CN115896284A - 用于肺部疾病诊断的标志物、试剂、试剂盒和检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于肺部疾病诊断的标志物、试剂、试剂盒和检测系统。该用于检测肺部疾病的标志物为外泌体中的miRNA,miRNA包括miR‑143‑3p、miR‑103a‑3p、miR‑92a‑3p、miR‑223‑3p、miR‑363‑3p、miR‑199b‑3p、miR‑16‑5p、miR‑155‑5p、miR‑122‑5p、miR‑483‑5p、Let‑7c‑5p、miR‑486‑5p、miR‑192‑5p、miR‑20a‑5p、miR‑221‑3p、miR‑21‑5p和miR‑30e‑5p中的至少一种,通过检测miRNA的表达情况诊断肺部疾病。上述用于检测肺部疾病的标志物用于诊断肺结节良恶性时准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种用于肺部疾病诊断的标志物、试剂、试剂盒和检测系统。
背景技术
肺癌的早期发现是降低致死率的关键,CT的广泛应用使目前无临床症状的肺结节检出明显增多,对其良恶性的鉴别成为难点和关键,然而,单纯通过影像学判断结节良恶性非常困难。
液态活检是指通过体液对癌症等疾病做出诊断,具备取样简单、可重复性、无放射性及创伤性等优势。在精准医学时代,液态活检将是肺结节良恶性鉴别诊断的手段之一。液体活检对象主要包括:循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)和外泌体(exosomes)。但由于CTC及ctDNA在血液中含量低,收集纯化方法复杂,目前存在一定的弊端,而外泌体作为新兴的液体活检靶标正逐步成为新的检测对象。
虽然已经有采用外泌体miRNA作为疾病诊断的生物标志物,但外泌体miRNA用于肺结节良恶性鉴别时,准确性较差。
发明内容
基于此,有必要针对传统的外泌体miRNA作为标志物在肺结节良恶性时准确性较差的问题,提供一种用于诊断肺部疾病的标志物,该标志物用于检测肺结节良恶性时准确性高。
此外,还提供了一种上述标志物在制备肺部疾病的检测产品中的应用、肺部疾病的检测试剂、用于检测肺部疾病的试剂盒和检测系统。
一种用于肺部疾病诊断的标志物,所述标志物为miRNA,所述miRNA包括miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p、miR-192-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中的至少一种,通过检测所述miRNA的表达情况诊断肺部疾病。
在其中一个实施例中,所述miRNA为外泌体miRNA。
在其中一个实施例中,所述标志物至少满足以下一个特征:
(1)所述标志物能够用于肺癌辅助诊断,以区分肺癌与肺良性疾病、其他癌症、其他良性疾病、健康人;
(2)所述标志物能够用于肺结节良恶性鉴别诊断,以区分肺恶性结节和良性结节;
(3)所述标志物能够用于肺癌患者疗效诊断,以评估治疗效果;
(4)所述标志物能够用于肺癌复发监控诊断,评估复发风险。
在其中一个实施例中,所述miRNA包括miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p、miR-192-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中两种或两种以上的组合。
上述的用于肺部疾病诊断的标志物在制备通过如下方法进行肺部疾病诊断产品中的应用,所述方法包括以下步骤:测量样本中上述标志物的表达水平;及
根据所述标志物的表达水平诊断肺部疾病。
在其中一个实施例中,所述方法还包括以下步骤:富集所述样本的总外泌体;和/或,富集临床样本的具有肺组织特异性的外泌体。
在其中一个实施例中,所述具有肺组织特异性的外泌体为膜表达EGFR蛋白的外泌体。
在其中一个实施例中,所述应用包括以下任一项应用:
1)在制备用于肺部疾病诊断的miRNA标志物检测试剂中的应用;
2)在制备用于肺部疾病诊断的试剂盒中的应用;
3)在制备用于肺部疾病诊断的系统中的应用。
在其中一个实施例中,所述肺部疾病诊断包括以下诊断中的至少一种:
1)肺癌辅助诊断,所述肺癌辅助诊断用于区分肺癌与肺良性疾病、其他癌症、其他良性疾病、健康人;
2)肺结节良恶性鉴别诊断,所述肺结节良恶性鉴别诊断用于区分肺恶性结节和良性结节;
3)肺癌患者疗效评估诊断,所述肺癌患者疗效评估诊断用于评估治疗效果;
4)肺癌复发监控诊断,所述肺癌复发监控诊断用于评估复发风险。
在其中一个实施例中,所述方法适用的样本包括体液样本和/或组织样本。
一种肺部疾病的检测试剂,包括用于检测外泌体中的miRNA表达情况的试剂,所述miRNA包括miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p、miR-192-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中的至少一种。
在其中一个实施例中,所述用于检测外泌体中的miRNA含量的试剂包括检测引物对,所述检测引物对包括以下引物对中的至少一组:用于检测miR-143-3p表达量的miR-143-3p引物对;用于检测miR-103a-3p表达量的miR-103a-3p引物对;用于检测miR-92a-3p表达量的miR-92a-3p引物对;用于检测miR-223-3p表达量的miR-223-3p引物对;用于检测miR-363-3p表达量的miR-363-3p引物对;用于检测miR-199b-3p表达量的miR-199b-3p引物对;用于检测miR-16-5p表达量的miR-16-5p引物对;用于检测miR-155-5p表达量的miR-155-5p引物对;用于检测miR-122-5p表达量的miR-122-5p引物对;用于检测miR-483-5p表达量的miR-483-5p引物对;用于检测Let-7c-5p表达量的Let-7c-5p引物对;用于检测miR-486-5p表达量的miR-486-5p引物对;用于检测miR-192-5p表达量的miR-192-5p引物对;用于检测miR-20a-5p表达量的miR-20a-5p引物对;用于检测miR-221-3p表达量的miR-221-3p引物对;用于检测miR-21-5p表达量的miR-21-5p引物对;及用于检测miR-30e-5p表达量的miR-30e-5p引物对。
在其中一个实施例中,所述miR-143-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示;所述miR-103a-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示;所述miR-92a-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:5~6所示;所述miR-223-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:7~8所示;所述miR-363-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9~10所示;所述miR-199b-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示;所述miR-16-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:13~14所示;所述miR-155-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:15~16所示;所述miR-122-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:17~18所示;所述miR-483-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:19~20所示;所述Let-7c-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:21~22所示;所述miR-486-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:23~24所示;所述miR-143-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:25~26所示;所述miR-20a-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:27~28所示;所述miR-221-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:29~30所示;所述miR-21-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:31~32所示;所述miR-30e-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:33~34所示。
一种用于检测肺部疾病的试剂盒,包括上述的肺部疾病的检测试剂。
在其中一个实施例中,所述试剂盒还包括RNA提取试剂、质控品和PCR反应试剂中的至少一种。
一种肺部疾病的检测系统,包括检测模块,所述检测模块包括上述的肺部疾病的检测试剂。
在其中一个实施例中,还包括预处理模块,所述预处理模块用于从样品中富集miRNA。
在其中一个实施例中,所述预处理模块还包括外泌体富集试剂,所述外泌体富集试剂用于从样品中富集总外泌体和/或具有肺组织特异性的外泌体。
在其中一个实施例中,所述肺组织特异性的外泌体为外泌体膜表达EGFR蛋白的外泌体。
在其中一个实施例中,还包括数据处理模块,所述数据处理模块用于将来所述样品的miRNA表达量转换为诊断结果。
附图说明
图1为实施例1中富集的外泌体的纳米粒子跟踪分析结果;
图2为实施例1中富集的外泌体的电镜图;
图3为实施例1中外泌体miRNA的部分质量鉴定结果;
图4为实施例1中外泌体miRNA差异表达的火山图;
图5为实施例1中miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p和miR-223-3p的差异表达散点图;
图6为实施例1中miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-20a-5p和miR-16-5p的差异表达散点图;
图7为实施例1中miR-221-3p、miR-21-5p和miR-155-5p的差异表达散点图;
图8为实施例1中miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-30e-5p的差异表达散点图;
图9为实施例1中miR-486-5p、miR-192-5p差异表达散点图;
图10为实施例1中上调标志物的ROC曲线;
图11为实施例1中下调标志物的ROC曲线;
图12为实施例2中miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-363-3p、miR-20a-5p的差异表达散点图;
图13为实施例2中miR-483-5p、miR-122-5p、miR-192-5p的差异表达散点图;
图14为实施例2中miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-363-3p、miR-20a-5p、miR-483-5p、miR-122-5p、miR-192-5p标志物的ROC曲线;
图15~图17为实施例3中未经治疗阶段(治疗0周)、治疗中第2周、治疗中第4周阶段外泌体miRNA标志物miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-363-3p、miR-20a-5p、miR-483-5p、miR-122-5p、miR-192-5p表达水平及其差异;
图18~图20为实施例4中术后0个月、术后6个月阶段外泌体miRNA标志物miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-363-3p、miR-20a-5p、miR-483-5p、miR-122-5p、miR-192-5p表达水平及其差异;
图21为实施例6中的17种miRNAs标志物组合作为标志物的Score值分布散点图;
图22为实施例6中的17种miRNAs标志物组合作为标志物的ROC曲线;
图23为实施例7中的14种miRNAs标志物组合作为标志物的散点图;
图24为实施例7中的14种miRNAs标志物组合作为标志物的ROC曲线;
图25为实施例8中的12种miRNAs标志物组合作为标志物的散点图;
图26为实施例8中的12种miRNAs标志物组合作为标志物的ROC曲线;
图27为实施例9中的miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-20a-5p、miR-122-5p、miR-192-5p等5种miRNAs标志物在血浆外泌体与靶向捕获膜表达EGFR蛋白的血浆外泌体中的表达水平及其差异;
图28为实施例9中的在血浆外泌体与靶向捕获膜表达EGFR蛋白的血浆外泌体中,5种miRNAs标志物作为标志物的ROC曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
外泌体是活细胞分泌的大小为30nm~150nm的微小囊泡,广泛存在于唾液、血液、尿液等生物体液中,其包含蛋白质、脂肪、mRNA、miRNA等生物分子,可诱导细胞迁移、调节免疫应答、影响肿瘤微环境形成及促进转移等作用。外泌体具有很高的生物稳定性,并携带大量生物分子(特别是miRNA),介导细胞间的物质传递与信息交流。miRNA是长度21~25nt的RNA分子,可以特异性识别靶mRNA并调控编码基因的表达。
在本文中,如无特别说明,肺部疾病包括但不限于肺良性结节、肺恶性结节、肺良性疾病(例如肺部炎症、肺良性肿瘤,肺大泡和肺气肿等)。在本文中,如无特别说明,诊断包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。进一步地,在一些实施例中,肺部疾病诊断包括以下诊断中的至少一种:肺癌辅助诊断、肺结节良恶性鉴别诊断、肺癌患者疗效评估诊断和肺癌复发监控诊断。肺癌辅助诊断用于区分肺癌与肺良性疾病、其他癌症、其他良性疾病、健康人;肺结节良恶性鉴别诊断用于区分肺恶性结节和良性结节;肺癌患者疗效评估诊断用于评估治疗效果;肺癌复发监控诊断用于评估复发风险。
本申请一实施方式提供了一种用于肺部疾病诊断的标志物,该标志物为miRNA,miRNA包括miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p和、miR-192-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中的至少一种。进一步地,miRNA为外泌体miRNA。
进一步地,miRNA包括miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p、miR-192-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中两种或两种以上的组合。
在一些实施例中,miRNA包括miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p和miR-192-5p中的至少一种,通过检测miRNA的表达情况诊断肺部疾病。具体地,经本发明研究发现,外泌体miRNA中的miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p和miR-155-5p在肺恶性结节(早期肺癌)患者中的表达会显著上调,而miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p和miR-192-5p在肺恶性结节患者中的表达会显著下调。因此,上述miRNA中的至少一种可以用于检测是否患有肺恶性结节(早期肺癌)。可选地,肺部疾病为肺癌。在一个可选地具体实施例中,肺部疾病为恶性结节(或称早期肺癌)。进一步地,用于检测肺部疾病的miRNA还包括外泌体中的miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中的至少一种。具体地,经本发明研究发现,在肺恶性结节(早期肺癌)患者中,miR-20a-5p、miR-221-3p和miR-21-5p的表达会显著上调,miR-30e-5p的表达会显著下调。因此,miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中的至少一种可以用于肺恶性结节诊断。此外,还可以将miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p和miR-192-5p中的至少一种,与miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中的至少一种结合,用于肺恶性结节诊断。经验证,17种miRNAs标志物组合用于区分早期肺癌(肺恶性肺结节)与良性肺结节时灵敏度可以达到93.0%,特异性可以达到93.7%。17种miRNAs标志物组合用于区分早期肺癌(肺恶性肺结节)和肺良性疾病((肺部炎症、肺良性肿瘤,肺大泡和肺气肿等)时灵敏度可以达到85.7%,特异性可以达到95.8%。17种miRNAs标志物组合用于区分早期肺癌(肺恶性肺结节)、常见癌症(胃癌、肠癌、肝癌、乳腺癌等)和常见疾病(高血压、糖尿病、心脏病、支气管炎等)时灵敏度可以达到85.7%,特异性可以达到97.7%。
在一些实施例中,利用末端修饰有生物素的EGFR核酸适配体与表面修饰有链霉亲和素的载体(SA-树脂或磁珠)为反应体系,分离并富集血浆中膜表达EGFR蛋白的外泌体,体液外泌体中的miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-20a-5p、miR-122-5p和miR-192-5p中的至少一种用于更加显著地区分检测早期肺癌与健康人。具体地,经本发明研究发现,在经过EGFR适配体靶向捕获后,用于区分早期肺癌与健康人的体液外泌体miRNA中的miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-20a-5p、miR-122-5p和miR-192-5p作为标志物的ROC曲线下面积明显提升,预测准确性提高。miR-20a-5p和miR-192-5p在肺癌与健康人的表达差异显著提高。
本申请一实施方式还提供了一种上述任一实施例的用于肺部疾病诊断的标志物在制备通过如下方法进行肺部疾病诊断的产品中的应用,所述方法包括以下步骤:测量样本(例如临床样本)中上述任一实施例的标志物的表达水平;及根据所述标志物的表达水平诊断肺部疾病。进一步地,该方法还包括以下步骤:富集样本的总外泌体;和/或,富集样本的具有肺组织特异性的外泌体。更进一步地,具有肺组织特异性的外泌体为膜表达EGFR蛋白的外泌体。
基于上述,本申请一实施方式还提供了一种用于提高检测早期肺癌与健康人区分度的检测方法,该方法包括以下步骤:从待测样本中提取外泌体;检测外泌体中的miRNA的含量;及根据待测样本的miRNA含量区分待测样本是早期肺癌样本还是健康人样本。上述方法可以用于诊断早期肺癌、肺癌术中疗效评估以及术后复发监控。
可选地,待测样本为体液样本。在一些实施例中,待测样本为血液样本(例如血浆样本)、肺泡灌洗液样本或痰液样本。可以理解的是,待测样本不限于上述,还可以是其他含有上述标志物的样本(例如组织样本)。进一步地,在一些实施例中,从待测样本中提取外泌体的步骤包括:利用核酸适配体从待测样本中分离获得EGFR阳性外泌体。
基于上述,本申请一实施方式还提供了一种上述任一实施例的用于诊断肺部疾病的标志物制备肺部疾病的诊断产品(例如试剂或试剂盒)中的应用。
基于上述,本申请一实施方式还提供了一种肺部疾病的检测试剂,该肺部疾病的检测试剂包括用于检测外泌体中的miRNA含量的试剂。
在一些实施例中,用于检测外泌体中的miRNA含量的试剂包括用于检测外泌体中的miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p和miR-192-5p中的至少一种的含量的试剂。
可选地,用于检测外泌体中的miRNA含量的试剂包括检测引物对,检测引物对包括以下引物对中的至少一组:
用于检测miR-143-3p表达量的miR-143-3p引物对,miR-143-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示;用于检测miR-103a-3p表达量的miR-103a-3p引物对,miR-103a-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示;用于检测miR-92a-3p表达量的miR-92a-3p引物对,miR-92a-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:5~6所示;用于检测miR-223-3p表达量的miR-223-3p引物对,miR-223-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:7~8所示;用于检测miR-363-3p表达量的miR-363-3p引物对,miR-363-3p引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:9~10所示;用于检测miR-199b-3p表达量的miR-199b-3p引物对,miR-199b-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示;用于检测miR-16-5p表达量的miR-16-5p引物对,miR-16-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:13~14所示;用于检测miR-155-5p表达量的miR-155-5p引物对,miR-155-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:15~16所示;用于检测miR-122-5p表达量的miR-122-5p引物对,miR-122-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:17~18所示;用于检测miR-483-5p表达量的miR-483-5p引物对,miR-483-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:19~20所示;用于检测Let-7c-5p表达量的Let-7c-5p引物对,Let-7c-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:21~22所示;用于检测miR-486-5p表达量的miR-486-5p引物对,miR-486-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:23~24所示;用于检测miR-192-5p表达量的miR-192-5p引物对,miR-143-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:25~26所示。可以理解的是,针对各标志物的检测引物对的具体引物序列不限于上述,还可以根据具体需要检测的miRNA设计其他引物序列。
在一些实施例中,用于检测外泌体中的miRNA含量的试剂还包括用于检测外泌体中的miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中的至少一种的含量的试剂。可选地,检测引物对还包括以下引物对中的至少一组:
用于检测miR-20a-5p表达量的miR-20a-5p引物对,miR-20a-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:27~28所示;用于检测miR-221-3p表达量的miR-221-3p引物对,miR-221-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:29~30所示;用于检测miR-21-5p表达量的miR-21-5p引物对,miR-21-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:31~32所示;用于检测miR-30e-5p表达量的miR-30e-5p引物对,miR-30e-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:33~34所示。
在一些实施例中,用于检测外泌体中的miRNA含量的试剂还包括与检测引物对对应的检测探针。具体地,检测探针上连接有荧光基团和淬灭基团。可选地,荧光基团位于探针的5’端,淬灭基团位于探针的3’端。可选地,检测探针上连接的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE及Quasar 705中的一种。当然,在同一个反应体系中有两种以上的探针时,不同探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是,检测探针上连接的荧光基团不限于上述,还可以是其他荧光基团。
基于上述,本申请一实施方式还提供了一种用于检测肺部疾病的试剂盒,该试剂盒包括上述任一实施例的肺部疾病的检测试剂。
在一些实施例中,上述试剂盒还包括RNA提取试剂、质控品和PCR反应试剂中的至少一种。RNA提取试剂用于外泌体miRNA的提取;质控品用于质控;PCR反应试剂用于构建PCR扩增反应体系。
此外,本申请一实施方式还提供了一种肺部疾病的检测系统,该检测系统包括检测模块,检测模板包括上述任一实施例的肺部疾病的检测试剂。可选地,检测模块还包括检测设备。通过检测设备检测待测样本与检测试剂的反应的产物(例如扩增产物)而确定待测样本中标志物的含量。可选地,检测设备为荧光定量PCR仪。
进一步地,上述检测系统还包括预处理模块。可选地,预处理模块包括外泌体富集试剂。外泌体富集试剂用于从样品中富集总外泌体和/或具有肺组织特异性的外泌体。进一步地,肺组织特异性的外泌体为外泌体膜表达EGFR蛋白的外泌体。通过验证,在将待测样本经过靶向捕获富集血浆中膜表达EGFR蛋白的外泌体后可以提高标志物与早期肺癌相关性,具有显著优势。可选地,预处理模块包括与核酸适配体包被磁珠捕获技术相关的试剂及设备。
在一些实施例中,上述检测系统还包括数据处理模块。数据处理模块用于将来待测样品的miRNA表达量转换为诊断结果。
另外,本申请一实施方式还提供了一种肺部疾病诊断方法,该方法包括以下步骤:测量样本中上述任一实施例的标志物的表达水平;及根据标志物的表达水平诊断肺部疾病。可以理解的是,在一些实施例中,还包括采集临床患者样本的步骤。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明,则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明,均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规条件,例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
采集25例未经治疗的肺恶性结节(早期肺癌)患者和22例良性结节(作为对照)人的外周静脉血,分别进行如下操作:
1.外泌体富集、纯化和鉴定
(1)对血浆外泌体进行富集纯化(分子色谱排阻(SEC)法):
1)复合色谱离子交换柱,加入5ml PBS清洗柱达到平衡;
2)倒掉流出液,加入血清/血浆样本(5ml),丢掉流出液;
3)然后再500g离心3min,收集流出液,即为高纯度的总外泌体。
(2)用纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking analyzer,NTA)和透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,简称TEM)鉴定外泌体粒径大小和形态,结果如图1和图2所示。
由图1和图2可知,由步骤(1)获得的外泌体平均粒径91.3nm,实际浓度为6.5E+10(Particles/mL),电镜下囊泡结构呈圆形囊泡状,有双层膜结构,是典型的外泌体形态。
2.血浆外泌体mRNA提取与鉴定
采用商业化试剂盒miRNeasy mini kit(凯杰(Qiagen),217004)提取纯化外泌体mRNA,QUBIT测所提取的RNA浓度和纯度,并采用Agilent 2100生物分析仪系统分析总RNA质量和DV200值。DV200质量指标表示超过200nt的RNA片段的百分比。
3.RNA文库构建
(2)使用Monarch PCR&DNA Kit纯化PCR扩增后的cDNA产物;
(3)使用AMPure XP磁珠进行大小片段筛选;
(4)将步骤(2)扩增后的cDNA产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,割取所需的目标DNA片段(对应于miRNA)并回收,得到制备完成的miRNA测序文库。
(5)质控:使用Agilent 2100Bioanalyzer进行片段长度范围检测,使用Invitrogen Qubit进行浓度定量。
经过鉴定(部分结果如图3所示),各个样本的血浆外泌体miRNA文库2100片段分析合格,可用于后续测序上机。
4.上机测序,获得下机数据
(1)将上述miRNA文库进行二代测序,测序平台为Illumina HiSeq测序平台,测序读长在50bp到150bp之间,测序模式为单端测序或者双端测序。
(2)获得下机数据
5.下机数据分析及miRNAs标志物筛选
外泌体的miRNA测序下机数据分析包括:序列比对、全基因组Reads分布图谱,miRNA分类与注释、miRNA表达量分析、新miRNA预测、样品(组)间miRNA表达差异分析和聚类分析,最后对样品间相关性分析。
(1)通过质控工具对下机数据进行数据质控和预处理,得到去除了低质量序列和测序接头的有效数据,将其与人类参考基因组序列比对,获得定位于所述人类参考基因组序列的位置信息。
(2)利用位置信息以及对应的随机标签序列,对PCR重复序列进行去除,再将获得的已去除PCR重复的序列的位置与人类参考基因组中的miRNA位置相比较(miRNA位置信息取自于miRBase数据库,当某序列的5’端与某miRNA的5’端位置一致时,此序列记为此miRNA的测序序列),从而确定样本中所有的miRNA的表达量。
(3)基于miRNA的表达量数据,使用R语言edgeR包对肺恶性结节(早期肺癌)患者样本与肺良性结节样本(对照组)比对,筛选出在前者中有显著高表达或低表达的miRNAs。
经筛选,有23个在肺恶性结节(早期肺癌)患者样本显著高表达的miRNAs和13个显著低表达的miRNAs(变化差异倍数大于2)(差异表达的火山图如图4所示)。
(4)将miRNA的表达量作为自变量,使用R语言stats包进行逻辑回归建模,采用向后剔除的方法选择自变量,最终确定表达量差异具有统计学显著性的miRNAs,并按照表达量差异倍数进行排序,结果如表1所示。
表1
因此,经进一步确认,在显著高表达的13个miRNAs中有11个miRNAs的回归系数均具有统计学显著性高表达差异(P<0.05),和6个具有统计学显著性低表达差异(P<0.05)的miRNAs。所以,这17个miRNA可以作为肺癌早期检测的miRNA标志物。具体为上调:hsa-miR-143-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-155-5p;下调:hsa-miR-192-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-Let-7c-5p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-486-5p。
6.候选miRNAs标志物临床效果验证
(1)提取不同类型肺疾病血浆的外泌体及总miRNA(方法同前述)。
(2)实时荧光定量RT-qPCR技术(引物及探针如表2所示)检测上述候选血浆外泌体miRNAs表达量:采用逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,货号:K1622,Fermentas)建立逆转录体系(20μL体系反应条件:42℃,60min;85℃,5min;4℃,保存)。热循环参数(37℃,5min;94℃,5min预变性;变性94℃,15s和退火60℃,30s,延伸72℃,15s共50个循环;结束50℃,30s)。根据外投外源基因miR-39的CP值对样本进行提取质控,剔除质控不合格的样本。miRNA标志物标准品以10倍进行梯度稀释至(1×102copy/μL)检测,用以对样本表达量赋值并评价PCR扩增效率。
表2
(3)统计学方法
通过PCR下机数据获得miRNA检测的CP值和相对表达丰度值。根据相对定量公式计算miRNA靶标的表达量:△CP=CP(miRNA标志物)-CP(miRNA内参),检测结果(相对定量)=2-△CP。将检测结果与肺结节病理诊断对比统计分析。利用Graphpad Prism 7.0软件绘制差异性散点图;利用SPSS 22.0软件和MedCalc V20.0做出ROC曲线,得出cutoff值,计算符合率。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果如表3和图5~图11所示。其中,图5是miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p和miR-223-3p的差异表达散点图;图6是miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-20a-5p和miR-16-5p的差异表达散点图;图7是miR-221-3p、miR-21-5p和miR-155-5p的差异表达散点图;图8是miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-30e-5p的差异表达散点图;图9是miR-486-5p、miR-192-5p差异表达散点图;图10是上调标志物的ROC曲线,图11是下调标志物的ROC曲线。
表3
由表3和图5~图11可知,利用实时荧光定量PCR检测,上调标志物hsa-miR-143-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-155-5p和下调标志物hsa-miR-192-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-Let-7c-5p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-486-5p,在肺结节良恶性临床样本都具有很好区分效果,可用于肺结节良恶性鉴别。
实施例2
入组未经治疗的肺结节患者的肺泡灌洗液样本42例(其中恶性结节25例、良性结节17例)和痰液样本51例(其中肺恶性结节31例、良性结节20例)
按照实施例1中外泌体的富集、纯化方法以及外泌体miRNA提取方法,获得样本总miRNA。
按照实施例1中的方法通过RT-qPCR技术检测上述样本外泌体miRNA的表达量,获得miRNA检测的Cp值和相对表达丰度。利用Graphpad Prism 7.0软件绘制差异性散点图;利用SPSS 22.0软件和MedCalc V20.0做出ROC曲线。以P<0.05为差异具有统计学意义。
结果如图12~图14所示。其中,图12是miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-363-3p、miR-20a-5p的差异表达散点图;图13是miR-122-5p、miR-483-5p和miR-192-5p的差异表达散点图;图14是上述7个miRNA标志物的ROC曲线。
实施例3miRNA标志物用于早期肺癌患者疗效评估
纵向采集经医院确诊的肺癌患者在入组未经治疗阶段(治疗0周)、治疗中第2周、治疗中第4周阶段的体液样本(静脉外周血、肺泡灌洗液以及痰液)。
采用商业化试剂盒miRNeasy mini kit提取纯化获得样本外泌体miRNA,并通过RT-qPCR实验检测miRNA的表达量Cp值,根据公式计算相对表达量,结果如图15~17所示,其中,图15为术前、术中第2周、术中第4周静脉外周血外泌体miRNA标志物的差异表达散点图;图16为术前、术中第2周、术中第4周肺泡灌洗液外泌体miRNA标志物的差异表达散点图;图17为术前、术中第2周、术中第4周痰液样本中外泌体miRNA标志物的差异表达散点图。
如图15~图17中所示对不同治疗阶段患者样本的外泌体miRNA进行检测,miRNA上调标志物(miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-363-3p、miR-20a-5p)在治疗阶段与术前相比,基因表达量差异存在统计学意义(p<0.05)。在miR-122-5p、miR-483-5p和miR-192-5p的表达量检测结果中,miRNA靶标基因表达量出现上调,与疗效显著性相关,可用于治疗效果评估。
实施例4miRNA标志物用于复发监控检测结果
采集早期肺癌患者术后体液样本13例(静脉外周血、肺泡灌洗液以及痰液样本),术后6个月进行随访取样检测。其中7例无复发特征,6例在术后一年内出现复发或者淋巴结转移。统计分析患者在治疗后0个月与治疗后6个月的外泌体miRNA表达情况,分析miRNA表达水平与复发的相关性,结果如图18~图20所示,其中:图18为术后0个月、术后6个月阶段静脉外周血外泌体miRNA标志物的表达水平及其差异;图19为术后0个月、术后6个月阶段肺泡灌洗液外泌体miRNA标志物的表达水平及其差异;图20为术后0个月、术后6个月阶段痰液样本外泌体miRNA标志物的表达水平及其差异。
如图18所示,在6例复发样本中血浆外泌体miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-363-3p、miR-20a-5p、miR-483-5p、miR-122-5p和miR-192-5p术后0个月和术后6个月之间比较差异有统计学意义,而未复发样本中对应miRNA靶标无明显差异。如图19所示,肺泡灌洗液外泌体miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-363-3p、miR-20a-5p、miR-483-5p、miR-122-5p和miR-192-5p术后0个月和术后6个月的基因表达量差异在6例复发样本中存在统计学意义,在7例未复发样本中不存在明显差异。如图20所示,痰液样本外泌体miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-363-3p、miR-20a-5p、miR-483-5p、miR-122-5p和miR-192-5p术后0个月和术后6个月的基因表达量差异在6例复发样本中存在统计学意义,在7例未复发样本中不存在明显差异。上述说明体液外泌体miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-363-3p、miR-20a-5p、miR-483-5p、miR-122-5p、miR-192-5p可以作为肺癌术后检测的生化标志物,用于复发风险的评估。
实施例5两基因联合检测建模分析
将实施例1中的9个miRNA表达量进行两基因联合检测建模分析,获得公式S。
公式S为:S(Score)=C0+∑(Ci×miR-i)
基于具体临床样本(恶性结节患者47例和良性结节对照32例),得到具体的常数C0,和miRNA标志物的回归系数Ci,因此计算得到每例样本得分Score值。然后根据Score值进行ROC曲线分析,结果如表4所示。
miRNA上调靶标miRNA-16-5p分别联合上调靶标miRNA-143-3p、miRNA-103a-3p、miRNA-363-3p、miRNA-20a-5p、miRNA-223-3p进行临床样本检测exo-miRNA表达量,进行建模分析,获得如下公式S1-S5。
S1(Score)=-2.471+0.434×miR-16-5p+0.151×miR-143-3p;
S2(Score)=-2.613+0.21×miR-16-5p+0.278×miR-103a-3p;
S3(Score)=-2.319+0.291×miR-16-5p+0.535×miR-363-3p;
S4(Score)=-1.910+0.381×miR-16-5p+1.058×miR-20a-5p;
S5(Score)=-2.260+0.361×miR-16-5p+0.886×miR-223-3p;
miRNA上调靶标miRNA-16-5p分别联合下调靶标miRNA-483-5p、miRNA-122-5p、miRNA-192-5p、进行临床样本检测exo-miRNA表达量,进行建模分析,获得如下公式S6-S8。
S6(Score)=-1.062-0.344×miR-16-5p+1.545×miR-483-5p;
S7(Score)=-1.033-0.237×miR-16-5p+0.410×miR-122-5p;
S8(Score)=-0.425-0.349×miR-16-5p+0.380×miR-192-5p;
miRNA上调靶标miRNA-223-3p分别联合上调靶标miRNA-143-3p、miRNA-103a-3p、miRNA-363-3p、miRNA-20a-5p进行临床样本检测exo-miRNA表达量,进行建模分析,获得如下公式S9-S12。
S9(Score)=-2.280+0.672×miR-223-3p+0.113×miR-143-3p;
S10(Score)=-2.677+0.591×miR-223-3p+0218×miR-103a-3p;
S11(Score)=-2.604+0.724×miR-223-3p+0.433×miR-363-3p;
S12(Score)=-2.389+0.859×miR-223-3p+0.896×miR-20a-5p;
miRNA上调靶标miRNA-223-3p分别联合下调靶标miRNA-483-5p、miRNA-122-5p、miRNA-192-5p进行临床样本检测exo-miRNA表达量,进行建模分析,获得如下公式S13-S15。
S13(Score)=-0.302-0670×miR-223-3p+1.239×miR-483-5p;
S14(Score)=-0.296-0.547×miR-223-3p+0.327×miR-122-5p;
S15(Score)=-0.511+0.786×miR-223-3p-0.268×miR-192-5p;
miRNA上调靶标miRNA-143-3p联合上调靶标miRNA-103a-3p进行临床样本检测exo-miRNA表达量,进行建模分析,获得如下公式S16。
S16(Score)=-2.706+0.102×miR-143+0.217×miR-103a-3p。
表4
实施例6多基因联合检测建模分析
将实施例1中的17个miRNA表达量进行多基因联合检测建模分析,获得公式S。
公式S为:S(Score)=C0+∑(Ci×miR-i)
基于具体临床样本(恶性结节患者47例和良性结节对照32例),得到具体的常数C0,和17个miRNA标志物的回归系数Ci,因此计算得到每例样本得分Score值。然后根据Score值进行ROC曲线分析,得出cutoff值,根据cutoff值判读受试者患癌风险:Score>cutoff值为高风险;Score<cutoff值为低风险。
结果:S(Score)=-24.375+0.214×miR-143-3p+0.357×miR-103a-3p+1.242×miR-92a-3p+0.856×miR-223-3p+0.421×miR-363-3p+0.779×miR-199b-3p+2.134×miR-20a-5p+0.827×miR-16-5p+0.353×miR-221-3p+3.662×miR-21-5p+7.931×miR-155-5p-0.847×miR-122-5p-4.356×miR-483-5p-0.231×Let-7c-5p-0.867×miR-30e-5p-2.374×miR-486-5p-0.327×miR-192-5p。
对于47例恶性结节患者和32例良性结节对照,17种miRNAs标志物组合作为标志物的散点图和ROC曲线如图21~图22所示。由图21~图22可知,基于17种miRNAs标志物组合Score值对于肺良性和恶性结节有良好的区分效果,AUC为0.959(95%CI:0.914~1.000,P<0.0001),cutoff值取35.70,灵敏度为93.0%,特异性为93.7%。
实施例7多基因联合检测建模分析
按照实施例6相同的方法进行建模分析,获得公式S。
公式S为:S(Score)=C0+∑(Ci×miR-i);
基于入组未经治疗的早期肺癌患者35例、肺良性疾病(肺部炎症、肺良性肿瘤,肺大泡和肺气肿等)患者46例、健康对照25例,采集外周静脉血分离纯化血浆外泌体-miRNA,然后进行实时荧光定量PCR检测。得到具体的常数C0,和14个miRNA标志物的回归系数Ci,因此计算得到每例样本得分Score值。然后根据Score值进行ROC曲线分析,得出cutoff值,根据cutoff值判读受试者患癌风险:Score>cutoff值为高风险;Score<cutoff值为低风险。
结果:S(Score)=13.694+0.86×miR-143-3p+0.172×miR-103a-3p+0.338×miR-92a-3p+1.357×miR-223-3p+0.834×miR-363-3p+0.932×miR-199b-3p+1.135×miR-20a-5p+1.11×miR-16-5p+0.204×miR-21-5p-4.736×miR-122-5p-0.631×miR-483-5p-0.798×Let-7c-5p-5.391×miR-30e-5p-0.401×miR-192-5p。
对于35例早期肺癌患者、46例肺良性疾病(肺部炎症、肺良性肿瘤,肺大泡和肺气肿等)患者和25例健康对照,14种miRNAs标志物组合的作为标志物的散点图和ROC曲线如图23~图24所示。由图23~图24可知,基于14种miRNAs标志物组合Score值对于肺癌和肺部疾病有良好的区分效果,并且有效区分癌和健康组,AUC为0.950(95%CI:0.907~0.994,P<0.0001),cutoff值取44.46,灵敏度为85.7%,特异性为95.8%。
实施例8多基因联合检测建模分析
按照实施例6相同的方法进行建模分析,获得公式S。
公式S为:S(Score)=C0+∑(Ci×miR-i);
基于未经治疗的肺恶性结节(早期肺癌)患者35例、常见癌症(胃癌、肠癌、肝癌、乳腺癌等)患者54例、常见疾病(高血压、糖尿病、心脏病、支气管炎等)38例,采集外周静脉血分离纯化血浆外泌体-miRNA,然后进行实时荧光定量PCR检测,得到具体的常数C0,和12个miRNA标志物的回归系数Ci,因此计算得到每例样本得分Score值。然后根据Score值进行ROC曲线分析,得出cutoff值,根据cutoff值判读受试者患癌风险:Score>cutoff值为高风险;Score<cutoff值为低风险。
结果:S(Score)=-8.898+0.501×miR-143-3p+2.663×miR-103a-3p+1.376×miR-199b-3p+0.484×miR-16-5p+0.128×miR-221-3p+3.431×miR-21-5p+0.638×miR-155-5p-1.899×miR-122-5p-0.659×Let-7c-5p-0.555×miR-30e-5p-1.586×miR-486-5p-4.479×miR-192-5p。
对于35例入组未经治疗的肺恶性结节(早期肺癌)患者、54例常见癌症(胃癌、肠癌、肝癌、乳腺癌等)患者、38例常见疾病(高血压、糖尿病、心脏病、支气管炎等),12种miRNAs标志物组合的作为标志物的散点图和ROC曲线如图25~图26所示。由图25~图26可知,基于12种miRNAs标志物组合Score值可有效区分肺癌和其他常见肿瘤疾病,AUC为0.930(95%CI:0.871~0.988,P<0.0001),cutoff值取57.81,灵敏度为85.7%,特异性为97.7%。由此说明12种miRNAs标志物组合Score值不受其他肿瘤和常见疾病的干扰,可有效用于肺部疾病(结节良恶性、癌和疾病区分)的鉴别诊断。
实施例9靶向捕获exo联合miRNA检测用于早期肺癌筛查
采集28例未经治疗的早期肺癌患者和28例健康人的外周静脉血,进行直接富集血浆内总外泌体(作为对照),以及采用核酸适配体包被磁珠捕获技术,分离并富集血浆中膜表达EGFR蛋白的外泌体(作为实验组)。按照实施例1中miRNA的提取方法,获得样本总外泌体miRNA以及EGFR蛋白靶向捕获的外泌体miRNA。
通过RT-qPCR技术检测上述样本外泌体miRNA的表达量,获得miRNA检测的Cp值和相对表达丰度。利用Graphpad Prism 7.0软件绘制差异性散点图;利用SPSS 22.0软件和MedCalc V20.0做出ROC曲线。以P<0.05为差异具有统计学意义,以*表示,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.0001。
如图27~图28中所示,直接检测血浆外泌体miRNA-143-3p标志物在早期肺癌患者和健康人之间表达量差异有统计学意义,AUC为0.8380(95%CI:0.7347~0.9414,P<0.0001);通过靶向捕获富集血浆外泌体miRNA-143-3p标志物对于早期肺癌和健康人有很好的区分效果,表达量差异有统计学意义,AUC为0.9018(95%CI:0.8239~0.9797,P<0.0001)。与直接检测血浆外泌体miRNA-143-3p标志物表达量比较,靶向捕获富集外泌体能够提高早期肺癌和健康人的检测区分度。
如图27~图28中所示,直接检测血浆外泌体miRNA-103a-3p标志物在早期肺癌患者和健康人之间表达量差异有统计学意义,AUC为0.9258(95%CI:0.8589~0.9927,P<0.0001);通过靶向捕获富集血浆外泌体miRNA-103a-3p标志物对于早期肺癌和健康人有很好的区分效果,表达量差异有统计学意义,AUC为0.9478(95%CI:0.8935~1.000,P<0.0001)。与直接检测血浆外泌体miRNA-103a-3p标志物表达量比较,靶向捕获富集外泌体能够提高早期肺癌和健康人的检测区分度。
如图27~图28中所示,直接检测血浆外泌体miRNA-20a-5p标志物在早期肺癌患者和健康人之间表达量差异有统计学意义,AUC为0.7054(95%CI:0.5534~0.8573,P=0.0083);通过靶向捕获富集血浆外泌体miRNA-20a-5p标志物对于早期肺癌和健康人有很好的区分效果,表达量差异有统计学意义,AUC为0.9279(95%CI:0.8653~0.9906,P<0.0001)。与直接检测血浆外泌体miRNA-20a-5p标志物表达量比较,靶向捕获富集外泌体能够提高早期肺癌和健康人的检测区分度。
如图27~图28中所示,直接检测血浆外泌体miRNA-122-5p标志物在早期肺癌患者和健康人之间表达量差异有统计学意义,AUC为0.8776(95%CI:0.7822~0.9729,P<0.0001);通过靶向捕获富集血浆外泌体miRNA-122-5p标志物对于早期肺癌和健康人有很好的区分效果,表达量差异有统计学意义,AUC为0.8827(95%CI:0.7929~0.9724,P<0.0001)。与直接检测血浆外泌体miRNA-122-5p标志物表达量比较,靶向捕获富集外泌体能够提高早期肺癌和健康人的检测区分度。
如图27~图28中所示,直接检测血浆外泌体miRNA-192-5p标志物在早期肺癌患者和健康人之间表达量差异有统计学意义,AUC为0.7615(95%CI:0.6371~0.8859,P=0.0008);通过靶向捕获富集血浆外泌体miRNA-192-5p标志物对于早期肺癌和健康人有很好的区分效果,表达量差异有统计学意义,AUC为0.8472(95%CI:0.7449~0.9495,P<0.0001)。与直接检测血浆外泌体miRNA-192-5p标志物表达量比较,靶向捕获富集外泌体能够提高早期肺癌和健康人的检测区分度。
如图27~图28中所示,对比直接检测血浆外泌体miRNA标志物,通过靶向捕获富集血浆中膜表达EGFR蛋白的外泌体,再提取检测miRNA标志物表达水平可以提高标志物与早期肺癌相关性,具有显著优势。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,便于具体和详细地理解本发明的技术方案,但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是,在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案,均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (20)
1.一种用于肺部疾病诊断的标志物,其特征在于,所述标志物为miRNA,所述miRNA包括miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p、miR-192-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中的至少一种,通过检测所述miRNA的表达情况诊断肺部疾病。
2.根据权利要求1所述标志物,其特征在于,所述miRNA为外泌体miRNA。
3.根据权利要求1~2所述标志物,其特征在于,所述标志物至少满足以下一个特征:
(1)所述标志物能够用于肺癌辅助诊断,以区分肺癌与肺良性疾病、其他癌症、其他良性疾病、健康人;
(2)所述标志物能够用于肺结节良恶性鉴别诊断,以区分肺恶性结节和良性结节;
(3)所述标志物能够用于肺癌患者疗效诊断,以评估治疗效果;
(4)所述标志物能够用于肺癌复发监控诊断,评估复发风险。
4.根据权利要求1~2所述标志物,其特征在于,所述miRNA包括miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p、miR-192-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中两种或两种以上的组合。
5.权利要求1~4任一项所述的用于肺部疾病诊断的标志物在制备通过如下方法进行肺部疾病诊断的产品中的应用,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
测量样本中如权利要求1~4任一项所述的标志物的表达水平;及
根据所述标志物的表达水平诊断肺部疾病。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述方法还包括以下步骤:富集所述样本的总外泌体;和/或,富集所述样本的具有肺组织特异性的外泌体。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述具有肺组织特异性的外泌体为膜表达EGFR蛋白的外泌体。
8.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述应用包括以下任一项应用:
1)在制备用于肺部疾病诊断的miRNA标志物检测试剂中的应用;
2)在制备用于肺部疾病诊断的试剂盒中的应用;
3)在制备用于肺部疾病诊断的系统中的应用。
9.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述肺部疾病诊断包括以下诊断中的至少一种:
1)肺癌辅助诊断,所述肺癌辅助诊断用于区分肺癌与肺良性疾病、其他癌症、其他良性疾病、健康人;
2)肺结节良恶性鉴别诊断,所述肺结节良恶性鉴别诊断用于区分肺恶性结节和良性结节;
3)肺癌患者疗效评估诊断,所述肺癌患者疗效评估诊断用于评估治疗效果;
4)肺癌复发监控诊断,所述肺癌复发监控诊断用于评估复发风险。
10.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述方法适用的样本包括体液样本和/或组织样本。
11.一种肺部疾病的检测试剂,其特征在于,包括用于检测外泌体中的miRNA表达情况的试剂,所述miRNA包括miR-143-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-363-3p、miR-199b-3p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-122-5p、miR-483-5p、Let-7c-5p、miR-486-5p、miR-192-5p、miR-20a-5p、miR-221-3p、miR-21-5p和miR-30e-5p中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的检测试剂,其特征在于,所述用于检测外泌体中的miRNA含量的试剂包括检测引物对,所述检测引物对包括以下引物对中的至少一组:
用于检测miR-143-3p表达量的miR-143-3p引物对;
用于检测miR-103a-3p表达量的miR-103a-3p引物对;
用于检测miR-92a-3p表达量的miR-92a-3p引物对;
用于检测miR-223-3p表达量的miR-223-3p引物对;
用于检测miR-363-3p表达量的miR-363-3p引物对;
用于检测miR-199b-3p表达量的miR-199b-3p引物对;
用于检测miR-16-5p表达量的miR-16-5p引物对;
用于检测miR-155-5p表达量的miR-155-5p引物对;
用于检测miR-122-5p表达量的miR-122-5p引物对;
用于检测miR-483-5p表达量的miR-483-5p引物对;
用于检测Let-7c-5p表达量的Let-7c-5p引物对;
用于检测miR-486-5p表达量的miR-486-5p引物对;
用于检测miR-192-5p表达量的miR-192-5p引物对;
用于检测miR-20a-5p表达量的miR-20a-5p引物对;
用于检测miR-221-3p表达量的miR-221-3p引物对;
用于检测miR-21-5p表达量的miR-21-5p引物对;及
用于检测miR-30e-5p表达量的miR-30e-5p引物对。
13.根据权利要求12所述的检测试剂,其特征在于,所述miR-143-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示;所述miR-103a-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示;所述miR-92a-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:5~6所示;所述miR-223-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:7~8所示;所述miR-363-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9~10所示;所述miR-199b-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示;所述miR-16-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:13~14所示;所述miR-155-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:15~16所示;所述miR-122-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:17~18所示;所述miR-483-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:19~20所示;所述Let-7c-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:21~22所示;所述miR-486-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:23~24所示;所述miR-143-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:25~26所示;所述miR-20a-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:27~28所示;所述miR-221-3p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:29~30所示;所述miR-21-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:31~32所示;所述miR-30e-5p引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:33~34所示。
14.一种用于检测肺部疾病的试剂盒,其特征在于,包括权利要求11~13任一所述的肺部疾病的检测试剂。
15.根据权利要求14所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括RNA提取试剂、质控品和PCR反应试剂中的至少一种。
16.一种肺部疾病的检测系统,其特征在于,包括检测模块,所述检测模块包括权利要求11~13任一项所述的肺部疾病的检测试剂。
17.根据权利要求16所述的检测系统,其特征在于,还包括预处理模块,所述预处理模块用于从样品中富集miRNA。
18.根据权利要求17所述的检测系统,其特征在于,所述预处理模块还包括外泌体富集试剂,所述外泌体富集试剂用于从样品中富集总外泌体和/或具有肺组织特异性的外泌体。
19.根据权利要求18所述的检测系统,其特征在于,所述肺组织特异性的外泌体为外泌体膜表达EGFR蛋白的外泌体。
20.根据权利要求16~19任一所述的检测系统,其特征在于,还包括数据处理模块,所述数据处理模块用于将来所述样品的miRNA表达量转换为诊断结果。
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