录PCR诊断脓毒症的产品至少包括一对特异扩增LOC105371028基因的引物;所述通过实时定量PCR诊断脓毒症的产品至少包括一对特异扩增LOC105371028基因的引物;所述通过原位杂交诊断脓毒症的产品包括:与LOC105371028基因的核酸序列杂交的探针;所述用微阵列芯片诊断脓毒症的产品包括:与LOC105371028基因的核酸序列杂交的探针。
进一步,所述通过实时定量PCR特异扩增LOC105371028基因的引物序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
进一步,所述诊断脓毒症的产品包括芯片和/或试剂盒。
本发明提供了一种诊断脓毒症的产品,所述的产品能够通过检测样品中LOC105371028基因的表达水平来诊断脓毒症。
进一步,上面所述的产品包括芯片、或试剂盒。所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括用于检测LOC105371028基因转录水平的针对LOC105371028基因的寡核苷酸探针;所述试剂盒包括用于检测LOC105371028基因转录水平的试剂;其中,所述芯片和试剂盒可用于检测包括LOC105371028基因在内的多个基因(例如,与脓毒症相关的多个基因)的表达水平。通过将多个与脓毒症的标志物同时检测,可大大提高脓毒症诊断的准确率。
进一步,所述试剂盒中用于检测LOC105371028基因转录水平的试剂包括特异性扩增LOC105371028基因引物对。
进一步,所述特异性扩增LOC105371028基因的引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。
在本发明中,术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出,术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性,探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记,其范围包括引物。杂交方式,包括,但不限于:溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
在本发明中,术语“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上,所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)。所述基质可以是固体基质,例如,玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质,例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
各种探针阵列已经描述在文献中并且可以用于本发明上下文中检测可能与本文所述表型相关的标志物。例如,DNA探针阵列芯片或较大的DNA探针阵列晶片(否则,可以通过打断晶片而获得各个体芯片)用于本发明的一个实施方案。DNA探针阵列晶片一般包含玻璃晶片,其上放置了高密度DNA探针(短DNA片段)阵列。这些晶片各自可以保持例如约6000万个用于识别较长样品DNA序列(例如,来自个体或群体,例如,包含所关注的标志物)的DNA探针。用玻璃晶片上的DNA探针组识别样品DNA通过DNA杂交进行。当DNA样品与DNA探针阵列杂交时,样品结合于样品DNA序列互补的那些探针。通过评价个体样品DNA与那些探针更稳固地杂交,有可能确定已知的核酸序列是否存在于样品中,由此确定核酸中发现的标志物是否存在。
上述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里,所谓“互补”,只要是杂交即可,可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选100%的同源性。这些探针可以是DNA,也可以是RNA,另外,可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。
在本发明的上下文中,“LOC105371028基因”包括人LOC105371028基因序列及其变体。所述序列的“变体”是生物活性的序列,其因为在天然序列中一个或多个核苷酸的插入、缺失、修饰和/或替换具有与天然序列或野生型序列(或其补体)不同的核苷酸序列。这种变体通常与天然序列或其补体的序列一致性小于100%。然而,生物活性的变体通常与对应的天然存在的序列或其补体具有至少约70%的序列一致性,通常至少约75%、更通常至少约80%、甚至更通常至少约85%、甚至更通常至少约90%、且甚至更通常至少约95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。任何长度的变体核苷酸片段保留对应天然序列的生物活性。变体还包括其中在5’或3’端或在天然序列或其补体内添加一个或多个核苷酸的序列。变体还包括其中一些核苷酸被删除和任选地被一个或多个不同核苷酸替换的序列。
LOC105371028,gene ID为105371028,位于15号染色体上,目前GeneBank中LOC105371028存在三个转录产物,序列如XR_932740.2、XR_932741.2、XR_932739.2所示。本领域技术人员可以理解,在进行高通量测序及生物信息学分析时,不同的转录产物都可以看作是LOC105371028,也即LOC105371028的不同的转录产物也包括在本发明中。
本发明的LOC105371028基因可以是天然的或是人工合成的,或者使用可以表达LOC105371028的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
病毒载体可以是任何适当的载体,包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。真核表达载体可以是任何适当的表达载体,包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体,比如pBin438、pCAMBIA1301等。
在本发明的上下文中,“诊断脓毒症”既包括判断受试者是否已经患有脓毒症、也包括判断受试者是否存在患有脓毒症的风险。
术语“样品”,可以是血液、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或者组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞。样品可以得自患者或对象直接使用,或者进行预处理,如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、失活干扰成分、加入试剂等方式处理,以如本文所述或者本领域已知的一些方式修饰样品的特性。
本发明的优点和有益效果:
本发明首次发现了LOC105371028基因与脓毒症的发生发展相关,对于揭示脓毒症的发病机理具有重要的意义
本发明提供了一种诊断产品,通过检测LOC105371028的表达水平,来判断患者是否患有脓毒症或者患脓毒症的风险高低,从而实现脓毒症患者的早期诊断,降低因脓毒症引起的死亡率,节约医疗资源。
附图说明
图1显示利用QPCR检测LOC105371028基因在脓毒症患者中的表达情况图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与脓毒症相关的基因标志物
1、样品收集
各收集3例正常人血液和脓毒症患者血液样本,上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。
实验组:脓毒症患者,符合2016年制定的脓毒症3.0诊断标准。排除标准:1)年龄<18周岁;2)妊娠期妇女;3)合并恶性肿瘤、严重肝脏、血液系统及免疫缺陷疾病者;4)正在使用抗凝素或激素的患者;5)入院前使用抗生素及透析治疗者。
2、RNA样品的制备及质量分析
使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下:
1)取1ml收集在肝素或EDTA处理过的试管中的全血,放进无菌离心管中;
2)收集血细胞:3000rpm离心5min,小心地从样品顶部吸走上清;
3)加1ml血细胞裂解液,小心吸放4-5次,重悬沉淀物,3000rpm离心5min,重复该步骤两次(共三次);
4)避开细胞沉淀物,小心吸走几乎所有上清,只保留100μl上清液;然后加175μlRNA裂解液到细胞中,吸放重悬并裂解细胞;
5)加350μl RNA稀释液,颠倒混合3-4次;
6)置于70℃水浴中3min;
7)室温下13000g离心10min,将清亮裂解物转移到一支无菌离心管中;
8)向澄清裂解液中加入200μl 95%乙醇,用移液枪吸放3-4次以混合;将此混合物转移到离心柱装配体中,13000g离心1min;
9)从离心柱装配体上拿下离心柱,弃去收集管中的液体,将离心柱装回到收集管上,确认一下RNA Wash Solution已用乙醇稀释,加600μl RNA洗涤液于离心柱装配体,13000g离心1min;
10)弃去收集管中的液体,将离心柱装回到收集管上,将50μl新鲜制备的DNase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上;
11)室温下孵育15min,向离心柱中加入200μl DNA酶终止缓冲液,13000g离心1min;
12)加入600μl RNA洗涤液,13000g,离心1min;
13)清空收集管,向离心柱内加入250μl RNA洗涤液(已加入乙醇),高速离心2min;
14)将离心柱从收集管上转移到洗脱管上,向膜上加100μl无核酸酶水,将离心柱装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外,13000g离心1min,丢弃离心柱,盖好盛有RNA的洗脱管,存于-70℃。
15)检测RNA的浓度,鉴定RNA的产量和纯度,建立cDNA文库的要求为RNA总量5μg,浓度≥200ng/μL,OD260/280介于1.8~2.2之间。
3、构建cDNA文库
1)去除rRNA
2)片段化RNA
利用金属离子,将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
3)反转录合成cDNA
在逆转录酶的作用下,利用随机引物,以RNA为模板反转合成一链cDNA,进行二链合成时,dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP,使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
4)连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端,加入End Repair Mix将其补成平末端,随后在3’末端加上一个A碱基,用于连接Y字形的接头。
5)UNG酶消化cDNA二链
使用UNG酶将cDNA第二链消化,使文库中仅包含cDNA第一链。
4、上机测序
使用Illumina x-ten测序平台,进行2*150bp测序。
5、生物信息学分析
1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行修剪,修剪掉质量<20的碱基,并且删掉N大于10%的reads;
2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7,fasta和gff文件下载自NCBI;
3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出;cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出;
4)cuffdiff比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异,显著差异lncRNA筛选条件为:FDR<0.01。
6、结果
RNA-seq结果显示,LOC105371028基因在脓毒症患者血液中的表达水平显著高于正常人中的表达水平。
实施例2QPCR测序验证LOC105371028基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择LOC105371028基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择脓毒症患者血液和正常人血液各35例。
2、RNA提取
提取过程实施例1。
3、逆转录
采用Tiangen公司的FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号:KR106)进行反转录。首先去除基因组DNA反应,在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl,总RNA 1μg,加RnaseFree ddH2O使总体积至10μl,水浴锅中42℃加热3min,然后置于冰上放置。再将10×FastRT Bμffer 2.0μl,RT Enzyme Mix 1.0μl,FQ-RT Primer Mix 2.0μl,RNase Free ddH2O5.0μl,混合后加入上述试管中一起混合共20μl,水浴锅中42℃加热15min,95℃加热3min之后放于冰上。
4、QPCR扩增检验
1)引物设计
根据LOC105371028和GADPH的基因序列设计引物,其中,选择LOC105371028的不同转录本之间的共同区域进行引物设计,具体引物序列如下:
GAPDH基因:
正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.1);
反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.2)。
LOC105371028基因:
正向引物为5’-AGTCTTCTGTTATCTTCT-3’(SEQ ID NO.3);
反向引物为5’-CTTATTCTTCTTCCTTCTC-3’(SEQ ID NO.4)
2)扩增
用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号:FP205),进行扩增,实验操作按产品说明书进行。每个样本设置3个平行管,所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
表1PCR反应体系
试剂 | 体积 |
2×SuperRealPreMixPlus | 10μl |
正向引物 | 0.6μl |
反向引物 | 0.6μl |
5×ROX Reference Dye<sup>△</sup> | 2μl |
DNA模板 | 2μl |
灭菌蒸馏水 | 4.8μl |
扩增程序为:95℃15min,(95℃10s,55℃30s,72℃32s)×40个循环。在60-95℃进行融解曲线分析,温度升高速度0.5℃/5s,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,2-ΔΔCT法进行相对定量。
5、结果
结果如图1所示,与正常人的血液相比,LOC105371028基因在脓毒症患者血液中的表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05),同RNA-sep结果一致,其中,显著上调的脓毒症患者有34个,无显著变化的1个,提示LOC105371028可作为分子标志物应用于脓毒症的诊断。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 泰山医学院 泰山医学院附属医院
<120> 非编码RNA在诊断脓毒症中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagccccagc cttctccat 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtcttctgt tatcttct 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttattcttc ttccttctc 19
Claims (10)
1.检测LOC105371028的试剂在制备诊断脓毒症的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述诊断脓毒症的产品包括:通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交或微阵列芯片诊断脓毒症的产品。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述通过实时定量PCR诊断脓毒症的产品至少包括一对特异扩增LOC105371028基因的引物。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述特异扩增LOC105371028基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述诊断脓毒症的产品包括芯片和/或试剂盒。
6.一种诊断脓毒症的产品,其特征在于,所述的产品能够通过检测样品中LOC105371028的水平来诊断脓毒症。
7.根据权利要求6所述的产品,其特征在于,所述产品包括芯片、或试剂盒。
8.根据权利要求7所述的产品,其特征在于,所述检测试剂盒包括用于特异性扩增LOC105371028引物对,优选的,所述特异性扩增LOC105371028的引物对序列如SEQ ID NO.3~4所示。
9.LOC105371028在构建预测脓毒症的计算模型中的应用。
10.LOC105371028在制备治疗脓毒症的药物组合物中的应用。
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2019
- 2019-01-31 CN CN201910097367.2A patent/CN109628585A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN112226491A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-01-15 | 赣南医学院 | 一种评价脓毒症的生物标志物的筛选方法 |
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