CN115927614A - 基于Alu重复原件的肠癌早期筛查检测引物、检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及基于Alu重复原件的肠癌早期筛查检测引物、检测方法和试剂盒，包括与循环肿瘤相关的Alu‑LFR引物和Alu‑SFR引物。与现有技术相比，本发明选取Alu重复原件作为肿瘤早期筛查，诊断，预后的新型标志物，由于循环肿瘤DNA是肿瘤体细胞DNA脱落或肿瘤细胞凋亡后释放进入循环系统，不依赖于cfDNA浓度的标志物，与肿瘤细胞凋亡相关，其特定的来源使得ctDNA相较于其他蛋白标志物检测准确性更高，且能够反应肿瘤的情况，因此相较于cfDNA浓度更具有早期诊断意义，可作为一种肠癌早期筛查手段为临床提供一定辅助诊断信息。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及基于Alu重复原件的肠癌早期筛查检测引物、检测方法和试剂盒。
背景技术
肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，在全球范围内每年约有120多万人罹患肠癌，并且超过半数以上的人直接或间接的死于肠癌，其发病率也在逐年升高，使得肠癌成为了最常见的第三大癌症。而在我国，近年来新发肠癌患者超过180万例，约90万患者死亡，其发病率(10.2％)和死亡率(9.2％)已经攀升至所有癌肿前列。肠癌的发病率和死亡率具有比较明显的区域性，不同国家，不同区域之间存在明显差异。例如，在我国东部地区的发病率和死亡率最高，西部地区次之而中部地区最低。导致肠癌发病的因素较多：年龄和性别，45-59岁的男性为高危人群，女性发病人数也在逐年提升；不同的生活方式，抽烟，饮酒，锻炼，不用的饮食习惯；遗传因素占肠癌风险的35％以上，家族性腺瘤性息肉病及遗传性非息肉病性大肠癌等都是由于相应的基因发生突变导致的，这类患者不仅发病几率明显增加，并且发病年龄更小。
早期肠癌多发于大肠粘膜层及黏膜下层，不具有淋巴转移，肠癌早期预防及干预能极大提高患者生存率，早期原发性肠癌是可以通过手术进行根治性切除使得肠癌的早期治愈率明显提升；更早期的粘膜内癌，几乎可100％治愈。晚期肠癌的5年存活率则急剧下降至20％以下。有研究表明大多数肠癌发病是由息肉发展所致。正常的肠粘膜病变长出息肉，再从息病变发展成肠癌，一般需要数年甚至数十年时间，因此肠癌早筛查，早诊断，早干预能够明显提高肠癌患者生存率，提高生活质量是至关重要。目前位置肠癌常用的检测方法种类较多，包括影像学检测，生化指标检测，癌胚抗体原检测等，随着检测技术发展及更多生物标志物被发现，越来越多的技术应用到肠癌的检测领域，分子诊断技术已经应用于肿瘤早期筛查领域，大幅度提高的检测的灵敏度和特异性，虽然血液cfDNA浓度可用于区分疾病与健康人，但其会随诊肿瘤的分期，突变负荷的进展而变动，并且会受到年龄，性别，区域，饮食习惯，生活环境等因素的影响，检测周期较长，费用偏高，应用局限。
发明内容
针对以上述背景技术的不足，本发明提供一种用于结直肠癌易感基因SNP检测的引物、试剂盒及应用，解决了肠癌早期筛查灵敏度和特异性不高，检测周期较长，费用偏高的问题。
一方面，本发明提供用于结直肠癌易感基因SNP检测的引物，关键在于：包括与循环肿瘤相关的Alu-LFR引物和Alu-SFR引物；其中，Alu-LFR引物的序列如下：
上游引物Seq ID NO.1：GTGGCTCACGCCTGTAATC，
下游引物Seq ID NO.2：CAGGCTGGAGTGCAGTGG；
Alu-SFR引物的序列如下：
上游引物Seq ID NO.3：CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG，
下游引物Seq ID NO.4：CCCGAGTAGCTGGGATTACA。
另一方面，本发明提供一种基于Alu重复原件检测的癌症早期检测方法，关键在于包括以下步骤：
S1.提取外周血中游离的基因组；
S2.将基因组作为模板，加入如权利要求1所述的Alu-LFR引物和Alu-SFR引物，进行qPCR检测反应；
S3.将反应产物纯化后进行cfDNA浓度分析,根据Alu-SFR和/或Alu Score的浓度值，进行早期肠癌的风险评估。
优选的，所述S1中采用MagMax Cell Free DNAIsolation Kit试剂盒从外周血中提取cfDNA。
优选的，所述S1具体为：将收集的外周血离心分离，取上层血浆；将分离的血浆再次进行离心分离，去除杂质；使用MagMax Cell Free DNAIsolationKit试剂盒从除杂后的血浆中提取cfDNA。
优选的，S2中PCR总体系为：2x iTaqUniversal SYBR Green SupermixμL 10μmol/L，上下游引物混合液2μL，无核酸酶水6μL，模板2μL。
优选的，S2中反应程序为：95℃/3min；95℃/5s，62℃/30s，40个循环，62℃/hold。
优选的，Alu Score为cfDNA的长片段浓度与短片段浓度比值，即Alu Score＝Alu-SFR Conc./Alu-SFR Conc。
优选的，S3中的评估方式为：以Alu-SFR＝＝1.3ng/μL作为阳性判断值；以AluScore＝0.467作为阳性判断值。
另一方面，本发明提供一种基于Alu重复原件检测的癌症早期检测的试剂盒，关键在于：包括lu-LFR引物和Alu-SFR引与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1本发明选取Alu重复原件作为肿瘤早期筛查，诊断，预后的新型标志物，由于循环肿瘤DNA是肿瘤体细胞DNA脱落或肿瘤细胞凋亡后释放进入循环系统，不依赖于cfDNA浓度的标志物，与肿瘤细胞凋亡相关，其特定的来源使得ctDNA相较于其他蛋白标志物检测准确性更高，且能够反应肿瘤的情况，因此相较于cfDNA浓度更具有早期诊断意义，可作为一种肠癌早期筛查手段为临床提供一定辅助诊断信息；
2.选取NCBI数据调取Alu重复原件的序列，并据此设计两对引物用于该重复原件的浓度定量，分别是长片段引物Alu-LFR和Alu-SFR，其中Alu-LFR的扩增产物片段为247bp，Alu-SFR的扩增产品片段长度为115bp，以荧光定量PCR结果得到的Alu-LFR和Alu-SFR的比值作为cfDNA完整性的指数；
3.本发明的不同需要大型检测设备或专用检测设备，也不属于属于有创检测，检测周期短，费用低，高通量，特别适用于肠癌高风险人群早期筛查。
附图说明
图1为Alu-SFR cfDNA浓度在健康人和肠癌患者之间的比较图；
图2为Alu Score在健康人和肠癌患者之间的比较图；
图3为Alu-SFR cfDNA的AUC曲线图；
图4为Alu Score的AUC曲线图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
实施例1基于Alu重复原件的肠癌早期筛查的试剂盒
包括MagMax Cell Free DNAIsolation Kit(Thermofisher)试剂盒、2x iTaqUniversal SYBR Green SupermixμL，Alu-LFR引物和Alu-SFR引物，无核酸酶水；Alu-LFR引物的序列如下：
上游引物Seq ID NO.1：GTGGCTCACGCCTGTAATC，
下游引物Seq ID NO.2：CAGGCTGGAGTGCAGTGG；
Alu-SFR引物的序列如下：
上游引物Seq ID NO.3：CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG，
下游引物Seq ID NO.4：CCCGAGTAGCTGGGATTACA
实施例2基于Alu重复原件检测的癌症早期检测方法
1.使用STRECK血液采集管收集患者和健康人的外周血10毫升，将STRECK管离心15分钟，取上层血浆至无菌15毫升离心管中，避免将血细胞吸入血浆而造成的基因组DNA污染；将已经收集的血浆在4℃，16000g告诉离心15分钟去除血浆中细胞碎片等杂质，吸取上清液与洁净的离心管，即为分离好的血浆，可置于-80℃冰箱中保存备用；采用MagMax CellFree DNAIsolation Kit(Thermofisher)试剂盒从血浆中提取cfDNA，最后将其溶解在30μLTE Buffer中备用，若游离核酸无法及时进行定量检测，可于-80℃保存；
2.采用已经精确定量的人类参考基因组样品作为标准品，十倍梯度稀释至6个梯度作为绝对定量的标准曲线，每个梯度标准品设置2个复孔，于ABI7500荧光定量PCR仪上对样本cfDNA进行扩增；PCR扩增体系为2x iTaqUniversal SYBR Green SupermixμL 10μmol/L，Alu-LFR引物和Alu-SFR引物混合液2μL，无核酸酶水6μL，模板2μL；反应条件：95℃预变性3min；95℃5s，62℃30s，共40个循环，62℃退火过程收集荧光信号，每个样本设置3个重复；
3.以Alu-SFR＝＝1.3ng/μL和/或Alu Score＝0.467作为阳性判断值，用于对肠癌患者和健康人的区分。
对65例健康者和66例食道癌患者的血液样本同时采用本发明进行早期肠癌检测，数据采集和分析采用ABI7500荧光定量软件完成，通过对应的标准曲线分别计算肠癌患者组和对健康人组中cfDNA浓度(Alu-LFR浓度和Alu-SFR浓度)，采用Mann–Whiney U检验。
图1中显示，肠癌患者和健康人的Alu-SFR浓度存在显著性差异(p<0.0001)。
图2中显示，肠癌患者和健康人的Alu Score差异极显著(p<0.001)。可见，AluScore在肠癌患者中均显著高于健康人群。
为了进一步确定Alu-SFR和Alu-Score对肠癌患者和健康人的分类效果，基于Alu-SFR自动生成ROC曲线，并统计曲线下面积AUC值(图3)，横坐标为1-特异度，纵坐标为敏感度，图3可以看到，当Alu-SFR＝1.3ng/μL时Youden Index最大[0.5857(95％CI:0.4447-0.6961)],作为Alu-SFR的阳性判断值，对应的敏感度70.83％(95％CI:58.9％-81.0％),特异性88.14％(95％CI:77.1％-95.1％)。
基于Alu-Score自动生成ROC曲线，并统计曲线下面积AUC值(图4)，横坐标为1-特异度，纵坐标为敏感度，图4可以看到，当Alu Score＝0.467时Youden Index最大[0.646(95％CI:0.5077-0.7385)]，作为Alu Score的阳性判断值，其敏感度81.54％(95％CI：70％-91％)，特异性83.08％(95％CI:71.7％-91.2％)。
可见，本发明通过定量检测人外周血游离核酸(cfDNA)中的Alu重复原件，确定Alu-SFR浓度和Alu Score在肠癌患者中均显著高于健康人群。虽然血液cfDNA浓度可用于区分疾病与健康人，但其会随诊肿瘤的分期，突变负荷的进展而变动，并且会受到年龄，性别，区域，饮食习惯，生活环境等因素的影响；Alu Score则是不依赖于cfDNA浓度的标志物，与肿瘤细胞凋亡相关，因此相较于cfDNA浓度更具有早期诊断意义，可作为一种肠癌早期筛查手段为临床提供一定辅助诊断信息。
最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.基于Alu重复原件的肠癌早期筛查检测引物，其特征在于：包括与循环肿瘤相关的Alu-LFR引物和Alu-SFR引物；其中，Alu-LFR引物的序列如下：
上游引物Seq ID NO.1：GTGGCTCACGCCTGTAATC，
下游引物Seq ID NO.2：CAGGCTGGAGTGCAGTGG；
Alu-SFR引物的序列如下：
上游引物Seq ID NO.3：CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG，
下游引物Seq ID NO.4：CCCGAGTAGCTGGGATTACA。
2.一种基于Alu重复原件检测的癌症早期检测方法，其特征在于包括以下步骤：
S1.提取外周血中游离的基因组；
S2.将基因组作为模板，加入如权利要求1所述的Alu-LFR引物和Alu-SFR引物，进行qPCR检测反应；
S3.将反应产物纯化后进行cfDNA浓度分析，根据Alu-SFR浓度值和/或Alu Score值，进行早期肠癌的风险评估。
3.根据权利要求2所述基于Alu重复原件检测的癌症早期检测方法，其特征在于所述S1中采用MagMax Cell Free DNA Isolation Kit试剂盒从外周血中提取cfDNA。
4.根据权利要求3所述的基于Alu重复原件检测的癌症早期检测方法，其特征在于所述S1具体为：将收集的外周血离心分离，取上层血浆；将分离的血浆再次进行离心分离，去除杂质；使用MagMax Cell Free DNA Isolation Kit试剂盒从除杂后的血浆中提取cfDNA。
5.根据权利要求3所述的基于Alu重复原件检测的癌症早期检测方法，其特征在于S2中PCR总体系为：2x iTaq Universal SYBR Green Supermix μL 10μmol/L，Alu-LFR引物和Alu-SFR引物的混合液2μL，无核酸酶水6μL，模板2μL。
6.根据权利要求3所述的基于Alu重复原件检测的癌症早期检测方法，其特征在于S2中反应程序为：95℃/3min；95℃/5s，62℃/30s，40个循环，62℃/hold。
7.根据权利要求3所述的基于Alu重复原件检测的癌症早期检测方法，其特征在于S3中Alu Score为cfDNA的长片段浓度与短片段的浓度比值，即Alu Score＝Alu-SFR Conc./Alu-SFR Conc。
8.根据权利要求3所述的基于Alu重复原件检测的癌症早期检测方法，其特征在于S3中的评估方式为：以Alu-SFR＝＝1.3ng/μL作为阳性判断值；以Alu Score＝0.467作为阳性判断值。
9.一种基于Alu重复原件检测的癌症早期检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1中的Alu-LFR引物和Alu-SFR引物。
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|---|---|---|---|---|
| CN116411084A (zh) * | 2023-06-06 | 2023-07-11 | 北京求臻医疗器械有限公司 | 轻量级微卫星不稳定性检测装置及其应用 |
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