CN108179190B

CN108179190B - 一种非小细胞肺癌的血浆外泌体circRNA标志物及其检测引物、试剂盒

Info

Publication number: CN108179190B
Application number: CN201810112800.0A
Authority: CN
Inventors: 杨磊; 吕嘉春; 丘福满
Original assignee: Guangzhou Medical University
Current assignee: Guangzhou Medical University
Priority date: 2018-02-05
Filing date: 2018-02-05
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2038-02-05
Also published as: CN108179190A

Abstract

本发明公开了一种非小细胞肺癌的血浆外泌体circRNA标志物及其检测引物、试剂盒。所述circRNA标志物为circ_0047921、circ_0007761或circ_0056285中的一种或多种。在NSCLC患者血浆外泌体中，上述circRNAs的表达水平与其他肺部疾患病人和健康人群血浆外泌体有显著差异。本发明还提供了分别用于检测circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285的特异性引物组及其试剂盒。本发明的标志物可单独用于NSCLC的诊断，具有一定的准确性，其组合可以显著提高诊断的准确度（AUC为0.894，敏感度和特异度分别为87.25%和80.00%），并且可以鉴别NSCLC患者与其他肺部疾病患者包括肺结核、慢性阻塞性肺等疾病病患，有助于实现NSCLC的早期发现。

Description

一种非小细胞肺癌的血浆外泌体circRNA标志物及其检测引物、试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种非小细胞肺癌的血浆外泌体circRNA标志物及其检测引物、试剂盒。

背景技术

肺癌是我国乃至全世界最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均位居癌症首位。最新数据显示2015年我国居民新发肺癌约73.33万例，占全部恶性肿瘤的17.09%；死亡人数达61.02万，占全部恶性肿瘤的21.68%。80%以上的肺癌是非小细胞肺癌（NSCLC）。NSCLC的5年生存率仍低于20%。研究发现，肺癌未转移者的5年生存率（60%～80%）要显著高于局部转移者（生存率25%～50%）和远端转移者（生存率低于5%）。可见，早期发现、早期治疗是提高肺癌治愈率的关键。

由于肺癌发病隐匿且缺乏有效的早期诊断方法，50%以上的肺癌患者在病理确诊时就已发生转移，错失了治疗良机。目前采用的早期诊断方法即影像学检查，包括低剂量螺旋计算机断层扫描、正电子发射型计算机断层扫描显像结合非开胸手术活检，都存在灵敏度低或假阳性等问题。近年来，基于分子诊断的液体活检技术在肿瘤诊断中受到广泛关注，一些肿瘤特异的分子标志物如癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌相关抗原（SCC-Ag）及循环微小RNA（microRNA）等的检测加上辅助的影像学检查，能提高诊断的灵敏度。这些分子标志物可在血液等体液中直接检测，具有简便、快捷、无创、廉价、可重复检测等优点，容易为病人接受，对肿瘤的临床诊断具有重要意义，有很好的临床应用前景。

外泌体（Exosomes）是一种直径为30～100纳米之间的小囊泡，可由多种细胞分泌，内含大量的蛋白质、脂质和RNA分子。外泌体既参与了机体正常的生理活动，也影响着人类疾病的发生发展。与正常细胞一样，肿瘤细胞也分泌外泌体。来源于肿瘤细胞的外泌体，其内含物成分直接由肿瘤细胞产生并储藏在其内，研究显示外泌体内基因的表达水平与宿主细胞具有高度一致性。外泌体体积微小，易于进入血液中，且其自身稳定，膜结构可有效保护其内含分子被降解，是循环RNA的有效载体。有研究者指出血浆外泌体比血液更能反映肿瘤细胞的成分特征，在肺癌组织中高表达的、被认为是肿瘤标志物的表皮生长因子受体在肺癌病例血浆外泌体中的表达显著高于健康人群血浆外泌体中的表达，但直接在血浆中检测EGFR的表达，两者却无显著差异。由此可见，血浆外泌体含有肿瘤分子标志物，收集方便，是理想的液体活检载体。

NSCLC细胞分泌的外泌体进入血液融合为血浆外泌体，其携带的肺癌特异性表达的分子有望作为肺癌早期诊断的分子标志物。相对于外泌体内含的蛋白质和脂质分子，RNA分子的检测手段更为简便、快捷、廉价，是最为理想的检测标志。然而，大部分的RNA为线性RNA，稳定性差，易于降解，临床应用价值有限。不同于线性RNA，环状RNA（circRNA）是一种具有环状特征的RNA分子，呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。大量研究显示circRNA与肿瘤包括NSCLC发生发展密切相关，其在肿瘤与其他疾病中有特征性的表达方式，提示circRNA具有作为肿瘤早期诊断标志的潜力。此外，已有少量研究报道血浆外泌体中检测出circRNA。

目前，尽管一些研究已报道一些可用于肺癌诊断的分子标志物，但总体而言，这些标志物的特异性较差，且可靠性低。因此，仍需探索高效、特异的肺癌分子标志物，用于肺癌的早期诊断。外泌体circRNA既具备肿瘤外泌体和circRNA的肿瘤特异性特征，还具有外泌体膜结构和circRNA自身闭环结构的双重稳定保障，是肿瘤诊断的极佳标志。目前尚未有有关外泌体circRNA在NSCLC诊断中的研究报道，寻找可用于NSCLC诊断的外泌体circRNA是NSCLC研究中亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有非小细胞肺癌检测诊断标志物特异性较差、可靠性低等问题，提供一种用于非小细胞肺癌检测诊断的血浆外泌体circRNA标志物。所述标志物可单独用于NSCLC的诊断，具有一定的准确性，其组合可以显著提高诊断的准确度，并且可以鉴别NSCLC患者与其他肺部疾病患者包括肺结核、慢性阻塞性肺等疾病病患，有助于实现NSCLC的早期发现。

本发明的第一个目的是提供一种非小细胞肺癌的血浆外泌体circRNA标志物。

本发明的第二个目的是提供一种检测所述血浆外泌体circRNA标志物的引物组。

本发明的第三个目的是是提供一种检测所述血浆外泌体circRNA标志物的非小细胞肺癌诊断试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种非小细胞肺癌的血浆外泌体circRNA标志物，所述标志物为circ_0047921、circ_0007761或circ_0056285中的一种或多种，所述circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285的cDNA序列依次如SEQ ID NO：1～3所示。

本发明人致力于提高肺癌诊断准确率以及早期诊断的研究，经过深入的研究，通过高通量测序技术发现了一组NSCLC血浆外泌体的circRNA标志物：circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285。在NSCLC患者血浆外泌体中，这些circRNAs的表达显著差别于其他肺部疾病和健康对照。联合应用这些标志物，诊断的准确度显著高于应用单一标志物的情形，进一步联合个体基本特征更能显著提高诊断价值，对NSCLC的诊断具有较高的准确度。并且，能够检测出NSCLC早期患者。因此，可应用这些标志物来制造可高效诊断NSCLC的诊断试剂盒。

所述circ_0007761定位于染色体3p14.1区；circ_0056285定位于染色体2q14.2区；circ_0047921定位于染色体18q22.2，其在肺癌中的表达及临床意义均未见报道。

本发明还请求保护所述标志物在诊断非小细胞肺癌和/或区分非小细胞肺癌早、中、晚期或在制备非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用。

一种用于检测上述血浆外泌体circRNA标志物表达情况的引物组，包括三对分别检测circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285的上下游引物circ_0047921-F和circ_0047921-R，circ_0007761-F和circ_0007761-R，circ_0056285-F和circ_0056285-R，引物核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO：4～9所示。

circ_0047921-F：5’-CAGCGCAGGAGAAAACGAAAC-3’（SEQ ID NO：4）；

circ_0047921-R：5’-AGGCTGACAAGTGAGTGTGA-3’（SEQ ID NO：5）

circ_0007761-F： F：5’-GGGACAGTCGTGGAATCTGT-3’ （SEQ ID NO：6）

circ_0007761-R：5’-ACATTCTTTCCGCTCCTTCC-3’（SEQ ID NO：7）

circ_0056285-F：3： F：5’-AAGTCTGACCTAGAGGAGCGG-3’（SEQ ID NO：8）

circ_0056285-R：5’-TGTGACACACAGATGACCCAC-3（SEQ ID NO：9）

利用上述引物组可特异性检测所述三种circRNAs的表达情况，采用常规荧光定量PCR法即可快速、简便、廉价、直观地获得检测结果，从而可作出判断。

同时，本发明还请求保护所述引物组在制备非小细胞肺癌诊断试剂和/或试剂盒中的应用。

一种非小细胞肺癌诊断试剂盒，所述试剂盒包含检测所述血浆外泌体circRNA标志物circ_0047921、circ_0007761或circ_0056285的引物组。

优选地，所述试剂盒中的引物组为上述SEQ ID NO：4～9所示引物组中的一对或多对。

优选地，所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂、荧光定量PCR反应所需试剂、DEPC处理水、阳性对照和阴性对照；所述阳性对照可选用任何肺癌细胞系提取的总RNA，阴性对照采用去离子水。

优选地，所述试剂盒诊断非小细胞肺癌10μL的荧光定量PCR反应体系为：cDNA模板2μL，10μM特异性引物F、R（SEQ ID NO：4～9中任一对引物）各0.5μL，PCR MIX 5μL，去离子水2μL。

优选地，所述试剂盒荧光定量PCR反应程序为：50℃ 2min，95℃ 10min；92℃ 15s，60℃ 1 min，共45个循环。

更优选地，所述试剂盒还包含有样本外泌体分离及RNA提取所需试剂。

作为一种优选地实施方式，本发明还提供利用所述试剂盒进行NSCLC检测（确定、鉴定或诊断）的方法，所述方法包括如下步骤：

S1.超高速离心法分离血浆外泌体；

S2.常规方法提取外泌体RNA，并逆转录为cDNA；

S3.以步骤S2所述cDNA为模板，用SEQ ID NO：4～9所示引物组进行荧光定量PCR检测，确定circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285的表达水平。

S4.利用预测概率模型Y_pre1=-40.106+0.131×Ct_{(circ_0047921)}+0.663×Ct_{(circ_0056285)}+417.86×1/Ct_{(circ_0007761)}；或Y_pre2=-37.692+0.136×Ct_{(circ_0047921)}+0.669×Ct_{(circ_0056285)}+ 384.487×1/Ct_{(circ_0007761)}+0.045×年龄-0.209×BMI+1.271×吸烟状态-2.206×肺癌家族史+1.753×肿瘤家族史进行预测。

优选地，步骤S1所述超高速速离心法步骤为：样本血浆在在4 ℃的环境下，离心2000×g 20min，弃沉淀；然后离心l0,000×g 30min，弃沉淀；再将样品用0.22μm的注射器滤筛过滤并且离心120,000×g 2hour，弃掉上清液；PBS重悬，再次超速离心120,000×g1hour；室温干燥，10μL冷PBS重悬。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现了对非小细胞肺癌（NSCLC）具有较高诊断价值的生物标记物外泌体circRNA：circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285；通过以circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285作为检测（确定、鉴定或诊断）NSCLC的标志物，分析这些circRNAs在血浆外泌体的表达情况，可以较大概率准确判断受试者的是否罹患NSCLC，为疾病的早期发现提供依据，或可早期评估受试者罹患肺癌的可能性。这些标志物可单独用于NSCLC的诊断，具有一定的准确性，其组合可以显著提高诊断的准确度（AUC为0.872，敏感度和特异度分别为81.86%和77.45%），并且可以鉴别NSCLC患者与其他肺部疾病患者包括肺结核、慢性阻塞性肺等疾病病患，有助于实现NSCLC的早期发现。通过进一步制备血浆外泌体circRNA标志物和诊断试剂盒，可以使得NSCLC的诊断更加方便易行，早期发现NSCLC，为患者早期治疗提供契机，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为NSCLC外泌体circRNA标记物筛选流程。

图2为NSCLC相关circRNA标志物的表达情况；A为血浆来源的Exosomal circRNA差异表达谱；B为NSCLC相关circRNA标志物在肺癌组织与癌旁组织表达情况；C为血浆外泌体circRNA标志物在实验组NSCLC病例与对照表达情况；D为血浆外泌体circRNA标志物在所有NSCLC病例与对照表达情况。

图3为3个标志物及其组合对于诊断NSCLC的ROC曲线；其中左图为所有NSCLC诊断分析；右图为早期NSCLC诊断分析。

图4为本发明用于诊断NSCLC的流程图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 非小细胞肺癌标志物的筛选

一、研究方法

1、研究人群

病例组为2014年11月至2016年12月在广州医科大学附属肿瘤医院、广州医科大学附属第一医院、广州市第一人民医院、广州市胸科医院收集的245例NSCLC病例，均经病理组织学确诊，采血前未经过手术和放化疗。对照组为同期收集的在上述医学就诊的肺部其他疾病患者和体检中心健康人群，按性别相同、年龄±5岁、吸烟状态并吸烟量相近的原则，组间频率匹配的方式收集44例肺部其他疾病患者和231例健康对照。在签订知情同意书后，所有研究对象提供外周静脉血5ml及个体基本信息如性别、年龄、有关疾病史、肿瘤家族史、吸烟、饮酒等。统计结果显示，病例组和对照组在性别、年龄、吸烟状态及吸烟量等因素上无明显统计学差异，但在BMI、饮酒史、肿瘤家族史上有显著差异。表1为此次研究中NSCLC组和对照组人群的人口学资料。

表1 人群个体特征和主要环境暴露因素分布结果

变量	病例 n (%)	对照 n (%)	<i>P</i>值<sup><i>a</i></sup>
				样本量	245	275
年龄
				≤ 60岁	134(54.7)	146(53.1)	0.714
> 60岁	111(45.3)	129(46.9)
				性别
男	168(68.6)	189(68.7)	0.970
				女	77(31.4)	86(31.3)
吸烟史
				吸烟者	139(56.7)	158(57.4)	0.869
不吸烟者	106(43.3)	117(42.6)
				吸烟量（包年）
≥20	105(42.8)	127(46.2)	0.595
				<20	34(13.9)	31(11.3)
0	106(43.3)	117(42.5)
				BMI
<18.5	45(18.4)	16(5.8)	<0.001
				18.5-23.9	149(60.8)	137(49.8)
>23.9	51(20.8)	122(44.4)
				饮酒史
饮酒者	60(24.5)	105(38.2)	0.001
				不饮酒者	185(75.5)	170(61.8)
肿瘤家族史
				有	25(10.2)	15(5.5)	0.045
无	220(89.8)	258(94.5)
				肺癌家族史
有	7(2.9)	10(3.6)	0.618
				无	238(97.1)	265(96.4)
患病状态
				肺腺癌	245(100)
其他肺部疾病<sup><i>b</i></sup>		44(16.0)
				健康		231(84.0)
临床分期
				I	20(8.1)
II	36(14.7)
				III	83(33.9)
IV	106(43.3)

^a P值为双侧卡方检测。

^b包括肺结核、慢阻肺等。

2、筛选方法

本发明进行NSCLC标志物的筛选流程如图1。本实施例的目的是从血浆外泌体中筛选出可以区分NSCLC患者和非NSCLC样本的circRNA标志物。通过高通量测序技术将NSCLC患者的血浆外泌体样本与非NSCLC的样本中的circRNA进行大规模的比较，继而对差异分子在大样本中进行验证，以期筛选出NSCLC相关分子标记物。

本发明人共筛选出3个circRNAs，其在NSCLC患者的血浆外泌体样本与非NSCLC的样本中的表达有显著差异，并且可以较好地对两组人群进行区分。其中，circ_0007761（P<0.001）在NSCLC外周血来源的外泌体中的表达水平显著高于其他肺疾病来源和健康对照来源的外泌体，circ_0056285（P=0.001）在前者中的表达水平要显著低于后两者，而circ_0047921（P<0.001）在NSCLC外周血来源的外泌体中的表达水平显著高于健康对照来源的外泌体，但低于其他肺疾病来源的外泌体。如图2所示。因此，本发明人共新发现了3个有效的NSCLC分子标志物：circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285，其cDNA序列依次如SEQID NO：1～3所示。

实施例2 非小细胞肺癌诊断模型的建立以及ROC分析

利用ROC曲线法对实施例1获得的3个血浆外泌体circRNAs在NSCLC的筛选和诊断的临床价值进行了分析。3个circRNAs单独对NSCLC均有显著的诊断价值，circ_0047921准确性达到0.577（95%可信区间为0.523-0.631），circ_0007761准确性达到0.667（95%可信区间为0.617-0.718），circ_0056285准确性达到0.683（95%可信区间为0.634-0.732）。采用多变量线性组合的ROC曲线分析方法对上述四个指标进行组合，利用二项逻辑回归获得个体预测概率模型Y_pre1=-40.106+0.131×Ct_{(circ_0047921)}+0.663×Ct_{(circ_0056285)}+417.86×1/Ct_{(circ_0007761)}。该组合对NSCLC的诊断价值显著提升，准确性达到0.797（95%可信区间为0.756-0.839），正确分类指数最大时灵敏度为67.65%，特异度为80.17%。若进一步将性别、年龄等个体特征值加入模型，获得个体预测概率模型Y_pre2=-37.692+0.136×Ct_{(circ_0047921)}+0.669×Ct_{(circ_0056285)}+384.487×1/Ct_{(circ_0007761)}+0.045×年龄-0.209×BMI+1.271×吸烟状态-2.206×肺癌家族史+1.753×肿瘤家族史，此模型诊断的准确性进一步提高，达到0.894（95%可信区间为0.865-0.923），正确分类指数最大时灵敏度为87.25%，特异度为80.00%，可见该预测模型对肺腺癌的诊断具有较高的准确性（模型说明：年龄单位为岁；吸烟状态编码为现在吸烟2，过去吸烟1，不吸烟0；肺癌家族史及肿瘤家族史为1是0否），其结果如如图3所示。

为了探索该模型对于早期肺癌诊断的能力，本发明人在245例肺癌患者选取了56例早期肺癌患者，发现上述模型Y_pre1和Y_pre2均可以显著区分早期肺癌患者和对照组（图3），前者准确性达到0.713（95%可信区间为0.630-0.796），后者准确性达到0.863（95%可信区间为0.808-0.919）。

实施例3 非小细胞肺癌诊断剂盒的制备及临床应用

1、制备临床用的检测试剂盒

一种非小细胞肺癌诊断剂盒，所述试剂盒包含以下组分：1.5ml EP管，分别装有检测circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285表达的特异性引物。所述的试剂盒中还可包括用于外泌体分离，RNA提取，逆转录和荧光定量PCR检测等所需的其他各种试剂，包括但不限于：Taq DNA聚合酶、逆转录酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水和PBS缓冲液。该试剂盒可直接应用于临床。所述特异性引物序列如下：

circ_0047921-F：5’-CAGCGCAGGAGAAAACGAAAC-3’（SEQ ID NO：4）；

circ_0047921-R：5’-AGGCTGACAAGTGAGTGTGA-3’（SEQ ID NO：5）

circ_0007761-F： F：5’-GGGACAGTCGTGGAATCTGT-3’ （SEQ ID NO：6）

circ_0007761-R：5’-ACATTCTTTCCGCTCCTTCC-3’（SEQ ID NO：7）

circ_0056285-F：3： F：5’-AAGTCTGACCTAGAGGAGCGG-3’（SEQ ID NO：8）

circ_0056285-R：5’-TGTGACACACAGATGACCCAC-3（SEQ ID NO：9）。

所述试剂盒使用方法如图4所示，具体包括如下步骤：

S1.超高速离心法分离血浆外泌体；

S2.常规方法提取外泌体RNA，并逆转录为cDNA；

S3.以步骤S2所述cDNA为模板，配置荧光定量PCR反应体系为：样本cDNA 2μL，10μM特异性引物F、R各0.5μL，PCR MIX （含5U/μL Taq DNA聚合酶，20mM dNTP，25mM MgCl₂，5×荧光定量PCR反应缓冲液）5μL，去离子水2μL，共10μL。反应程序为：50℃ 2min，95℃ 10min；92℃ 15 s，60℃ 1 min，共45个循环。在ABI 7900或7500等荧光定量PCR仪上进行检测，按常规程序自动分析得到各标志物Ct值；

具体地，分离外泌体并提取RNA、逆转录为cNDA的步骤如下所示：

（1）使用肝素钠抗凝管才外周静脉血5ml，立即置于4℃保存过夜，隔天分离血浆，冻存于-20℃冰箱。所有血浆均在一周内分离外泌体并提取RNA。

（2）采用超高速速离心法分离血浆外泌体，样本血浆在在4 ℃的环境下，离心2000×g 20min，弃沉淀；然后离心l0,000×g 30min，弃沉淀；再将样品用0.22μm的注射器滤筛过滤并且离心120,000×g 2hour，弃掉上清液；PBS重悬，再次超速离心120,000×g 1hour；室温干燥，20μL冷PBS重悬。

（3）按照QIAzol Lysis Reagent试剂盒（德国QIAGEN公司）操作说明书从血浆分离的Exosomes中提取总RNA。

（4）按照Takara反转录试剂盒（中国宝生物工程有限公司）操作说明书进行逆转录反应（RNA逆转录为cDNA）。反应总体积为20μl：预混液12μl（含总RNA 10μl， Random 6 mersprimer 1μl，dNTP Mixture 1μl），5×PrimeScript® Buffer 4μl，RNase Inhibitor 0.5μl，PrimeScript® RTase 1μl，RNase Free dH₂O 2.5μl。反应程序为：预混液65℃ 5min，冰上急冷，加入其他反应液，30℃ 5min，42℃ 60min，95℃ 5 min，处理后，冰上放置。-80℃冻存备用。

2、临床应用

获得4位临床疑似患者的血浆样本，应用所述的试剂盒，如前所述进行circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285表达的检测。

1位疑似患者结果如下：男性，56岁，BMI 20.8，吸烟者，无肿瘤及肺癌家族史，circ_0047921 Ct值为27.07557967，circ_0007761为33.504257，circ_0056285为36.6609715。利用以上指标分析发现其患有NSCLC的概率超过80%。进一步临床CT以及病理学确证该患者为NSCLC III期。

另1位疑似患者结果如下：男性，55岁，BMI 21.2，不吸烟者，无肿瘤及肺癌家族史，circ_0047921 Ct值为32.92468833，circ_0007761为35.48282933，circ_0056285为33.612311。利用以上指标分析发现其不患有NSCLC的概率超过85%。进一步临床确证其不患病。

再1位疑似患者结果如下：女性，35岁，BMI 18.2，不吸烟者，无肿瘤及肺癌家族史，circ_0047921 Ct值为35.091314，circ_0007761为36.32602333，circ_0056285为34.90931233。利用以上指标分析发现其患有NSCLC的概率不超过25%。进一步临床确证其罹患肺结核。

最后1位疑似患者结果如下：男性，44岁，BMI 20.2，过去吸烟者，有肿瘤家族史，circ_0047921 Ct值为35.269516，circ_0007761为34.846086，circ_0056285为34.661597。利用以上指标分析发现其患有NSCLC的概率接近90%。进一步临床CT以及病理学确证该患者为NSCLC II期。

序列表

<110> 广州医科大学

<120> 一种非小细胞肺癌的血浆外泌体circRNA标志物及其检测引物、试剂盒

<130> YG18100380AA042

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atagttttga ggcagctgtg ccatcaaata gccacattgt ttcggaacct ggaaagaatg 60

tcacactcac ttgtcagcct cagatgacgt ggcctgtgca ggcagtgagg tgggaaaaga 120

tccagccccg tcagatcgac ctcttaactt actgcaactt ggtccatggc agaaatttca 180

cctccaagtt cccaagacaa atagtgagca actgcagcca cggaaggtgg agcgtcatcg 240

tcatccccga tgtcacagtc tcagactcgg ggctttaccg ctgctacttg caggccagcg 300

caggagaaaa cgaaaccttc gtgatgagat tgactgtagc cgagg 345

<210> 2

<211> 405

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

gagcggaaag aatgtcggag cgggccgcgg atgacgtcag gggggagccg cgccgcgcgg 60

cggcggcggc gggcggagca gcggccgcgg ccgcccggca gcagcagcag cagcagcagc 120

agcagcagcc gccgcctccg cagccccagc ggcagcagca cccgccaccg ccgccacggc 180

gcacacggcc ggaggacggc gggcccggcg ccgcctccac ctcggccgcc gcaatggcga 240

cggtcgggga gcgcaggcct ctgcccagtc ctgaagtgat gctgggacag tcgtggaatc 300

tgtgggttga ggcttccaaa cttcctggga aggacgggac agaattggac gaaagtttca 360

aggagtttgg gaaaaaccgc gaagtcatgg ggctctgtcg ggaag 405

<210> 3

<211> 548

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

ctcttcagtg ggtcatctgt gtgtcacagc ctcagaagac cagcgagatg gctgccaaca 60

agagtaaggg ccagagctcc ttggccctcc acaaggtgat catggttggc agcggaggcg 120

ttggcaagtc agccctgacg cttcagttca tgtatgacga gtttgtagaa gactatgaac 180

ctaccaaagc tgacagttat agaaagaaag tggttcttga tggggaagaa gttcagatag 240

atattctgga caccgctggg caagaggact acgcagccat tcgagataac tactttcgga 300

gtggggaagg gtttcttctt gtgttctcaa tcacagaaca tgaatccttt acagcaactg 360

ccgaattcag ggaacagatt ctccgtgtga aggctgaaga agataaaatt ccactgctcg 420

tcgtgggaaa caagtctgac ctagaggagc ggaggcaggt gcctgtggag gaggccagga 480

gtaaagccga agagtggggc gtgcagtacg tggagacgtc agcgaagacc cgggccaacg 540

tggacaag 548

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

cagcgcagga gaaaacgaaa c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

aggctgacaa gtgagtgtga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

gggacagtcg tggaatctgt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

acattctttc cgctccttcc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

aagtctgacc tagaggagcg g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

tgtgacacac agatgaccca c 21

Claims

1.用于检测血浆外泌体circRNA标志物表达的试剂或引物在制备非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述标志物为circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285，所述circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285的cDNA序列依次如SEQ ID NO：1～3所示。

2.一种用于检测权利要求1中所述血浆外泌体circRNA标志物的引物组在制备非小细胞肺癌诊断试剂和/或试剂盒中的应用，其特征在于，包括三对分别检测circ_0047921、circ_0007761和circ_0056285的上下游引物，引物核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO：4～9所示。