KR20230017885A - 유전자 마커 조합 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

유전적 종양 마커의 조합, 메틸화 검출 시약, 키트, 및 이의 용도가 개시된다. 폐암 표본은 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 조합의 메틸화 수준을 측정하여 구별될 수 있다. 실험에 의해 입증된 본 발명의 시약은 폐암을 검출 및 진단할 수 있고, 임상적 적용 가치가 있다.

Description

유전자 마커 조합 및 이의 용도
본 발명은 생물 의학 분야에 관한 것으로, 특히 유전자 마커의 조합 및 이의 용도에 관한 것이다.
폐암은 튜니카 점막 기관지, 샘 또는 폐포 상피에서 유래한 악성 폐 종양이다. 폐암은 병리학적 패턴에 따라 다음과 같이 나눌 수 있다: 1) 소세포 폐암(SCLC): SCLC는 특수한 병리학적 유형의 폐암으로 원격 전이 성향이 뚜렷하고 예후가 좋지 않지만 대부분의 환자가 화학방사선요법에 민감성이다; 2) 비소세포 폐암(NSCLC): NSCLC는 SCLC를 제외한 다른 병리학적 유형의 폐암이며 편평세포 암종, 선종성 암종 및 대세포 암종을 포함한다. 폐암은 생물학적 거동 및 임상 경과 측면에서 일정한 차이가 있다. 발생 위치에 따라 폐암은 다음과 같이 나눌 수 있다: 1) 중추성 폐암: 분절 기관지 개구부 이상에서 성장하는 폐암; 및 2) 말초 폐암: 분절 기관지 개구부를 넘어 성장하는 폐암.
최근 몇 년 동안, 인구 고령화, 대기 오염 및 흡연과 같은 요인의 영향으로 인해 중국에서 폐암의 이환율과 사망률이 해마다 점진적으로 증가하고 있다. 문헌 [China Cancer Registry Annual Report (2017)]에 따르면 중국 전역에서 분당 약 7명이 암으로 진단되며 폐암의 이환율과 사망률이 1위를 차지한다. 중국은 세계에서 폐암 환자가 가장 많은 나라가 되었다. 전문가들은 2025년이면 폐암 환자가 100만 명에 달할 것으로 내다보고 있다. 또한, 역학조사에 따르면 흡연은 폐암을 일으키는 중요한 요인이다. 전세계적으로 폐암의 약 80-90%는 흡연에 기인할 수 있다. 비흡연자와 비교하여, 하루에 1-19개비 및 20개비 이상을 흡연하는 45-64세의 사람들은 각각 폐암에 걸릴 상대적 위험(4.27 및 8.61)이 있고; 한 번도 흡연해보지 않은 사람 비해, 하루에 1-19개비 및 20개비 이상을 장기간 흡연한 사람은 폐암으로 사망할 상대적 위험(6.14 및 10.73)이 있다. 폐암의 치료 기술은 빠르게 변화하고 있지만, 5년 생존율은 4%에서 약 12%로 증가하는 데 그친다. 기존 항종양제는 여전히 질환을 완화시키는 효과만 달성할 수 있고, 환자의 무진행 생존 기간은 평균 3-5개월만 연장된다. 그러나, 수술 후 1상 폐암 환자는 5년 생존율이 최대 약 60-70%이다. 따라서, 폐암의 조기 진단 및 조기 수술은 폐암의 5년 생존률을 증가시키고 사망률을 감소시키는 가장 효과적인 방법 중 하나이다.
현재, 폐암에 대한 몇 가지 중요한 임상 보조 진단 방법이 있지만 폐암의 조기 발견 및 조기 진단을 완전히 실현할 수는 없다.
(1) 생화학적 혈액 검사: 현재 원발성 폐암에 대한 구체적인 생화학적 혈액 검사는 없다. 폐암 환자의 혈중 알칼리성 인산가수분해효소 또는 혈중 칼슘의 상승은 골 전이 가능성을 고려해야 하며, 혈중 알칼리성 인산가수분해효소, 글루탐산 옥살아세트산 트랜스아미나제, 젖산 탈수소효소 또는 빌리루빈의 상승은 간 전이의 가능성을 고려해야 한다.
(2) 종양 마커 검사: 1) CEA: 폐암 환자의 30-70%의 혈청에 비정상적으로 높은 수준의 CEA가 존재하지만 주로 진행성 폐암 환자에서 존재한다. 현재, 혈청 내 CEA 검사는 주로 폐암의 예후를 추정하고 치료 과정을 모니터링하는 데 사용된다. 2) NSE: NSE는 소세포 폐암에 선호되는 마커로서 소세포 폐암 진단 및 치료 반응 모니터링에 사용되며 검사 방법 및 사용 시약의 차이에 따라 기준치가 상이하다. 3) CYFRA21-1: CYFRA21-1은 비소세포 폐암에 선호되는 마커로서 편평세포 폐암 진단에 60%의 민감도를 달성할 수 있으며, 검사 방법과 사용 시약의 차이에 따라 기준치가 상이하다.
(3) 영상학적 검사: 1) 흉부 X-선 검사: 흉부 X-선 검사는 흉부 PA 및 측면 투영법을 포함해야 한다. 1차 병원에서는 흉부 PA 및 측면 투영법이 폐암의 예비 진단에서 여전히 가장 기본적이고 선호되는 영상 진단 방법이다. 폐암이 진단되거나 의심되면 흉부 CT 검사를 실시한다. 2) CT 검사: 흉부 CT는 폐암의 가장 일반적이고 중요한 검사법으로 폐암의 진단 및 감별 진단 및 치료 후 병기결정 및 추적 검사에 사용된다. CT 유도 경흉부 바늘 생검은 폐암의 중요한 진단 기술이다. 여건이 좋은 병원에서는 난해한 정성적 폐 병변 진단에 CT 유도 경흉부 바늘 생검을 이용할 수 있으며, 폐암의 임상 진단은 다른 방법으로 재료 채취가 어려운 경우 세포학적 및 조직학적 확인을 필요로 한다. 최근에는 다절편 나선형 CT 및 저선량 CT(LDCT)가 조기 폐암을 발견하고 사망률을 낮추는 데 효과적인 스크리닝 도구이다. 미국 국립 폐암 스크리닝 검사(NLST)는 흉부 X선 스크리닝 검사와 비교하여 LDCT가 폐암 사망률을 20%까지 낮출 수 있음을 보여주었다. 저선량 나선형 CT는 초기 폐암을 스크리닝하는 중요한 수단으로 권장된다. 그러나, 사람의 영향 요인이 더 많기 때문에 위양성률이 매우 높다. 3) 초음파 검사: 초음파 검사는 주로 복부 생체 기관과 복부 및 후복막 림프절에 전이가 있는지 여부를 발견하는 데 사용되며 경부 림프절 검사에도 사용될 수 있다. 흉벽 또는 흉벽 병변에 인접한 폐 병변의 고형-낭포 특성을 확인할 수 있으며, 초음파 유도 경피적 생검을 실시한다. 초음파 검사는 흉수 추출 및 위치파악에 더 자주 사용된다. 4) 뼈 스캐닝: 뼈 스캐닝은 폐암의 뼈 전이 검출에 대해 더 높은 민감도를 갖지만 특정 위양성률을 갖는다. 뼈 스캐닝은 다음 조건에 사용될 수 있다: 폐암의 수술 전 검사; 국소 증상이 있는 환자.
(4) 기타 검사 : 1) 객담 세포 검사: 객담 세포 검사는 현재 폐암에 대한 간단하고 편리한 비침습적 진단 방법으로서, 지속적인 도말 검사를 통해 약 60%까지 양성률을 높일 수 있으며, 폐암이 의심되는 경우 일상적인 진단 방법이다. 2) 광섬유 기관지경 검사: 광섬유 기관지경 검사는 폐암 진단에서 가장 중요한 수단 중 하나로서, 폐암의 정성적 위치 진단 및 수술 계획 선택에서 중요한 역할을 하며, 수술적 치료를 받을 환자에게 꼭 필요한 일상적인 검사 항목이다. 그러나, 경기관지 바늘 흡인(transbronchial needle aspiration, TBNA)은 치료 전 병기결정에 유리하지만, 기술적인 어려움과 위험이 더 높기 때문에, 필요한 사람들은 추가 검사를 위해 상급 병원으로 이송될 수 있다. 3) 기타: 기타 검사로는 경피적 폐 생검, 비디오 지원 흉곽 수술, 종격동 생검, 흉수 세포 검사 등이 있으며 적응증이 있는 경우 기존의 상태에 따라 진단 보조용으로 각각 사용할 수 있다.
영상학적 검사에서 다절편 나선형 CT 및 저선량 CT(LDCT)는 조기 폐암을 발견하고 사망률을 낮추는 데 효과적인 스크리닝 도구이다. 미국 국립 폐암 스크리닝 검사(NLST)는 흉부 X선 스크리닝과 비교하여 LDCT가 폐암 사망률을 20%까지 낮출 수 있음을 보여주었다. 모든 폐암 스크리닝 항목의 성패는 고위험군의 식별에 달려 있음이 임상 실무에서 입증되고 있다. 여러 고위험 인자를 융합한 위험 예측 모델은 폐암의 고위험군을 식별하는 방법 중 하나로 세계적으로 인정받고 있다. 개입 조치 또는 치료 수단의 개선에서 임상의를 지원함으로써 위험 모델은 폐암 환자의 치료 효과를 더욱 향상시킨다. 고위험군에 특정된 스크리닝이 현재 높은 폐암 사망률을 낮출 수 있다는 점은 세계적으로 인정되고 있지만, 고위험군에 대한 정의는 여전히 해결하기 어려운 문제이다. 폐암 스크리닝의 이익-손해 비율을 최대화하기 위해, 첫 번째 핵심 문제는 질환 위험이 높은 군을 정의하는 방법이고; 두 번째 핵심 문제는 고위험 요인의 정의, 총 위험의 정량적 요약 및 스크리닝 이익 마진의 선택을 포함하여 군을 스크리닝하는 방법을 결정하는 것이다.
기술의 비약적인 발전으로 종양 마커 검출은 영상 진단 및 병리 진단에 이어 종양 진단 및 치료의 새로운 분야로 부상하고 있으며 종양의 진단, 검출, 및 치료에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 종양 마커는 체액 또는 조직에서 검출될 수 있고 종양의 존재, 분화 정도, 예후 추정, 개인맞춤형 약물, 치료 효과 등을 반영할 수 있다. 초기 폐암 환자는 뚜렷한 증상이 없고; 초기 폐암은 의사와 환자가 인식하기 어려우며; 혈액 또는 생화학적 항목에 뚜렷한 특이적 마커가 없기 때문에 일상적인 진단 방법으로는 조기 발견 및 조기 진단이 어렵다. 따라서, 폐암의 조기 진단, 특히 대규모 적용 개체에 대한 스크리닝은 비교적 어렵다.
점점 더 많은 연구는 종양 형성 과정에 두 가지 주요 메커니즘 범주가 포함되어있음을 보여준다. 하나의 메커니즘은 DNA 염기 서열 변화를 통해 돌연변이를 형성하는 것으로 유전적 메커니즘이라고 한다. 종양은 유전병으로 작용하는 것으로 분자 생물학 분야에서 입증되었다. 다른 메커니즘은 후생적 메커니즘으로 DNA 서열 변화와 무관하게 유전자 발현 수준을 변화시킬 수 있으며, 후생적 메커니즘의 효과는 종양 형성 과정에서 점점 더 주목을 받고 있다. 유전적 메커니즘 및 후생적 메커니즘은 교차 존재하며 함께 종양 형성을 촉진한다. 유전자의 비정상적인 메틸화는 종양 발생의 초기 단계에서 발생할 수 있고; 종양의 점진적인 발달 과정에서 유전자의 비정상적인 메틸화 정도는 증가된다. 98개의 일반적인 인간 원발성 종양의 게놈 분석을 통해, 각 종양이 적어도 600개의 비정상적으로 메틸화된 CpG 섬을 포함하고 있음을 발견했다.
많은 연구에서 프로모터의 비정상적인 메틸화가 많은 종양의 발생 과정에서 빈번한 초기 사건임이 밝혀졌다. 따라서, 종양 관련 유전자의 메틸화 상태는 종양형성의 초기 민감도 지표이며 유망한 종양 분자 바이오마커로서 확인된다. 더 중요한 것은 암화 세포가 DNA를 말초 혈액으로 방출할 수 있다는 것이다. 정상인의 말초 혈액에는 나노그램 수준의 유리 DNA가 존재한다. 이 연구는 종양 조직에 존재하는 종양 관련 유전자의 비정상적 프로모터 메틸화가 말초 혈장/혈청, 종양 침범, 및 장기 관련 체액(예컨대 타액 및 객담)에서도 검출될 수 있음을 발견했다. 이러한 생물학적 샘플은 쉽게 구할 수 있고 PCR 기술을 통해 샘플 내 다량의 DNA를 증폭하여 민감하게 검출될 수 있다. 따라서, 일부 종양 관련 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 상태를 검출하는 것은 종양의 조기 진단에 매우 유용한 정보를 제공할 수 있다. 다른 유형의 종양 분자 마커와 비교할 때, 바이오마커는 프로모터의 비정상적인 메틸화를 검출하는 데 더 많은 이점이 있다. 특정 유전자는 상이한 유형의 종양에서 프로모터의 비정상적 메틸화의 영역이 동일하므로, 검출이 상대적으로 편리하다. 또한, 대립형질 결실 마커와 비교하여, 비정상적인 메틸화는 양성 신호이며 정상 조직에서 음성 배경과 쉽게 구별된다. Estelleret 등은 22명의 NSCLC 사례의 종양 조직 및 혈청에서 p16, DAPK, GSTP1, 및 MGM T와 같은 유전자의 프로모터 영역의 비정상적인 메틸화 상태를 검출하고, 적어도 하나의 유전자의 프로모터 메틸화가 종양 조직 중 68%(15/22)에 존재함을 발견했다. 그러나, 15개의 양성 조직 사례 중에서, 11개 사례의 혈청에서도 프로모터의 비정상적인 메틸화의 존재가 검출되었다. 또한, 많은 연구자들은 각각 간암, 두경부 암종, 식도암, 및 결장암 환자의 종양 조직 및 혈청에서 일부 종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화를 검출했다.
기존 폐암 검출 기술은 주로 민감도가 낮고, 위양성률이 높으며, 침습적이고; 조기 폐암은 현재의 일상적인 검출 기술로는 검출하기 어렵다.
또한, 폐암의 객담 검출과 같은 비침습적 검출은 난이도가 더 높다. 연구자들에 의해 폐암 환자의 객담에서 종양 마커가 연구되고 있지만, 다른 종양 환자의 혈액 샘플에서 종양 마커를 검출하고 평가한 것과 비교할 때 객담 샘플의 성공률은 매우 낮다. 주요 이유는 다음과 같다: (1) 객담의 조성물은 복잡하고, 질병이나 환경에 따라 객담의 성분과 점성은 그룹 간 차이가 더 크고; (2) 객담은 많은 기관지 상피 세포 및 박테리아, 구강 점막 세포 및 기타 비-폐암 세포의 성분을 함유하고; 폐암에서 유래한 충분한 DNA는 일반적인 샘플 처리 방법으로는 효과적으로 농축할 수 없고; (3) 많은 흡연 환자는 가래가 없다. 이전 10편의 논문에 관한 문헌 [Molecular Sputum Analysis for the Diagnosis of Lung Cancer]의 A. J. Hubers 등의 연구는 폐암 조직의 마커 메틸화도의 중앙값이 48%인 반면, 객담의 메틸화도의 중앙값은 38%임을 보여준다. 결과는 조직에서 메틸화 마커의 검출률이 객담보다 상당히 더 높다는 것을 보여준다. 한편, Rosalia Cirincione (Methylation profile in tumor and sputum samples of lung cancer patients detected by spiral computed tomography: A nested case-contro)에서는 폐암 조직에서 RARbeta2, P16, 및 RASSF1A의 검출률이 각각 최대 65.5%, 41.4%, 및 51.7%이며, 오직 객담에서의 검출율은 각각 최대 44.4%, 5% 및 5%임이 보고되었다.
본 발명의 목적 중 하나는 유전자 마커의 조합, 뿐만 아니라 유전자 마커의 조합을 검출하기 위한 검출/진단 시약 및 유전자 마커의 조합의 용도를 제공하는 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 유전자 마커의 조합을 제공한다. 유전자 마커의 조합은 HOXB4 및 SRCIN1을 포함한다.
본 발명에서 유전자 마커의 조합은 각 유전자 마커 내 임의의 길이의 단편을 추가로 포함한다. 즉, HOXB4로부터의 임의의 단편과 SRCIN1로부터의 임의의 단편(단편은 임의의 길이일 수 있음)의 조합은 본 발명의 보호 범위 내에 속한다.
HOXB4 유전자는 Antp 호메오박스 유전자 패밀리의 구성원이고 17번 염색체의 호메오박스 클러스터 B 유전자에 속한다. 호메오박스 DNA 결합 도메인이 있는 핵단백질이 암호화되어 있으며, 암호화된 단백질은 발생에 참여하는 특정 서열 전사 인자 역할을 한다. 단백질의 세포내 또는 이소성(ectopic) 발현은 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 생체 내 및 시험관 내에서 증폭시켜 단백질이 치료용 줄기 세포 증폭을 위한 잠재적인 후보가 되도록 할 수 있다.
SRCIN1의 정식 명칭은 SRC 키나제 신호 억제제 1이다. SRC의 음성 조절 인자 역할을 하는 SRCIN1의 유전자 및 단백질은 CSK를 활성화시켜 SRC 활성 및 다운스트림 신호 전달을 억제함으로써, 세포 확산 및 이동 장애를 일으킨다. SRCIN1은 수상 돌기 가지의 형태를 조절하고 칼슘 의존성 엑소시토시스에 참여한다.
본 발명은 폐암 검출 시약 또는 키트의 제조에서 다중 유전자 조합 메틸화 검출 시약의 용도를 추가로 제공한다. 유전자는 HOXB4 및 SRCIN1을 포함한다.
현재, 폐암의 누락 검출률은 더 높다. 특히, 선종성 암종 유형의 경우 비침습적 객담 검출이 극히 어렵고 검출률도 극히 낮다. 그 이유는 선종성 암종 대부분이 보다 작은 기관지에서 기원하여 말초 폐암이며, 폐 깊숙이 떨어져 나온 세포는 객담을 통해 기침으로 배출되기 어렵기 때문이다. 따라서, 선종성 암종에 대한 객담 검출 수단은 현재 거의 전무하다.
누락 검출률을 낮추는 것은 초기 종양 스크리닝에서 특히 중요하다. 조기 종양 스크리닝 제품이 전체 또는 대다수의 환자를 스크리닝하지 못하면, 검출되지 않은 환자는 충분한 위험 경고를 받지 못하고 치료 기회가 지연될 것이며, 이는 환자에게 막대한 손실이다.
종양 마커의 검출 시약 또는 검출 수단에 의해 제한된, 일부 폐암 관련 종양 마커가 종래 기술에서 발견되었지만, 이들 종양 마커의 민감도 및 특이도에 대한 요건은 충족될 수 없다. 따라서, 현시점에서 폐암에 실질적으로 적용될 수 있는 스크리닝 수단에 대해서 본 기술분야에서 더 연구할 필요가 여전히 존재한다. 그러나, 비침습적 스크리닝은 샘플링에서 고유한 장점이 있지만, 비침습적 스크리닝은 다른 측면에서도 일부 제한이 있다. 예를 들어, 폐암의 선종성 암종 유형의 경우, 폐 깊숙이 떨어져 나온 세포는 객담을 통해 기침으로 배출되기 어렵기 때문에, 일반적으로 본 기술분야의 기술자는 이러한 유형의 폐암이 비침습적 스크리닝에 적합하지 않다고 여길 것이다. 또한, 임의의 다른 유형의 폐암이라도 지금까지 보고된 비침습적 스크리닝 방법으로는 임상 적용 요건을 충족하기 어렵다. 관련 연구가 수년 동안 진행되어 왔지만 아직까지 임상적으로 적용할 수 있는 폐암의 비침습적 스크리닝 방법은 전무하다.
본 발명은 HOXB4 및 SRCIN1 유전자에 대한 메틸화 검출 시약을 포함하는 다중 유전자 조합 메틸화 검출 시약 또는 키트를 추가로 제공한다.
"메틸화 검출 시약"은 다음 내용물을 포함한다: 유전자 또는 유전자 내용물의 임의의 더 작은/짧은 서열에 특정된 검출 시약. 즉, 검출은 유전자의 임의의 유전자좌(예로, 더 작은 단편)에서 특정해 수행되고, 검출 시약은 본 발명의 보호 범위 내에 있어야 한다.
본 발명의 유전자 마커 HOXB4 및 SRCIN1은 조합된 방식으로 검출된다. 즉, 본 발명의 여러 유전자 마커는 동시에 검출된다.
본 발명에서 "검출"은 진단을 의미하고, 폐암의 조기진단 외에 폐암의 중기 및 말기 진단을 포함하며, 폐암 스크리닝, 위험성 평가, 예후, 질환 식별, 질환 병기 진단, 및 치료 표적의 선정을 추가로 포함한다.
폐암 마커 조합 HOXB4 및 SRCIN1의 적용으로 폐암의 조기 진단이 가능해진다. 임상적 또는 형태학적 정상 외형 세포에서 암 세포의 메틸화 유전자가 메틸화된다고 결정된 경우, 정상 외형 세포가 암으로 발전하는 것으로 나타났다. 따라서, 폐암은 정상 외형 세포에서 폐암 특이적 HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합의 메틸화를 통해 조기에 진단될 수 있다.
조기 진단은 전이 전, 바람직하게는 조직 또는 세포의 형태학적 변화가 관찰되기 전에 암 가능성을 발견하는 것을 포함한다.
본 발명의 시약/키트는 폐암의 조기 진단 외에도 폐암 스크리닝, 위험성 평가, 예후, 질환 식별, 질환 병기 진단, 및 치료 표적의 선정에 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
질환 병기의 선택적 구현예로서, 상이한 병기 또는 단계에서 폐암의 진행에 의해 샘플로부터 수득된 HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합의 메틸화를 측정함으로써 폐암을 진단할 수 있다. 폐암 각 병기의 샘플에서 단리된 핵산의 HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합의 메틸화 정도를 변칙적으로 세포 증식이 없는 조직의 샘플에서 단리된 하나 이상의 핵산의 HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합의 메틸화 정도와 비교함으로써, 샘플에서 폐암의 특정 병기를 검출할 수 있다.
일반적으로, CpG 섬은 CpG 디뉴클레오티드가 풍부한 일부 영역을 말하며 일반적으로 프로모터 및 인접 영역에 위치한다. 본 발명에서 CpG 섬은 CpG 디뉴클레오티드가 풍부한 프로모터 및 인접 영역을 의미할 뿐만 아니라, 이형접합 메틸화를 갖는 CpG 유전자좌, 또는 단리된 CpG 유전자좌를 포함한다.
HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합에서의 조합된 메틸화 검출 시약은 종래 기술의 메틸화 검출 시약일 수 있다. 종래 기술에서, 표적 유전자의 메틸화는 메틸화 특이적 PCR(MSP), 정량적 메틸화 특이적 PCR(qMSP), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질 PCR, 정량적 PCR 및 DNA 칩, 메틸화 민감도 제한 엔도뉴클레아제, 비설파이트 시퀀싱 또는 파이로시퀀싱과 같은 기존의 여러 방법으로 검출될 수 있다. 또한, 미국 가출원 62/007,687을 통해 다른 메틸화 검출 방법을 도입할 수 있다. 각 검출 방법에는 상응하는 시약이 포함된다. 이들 시약은 본 발명에서 HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합의 메틸화를 검출하기 위해 모두 사용될 수 있다.
본 발명은 HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합에 대한 조합된 메틸화 검출 시약을 추가로 제공한다. 조합된 메틸화 검출 시약은 HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합에서 각 유전자에 특정된 프라이머 및/또는 프로브를 포함한다.
본 발명의 일부 특정 구현예에서, 검출 시약은 HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합에서 각 유전자의 CpG 섬으로부터 수득된 프라이머 및/또는 프로브를 포함한다.
본 발명의 일부 특정 구현예에서, 프라이머 및/또는 프로브는 정량적 메틸화 특이적 PCR(qMSP)을 통해 HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합에서 각 유전자의 메틸화를 검출한다.
본 발명의 일부 특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 메틸화 검출 시약은 HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합에서 각 유전자의 게노솜(genosome), 유전자간 영역, 또는 프로모터 영역 및 프로모터 영역 근처 영역의 메틸화 수준을 검출한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 메틸화 검출 시약은 HOXB4 및 SRCIN1 유전자 조합에서 각 유전자의 프로모터 영역 또는 프로모터 영역 근처 영역의 CpG 섬으로부터 수득된 프라이머 및/또는 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 메틸화 검출 시약에서, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 중 정방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
I. 서열번호 1, 서열번호 16 및 서열번호 19로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
II. I에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 역방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
III. 서열번호 2, 서열번호 17 및 서열번호 20으로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열;
IV. III에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 정방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
V. 서열번호 4 및 서열번호 22로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
VI. V로 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 역방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함한다:
VII. 서열번호 5로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
VIII. VII에 나타낸 서열의 상보적 서열.
일부 구현예에서, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타낸다.
일부 구현예에서, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 쌍은 서열번호 16 및 서열번호 17로 나타낸다.
HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 쌍은 서열번호 19 및 서열번호 20으로 나타낸다.
일부 구현예에서, SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5로 나타낸다.
일부 구현예에서, SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 쌍은 서열번호 22 및 서열번호 5로 나타낸다.
일부 구현예에서, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프로브는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 가지고;
IX. 서열번호 3, 서열번호 18 및 서열번호 21로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
X. IX에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프로브는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 갖는다:
XI. 서열번호 6으로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
XII. XI에 나타낸 서열의 상보적 서열.
일부 구현예에서, 폐암은 소세포 폐암 및 비소세포 폐암으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 비소세포 폐암은 편평세포 암종 또는 선종성 암종으로부터 선택된다.
본 발명은 폐암 검출용 키트를 추가로 제공한다. 키트는 조합된 메틸화 검출 시약을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 키트는 키트에 공통 시약을 추가로 포함한다. 예를 들어, qMSP의 일반적인 변환제(transforming agent)는 메틸화되지 않은 시토신 염기를 우라실로 변환시키는 데 사용되는 반면, 메틸화된 시토신 염기는 그대로 유지된다. 변환제는 특별히 제한되지 않는다. 선행 기술에 보고된 시토신을 우라실로 변환할 수 있는 모든 시약이 이용가능하며, 히드라조늄 염, 비설파이트, 및 히드로설파이트(나트륨 메타비설파이트, 칼륨 비설파이트, 세슘 비설파이트, 및 암모늄 비설파이트) 중 하나 또는 여러 개를 포함한다. 또 다른 예는 유전자 증폭에 흔히 사용되는 DNA 중합효소, dNTP, Mg2+ 이온, 버퍼 등이다.
일부 구현예에서, 시약 또는 키트는 참조 유전자의 검출 시약을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 참조 유전자는 β-액틴이다.
일부 구현예에서, 참조 유전자의 검출 시약은 참조 유전자에 특정된 프라이머 및 프로브를 의미한다.
일부 구현예에서, 참조 유전자의 검출 시약은 서열번호 13 및 서열번호 14로 나타낸 프라이머 쌍이고, 프로브는 서열번호 15로 나타낸다.
본 발명은 폐암 검출 시약 또는 키트의 제조에서 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 조합된 메틸화 검출 시약의 용도를 제공한다.
본 발명은 프라이머를 제공한다. 프라이머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 20 또는 서열번호 22와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 적어도 임의의 상기 서열의 상보적 서열로부터 선택된다.
본 발명은 프라이머를 제공한다. 프라이머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 적어도 임의의 상기 서열의 상보적 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2, 또는 서열번호 4 및 서열번호 5로 나타낸 적어도 하나의 프라이머 쌍으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2, 또는 서열번호 4 및 서열번호 5로 나타낸 프라이머 쌍으로부터 선택된다.
프라이머는 핵산 단편을 증폭하는 데 사용된다. 프라이머의 성공적인 설계가 PCR에서 가장 중요하다는 것은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 일반 PCR에 비해, 프라이머의 설계 영향은 메틸화 검출에서 더욱 중대하다. 그 이유는 DNA 가닥의 "C"가 메틸 황화 반응에 의해 "U"로의 변환이 촉진되어 GC 함량이 감소하기 때문이다. 따라서, PCR 후 긴 연속 "T"가 서열에 나타나고; DNA 가닥 파손이 일어나기 쉬우며, 적절한 Tm 값을 갖는 안정한 프라이머를 선택하기 어렵다. 또한, 황화 DNA와 황화되지 않거나 완전히 처리되지 않은 DNA를 구별하기 위해서는 프라이머에 충분한 "C"가 있어야 한다. 따라서, 안정한 프라이머 선택의 어려움이 증가한다. 따라서, DNA 메틸화 검출에서, 증폭 단편의 길이 및 위치와 같은 프라이머의 특정 증폭 단편의 선택, 및 프라이머의 선택은 검출 민감도 및 특이도에 영향을 미친다. 실험을 통해, 본 발명자는 상이한 표적 증폭 단편 및 프라이머가 상이한 검출 효과를 갖는다는 것을 발견하였다. 일부 유전자 또는 핵산 단편이 종양과 비종양에서 발현 차이가 있음이 여러 번 발견되었다. 그러나, 유전자 또는 핵산 단편을 임상 적용을 위한 종양 마커로 변환하는 데에는 여전히 매우 먼 거리가 있다. 가장 중요한 이유는 다음과 같다: 검출 시약의 한계로 인해 잠재적인 종양 마커의 검출 민감도 및 특이도가 검출 요구 사항을 충족하기 어렵거나, 검출 방법은 작동이 복잡하고 비용이 많이 들고 대규모로 임상적으로 적용되기 어렵다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산 프로브를 추가로 제공한다. 핵산 프로브는 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 18 및 서열번호 21로 나타낸 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 적어도 임의의 상기 서열의 상보적 서열로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 핵산 프로브는 서열번호 3 및 서열번호 6으로 나타낸 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 키트는 증폭에 사용되는 프라이머 쌍을 포함하는 제1 용기, 및 프로브를 포함하는 제2 용기를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 설명서를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 핵산 추출 시약을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 샘플링 장치를 추가로 포함한다.
본 발명은 메틸화 검출 시약 또는 키트의 제조에서, 또는 폐암 검출 시약 또는 키트의 제조에서, 상기 메틸화 검출 시약, 키트, 프라이머, 및 프로브의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 메틸화 검출에서 상기 메틸화 검출 시약, 키트, 프라이머, 및 프로브의 용도 또는 폐암 검출에서의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 폐암 검출 시스템을 추가로 제공한다. 시스템은 다음 구성요소를 포함한다:
(1) HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 조합된 메틸화 검출 구성요소;
(2) 데이터 처리 구성요소; 및
(3) 결과 출력 구성요소.
일부 구현예에서, 메틸화 검출 구성요소는 메틸화 검출 기구를 포함한다.
일부 구현예에서, 메틸화 검출 구성요소는 메틸화 검출 기구, 키트, 프라이머, 및 프로브를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 메틸화 검출 기구는 형광 정량 PCR 기구, PCR 기구, 및 시퀀서 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 데이터 처리 구성요소는 데이터 처리 기계를 포함한다.
데이터 처리 기계는 본 기술분야의 기술자에 의해 사용될 수 있고 데이터 처리를 수행할 수 있는 임의의 장치 또는 기구 또는 기기를 포함한다.
일부 구현예에서, 데이터 처리 기계는 계산기 및 컴퓨터 중 하나 이상을 포함한다.
컴퓨터에는 본 기술분야의 기술자에 의해 사용될 수 있고 데이터 처리 또는 통계 분석을 수행할 수 있는 임의의 소프트웨어 또는 프로그램이 내장되어 있다.
일부 구현예에서, 컴퓨터는 SPSS, SAS, 및 Excel의 소프트웨어의 하나 이상의 종이 내장된 컴퓨터를 포함한다.
일부 구현예에서, 결과 출력 구성요소는 결과 출력 유닛을 포함한다.
출력 유닛은 데이터 처리 결과를 판독가능한 콘텐츠로 표시할 수 있는 임의의 장치 또는 기구 또는 기기를 포함한다.
일부 구현예에서, 메틸화 검출 구성요소는 다중 유전자 조합 메틸화 검출 시약을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 결과 출력 유닛은 하나 이상의 스크린 및 종이 보고서를 포함한다.
일부 구현예에서, 데이터 프로세서는 다음으로 구성된다: a. 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 테스트 데이터를 수신하고; b. 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 테스트 데이터를 저장하고; c. 검출될 샘플의 테스트 데이터를 정상 대조군 샘플의 동일한 유형과 비교하고; d. 비교 결과에 따라 대상체가 폐암을 앓을 확률 또는 가능성을 응답한다.
일부 구현예에서, 결과 출력 구성요소는 대상체가 폐암을 앓을 확률 또는 가능성을 출력하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 데이터 처리 구성요소의 기준은 다음과 같다: 폐암 표본 및 정상 표본은 경계 값에 따라 결정된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 HOXB4 및 SRCIN1의 조합된 검출은 다중 PCR 모드에서 실현될 수 있다.
일부 구현예에서, 표본의 메틸화 수준은 표적 유전자, 즉 HOXB4 및 SRCIN1의 Cp 값 및/또는 ΔCp 값에 따라 결정된다(ΔCp 값 = Cp표적 유전자 - Cp참조 유전자).
일부 구현예에서, 조직 표본에서 1개 유전자의 ΔCp 값이 ΔCp 값의 경계 값보다 작은 한 조직 표본을 폐암 표본으로 결정하고; 조직 표본에서 2개 유전자의 ΔCp 값이 동시에 ΔCp 값의 경계 값 이상인 경우에만 조직 표본을 정상 표본으로 결정한다.
일부 구현예에서, 표본에서 Cp 값의 경계 값은 35 내지 39 범위이고; ΔCp 값의 경계 값은 4 내지 12 범위이다.
일부 구현예에서, 조직 표본에서, HOXB4 및 SRCIN1의 조합된 검출 동안, HOXB4의 ΔCp 값의 경계 값은 5.4이고, SRCIN1의 ΔCp 값의 경계 값은 6.5이다.
일부 구현예에서, 객담 표본에서, HOXB4 및 SRCIN1의 조합된 검출 동안, HOXB4 및 SRCIN1의 임계 Cp 값은 각각 36.9 및 37.0이다. 개별 유전자 검출 결과 중 하나가 상기 임계값 미만인 경우 표본을 양성(즉, 폐암 표본)으로 식별할 수 있고; 검출 결과 중 2개 항목이 해당 임계값 이상인 경우 표본을 음성(즉, 정상 표본)으로 식별할 수 있다.
일부 구현예에서, HOXB4 및 SRCIN1의 다중 PCR 검출 동안, 객담 표본에서 Cp 값의 경계 값은 36.7인 반면, 세척액 표본에서 Cp 값의 경계 값은 37.2이고 ΔCp 값의 경계 값은 9이다.
일부 구현예에서, HOXB4 및 SRCIN1의 다중 PCR 검출 동안, 객담 표본의 Cp 값이 Cp 값의 경계 값 미만인 경우 표본을 폐암 표본으로 결정하고; 객담 표본의 Cp 값이 Cp 값의 경계 값 이상인 경우 표본을 정상 표본으로 결정한다.
일부 구현예에서, HOXB4 및 SRCIN1의 다중 PCR 검출 동안, 세척액 표본의 Cp 값 및 ΔCp 값의 임의의 수치가 Cp 값 및 ΔCp 값의 경계 값 미만인 경우 표본을 폐암 표본으로 결정하고; 세척액 표본의 Cp 값 및 ΔCp 값이 Cp 값 및 ΔCp 값의 경계 값 이상인 경우 표본을 정상 표본으로 결정한다.
일부 구현예에서, 종양은 폐암이다.
일부 구현예에서, 종양은 소세포 폐암 및 비소세포 폐암이다.
일부 구현예에서, 비소세포 폐암은 편평세포 암종 또는 선종성 암종으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 검출될 특정 샘플 또는 샘플의 유형은 폐포 세척액, 조직, 흉수, 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 전립선액, 또는 배설물 중 적어도 하나로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 샘플은 폐포 세척액, 조직, 또는 객담 중 적어도 하나로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 샘플은 폐포 세척액 또는 객담 중 적어도 하나로부터 선택된다.
본 발명은 폐암 진단 방법을 추가로 제공한다. 방법은 다음 단계를 포함한다:
(1) 대상체로부터 유래된 검출될 샘플에서 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 검출하는 단계;
(2) 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 비교하는 단계; 및
(3) 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 메틸화 수준의 편차를 기준으로 폐암을 진단하는 단계.
일부 구현예에서, 본 발명은 폐암 진단 방법을 제공한다. 방법은 하기 단계를 포함한다: (1) 대상체로부터 유래된 검출될 샘플에서 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 검출하는 단계, 여기서 검출은 대상체의 검출될 샘플과 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준 검출용 검출 시약 사이의 접촉을 포함함; (2) 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 비교하는 단계; 및 (3) 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 메틸화 수준의 편차를 기준으로 폐암을 진단하는 단계.
일부 구현예에서, 본 발명은 폐암 진단 방법을 제공한다. 방법은 다음 단계를 포함한다: 대상체로부터 유래된 검출될 샘플에 유전자의 메틸화 검출 시약을 첨가하고, 검출될 샘플에서 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 검출하는 단계; 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 비교하는 단계; 및 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 메틸화 수준의 편차를 기준으로 폐암을 진단하는 단계.
일부 구현예에서, 단계 (3)에서의 편차는 2개 유전자, 즉 HOXB4 및 SRCIN1 중 임의의 것의 메틸화 수준의 편차를 지칭한다.
일부 구현예에서, 단계 (1)에서, 검출은 대상체의 검출될 샘플과 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준 검출용 검출 시약 사이의 접촉을 포함한다.
일부 구현예에서, HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준은 정량적 메틸화 특이적 PCR(qMSP)을 이용하여 검출된다.
일부 구현예에서, 검출될 샘플 및 정상 샘플의 메틸화 결과는 결과를 통해 비교되고; 검출될 샘플 및 정상 샘플의 결과가 유의한 차이 또는 극히 유의한 차이를 갖는 경우, 상기 결과로부터 검출될 샘플은 질환 위험이 높은 것으로 결정된다.
본 발명의 진단 방법은 폐암 치료 전, 후에 사용되거나 폐암 치료와 병용될 수 있다. 치료 후에 사용될 때, 진단 방법은 치료의 성공의 평가, 또는 치료 후 폐암의 완화, 재발 및/또는 진행(전이 포함)의 모니터링을 포함한다.
한 측면에서, 폐암 치료 방법이 추가로 제공된다. 방법은 다음 단계를 포함한다:
(1) 대상체로부터 유래된 검출될 샘플에서 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 검출하는 단계;
(2) 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 비교하는 단계;
(3) 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 메틸화 수준의 편차를 기준으로 폐암을 진단하는 단계; 및
(4) 폐암을 진단받은 대상체에게 항폐암제를 적용하는 단계.
본 발명의 다른 측면은 폐암 치료 방법을 제공한다. 방법은 수술, 화학요법, 방사선요법, 화학방사선요법, 면역요법, 종양세포용해성 바이러스 요법, 또는 본 기술분야에서 이용가능한 다른 유형의 폐암에 대한 임의의 다른 치료 방법 및 이들 치료 방법의 조합을 상기 잔단 방법에 의해 폐암으로 진단된 환자에게 적용하는 것을 포함한다.
연구를 통해, 일부 특정 구현예에서, 폐암 샘플은 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 조합을 검출함으로써 샘플과 잘 구별될 수 있음이 본 발명에서 밝혀졌다. 폐암에 대한 검출 민감도와 특이도는 매우 높다.
도 1은 조직 샘플을 검출하기 위한 상이한 마커 조합의 ROC 곡선이고;
도 2는 객담 샘플을 검출하기 위한 상이한 마커 조합의 ROC 곡선이고;
도 3은 세척액 표본을 검출하기 위한 HOXB4 및 SRCIN1 조합 검출의 증폭 곡선이다.
본 발명의 기술 해결책은 아래에서 특정 예에 의해 추가로 설명될 것이다. 특정 예는 본 발명의 보호 범위에 대한 제한을 나타내지 않는다. 본 발명의 개념에 따라 다른 사람이 수행한 일부 불필요한 수정 및 조정은 여전히 본 발명의 보호 범위에 속한다.
본 발명에서 "프라이머" 또는 "프로브"는 표적 분자(예컨대 표적 핵산 단편)의 적어도 6개의 연속 뉴클레오티드의 서열에 상보적인 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 프라이머 또는 프로브 서열의 적어도 한 부분은 증폭된 서열에 대해 상보적이지 않다. 일부 구현예에서, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드의 서열에 상보적인 영역을 포함한다. 프라이머 또는 프로브가 "표적 분자의 적어도 x개의 연속 뉴클레오티드에 상보적인" 영역을 포함하는 경우, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자의 적어도 x개의 연속 또는 불연속 블록 뉴클레오티드에 적어도 95% 상보적이다. 일부 구현예에서, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이다.
본 발명에서, "정상" 샘플은 암 또는 종양이 없는 것으로 알려진 개인으로부터 단리된 동일한 유형의 샘플을 의미한다.
본 발명에서 메틸화 검출 샘플은 DNA, 또는 RNA, 또는 mRNA 함유 DNA 및 RNA 샘플 또는 DNA-RNA 혼성체를 비제한적으로 포함하고, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
본 발명에서, "대상체"는 사람과 같은 포유동물이다.
본 발명에서, "메틸화 수준"은 "메틸화 정도"와 동일하고, 일반적으로 메틸화 시토신의 백분율로 나타낼 수 있으며, 여기서 메틸화 시토신의 백분율은 메틸화 시토신의 양을 메틸화 시토신의 양 및 메틸화되지 않은 시토신의 양의 합으로 나눔으로써 수득된다. 또한, 현재 메틸화 수준은 일반적으로 메틸화된 표적 유전자의 수를 참조 유전자의 수로 나누는 방법을 이용하여 제시하고 있다. 또한, 메틸화 수준은 종래 기술의 다른 메틸화 수준 표시 방법에 의해 제시된다.
본 발명에서 "샘플"은 "표본"과 동일하다.
본 발명에서 사용된 "및/또는"은 하나 이상의 관련된 나열 항목 및 임의의 가능한 조합을 지칭하고 포괄한다. 둘 이상의 항목의 목록에서 사용되는 경우, 용어 "및/또는"은 나열된 항목 중 어느 것을 단독으로 사용하거나, 둘 이상의 나열된 항목의 임의의 조합으로 사용할 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 조성물, 조합, 또는 구조가 A, B, C, 및/또는 D의 구성 요소를 포함(또는 함유)하는 것으로 기술된 경우, 조성물은 별도로 A를 포함하고, 별도로 B를 포함하고, 별도로 C를 포함하고 별도로 D를 포함할 수 있고; A 및 B의 조합, A 및 C의 조합, A 및 D의 조합, B 및 C의 조합, B 및 D의 조합, C 및 D의 조합, A, B 및 C의 조합, A, B 및 D의 조합, A, C 및 D의 조합, B, C 및 D의 조합, 또는 A, B, C 및 D의 조합을 포함할 수 있다.
실시예 1
본 발명자에 의해 수백 개의 유전자가 스크리닝되었다. 조직 샘플로부터 유전자를 스크리닝하고, 유전자 β-액틴을 참조 유전자로 하여, HOXB4, SRCIN1, PCDHGA12, 및 HOXD8과 같은 유전자 중 2개씩 조합된 검출 결과를 비교하였고, 각 유전자의 검출 프라이머 및 프로브는 다음과 같다:
HOXB4의 검출 프라이머 및 프로브는 다음과 같다:
서열번호 1 HOXB4-F1 프라이머 F: TTCGTCGTTTTCGTTATCATTC
서열번호 2 HOXB4-R1 프라이머 R: TACTAACCGCCTCGCTAC
서열번호 3 HOXB4-P1 프로브 P: FAM-CGGGTTTTTGCGTCGTTATTCGTC-BQ1
SRCIN1의 검출 프라이머 및 프로브는 다음과 같다:
서열번호 4 SRCIN1 프라이머 F: TCGTGTGTCGTCGTTCAGAC
서열번호 5 SRCIN1 프라이머 R: GAAATACCCGCGAAAATACTG
서열번호 6 SRCIN1 프로브 P: FAM-AGTTTTACGTTGGAGAAGCGTCGG-BQ1
PCDHGA12의 검출 프라이머 및 프로브는 다음과 같다:
서열번호 7 PCDHGA12 프라이머 F: TTGGTTTTTACGGTTTTCGAC
서열번호 8 PCDHGA12 프라이머 R: AAATTCTCCGAAACGCTCG
서열번호 9 PCDHGA12 프로브 P: FAM-ATTCGGTGCGTATAGGTATCGCGC-BQ1
HOXD8의 검출 프라이머 및 프로브는 다음과 같다:
서열번호 10 HOXD8 프라이머 F: TTAGTTTCGGCGCGTAGC
서열번호 11 HOXD8 프라이머 R: CCTAAAACCGACGCGATCTA
서열번호 12 HOXD8 프로브 P: FAM-AAAACTTACGATCGTCTACCCTCCG-BQ1
β-액틴의 검출 프라이머 및 프로브는 다음과 같다:
서열번호 13 β-액틴 프라이머 F: GGAGGTTTAGTAAGTTTTTTGGATT
서열번호 14 β-액틴 프라이머 R: CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA
서열번호 15 β-액틴 프로브 P: FAM-TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT-BQ1
실험 절차:
1. DNA의 추출
진단된 폐암 환자의 표본 및 비-폐암 환자의 표본을 채취하였고, 표본은 각각 파라핀 포매된 조직 표본, 객담 표본, 및 세척액 표본을 포함한다. 샘플 전처리 및 세포 단리 후, Magen Company의 HiPure FFPE DNA 키트(D3126-03) 지침에 따라 DNA 추출을 수행하였다.
2. DNA 변형
비설파이트 변형은 ZYMO RESEARCH Biotechnology Company의 EZ DNA MethylationTM 키트(D5002) 지침에 따라 수행하였다.
3. 증폭 및 검출
[표 1] 용액 제조 시스템
Figure pct00001
증폭 시스템: 다양한 검출 유전자의 증폭 시스템을 표 2 및 표 3에 나타낸다.
[표 2] HOXB4, SRCIN1m 및 β-액틴의 증폭 시스템
Figure pct00002
[표 3] PCDHGA12 및 HOXD8의 증폭 시스템
Figure pct00003
4. 검출 결과
샘플 정보: 91개의 정상 조직 샘플 및 78개의 암 조직 샘플을 포함하여 총 169개의 폐 조직 샘플이 있다. 78개의 암 조직 샘플은 편평상피 암종 샘플 27개, 선종성 암종 샘플 38개, 소세포 암 샘플 3개, 대세포 암 샘플 4개, 복합 암 샘플 1개, 및 명확하게 분류되지 않은 폐암 샘플 5개를 포함한다. 77쌍의 암 및 암 인접 대조군 샘플이 있다.
ACTB는 참조 유전자 역할을 한다; 표본의 메틸화 수준은 표적 유전자, 즉 HOXB4 및 SRCIN1의 ΔCp 값에 따라 결정된다(ΔCp 값 = Cptarget 유전자 - CpACTB); HOXB4 및 SRCIN1의 임계값은 각각 다음과 같다: ΔCp 값 = 5.4, 및 ΔCp 값 = 6.5. 검출 결과의 한 항목이 상기 임계값 미만인 경우, 표본을 양성으로 식별할 수 있고; 검출 결과의 2개 항목이 해당 임계값 이상인 경우, 표본을 음성으로 식별할 수 있다.
PCDHGA12의 임계값은 Cp 값 = 25.9이고, HOXD8의 임계값은 Cp 값 = 27.4이다. 각 마커의 검출 결과가 해당 임계값 이상인 경우 표본을 음성으로 식별할 수 있고; 각 마커의 검출 결과가 해당 임계값 미만인 경우 표본을 양성으로 식별할 수 있다.
모든 조직 샘플을 시험하기 위한 HOXB4 및 SRCIN1의 조합, HOXB4 및 PCDHGA12의 조합, 및 HOXB4 및 HOXD8 조합의 ROC 곡선을 도 1에 나타낸다. 조직에서 시험된 각 유전자의 통계 결과를 표 3에 나타낸다.
[표 3] 조직에서의 검출 결과
Figure pct00004
[표 3] (계속)
Figure pct00005
상기 결과로부터, 정상군과 전체 암군의 비교를 통해, 조직 샘플에서 HOXB4 및 SRCIN1의 조합의 검출은 특이도 97.8%, 민감도 89.7%이고; 다른 두 가지 조합의 검출과 비교하여, HOXB4 및 SRCIN1 조합의 검출은 일치하는 특이도의 경우에 더 높은 민감도를 가짐을 알 수 있다. 또한, HOXB4 및 SRCIN1의 개별 검출과 비교하여 명백하지는 않지만 HOXB4 및 SRCIN1의 조합의 검출은 민감도를 현저히 향상시킨다.
상기 결과에 따르면, HOXB4 및 SRCIN1은 특이도가 높은 조직 샘플에서 여전히 더 높은 민감도를 갖는다. 특히, 조합된 검출을 통해 특이도가 기본적으로 영향을 받지 않는 조건에서 민감도가 크게 향상된다. 비침습적 검출 샘플인 객담은 폐암 진단에 의의가 있다. 따라서, 2개의 마커, 즉 HOXB4 및 SRCIN1이 발명자에 의해 객담에서 검출된다.
실시예 2: 객담 내 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 검출
샘플 정보: 51개의 정상 대조군 샘플 및 56개의 암군 샘플을 포함하여 총 107개의 시험된 객담 샘플이 있다. 56개의 암군 샘플은 편평상피 암종 샘플 20개, 소세포 암 샘플 8개, 선종성 암종 샘플 20개, 대세포 암 샘플 1개, 거대 세포 암종 샘플 1개, 및 명확하게 분류되지 않은 폐암 샘플 6개를 포함한다.
시험 절차:
a. 진단된 폐암 환자 및 비-폐암 환자의 객담 표본을 수집하고; 표본을 NaOH로 희석하고 원심분리 침전시켜 세포를 단리하고; 표본을 PBS로 2회 세척하고; 이후 Magen Company의 DNA 추출 키트(HiPure FFPE DNA Kit D3126-03)를 이용하여 DNA를 추출한다.
b. DNA는 ZYMO RESEARCH Biotechnology Company의 DNA 변환 키트(EZ DNA Methylation Kit, D5002)를 이용하여 비설파이트 변형된다.
c. 각 유전자 마커에 대한 프라이머 및 프로브 서열, 용액 제조 시스템 및 증폭 시스템은 실시예 1과 동일하다.
d. 표본의 메틸화 수준은 표적 유전자, 즉 HOXB4 및 SRCIN1의 Cp 값에 따라 결정되고; HOXB4 및 SRCIN1의 임계 Cp 값은 각각 36.9 및 37.0이다. 단일 유전자의 검출 결과 중 하나의 항목이 상기 임계값 미만인 경우 표본을 양성으로 식별할 수 있고; 검출 결과의 2개 항목이 해당 임계값 이상인 경우 표본을 음성으로 식별할 수 있다.
PCDHGA12 및 HOXD8: PCDHGA12의 임계값은 Cp 값 = 23.48이고; HOXD8의 임계값은 Cp 값 = 26.4이다; 각 마커의 검출 결과가 해당 임계값 이상일 때 표본을 음성으로 식별할 수 있고; 각 마커의 검출 결과가 해당 임계값 미만인 경우 표본을 양성으로 식별할 수 있다.
e. 검출 결과는 다음과 같다:
[표 4] 객담에서의 검출 결과
Figure pct00006
[표 4] (계속)
Figure pct00007
객담 표본을 시험하기 위한 HOXB4 및 SRCIN1의 ROC 곡선을 도 2에 나타내고, 통계 결과를 표 4에 나타낸다. 상기 결과로부터 객담 샘플에서 HOXB4 및 SRCIN1의 조합을 검출하는 동안, 정상군과 전체 암군의 비교를 통해, 폐암에 대한 민감도는 76.8%로 향상되고; 정상군 및 전체 소세포 암군의 비교를 통해 민감도를 100%까지 높일 수 있음을 알 수 있다. 단일 유전자 마커에 비해, HOXB4의 검출률은 64.3%이고, SRCIN1의 검출률은 48.2%이다. 두 유전자의 조합된 검출 동안, 폐암에 대한 민감도는 76.8%로 향상되고; 두 유전자는 상승작용을 갖는다.
실시예 3: HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 다중 PCR 시스템의 최적화
상기 결과는 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 조합된 검출이 폐암의 검출률을 현저히 향상시킬 수 있음을 보여준다. PCR 시스템은 다중 PCR 모드에서 발명자에 의해 최적화됨으로써 검출 절차를 단순화하고 실시예 2의 샘플을 기반으로 검증을 수행한다. 다양한 유전자의 검출 프라이머 및 프로브는 다음과 같다:
HOXB4, SRCIN1, 및 β-액틴의 검출 프라이머 및 프로브의 서열은 실시예 1과 동일하다.
a. 객담 샘플 처리는 실시예 2와 동일하다.
b. 용액 제조 시스템은 다음과 같다:
[표 5] 용액 제조 시스템
Figure pct00008
c. 증폭 시스템은 실시예 1의 표 2의 증폭 시스템과 동일하다.
d. 표본의 메틸화 수준은 표적 유전자, 즉 HOXB4 및 SRCIN1의 다중 PCR의 Cp 값에 따라 결정되고; HOXB4 및 SRCIN1의 다중 PCR 검출의 임계 Cp 값은 36.7이다. 단일 유전자의 검출 결과 중 하나의 항목이 상기 임계값 미만인 경우 표본을 양성으로 식별할 수 있고; 검출 결과가 임계값 이상인 경우 표본을 음성으로 식별할 수 있다.
e. 검출 결과를 표 6에 나타낸다:
[표 6] 검출 결과
Figure pct00009
상기 결과는 HOXB4 및 SRCIN1의 다중 PCR 시스템의 검출 결과가 기본적으로 실시예 2의 검출 결과와 일치함을 보여준다. 따라서, 다중 PCR 시스템의 검출 결과는 폐암 검출을 위한 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 조합의 결정된 결과로서 작용할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4: 세척액에서 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 검출
샘플 정보: 총 387개의 시험된 폐포 세척액 샘플이 있고, 샘플은 303개의 정상 대조군 샘플 및 84개의 암군 샘플을 포함한다. 84개의 암군 샘플은 편평상피 암종 샘플 21개, 선종성 암종 샘플 40개, 소세포 암 샘플 10개 및 명확하게 분류되지 않은 폐암 샘플 13개를 포함한다.
HOXB4, SRCIN1 및 β-액틴의 검출 프라이머 및 프로브의 서열은 실시예 1과 동일하다.
시험 절차:
a. 진단된 폐암 환자 및 비-폐암 환자의 폐포 세척액 표본을 수집하고; 표본을 원심분리하여 세포를 단리한 후, Magen Company의 DNA 추출 키트(HiPure FFPE DNA Kit D3126-03)를 이용하여 DNA를 추출한다.
b. DNA는 ZYMO RESEARCH Biotechnology Company의 DNA 변환 키트(EZ DNA Methylation Kit, D5002)를 이용하여 비설파이트 변형된다.
c. 용액 제조 시스템 및 증폭 시스템은 실시예 3과 동일하다.
d. 검출 결과는 다음과 같다:
ACTB는 참조 유전자 역할을 한다; 표본의 메틸화 수준은 표적 유전자, 즉 HOXB4 및 SRCIN1의 Cp 값 및 ΔCp 값에 따라 결정된다(ΔCp 값 = Cptarget 유전자 - CpACTB); HOXB4 및 SRCIN1의 임계값은 다음과 같다: Cp 값 = 37.2. 및 ΔCp 값 = 9. 검출 결과의 하나의 항목이 상기 임계값 미만인 경우 표본을 양성으로 식별할 수 있고; 검출 결과의 2개 항목이 임계값 이상인 경우 표본을 음성으로 식별할 수 있다. 387개의 폐포 세척액 표본의 검출 결과는 다음과 같다:
[표 7] 검출 결과
Figure pct00010
모든 세척액 표본을 시험하기 위한 HOXB4 및 SRCIN1 조합의 증폭 곡선을 도 3에 나타내고, 통계 결과를 표 7에 나타낸다. 상기 결과로부터 HOXB4 및 SRCIN1의 조합의 검출은 96.0%의 높은 특이도에서 77.4%의 민감도에 도달하고; 폐암의 아형에 따른 비교 분석을 통해 HOXB4 및 SRCIN1의 조합의 검출율은 편평상피 암종 군에서 최대 71.4%에 도달함을 알 수 있다. 특히 선종성 암종의 검출 효과에 대해 HOXB4 및 SRCIN1의 조합의 검출 민감도는 최대 75.0%이다. 이 중요한 발견은 선종성 암종의 검출에 의의가 있다. 선종성 암종은 일반적으로 말초성이기 때문에, 기관지의 나무 유사 생리학적 구조로 인해, 폐포 세척액이 폐포 또는 폐 깊숙이 암 조직과 접촉이 어렵다.
실시예 5 객담 샘플에서 상이한 마커 조합의 검출 결과
본 발명자는 객담 샘플에서 상이한 마커 조합의 검출 조건을 동시에 비교한다. 비교 그룹은 다음과 같다:
그룹 1: HOXB4+SRCIN1
그룹 2: HOXB4+PCDHGA12
그룹 3: SRCIN1+PCDHGA12
그룹 4: HOXB4+HOXD8
그룹 5: SRCIN1+HOXD8
그룹 6: SRCIN1+PCDHGA12+HOXD8
그룹 7: SRCIN1+HOXB4+HOXD8
구체적인 실험 조건 및 조작은 실시예 2와 동일하다.
107개의 객담 샘플에서 다양한 마커 조합이 검출된다. 객담 샘플은 51개의 정상 대조군 샘플 및 56개의 암군 샘플을 포함한다. 각 그룹의 검출 결과를 표 8에 나타낸다.
[표 8] (정상군 vs. 전체 암군)
Figure pct00011
표 8의 결과는 상이한 마커 조합이 객담 샘플의 폐암 검출률에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여준다. 조합 1, 조합 2, 조합 3, 조합 4, 및 조합 5의 분석 결과는 2개의 상이한 마커 조합마다 검출 결과가 크게 다름을 보여주고; 조합 1에서, HOXB4 및 SRCIN1 조합의 검출은 92.2% 특이도 및 76.8% 민감도를 가지고; 조합 1의 포괄적인 검출 성능은 나머지 4개 조합 중 어느 것보다 훨씬 더 높다. 조합 3, 조합 5, 및 조합 6, 또는 조합 1 및 조합 7의 분석을 통해, 결과는 여분의 마커가 증가한다고 해서 검출률이 반드시 향상되는 것은 아니며, 오히려 특이도가 감소할 가능성이 있음을 보여준다. 결과는 어떠한 유전자 마커 조합도 본 발명의 조합 1과 같이 민감도, 특이도 및 AUC의 3가지 지표에서 포괄적으로 우수한 효과를 달성할 수 없음을 보여준다. 명백하지는 않지만, 조합된 검출을 수행하기 위한 표적 유전자 마커의 양을 증가시킴으로써 특이도 및 민감도가 상응하게 개선되는 것은 아니다(예컨대 조합 6 및 조합 7).
실시예 6 프라이머 및 프로브 조합의 선택
프라이머 및 프로브는 종양 마커의 검출 효과에 상당한 영향을 미친다. 검출 민감도 및 특이도를 최대한 향상시킬 수 있는 프라이머 및 프로브를 찾기 위해 연구하던 중에 본 발명자는 여러 쌍의 프라이머 및 그의 상응하는 프로브를 설계하였다. 따라서, 본 발명의 검출 시약은 실제로 임상 검출에 적용될 수 있다.
40개의 객담 샘플에서 다양한 프라이머 및 프로브 조합이 검출된다. 객담 샘플은 정상 대조군 샘플 15개 및 암군 대조군 샘플 25개를 포함한다.
[표 9] 프라이머 및 프로브
Figure pct00012
다양한 용액 제조 시스템이 일치하고; 용액 제조 시스템 및 다양한 증폭 절차가 일치하며, 증폭 절차는 실시예 2와 동일하다.
검출 결과를 표 10 및 표 11에 나타낸다.
[표 10] 객담 샘플에서 HOXB4 검출 결과 (정상군 vs. 전체 암군)
Figure pct00013
[표 11] 객담 샘플에서 SRCIN1 검출 결과 (정상군 vs. 전체 암군)
Figure pct00014
결과는 동일한 영역의 상이한 프라이머 쌍에 대해 검출 결과가 영향을 받을 것임을 보여준다. 일치하는 특이도의 경우, HOXB-F1, HOXB-R1, HOXB-P1, SRCIN1-F1, SRCIN1-R1, 및 SRCIN1-P1의 프라이머 및 프로브 조합은 더 높은 민감도를 갖는다.
<110> CREATIVE BIOSCIENCES (GUANGZHOU) CO., LTD. <120> Genetic Marker Combination And Application Thereof <130> 2022-FPA-1871 <150> CN 202010494245.X <151> 2020-06-03 <160> 22 <170> PatentIn 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXB4 primer F <400> 1 ttcgtcgttt tcgttatcat tc 22 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXB4 primer R <400> 2 tactaaccgc ctcgctac 18 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXB4 probe P <400> 3 cgggtttttg cgtcgttatt cgtc 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRCIN1 primer F <400> 4 tcgtgtgtcg tcgttcagac 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRCIN1 primer R <400> 5 gaaatacccg cgaaaatact g 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRCIN1 probe P <400> 6 agttttacgt tggagaagcg tcgg 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCDHGA12 forward primer <400> 7 ttggttttta cggttttcga c 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCDHGA12 reverse primer <400> 8 aaattctccg aaacgctcg 19 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCDHGA12 probe <400> 9 attcggtgcg tataggtatc gcgc 24 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXD8 forward primer <400> 10 ttagtttcgg cgcgtagc 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXD8 reverse primer <400> 11 cctaaaaccg acgcgatcta 20 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXD8 probe <400> 12 aaaacttacg atcgtctacc ctccg 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin forward primer <400> 13 ggaggtttag taagtttttt ggatt 25 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin reverse primer <400> 14 caataaaacc tactcctccc tta 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin probe <400> 15 ttgtgtgttg ggtggtggtt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXB4 forward primer <400> 16 attcgttcgg gtattacgtc 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXB4 reverse primer <400> 17 ccaaaatccc gacaaaccg 19 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXB4 detection probe <400> 18 cggttagagg cgagagagta gttt 24 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXB4 forward primer <400> 19 cgggtttcgg gcggcgcgc 19 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXB4 reverse primer <400> 20 cgaacgataa cgaaaacgac g 21 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXB4 detection probe <400> 21 amcgtgtatc gtgtagcgtt acgcggb 27 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRCIN1 forward primer <400> 22 tatcgtgtat cgtcgttcgg ac 22

Claims (12)

  1. 유전자 마커의 조합으로서,
    상기 유전자 마커는 HOXB4 및 SRCIN1을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 마커의 조합.
  2. 폐암 검출 시약 또는 키트의 제조에서의 다중 유전자 조합 메틸화 검출 시약의 용도로서,
    상기 유전자는 HOXB4 및 SRCIN1을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  3. HOXB4 및 SRCIN1 유전자에 대한 메틸화 검출 시약을 포함하는 다중 유전자 조합 메틸화 검출 시약/키트.
  4. 청구항 2 또는 청구항 3에 있어서,
    상기 다중 유전자 조합 메틸화 검출 시약은 각 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 및/또는 프로브를 포함하고,
    선택적으로 각 유전자의 CpG 섬으로부터 수득된 프라이머 및/또는 프로브를 포함하고, 및
    선택적으로 각 유전자의 게노솜(genosome), 유전자간 영역, 프로모터 영역 또는 프로모터 영역 근처 영역의 CpG 섬으로부터 수득된 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도 또는 시약.
  5. 청구항 2 또는 청구항 3에 있어서,
    HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 정방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    I. 서열번호 1, 서열번호 16 및 서열번호 19로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    II. I에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 역방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    III. 서열번호 2, 서열번호 17 및 서열번호 20으로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    IV. III에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 정방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    V. 서열번호 4 및 서열번호 22로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    VI. V로 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 역방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    VII. 서열번호 5로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    VIII. VII에 나타낸 서열의 상보적 서열;
    선택적으로, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타내고;
    선택적으로, SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5로 나타내고;
    선택적으로, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프로브는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 가지고;
    IX. 서열번호 3, 서열번호 18 및 서열번호 21로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    X. IX에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프로브는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 갖는 것을 특징으로 하는 용도 또는 시약:
    XI. 서열번호 6으로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    XII. XI에 나타낸 서열의 상보적 서열.
  6. 폐암은 소세포 폐암 및 비소세포 폐암으로부터 선택되고; 더 바람직하게는 비소세포 폐암은 편평세포 암종 또는 선종성 암종으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 청구항 1에 따른 유전자 마커 또는 청구항 2에 따른 용도 또는 청구항 3에 따른 시약의 조합.
  7. 검출 시약으로 검출될 샘플은 폐포 세척액, 조직, 흉수, 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 전립선액 또는 배설물 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    바람직하게는, 샘플은 폐포 세척액, 조직 또는 객담 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    더 바람직하게는, 샘플은 폐포 세척액 또는 객담 중 적어도 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 청구항 1에 따른 유전자 마커 또는 청구항 2에 따른 용도 또는 청구항 3에 따른 시약의 조합.
  8. 다음 구성요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 검출 시스템:
    (1) HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 조합된 메틸화 검출 구성요소;
    (2) 데이터 처리 구성요소; 및
    (3) 결과 출력 구성요소;
    바람직하게는, 메틸화 검출 구성요소는 메틸화 검출 기구를 포함하고;
    바람직하게는, 메틸화 검출 기구는 형광 정량 PCR 기구, PCR 기구 및 시퀀서 중 하나 이상을 포함하고;
    바람직하게는, 데이터 처리 구성요소는 데이터 처리 기계를 포함하고;
    바람직하게는, 데이터 처리 기계는 계산기 및 컴퓨터 중 하나 이상을 포함하고;
    바람직하게는, 컴퓨터는 SPSS, SAS 및 Excel의 소프트웨어 중 하나 이상이 내장된 컴퓨터를 포함하고;
    바람직하게는, 결과 출력 구성요소는 결과 출력 유닛을 포함하고;
    바람직하게는, 결과 출력 유닛은 스크린 및 종이 보고서 중 하나 이상을 포함하고;
    바람직하게는, 메틸화 검출 구성요소는 청구항 3 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 다중 유전자 조합 메틸화 검출 시약을 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 데이터 처리 구성요소는 다음으로 구성되고: a. 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 테스트 데이터를 수신하고; b. 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 테스트 데이터를 저장하고; c. 검출될 샘플의 테스트 데이터를 정상 대조군 샘플의 동일한 유형과 비교하고; d. 비교 결과에 따라 대상체가 폐암을 앓을 확률 또는 가능성을 응답함;
    바람직하게는, 결과 출력 구성요소는 대상체가 폐암을 앓을 확률 또는 가능성을 출력하기 위해 사용되며;
    바람직하게는, 데이터 처리 구성요소의 기준은 다음과 같다: 검출될 샘플 및 정상 샘플의 메틸화 결과는 결과를 통해 비교되고; 검출될 샘플 및 정상 샘플의 메틸화가 유의한 차이 또는 극히 유의한 차이를 갖는 경우, 상기 결과로부터 검출될 샘플은 질환 위험이 높은 것으로 결정된다.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 폐암은 소세포 폐암 및 비소세포 폐암으로부터 선택되고; 더 바람직하게는, 비소세포 폐암은 편평세포 암종 또는 선종성 암종으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐암 검출 시스템.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 검출 시스템으로 검출될 샘플은 폐포 세척액, 조직, 흉수, 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 전립선액 또는 배설물 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    바람직하게는, 샘플은 폐포 세척액, 조직 또는 객담 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    더 바람직하게는, 샘플은 폐포 세척액 또는 객담 중 적어도 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐암 검출 시스템.
  11. (1) 대상체로부터 유래된 검출될 샘플에서 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 검출하는 단계;
    (2) 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 비교하는 단계; 및
    (3) 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 메틸화 수준의 편차를 기준으로 폐암을 진단하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단 방법으로서,
    선택적으로, HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준은 정량적 메틸화 특이적 PCR(qMSP)을 이용하여 검출되고;
    선택적으로, 단계 (1)에서, 검출은 대상체의 검출될 샘플과 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 검출하기 위한 검출 시약 사이의 접촉을 포함하고;
    선택적으로, 검출될 샘플 및 정상 샘플의 메틸화 결과는 결과를 통해 비교되고; 검출될 샘플 및 정상 샘플의 메틸화가 유의한 차이 또는 극히 유의한 차이를 갖는 경우, 상기 결과로부터 검출될 샘플은 질환 위험이 높은 것으로 결정되고;
    선택적으로, 검출될 샘플은 폐포 세척액, 조직, 흉수, 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 전립선액 또는 배설물 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    선택적으로, 샘플은 폐포 세척액, 객담 또는 조직 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    선택적으로, 샘플은 폐포 세척액 또는 객담 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    선택적으로, 폐암은 소세포 폐암 및 비소세포 폐암으로부터 선택되고;
    선택적으로, 비소세포 폐암은 편평세포 암종 또는 선종성 암종으로부터 선택되고;
    선택적으로, 단계 (1)에서, HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준은 다중 유전자 조합 메틸화 검출 시약에 의해 검출되고, 조합 검출 시약은 각 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 및/또는 프로브를 포함하고;
    선택적으로 각 유전자의 CpG 섬으로부터 수득된 프라이머 및/또는 프로브를 포함하고,
    선택적으로 각 유전자의 게노솜, 유전자간 영역, 프로모터 영역 또는 프로모터 영역 근처 영역의 CpG 섬으로부터 수득된 프라이머 및/또는 프로브를 포함하고;
    선택적으로, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 정방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    I. 서열번호 1, 서열번호 16 및 서열번호 19로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    II. I에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 역방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    III. 서열번호 2, 서열번호 17 및 서열번호 20으로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    IV. III에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 정방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    V. 서열번호 4 및 서열번호 22로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    VI. V로 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 역방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    VII. 서열번호 5로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    VIII. VII에 나타낸 서열의 상보적 서열;
    선택적으로, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타내고;
    선택적으로, SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5로 나타내고;
    선택적으로, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프로브는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 가지고:
    IX. 서열번호 3, 서열번호 18 및 서열번호 21로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    X. IX에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프로브는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 갖는 폐암 진단 방법:
    XI. 서열번호 6으로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    XII. XI에 나타낸 서열의 상보적 서열.
  12. (1) 대상체로부터 유래된 검출될 샘플에서 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 검출하는 단계;
    (2) 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준을 비교하는 단계;
    (3) 검출될 샘플 및 정상 대조군 샘플의 메틸화 수준의 편차를 기준으로 폐암을 진단하는 단계; 및
    (4) 폐암을 진단받은 대상체에게 항폐암제를 투여하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 치료 방법으로서,
    선택적으로, HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준은 정량적 메틸화 특이적 PCR(qMSP)을 이용하여 검출되고;
    선택적으로, 검출될 샘플 및 정상 샘플의 메틸화 결과는 결과를 통해 비교되고; 검출될 샘플 및 정상 샘플의 메틸화가 유의한 차이 또는 극히 유의한 차이를 갖는 경우, 상기 결과로부터 검출될 샘플은 질환 위험이 높은 것으로 결정되고;
    선택적으로, 유전자의 메틸화 수준은 정량적 메틸화 특이적 PCR을 이용하여 검출되고;
    선택적으로, 검출될 샘플은 폐포 세척액, 조직, 흉수, 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 전립선액 또는 배설물 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    선택적으로, 샘플은 폐포 세척액, 객담 또는 조직 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    선택적으로, 샘플은 폐포 세척액 또는 객담 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    선택적으로, 폐암은 소세포 폐암 및 비소세포 폐암으로부터 선택되고;
    선택적으로, 비소세포 폐암은 편평세포 암종 또는 선종성 암종으로부터 선택되고;
    선택적으로, 상기 (1) 단계에서, HOXB4 및 SRCIN1 유전자의 메틸화 수준은 다중 유전자 조합 메틸화 검출 시약에 의해 검출되고, 상기 조합 검출 시약은 각 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 및/또는 프로브를 포함하고;
    선택적으로 각 유전자의 CpG 섬으로부터 수득된 프라이머 및/또는 프로브를 포함하고, 및
    선택적으로 각 유전자의 게노솜, 유전자간 영역, 프로모터 영역 또는 프로모터 영역 근처 영역의 CpG 섬으로부터 수득된 프라이머 및/또는 프로브를 포함하고;
    선택적으로, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 정방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    I. 서열번호 1, 서열번호 16 및 서열번호 19로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    II. I에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 역방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    III. 서열번호 2, 서열번호 17 및 서열번호 20으로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    IV. III에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 정방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    V. 서열번호 4 및 서열번호 22로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    VI. V로 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머의 역방향 프라이머는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 포함하고:
    VII. 서열번호 5로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    VIII. VII에 나타낸 서열의 상보적 서열;
    선택적으로, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타내고;
    선택적으로, SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프라이머 쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5로 나타내고;
    선택적으로, HOXB4 유전자의 메틸화 검출용 프로브는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 가지고:
    IX. 서열번호 3, 서열번호 18 및 서열번호 21로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    X. IX에 나타낸 서열의 상보적 서열; 및/또는
    SRCIN1 유전자의 메틸화 검출용 프로브는 하기에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 어느 것을 갖는 폐암 치료 방법:
    XI. 서열번호 6으로 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
    XII. XI에 나타낸 서열의 상보적 서열.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111676287B (zh) * 2020-06-03 2022-04-29 广州康立明生物科技股份有限公司 一种基因标志物组合及其应用
CN111662980A (zh) * 2020-06-03 2020-09-15 广州市康立明生物科技有限责任公司 一种肺癌检测试剂及试剂盒
CN111647657B (zh) * 2020-06-03 2022-07-12 广州康立明生物科技股份有限公司 一种肺癌检测试剂及试剂盒
CN115807095B (zh) * 2022-12-07 2023-10-13 中国人民解放军总医院第八医学中心 一种肺腺癌甲基化位点检测的引物组合物及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101541319B (zh) * 2006-10-31 2013-09-18 托莱多大学 Src和Src家族激酶的Na+/K+-ATP酶特异性肽抑制剂/激活剂
JP6543569B2 (ja) * 2012-05-22 2019-07-10 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ 定量的多重メチル化特異的ＰＣＲ法−ｃＭｅｔｈＤＮＡ、試薬、及びその使用
CN103627814B (zh) * 2013-12-13 2015-05-27 青岛大学医学院附属医院 一种检测Notch信号通路的试剂、PCR检测方法及其应用
CA2938451C (en) * 2014-01-30 2023-10-17 The Regents Of The University Of California Methylation haplotyping for non-invasive diagnosis (monod)
CN103993096A (zh) * 2014-06-09 2014-08-20 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的试剂盒
JP6395131B2 (ja) * 2014-07-10 2018-09-26 シスメックス株式会社 肺癌に関する情報の取得方法、ならびに肺癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
US11603555B2 (en) * 2015-06-15 2023-03-14 Cepheid Integrated purification and measurement of DNA methylation and co-measurement of mutations and/or MRNA expression levels in an automated reaction cartridge
CN107974503A (zh) * 2016-10-20 2018-05-01 上海透景诊断科技有限公司 多个肺癌相关基因甲基化联合检测试剂盒、联合检测方法和应用
DK3391907T3 (da) * 2017-04-20 2020-03-09 Iomx Therapeutics Ag Intracellulær kinase sik3, der er associeret med resistens over for antitumorimmunresponser, og anvendelser deraf
CA3066350A1 (en) * 2017-06-06 2018-12-13 The Johns Hopkins University Induction of synthetic lethality with epigenetic therapy
CN110499364A (zh) * 2019-07-30 2019-11-26 北京凯昂医学诊断技术有限公司 一种用于检测扩展型遗传病全外显子的探针组及其试剂盒和应用
CN110317875A (zh) * 2019-07-30 2019-10-11 苏州呼呼健康科技有限公司 一种与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒
CN111676287B (zh) * 2020-06-03 2022-04-29 广州康立明生物科技股份有限公司 一种基因标志物组合及其应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102603707B1 (ko) 2023-05-24 2023-11-17 (주) 아이크로진 마커 및 컨텐츠 자동화 전산 시스템 및 이의 운영 방법

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