CN107937513B - 新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法。本发明针对新生儿50种遗传病104种基因,并结合靶序列液相杂交捕获技术和半导体测序技术,设计了1347个探针捕获区域,基于所提供的探针捕获区域可根据常规方法设计获得相应的探针,实现新生儿50种遗传病有效筛查,其具有准确率高,特异性好,通量大的优势,拥有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因测序领域,更具体地涉及新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法。
背景技术
东莞市每年约有16万名新生儿出生,据统计出生缺陷发生率一直在2.6%左右,预计每年出生的缺陷儿在4000人左右。出生缺陷发生原因比较复杂,其中遗传病是主要原因之一,对于遗传导致出生缺陷,能通过新生儿筛查遗传性相关基因,实现早发现、早诊断、早治疗的目的,从而大幅度提高患者的生存质量、大大降低家庭和社会负担。
实现筛查的关键一方面需要满足大样本通量的要求,另一方面需要满足多检测位点或基因的要求,因此,高通量测序技术非常适用于遗传病筛查,可以有效扩大筛查覆盖率和检出率,准确分析遗传方式,预测再发风险,并且为用药提供指导。新生儿常见的遗传病很多,如苯丙酮尿症、酪氨酸血症、枫糖尿病、克拉伯病、结节性硬化症等等,这些遗传病往往与一个或多个基因突变相关,通过检测新生儿遗传病相关基因信息,分析其突变信息可实现筛查目的。探针杂交是基因捕获常用的技术之一,杂交探针是一小段DNA片段(十几到几百个碱基),用于捕获与其互补的目标序列。目前基于探针捕获的高通量测序已有应用于临床,通量大,费用更低,结果更可靠。
发明内容
本发明的目的在于提供新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法。
本发明的技术方案是:
一种新生儿遗传病基因检测探针组,所述探针组依据1347个捕获区域设计获得,所述捕获区域如表2所示。
一种新生儿遗传病基因筛查试剂盒,所述试剂盒含有上述新生儿遗传病基因检测探针组。
一种检测新生儿遗传病基因的测序文库构建方法,包括如下步骤:
(1)样品采集与提取:收集待测样品,提取基因组DNA;
(2)DNA片段化:将基因组DNA超声打断至100~500bp的DNA片段;
(3)末端修复与接头连接:对DNA片段进行末端修复及测序接头连接;产物进行纯化;
(4)杂交前扩增:将上一步纯化产物进行PCR扩增富集、纯化,获得用于杂交捕获的DNA文库;
(5)第一次探针捕获:将DNA文库进行杂交前封闭,采用上述检测探针组进行杂交捕获;
(6)目标区域富集:将第一次探针捕获产物洗脱,获得捕获的靶序列,将捕获的靶序列进行PCR扩增,获得富集的靶序列;
(7)第二次探针捕获与目标区域富集:将富集的靶序列作为第一次探针捕获步骤中的DNA文库,再进行一次探针捕获及目标区域富集,对第二次富集的靶序列进行纯化,获得待测序产物;
(8)将待测序产物进行二代测序,采用生物信息学分析测序结果。
作为上述测序文库构建方法的优选,所述步骤(1)中,待测样品品选自血斑、血液、肌肉组织。
作为上述测序文库构建方法的优选,所述步骤(3)和所述步骤(4)中,纯化为磁珠纯化,如实施例所用的Agencourt AMPure XP Kit。
作为上述测序文库构建方法的优选,所述步骤(4)中,PCR扩增富集的体系为:纯化产物40μL、接头引物10μL、NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix 50μL;反应条件为:98℃预变性30s;循环5次(98℃变性10s;58℃退火30s;72℃延伸30s);72℃延伸5min。
作为上述测序文库构建方法的优选,所述步骤(6)中,PCR扩增的体系为:捕获的靶序列33.5μL、5×HerculaseⅡReaction Buffer 10μL、dNTP mix(25mM each)0.5μL、接头引物5μL、HerculaseⅡFusion DNA Polymerasel 1μL;反应条件为:98℃预变性2min;循环5次(98℃变性30s;58℃退火30s;72℃延伸1min);72℃延伸5min。
其中,接头引物为适应测序平台接头的选择,如实施例中的接头引物是针对IonTorrent测序平台的A和P接头的接头引物。
作为上述测序文库构建方法的优选,所述步骤(6)中,洗脱采用Invitrogen公司的Dynabeads MyOne Streptavidin T1。
作为上述测序文库构建方法的优选,所述步骤(3)中,末端修复与接头连接采用NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent试剂盒。
作为上述测序文库构建方法的优选,所述步骤(8)中,二代测序采用半导体测序。
本发明的有益效果:
本发明针对新生儿50种遗传病104种基因,并结合靶序列液相杂交捕获技术和半导体测序技术,设计了1347个探针捕获区域(如表2所示),基于所提供的探针捕获区域可根据常规方法设计获得相应的探针,实现新生儿50种遗传病有效筛查,其具有准确率高,特异性好,通量大的优势,拥有广阔的应用前景。
具体实施方式
发明人结合靶序列液相杂交捕获技术和半导体测序技术,设计了一组新生儿50种遗传病基因检测探针,并提供了新生儿遗传病筛查方法。
实施例1、新生儿50种遗传病基因检测探针组
发明人经过查阅大量新生儿遗传病致病基因相关文献及数据库,获得了新生儿50种遗传病及其相关基因(详见表1),通过高通量的实验筛选及相关实验验证,最终优选出1347个探针捕获区域(捕获区域见表2所示),针对探针捕获区域的探针联合使用可用于检测新生儿50种遗传病致病基因;针对所设计的探针捕获区域的探针特异性强、灵敏度高,对新生儿遗传病致病基因缺失、重复、点突变的情况均能进行有效的检测。
表1、新生儿50种遗传病及其相关致病基因
表2、50种新生儿遗传病对应104个致病基因的捕获区域
实施例2、新生儿50种遗传病致病基因捕获和测序方法
(1)样品采集与提取:以东莞市第八人民医院提供的6例经临床确诊为新生儿遗传病的患者外周血为例,分别采用QIAamp DNA Blood Mini Kit进行基因组DNA提取;
(2)DNA片段化:将基因组DNA超声打断至100~500bp的DNA片段;
(3)末端修复与接头连接:使用NEBNext Fast DNA Library Prep Set for IonTorrent试剂盒对DNA片段进行末端修复及测序接头连接;产物用Agencourt AMPure XPKit纯化;
(4)杂交前扩增:将上一步纯化产物进行PCR扩增富集,PCR体系为:纯化产物40μL、接头引物10μL、NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix 50μL;反应条件为:98℃预变性30s;循环5次(98℃变性10s;58℃退火30s;72℃延伸30s);72℃延伸5min;PCR扩增产物用Agencourt AMPure XP Kit进行纯化,获得用于杂交捕获的DNA文库;
(5)第一次探针捕获:使用SureSelect TE Reagent Kit,PTN,16(Agilent)试剂盒,按说明书操作,将DNA文库进行杂交前封闭,获得已封闭的DNA文库;再将实施例1针对探针捕获区域的探针配制成探针混合液;与已封闭的DNA文库进行17小时的杂交捕获;
(6)目标区域富集:将第一次探针捕获产物使用Dynabeads MyOne StreptavidinT1(Invitrogen)进行洗脱,获得捕获的靶序列,将捕获的靶序列进行PCR扩增,获得富集的靶序列,PCR扩增体系为:捕获的靶序列33.5μL、5×HerculaseⅡReaction Buffer 10μL、dNTP mix(25mM each)0.5μL、引物5μL、HerculaseⅡFusion DNA Polymerasel 1μL;反应条件为:98℃预变性2min;循环5次(98℃变性30s;58℃退火30s;72℃延伸1min);72℃延伸5min;
(7)第二次探针捕获与目标区域富集:将富集的靶序列作为第一次探针捕获步骤中的DNA文库,再进行一次探针捕获及目标区域富集,第二次富集的靶序列用AgencourtAMPureXP Kit进行纯化,获得待测序产物;
(8)将待测序产物用Ion Torrent平台测序,采用生物信息学分析测序结果。
本实施例中,基因组DNA提取浓度及DNA文库浓度用Qubit定量,结果如表3所示。
表3、基因组DNA提取浓度及DNA文库浓度
本实施例中,待测序产物的Qubit定量和qPCR定量结果如表4所示。
表4、测序产物的Qubit定量和qPCR定量浓度
本实施例中,6份样本的新生儿50种遗传病的筛查结果,如表5所示。
表5、6份样本的新生儿50种遗传病的筛查结果
综上,根据本发明的探针捕获区域(如表2所示)设计相应的探针,即可实现新生儿50种遗传病的筛查。
以上所述仅为本发明的实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均落在本发明要求的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种新生儿遗传病基因检测探针组,其特征在于:所述探针组依据1347个捕获区域设计获得,所述捕获区域如下所示:
2.一种新生儿遗传病基因筛查试剂盒,其特征在于:所述试剂盒含有权利要求1所述的新生儿遗传病基因检测探针组。
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