CN103993096A - 一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的试剂盒 - Google Patents

一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的试剂盒 Download PDF

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CN103993096A CN201410252472.6A CN201410252472A CN103993096A CN 103993096 A CN103993096 A CN 103993096A CN 201410252472 A CN201410252472 A CN 201410252472A CN 103993096 A CN103993096 A CN 103993096A
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Abstract

本发明涉及一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的试剂盒，该试剂盒包括279种经过生物素标记的基因探针组合物，本发明对诊断IBMFS的敏感性及特异性均较高，可用于临床。

Description

一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的试剂盒。
背景技术
先天性骨髓衰竭综合征(Inherited bone marrow failure syndromes,IBMFS)是一组以骨髓衰竭、先天畸形及易发生肿瘤为主要表现的疾病的总称。IBMFS包括范可尼贫血(Fanconianemia,FA)、先天性角化不良(Dyskeratosis congenita,DC)、Shwachman-diamond综合征,(SDS)、无巨核细胞性血小板减少(Amegakaryocytic thrombocytopenia)、先天性纯红细胞再生障碍性贫血(Diamond-blackfan anemia,DBA)、网状组织发育不良(Reticulardysgenesis)、家族性再生障碍性贫血(Familial aplastic anemia)、伴挠骨缺失的血小板减少症(TAR)、严重的先天性中性粒细胞减少症等[1]。诊断这些疾病的重要依据是较典型的临床表现，但有1/3IBMFS患者缺乏临床特异性表现，且有部分患者在成人时才发病。另外，即使利用一些较特殊的检测手段如彗星及MMC等检测方法也易出现假阳性结果，而且漏诊率较高[2]。随着测序技术的发展，人们发现部分IBMFS患者会出现特有的基因突变，并通过测序方法对其进行检测以实现临床诊断。临床上所选择测序基因大多是根据临床表现，推测患者为某种疾病后制定的[3]，很可能出现漏诊的情况。另外，临床所用测序技术多为一代测序，其费用较高，很难广泛应用于临床。
高通量测序技术(High-throughput sequencing)，也称下一代测序技术(Next-generationsequencing technology)，是基因组学研究领域一个具有里程碑意义的方法。该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降，如第一代测序方法进行人类基因组测序需花费30亿美元，而第二代测序仅需万(美)元。如此低廉的单碱基测序成本使得我们可以实施更多物种的基因组计划从而解密更多生物物种的基因组遗传密码，同时在已完成基因组序列测定的物种中对该物种的其他品种进行大规模地全基因组重测序也成为了可能。近年来，人们结合第二代测序与微阵列技术而衍生出来的应用方法—目标序列捕获测序技术(Targeted Resequencing)即高通量捕获测序技术，为临床诊断疾病提供了可行的方法。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段；然后用第二代测序技术对这些区段进行测序，一般多采用Illumina HiSeq2000Sequencer技术进行测序；最后通过生物信息学方法对结果进行分析，总结患者相关疾病突变基因情况，为临床提供了较快速、准确、廉价的诊断方法。
[1]竺晓凡.儿童骨髓衰竭综合征.实用儿科临床杂志，2007,22(3)：165-167。
[2]van der Lelij P,Oostra AB,Rooimans MA,et al.Diagnostic overlap between Fanconi anemiaand the Cohesinopathies:Roberts Syndrome and Warsaw Breakage Syndrome.Anemia.2010；2010:565268.
[3]Gille JJ,Floor K,Kerkhoven,et al.Diagnosis of fanconi anemia:mutation analysis bymultiplex ligation-dependent probe amplification and PCR-Based sanger sequencing.Anemia.2012；2012:603253.
鉴于先天性骨髓衰竭综合征诊断较困难及目前测序方法昂贵的现状，本发明提供一种IBMFS高通量捕获测序诊断试剂盒，利用高通量捕获测序技术，为临床提供全面、快捷及经济的诊断方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的试剂盒，该试剂盒对诊断IBMFS的敏感性及特异性均较高，可用于临床。
本发明所采用的技术方案为：
一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的探针组合物，该探针组合物包括如下表1所示的279种经过生物素标记的基因探针：
表1
ABCA1 ITPKC EPOR RPL5 CASP10 NOP10 FOXO3a TBXAS1
ABCB7 JAK2 ESCO2 RPS10 CBL NOTCH3 FTL TCAB1
ABCC6 KLF4 ETV1 RPS17 CBL2 NPM1 FXYD2 TERC
ABCC8 KLHDC8B ETV6 RPS19 CD36 NR3C2 G6PD TERT
ABCG5 KLKB1 EZF RPS24 CDAN1 NRAS GAS1 TET2
ABCG8 KNG1 EZH2 RPS26 CETP NT5C3 GATA1 TF
ADAMTS1 KRAS F11 RPS37 CFH OCT3 GFI1 THBD
AK1 KRG2 F12 RUNX1 CFHR1 NHP2 GGCX THPO
ALAD KRIT1 F13A1 SCN4A CFHR3 ORAI1 GK FOXC2
ALAS2 LAMA3 F13B SEC23B CFI OTC TBCE TINF2
ALDH2 LBR F5 SERPINC1 CFP EPB42 GP1BA TMPRSS6
ALDH4A1 LDLR F8 SERPINE1 CHL1 P2RY12 GP1BB TNFA
ALDM LIPI F9 SERPINF2 CHLR1 PALB2 GP9 TNFRSF1A
ALG12 LMAN1 FAAP100 SERPING1 CKS2 PANK2 GSS RPL35a
ALS2 LMBRD1 FAAP24 SF1 CLDN16 PCCA HAMP TP53
ANK1 LPL FAM109A SF3A1 CLDN19 PCCB HBA1 TPP1
APOA1 MASTL FANCA SF3b1 CPN1 PDE4D HBA2 TRF1
APOA5 MCFD2 FANCB SH2D1A CSF3R ITGB3 HBB TRF2
APOB MDM2 FANCC SLC11A2 CST3 PLG HBG1 TRPM6
ARG1 MDS1 FANCD1 SLC25A38 CTC1 POT1 HBG2 TUBB1
ARSA MEFV FANCD2 SLC40A1 CYB5R3 PPOX HCFC2 U2AF1
ASXL1 MHF1 FANCE SLC4A1 CYCS PRF1 HFE U2AF2
ATAD3B MHF2 FANCF SLX4 CYP2A6 PROC HFE2 UBB
ATRX MLH1 FANCG SMAD4 CYP2C9 PROS1 HK1 UNC13D
B4GALT1 MMACHC FANCI SMARCAL CYP4F2 PRPF40B HMBS UNC18B
BACH1 MMADHC FANCJ SND1 DAPK1 PTPMT1 HOX2F C16orf57
BCAM MPL FANCL SOX2 DCLRE1C PTPN11 HOXB4 VANGL2
BCORL1 MSH2 FANCM SPTA1 ZNF93 RAD51C HPD VHL
BLM MTTP FANCN SPTB DNAH2 RAG1 HRG VKORC1
BMPR1A MYC FAS SRSF2 DNAH7 RAG2 IDH1 VWF
ITK MYH9 FGA STIM1 DNMT3A RAP1 IDH2 WAS
BRIP1 NAGA FKHRL1 STN1 EGF RARA IKAROS XIAP
ZNF43 NBS1 FLI1 STX11 EGLN1 RNF55 IKBKG XRCC2
BTK NF1 FLT4 STXBP2 EPAS1 RPL11 IL6 ZNRF4
BUB1B NFKBIA FLVCR2 TAT EPB41 RPL26 ITGA2B
进一步，所述279种基因探针的序列分别为如下表2所述的UCSC数据库中的Dec.2013(GRCh38/hg38)数据库的基因编号对应的序列。
表2
ABCA1 ITPKC EPOR RPL5 CASP10 NOP10 FOXO3a TBXAS1
uc004bcl.3 uc002oot.4 uc002mrj.2 uc001doz.3 uc002uxj.1 uc001zie.1 uc003psm.2 uc003vvi.3
ABCB7 JAK2 ESCO2 RPS10 CBL NOTCH3 FTL TCAB1
uc004eca.4 uc003ziw.3 uc003xgg.3 uc021yyt.1 uc001pwe.4 uc002nan.3 uc002plo.3 uc010vuh.2
ABCC6 KLF4 ETV1 RPS17 CBL2 NPM1 FXYD2 TERC
uc002den.4 uc004bdg.3 uc003ssw.4 uc003trd.3 uc001pwe.4 uc003mbi.3 uc021qqy.1 uc003ffr.1
ABCC8 KLHDC8B ETV6 RPS19 CD36 NR3C2 G6PD TERT
uc031xgt.1 uc003cwh.3 uc001qzz.3 uc002ort.3 uc003uhg.4 uc003ilj.4 uc004fly.2 uc003jcb.1
ABCG5 KLKB1 EZF RPS24 CDAN1 NRAS GAS1 TET2
uc002rtn.3 uc003iyy.3 uc004bdg.3 uc001jzs.3 uc001zql.3 uc009wgu.3 uc004aox.4 uc003hxk.3
ABCG8 KNG1 EZH2 RPS26 CETP NT5C3 GATA1 TF
uc002rtq.3 uc011bsa.2 uc003wfb.2 uc001sjf.3 uc002eki.2 uc003tdk.4 uc004dkq.4 uc003epv.2
ADAMTS1 KRAS F11 RPS37 CFH OCT3 GFI1 THBD
uc002ymf.3 uc001rgp.2 uc003iza.1 uc001jvc.4 uc001gtj.4 uc003nsv.4 uc001dov.4 uc002wss.3
AK1 KRG2 F12 RUNX1 CFHR1 NHP2 GGCX THPO
uc004bsm.4 uc001rjv.2 uc003mgo.4 uc010gmv.3 uc001gtn.3 uc003mir.3 uc002sps.3 uc003fol.1
ALAD KRIT1 F13A1 SCN4A CFHR3 ORAI1 GK FOXC2
uc011lxf.2 uc003ulu.1 uc003mwv.3 uc002jds.1 uc001gtn.3 uc031zps.1 uc003ird.3 uc002fjq.3
ALAS2 LAMA3 F13B SEC23B CFI OTC TBCE TINF2
uc004dua.4 uc002kuq.3 uc001gtt.1 uc002wrb.2 uc003hzr.4 uc004def.4 uc001hwz.2 uc001woa.4
ALDH2 LBR F5 SERPINC1 CFP EPB42 GP1BA TMPRSS6
uc001tst.3 uc001hoy.3 uc001ggg.1 uc001gjt.3 uc004dih.3 uc001zra.4 uc021tnz.1 uc032qno.1
ALDH4A1 LDLR F8 SERPINE1 CHL1 P2RY12 GP1BB TNFA
uc001bbc.3 uc002mqk.4 uc004fmt.3 uc003uxt.4 uc003bot.3 uc003eyw.2 uc002zpv.2 uc003nui.4
ALDM LIPI F9 SERPINF2 CHLR1 PALB2 GP9 TNFRSF1A
uc001tst.3 uc002yjm.3 uc004fas.1 uc002ftk.1 uc001qvy.1 uc002dlx.1 uc003elm.2 uc001qnu.3
ALG12 LMAN1 FAAP100 SERPING1 CKS2 PANK2 GSS RPL35a
uc003biy.3 uc002lhz.3 uc002kaq.3 uc001nkr.1 uc004aqh.3 uc002wkc.3 uc002xbg.3 uc003fyr.3
ALS2 LMBRD1 FAAP24 SF1 CLDN16 PCCA HAMP TP53
uc002uyo.3 uc003pfa.3 uc002nud.4 uc001oaz.2 uc003fsi.3 uc001voo.3 uc002nyw.3 uc002gij.3
ANK1 LPL FAM109A SF3A1 CLDN19 PCCB HBA1 TPP1
uc003xom.3 uc003wzk.4 uc009zvu.3 uc003ahl.3 uc001cht.1 uc003eqy.2 uc002cfx.1 uc001mel.1
APOA1 MASTL FANCA SF3b1 CPN1 PDE4D HBA2 TRF1
uc001ppv.1 uc001itm.3 uc002fou.1 uc002uue.3 uc001kql.2 uc003jsa.3 uc002cfv.4 uc003xzd.2
APOA5 MCFD2 FANCB SH2D1A CSF3R ITGB3 HBB TRF2
uc009yzf.3 uc021vha.1 uc004cwh.1 uc004euf.5 uc001caw.2 uc002ilj.3 uc001mae.1 uc002exd.5
APOB MDM2 FANCC SLC11A2 CST3 PLG HBG1 TRPM6
uc002red.3 uc001sui.5 uc004avh.3 uc001rxk.2 uc002wtm.4 uc003qtm.4 uc001mah.1 uc022bib.1
ARG1 MDS1 FANCD1 SLC25A38 CTC1 POT1 HBG2 TUBB1
uc003qcp.2 uc011bpj.1 uc001uub.1 uc003cjo.2 uc002gkq.4 uc003vlm.3 uc001mah.1 uc002yak.3
ARSA MEFV FANCD2 SLC40A1 CYB5R3 PPOX HCFC2 U2AF1
uc003bmz.5 uc002cun.1 uc003buw.3 uc002uqp.4 uc011aps.2 uc001fyg.2 uc001tkj.4 uc002zdb.1
ASXL1 MHF1 FANCE SLC4A1 CYCS PRF1 HFE U2AF2
uc002wxs.3 uc021ogd.1 uc003oko.1 uc002igf.4 uc003sxl.3 uc001jrf.4 uc003nfx.1 uc002qlu.3
ATAD3B MHF2 FANCF SLX4 CYP2A6 PROC HFE2 UBB
uc001afv.3 uc031rey.1 uc001mql.1 uc002cvp.2 uc002opl.4 uc002tok.3 uc001eni.2 uc001ugs.4
ATRX MLH1 FANCG SMAD4 CYP2C9 PROS1 HK1 UNC13D
uc004ecp.5 uc003cgl.3 uc003zwb.1 uc010xdp.2 uc001kka.4 uc003drb.4 uc001jpl.4 uc002jpp.4
B4GALT1 MMACHC FANCI SMARCAL CYP4F2 PRPF40B HMBS UNC18B
uc003zsg.2 uc009vxv.3 uc010bnp.1 uc002vgd.4 uc002nbs.1 uc001rus.2 uc001puz.1 uc010xjr.3
BACH1 MMADHC FANCJ SND1 DAPK1 PTPMT1 HOX2F C16orf57
uc002ynj.3 uc002txc.3 uc002izk.2 uc003vmi.3 uc004apc.4 uc001nfs.4 uc002inp.3 uc002emz.3
BCAM MPL FANCL SOX2 DCLRE1C PTPN11 HOXB4 VANGL2
uc002ozu.4 uc001ciw.3 uc002rzw.4 uc010nbi.3 uc001inn.4 uc001ttx.3 uc002inp.3 uc001fwc.2
BCORL1 MSH2 FANCM SPTA1 ZNF93 RAD51C HPD VHL
uc022cdu.1 uc002rvy.2 uc001wwd.4 uc001fst.1 uc002non.3 uc002iwu.4 uc001ubj.3 uc003bvc.3
BLM MTTP FANCN SPTB DNAH2 RAG1 HRG VKORC1
uc002bpr.4 uc003hvc.4 uc002dlx.1 uc001xhr.3 uc002giu.1 uc001mwu.4 uc003fqq.4 uc002eas.3
BMPR1A MYC FAS SRSF2 DNAH7 RAG2 IDH1 VWF
uc001kdy.3 uc003ysi.4 uc001kfr.3 uc002jsv.3 uc002utj.4 uc001mwv.4 uc002vct.4 uc001qnn.1
ITK MYH9 FGA STIM1 DNMT3A RAP1 IDH2 WAS
uc003lwo.1 uc003apg.3 uc003iod.1 uc021qco.1 uc002rgc.4 uc001ebl.3 uc002box.3 uc004dkm.4
BRIP1 NAGA FKHRL1 STN1 EGF RARA IKAROS XIAP
uc002izk.2 uc003bbw.4 uc003psm.2 uc001kxm.3 uc003hzy.4 uc002huk.2 uc003tow.4 uc010nqu.3
ZNF43 NBS1 FLI1 STX11 EGLN1 RNF55 IKBKG XRCC2
uc031rka.1 uc003yej.1 uc010sbu.2 uc003qks.4 uc001huv.2 uc001pwe.4 uc033fbu.1 uc003wld.3
BTK NF1 FLT4 STXBP2 EPAS1 RPL11 IL6 ZNRF4
uc010nno.3 uc002hgg.3 uc003mlz.4 uc010xjr.3 uc002ruv.3 uc001bhk.4 uc003svj.4 uc002mca.4
BUB1B NFKBIA FLVCR2 TAT EPB41 RPL26 ITGA2B
uc001zkx.4 uc001wtf.4 uc001xrs.2 uc002fap.2 uc001brm.2 uc002glh.1 uc002igt.1
本发明探针序列的合成可以利用传统的phosphoramodite寡核苷酸合成技术合成，也可以利用原位合成技术，在固体表面上大量合成捕获探针,在合成的末端加上生物素标记。
本发明还提供了一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的试剂盒，该试剂盒包括所述的探针组合物。
具体地，所述279种基因探针均溶解在TE缓冲液中，最终浓度均为150ng/ul。
本发明还提供了上述试剂盒的应用，将从病人血液中提取3-5ug DNA，并将其打断，扩增，从而构建病人的全基因组文库，然后利用本发明用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的试剂盒将病人疾病相关的多基因捕获出来，然后利用新一代测序仪Illumina HiSeq2000进行高通量测序，进而分析，找出这些疾病相关基因的所有突变信息，从而得到找到病人的致病基因，以达到准确基因诊断的目的。
本发明所具有的有益效果：
本发明对诊断IBMFS的敏感性及特异性均较高，可用于临床。
1)、本发明先天性骨髓衰竭性疾病诊断试剂盒的测序准确率为100％，可以作为临床标本测序的方法。
2)、本发明先天性骨髓衰竭性疾病诊断试剂盒不仅对疾病诊断的敏感性(96.4％)较传统方法(21.4％)高，而且更能进一步诊断出属于哪种先天性骨髓衰竭性疾病，这将为患者的诊断提供新的方法，为患者的治疗指明更加准确的方向，故值得临床推广应用。
附图说明
图1为实施例3中基因富集的流程图。
图2为实施例3生物信息学分析的流程图。
图3为通过第一代测序技术对患者王XX采用本发明方法测序的部分结果进行验证的测序峰图，其验证率为100％，提示测序结果可靠。灰色标记的为突变位点或突变开始位点，如箭头所指。
图4为实施例2的IBMFS诊断试剂盒对患者张XX诊断的测序结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
本发明实施例中所涉及的实验材料如下：
(一)研究对象
选取临床上有明显畸形、伴有骨髓衰竭性疾病的先天性骨髓衰竭性疾病患者28例，选取非先天性骨髓衰竭性疾病患者标本(阳性对照)及正常人标本(阴性对照)24例。各取外周血4ml，用乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, EDTA) 抗凝。
(二)主要试剂
1.AxyPrepTM Blood Genomic DNA Miniprep KIT      爱思进生物技术有限公司
2.红细胞裂解液                                  北京Solarbio公司
3.PBS缓冲液配制：
800mlddH2O中溶解8g NaCI、O.2g KCI、1.44g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4，用HCl调pH至7.4，加水定容至1L。
(三)主要仪器
实施例1
1、血液基因组DNA提取步骤：
(AxyPrepTM Blood Genomic DNA Miniprep KIT爱思进生物技术有限公司)
①加500μl Buffer AP1到1.5ml离心管中。
②加200-250μl抗凝全血到BufferAP1中，用移液器来回吸注几次，以彻底溶解残留在吸头上的血液。盖紧离心管盖子，旋涡振荡10s。
③加100μl Buffer AP2，旋涡振荡10s，12,000×g离心10min。
④将制备管置于2ml离心管(试剂盒内提供)中，将步骤③中的滤液加入到制备管中，12,000×g离心1min。
⑤弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加700μl Buffer W1A，室温放置2min。12,000×g离心30s。
⑥弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加800μl已加无水乙醇的Buffer W2，12,000×g离心1min。
⑦将制备管置回到原2ml离心管中，加500μl Buffer W2到制备管中，12,000×g离心1min。
⑧弃滤液，将制备管置回原2ml离心管，12,000×g离心1min。
⑨将制备管置于另一洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加80-200μl预热的Buffer TE，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱基因组DNA。
实施例2
IBMFS诊断试剂盒，包括279种经过生物素标记的基因探针：所述279种基因探针的序列分别为表2所述的UCSC数据库中的Dec.2013(GRCh38/hg38)数据库的基因编号对应的序列。所述279种基因探针均溶解在常规的TE溶液中，其最终浓度均为150ng/ul。
该试剂盒还包括：缓冲液HY、缓冲液BL、1X Binding缓冲液、2X Binding缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB2、洗涤缓冲液WB3、缓冲液Elute、缓冲液NE、说明书。
实施例3
目的基因测序(由北京迈基诺基因科技有限公司完成)
1)、构建基因组文库：取3ug实施例1所得标本基因组DNA，利用雾化法将DNA打断，每个打断的DNA序列长度为350-400个碱基。所选片段进行PCR扩增后，产物最终用AgilentBioanalyzer进行验证分析。
2)、基因的富集：利用实施例2的IBMFS诊断试剂盒中的基因捕获探针，对构建的基因组文库进行所选血液病基因的富集。具体流程如图1所示。
基因富集流程：将生物素标记的IBMFS相关基因捕获探针与1ug标本的DNA文库相混合，目标区域基因片段被杂交到探针上；进而通过生物素和streptavidin的磁珠结合被吸附到磁珠上；通过洗脱处理就能将非目标区域的DNA片段洗掉，得到所需要的目的基因。
3)、基因测序：经过富集的目标DNA用Illumina HiSeq2000测序仪进行测序,测序深度为200X。
生物信息学分析
利用Solexa QA软件包将低质量的测序数据滤去，利用cut adapt程序将接头序列滤去(http://code.google.com/p/cutadapt/)。最后依据human reference genome(hg19)数据库分析数据。具体流程如图2所示：
生物信息分析流程：
-参考基因组:UCSC hg19(http://genome.ucsc.edu/).
-序列比对数据库:SOAPaligner(http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html)
               Burrows-Wheeler Aligner(BWA)(http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml)
-突变类型检测方法:GATK and SOAPsnp(http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html)
-突变所参考数据库:dbSNP&1000G
具体分析流程如下所示：
SNP分析流程
(1)llumina HiSeq2000获取原始短序列；
(2)去除测序数据中的接头和低质量数据等；
(3)把短序列用SOAPaligner软件定位到人类基因组数据相应的位置上，所用到参数：soap2.20-a-b-t-v3-l42-s63-m100-x400，其中序列错配数为3，具体参数含义请参考：http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html；
(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；
(5)SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，所用到参数：soapsnp-i-d-o-r0.00005-e0.0001-M-t-u-L-s-2–T，具体参数含义请参考：http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；
(6)过滤低质量值(质量值>＝20)和低覆盖度(深度>＝10)的SNP；
(7)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；
(8)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs，在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs；
InDel分析流程
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到人类基因组上，所以到参数：bwa aln-L-l31-i10-k2-t7-e40，具体参数含义请参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；
(2)用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；
(3)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)；
(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels.
结果分析
测序结果的验证：
患儿王##，男性，,10岁，主因“诊断为范可尼贫血2年”，再次就诊于我院，本课题组曾因课题研究检测患儿全外显子，此次为证明诊断试剂盒测序的准确性，取此患儿的标本作为阳性对照，测序结果如表3所示，进一步经过一代测序后验证，其准确率达100％，如图3所示。
表3：所验证基因突变位点
√：杂合※：纯合
针对某一患者：
患儿张##，男性，9岁，主因“发现贫血、血小板减少6年”就诊。查体：可见中度贫血貌，浅表淋巴结未及明显肿大，心肺腹未见明显异常。行血常规检测示白细胞4.27×109/L，血红蛋白68g/L，血小板16×109/L；骨髓检查示：骨髓各系增生减低，骨髓小粒造血面积30％，以非造血细胞为主，三系增生减低骨髓象。行彗星及MMC检测结果为阳性，考虑为先天性骨髓衰竭性疾病。由于彗星及MMC实验仅能体现患者可能为某些先天性骨髓衰竭性疾病，如范可尼贫血、先天性角化不良等，但具体哪种类型并不能确定。我们采取实施例2的IBMFS诊断试剂盒测序后找出如下结果(如图4和表4)。其中FANCD1突变为已知突变基因报道(参考文献见：Choi,et al.J Clin Oncol,22,1638,2004.)，故患儿诊断为范可尼贫血FANCD1型)，患儿在诊断前已经使用药物治疗，但由于其原先诊断不明确，使用药物不当，致使目前病情加重，故我们建议其家属行骨髓移植术为患者治疗。这一案例充分说明，利用本发明诊断试剂盒对疾病做出更加确切的诊断，不仅对患儿的发病有本质的理解，而且可以指导患儿临床用药和治疗选择，从而使患者真正受益。
表4疾病相关的可疑突变位点
2分析52例患者临床表现及测序结果后，得出此种试剂盒的诊断特异性为100％，敏感性为96.4％，较彗星及MMC实验方法敏感性高，值得临床推广(表5)。
表5两种方法对诊断先天性骨髓衰竭性疾病的价值比较(％)

Claims (4)

1.一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的探针组合物，其特征在于：该探针组合物包括如下表1所示的279种经过生物素标记的基因探针：
表1
ABCA1 ITPKC EPOR RPL5 CASP10 NOP10 FOXO3a TBXAS1 ABCB7 JAK2 ESCO2 RPS10 CBL NOTCH3 FTL TCAB1 ABCC6 KLF4 ETV1 RPS17 CBL2 NPM1 FXYD2 TERC ABCC8 KLHDC8B ETV6 RPS19 CD36 NR3C2 G6PD TERT ABCG5 KLKB1 EZF RPS24 CDAN1 NRAS GAS1 TET2 ABCG8 KNG1 EZH2 RPS26 CETP NT5C3 GATA1 TF ADAMTS1 KRAS F11 RPS37 CFH OCT3 GFI1 THBD AK1 KRG2 F12 RUNX1 CFHR1 NHP2 GGCX THPO ALAD KRIT1 F13A1 SCN4A CFHR3 ORAI1 GK FOXC2 ALAS2 LAMA3 F13B SEC23B CFI OTC TBCE TINF2 ALDH2 LBR F5 SERPINC1 CFP EPB42 GP1BA TMPRSS6 ALDH4A1 LDLR F8 SERPINE1 CHL1 P2RY12 GP1BB TNFA ALDM LIPI F9 SERPINF2 CHLR1 PALB2 GP9 TNFRSF1A ALG12 LMAN1 FAAP100 SERPING1 CKS2 PANK2 GSS RPL35a ALS2 LMBRD1 FAAP24 SF1 CLDN16 PCCA HAMP TP53 ANK1 LPL FAM109A SF3A1 CLDN19 PCCB HBA1 TPP1 APOA1 MASTL FANCA SF3b1 CPN1 PDE4D HBA2 TRF1 APOA5 MCFD2 FANCB SH2D1A CSF3R ITGB3 HBB TRF2 APOB MDM2 FANCC SLC11A2 CST3 PLG HBG1 TRPM6 ARG1 MDS1 FANCD1 SLC25A38 CTC1 POT1 HBG2 TUBB1 ARSA MEFV FANCD2 SLC40A1 CYB5R3 PPOX HCFC2 U2AF1 ASXL1 MHF1 FANCE SLC4A1 CYCS PRF1 HFE U2AF2 ATAD3B MHF2 FANCF SLX4 CYP2A6 PROC HFE2 UBB ATRX MLH1 FANCG SMAD4 CYP2C9 PROS1 HK1 UNC13D B4GALT1 MMACHC FANCI SMARCAL CYP4F2 PRPF40B HMBS UNC18B BACH1 MMADHC FANCJ SND1 DAPK1 PTPMT1 HOX2F C16orf57 BCAM MPL FANCL SOX2 DCLRE1C PTPN11 HOXB4 VANGL2 BCORL1 MSH2 FANCM SPTA1 ZNF93 RAD51C HPD VHL BLM MTTP FANCN SPTB DNAH2 RAG1 HRG VKORC1 BMPR1A MYC FAS SRSF2 DNAH7 RAG2 IDH1 VWF ITK MYH9 FGA STIM1 DNMT3A RAP1 IDH2 WAS BRIP1 NAGA FKHRL1 STN1 EGF RARA IKAROS XIAP ZNF43 NBS1 FLI1 STX11 EGLN1 RNF55 IKBKG XRCC2 BTK NF1 FLT4 STXBP2 EPAS1 RPL11 IL6 ZNRF4 BUB1B NFKBIA FLVCR2 TAT EPB41 RPL26 ITGA2B
2.根据权利要求1所述一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的探针组合物，其特征在于：所述279种基因探针的序列分别为如下表2所述的UCSC数据库中的Dec.2013(GRCh38/hg38)数据库的基因编号对应的序列；
表2
ABCA1 ITPKC EPOR RPL5 CASP10 NOP10 FOXO3a TBXAS1 uc004bcl.3 uc002oot.4 uc002mrj.2 uc001doz.3 uc002uxj.1 uc001zie.1 uc003psm.2 uc003vvi.3 ABCB7 JAK2 ESCO2 RPS10 CBL NOTCH3 FTL TCAB1 uc004eca.4 uc003ziw.3 uc003xgg.3 uc021yyt.1 uc001pwe.4 uc002nan.3 uc002plo.3 uc010vuh.2 ABCC6 KLF4 ETV1 RPS17 CBL2 NPM1 FXYD2 TERC uc002den.4 uc004bdg.3 uc003ssw.4 uc003trd.3 uc001pwe.4 uc003mbi.3 uc021qqy.1 uc003ffr.1 ABCC8 KLHDC8B ETV6 RPS19 CD36 NR3C2 G6PD TERT uc031xgt.1 uc003cwh.3 uc001qzz.3 uc002ort.3 uc003uhg.4 uc003ilj.4 uc004fly.2 uc003jcb.1 ABCG5 KLKB1 EZF RPS24 CDAN1 NRAS GAS1 TET2 uc002rtn.3 uc003iyy.3 uc004bdg.3 uc001jzs.3 uc001zql.3 uc009wgu.3 uc004aox.4 uc003hxk.3 ABCG8 KNG1 EZH2 RPS26 CETP NT5C3 GATA1 TF uc002rtq.3 uc011bsa.2 uc003wfb.2 uc001sjf.3 uc002eki.2 uc003tdk.4 uc004dkq.4 uc003epv.2 ADAMTS1 KRAS F11 RPS37 CFH OCT3 GFI1 THBD uc002ymf.3 uc001rgp.2 uc003iza.1 uc001jvc.4 uc001gtj.4 uc003nsv.4 uc001dov.4 uc002wss.3 AK1 KRG2 F12 RUNX1 CFHR1 NHP2 GGCX THPO uc004bsm.4 uc001rjv.2 uc003mgo.4 uc010gmv.3 uc001gtn.3 uc003mir.3 uc002sps.3 uc003fol.1 ALAD KRIT1 F13A1 SCN4A CFHR3 ORAI1 GK FOXC2 uc011lxf.2 uc003ulu.1 uc003mwv.3 uc002jds.1 uc001gtn.3 uc031zps.1 uc003ird.3 uc002fjq.3 ALAS2 LAMA3 F13B SEC23B CFI OTC TBCE TINF2 uc004dua.4 uc002kuq.3 uc001gtt.1 uc002wrb.2 uc003hzr.4 uc004def.4 uc001hwz.2 uc001woa.4 ALDH2 LBR F5 SERPINC1 CFP EPB42 GP1BA TMPRSS6 uc001tst.3 uc001hoy.3 uc001ggg.1 uc001gjt.3 uc004dih.3 uc001zra.4 uc021tnz.1 uc032qno.1 ALDH4A1 LDLR F8 SERPINE1 CHL1 P2RY12 GP1BB TNFA uc001bbc.3 uc002mqk.4 uc004fmt.3 uc003uxt.4 uc003bot.3 uc003eyw.2 uc002zpv.2 uc003nui.4 ALDM LIPI F9 SERPINF2 CHLR1 PALB2 GP9 TNFRSF1A uc001tst.3 uc002yjm.3 uc004fas.1 uc002ftk.1 uc001qvy.1 uc002dlx.1 uc003elm.2 uc001qnu.3 ALG12 LMAN1 FAAP100 SERPING1 CKS2 PANK2 GSS RPL35a uc003biy.3 uc002lhz.3 uc002kaq.3 uc001nkr.1 uc004aqh.3 uc002wkc.3 uc002xbg.3 uc003fyr.3 ALS2 LMBRD1 FAAP24 SF1 CLDN16 PCCA HAMP TP53 uc002uyo.3 uc003pfa.3 uc002nud.4 uc001oaz.2 uc003fsi.3 uc001voo.3 uc002nyw.3 uc002gij.3 ANK1 LPL FAM109A SF3A1 CLDN19 PCCB HBA1 TPP1 uc003xom.3 uc003wzk.4 uc009zvu.3 uc003ahl.3 uc001cht.1 uc003eqy.2 uc002cfx.1 uc001mel.1 APOA1 MASTL FANCA SF3b1 CPN1 PDE4D HBA2 TRF1 uc001ppv.1 uc001itm.3 uc002fou.1 uc002uue.3 uc001kql.2 uc003jsa.3 uc002cfv.4 uc003xzd.2 APOA5 MCFD2 FANCB SH2D1A CSF3R ITGB3 HBB TRF2 uc009yzf.3 uc021vha.1 uc004cwh.1 uc004euf.5 uc001caw.2 uc002ilj.3 uc001mae.1 uc002exd.5 APOB MDM2 FANCC SLC11A2 CST3 PLG HBG1 TRPM6 uc002red.3 uc001sui.5 uc004avh.3 uc001rxk.2 uc002wtm.4 uc003qtm.4 uc001mah.1 uc022bib.1 ARG1 MDS1 FANCD1 SLC25A38 CTC1 POT1 HBG2 TUBB1
uc003qcp.2 uc011bpj.1 uc001uub.1 uc003cjo.2 uc002gkq.4 uc003vlm.3 uc001mah.1 uc002yak.3 ARSA MEFV FANCD2 SLC40A1 CYB5R3 PPOX HCFC2 U2AF1 uc003bmz.5 uc002cun.1 uc003buw.3 uc002uqp.4 uc011aps.2 uc001fyg.2 uc001tkj.4 uc002zdb.1 ASXL1 MHF1 FANCE SLC4A1 CYCS PRF1 HFE U2AF2 uc002wxs.3 uc021ogd.1 uc003oko.1 uc002igf.4 uc003sxl.3 uc001jrf.4 uc003nfx.1 uc002qlu.3 ATAD3B MHF2 FANCF SLX4 CYP2A6 PROC HFE2 UBB uc001afv.3 uc031rey.1 uc001mql.1 uc002cvp.2 uc002opl.4 uc002tok.3 uc001eni.2 uc001ugs.4 ATRX MLH1 FANCG SMAD4 CYP2C9 PROS1 HK1 UNC13D uc004ecp.5 uc003cgl.3 uc003zwb.1 uc010xdp.2 uc001kka.4 uc003drb.4 uc001jpl.4 uc002jpp.4 B4GALT1 MMACHC FANCI SMARCAL CYP4F2 PRPF40B HMBS UNC18B uc003zsg.2 uc009vxv.3 uc010bnp.1 uc002vgd.4 uc002nbs.1 uc001rus.2 uc001puz.1 uc010xjr.3 BACH1 MMADHC FANCJ SND1 DAPK1 PTPMT1 HOX2F C16orf57 uc002ynj.3 uc002txc.3 uc002izk.2 uc003vmi.3 uc004apc.4 uc001nfs.4 uc002inp.3 uc002emz.3 BCAM MPL FANCL SOX2 DCLRE1C PTPN11 HOXB4 VANGL2 uc002ozu.4 uc001ciw.3 uc002rzw.4 uc010nbi.3 uc001inn.4 uc001ttx.3 uc002inp.3 uc001fwc.2 BCORL1 MSH2 FANCM SPTA1 ZNF93 RAD51C HPD VHL uc022cdu.1 uc002rvy.2 uc001wwd.4 uc001fst.1 uc002non.3 uc002iwu.4 uc001ubj.3 uc003bvc.3 BLM MTTP FANCN SPTB DNAH2 RAG1 HRG VKORC1 uc002bpr.4 uc003hvc.4 uc002dlx.1 uc001xhr.3 uc002giu.1 uc001mwu.4 uc003fqq.4 uc002eas.3 BMPR1A MYC FAS SRSF2 DNAH7 RAG2 IDH1 VWF uc001kdy.3 uc003ysi.4 uc001kfr.3 uc002jsv.3 uc002utj.4 uc001mwv.4 uc002vct.4 uc001qnn.1 ITK MYH9 FGA STIM1 DNMT3A RAP1 IDH2 WAS uc003lwo.1 uc003apg.3 uc003iod.1 uc021qco.1 uc002rgc.4 uc001ebl.3 uc002box.3 uc004dkm.4 BRIP1 NAGA FKHRL1 STN1 EGF RARA IKAROS XIAP uc002izk.2 uc003bbw.4 uc003psm.2 uc001kxm.3 uc003hzy.4 uc002huk.2 uc003tow.4 uc010nqu.3 ZNF43 NBS1 FLI1 STX11 EGLN1 RNF55 IKBKG XRCC2 uc031rka.1 uc003yej.1 uc010sbu.2 uc003qks.4 uc001huv.2 uc001pwe.4 uc033fbu.1 uc003wld.3 BTK NF1 FLT4 STXBP2 EPAS1 RPL11 IL6 ZNRF4 uc010nno.3 uc002hgg.3 uc003mlz.4 uc010xjr.3 uc002ruv.3 uc001bhk.4 uc003svj.4 uc002mca.4 BUB1B NFKBIA FLVCR2 TAT EPB41 RPL26 ITGA2B uc001zkx.4 uc001wtf.4 uc001xrs.2 uc002fap.2 uc001brm.2 uc002glh.1 uc002igt.1
3.一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求1或2所述的探针组合物。
4.根据权利要求3所述一种用于诊断先天性骨髓衰竭性疾病的试剂盒，其特征在于：所述279种基因探针均溶解在TE缓冲液中，最终浓度均为150ng/ul。
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