CN105779590A - 一种用于人类线粒体基因检测的捕获探针组及试剂盒 - Google Patents
一种用于人类线粒体基因检测的捕获探针组及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105779590A CN105779590A CN201610151170.9A CN201610151170A CN105779590A CN 105779590 A CN105779590 A CN 105779590A CN 201610151170 A CN201610151170 A CN 201610151170A CN 105779590 A CN105779590 A CN 105779590A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- kit
- gene
- capture
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于人类线粒体基因检测的探针组及试剂盒,所述探针组可覆盖人类线粒体全基因组序列,探针序列为SEQ ID No:1‑213。本发明结合拥有自主知识产权的基因捕获测序技术,可以一次性检测出线粒体DNA的扩增,缺失,突变等基因变异信息,并且可同时处理多个样本,具有耗时短,成本低、特异性强的优点,可显著提高测序效果。本发明还提供一种用于人类线粒体全基因检测的试剂盒,所述试剂盒包含可检测线粒体全基因组的捕获探针及相关试剂,本发明的使用可为尽早采取正确、合理的干预提供依据,符合精准医疗的发展趋势。
Description
技术领域
本发明属于基因检测及分子遗传学领域,具体的说,具体涉及一种用于人类线粒体基因的捕获、测序的探针组及试剂盒。
背景技术
线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的、重要的细胞器。它是细胞进行氧化磷酸化的场所,参与能量代谢、细胞凋亡、维持细胞内钙铁离子平衡及其他生命活动的信号传导。人类线粒体DNA(mtDNA)全长为16596bp,为非常紧凑的环状双链DNA,外环为重链(H),内环为轻链(L),除有个1个与DNA复制其实有关的87bp的D环外,其他基因均无内含子。mtDNA共包含37个基因,这37个基因中有22个编码转移核糖核酸(tRNA)、2个编码核糖体核糖核酸(12S和16SrRNA)、12个编码多肽。动物模型和人类研究证据均证明,mtDNA突变是引起人类多因素疾病,部分遗传性疾病以及衰老的重要原因之一,因此线粒体DNA的研究是近20年来分子生物学研究的重要课题之一,如何准确快速的获得个体的线粒体基因全序列,对序列信息进行分析都有着极其重要的意义。
理想的遗传学检测线粒体基因突变是发现导致线粒体结构和功能缺陷的相关基因突变。线粒体基因突变可以是单个基因的缺失或者扩增,也可以是连续几个基因片段的缺失或扩增,还可以是某几个碱基的突变。直接测序目前为止是突变分析的金标准,目前临床上只能选择少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查,阳性率很低,大多数难以获得准确的检测结果,此外,这些位点的大多是基于其他人种的实验数据,中国人的基因突变位点和欧洲人的突变位点可能会有很大的区别,因此,现有的方法存在很大的局限性。无法完全满足目前线粒体基因突变的诊断需要。而传统的Sanger测序法,虽然可以实现对线粒体DNA全基因序列分析从而进行线粒体基因突变的检测及分析分析,但Sanger测序成本高,且测序背景较高,检测灵敏度有限,且无法同时处理大量样本,所以无法大规模的应用在临床的诊断上去。
综上所述,本发明提供了一种检测线粒体基因突变的捕获探针组及试剂盒,能够可以一次性分析出线粒体DNA的扩增,缺失,突变等信息,具有一次性处理多个样本,耗时短,成本低、特异性强的突出优点,意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测线粒体全基因组序列的捕获探针组及其试剂盒,所述探针组包含能特异性捕获全部线粒体基因的探针。可以全面、快速、准确的检测人类线粒体基因的多种突变类型。
一方面,本发明提供一种用于人类线粒体基因检测的探针组,所述探针组包含213个寡核苷酸探针,所述213个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.1-213所示。
所述具体探针序列为SEQIDNo:1-213。
另一方面,本发明提供一种用于一种检测线粒体全基因组序列的试剂盒。所述试剂盒包括:本发明所述的用于人类线粒体基因检测的探针组、富集缓冲液BL、富集缓冲液HY、文库富集结合缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB3、文库富集洗脱液、缓冲液NE、PCR反应液、产物纯化洗脱液。
本发明所提供的检测线粒体全基因组序列的方法,包括以下几个步骤:
①针对线粒体全基因组序列设计相应的捕获探针
②构建全基因组文库并使用步骤1中设计的捕获探针对线粒体DNA进行捕获
③将捕获并富集后的DNA上机测序,并进行后续的生物信息学分析。
首先从人体血液中提取3-5ugDNA,并将其打断,扩增,从而构建全基因组文库,我们将用我们开发的mtDNA全基因的捕获探针和待测样本的全基因组文库混合;待测样本mtDNA相关基因片段被杂交到探针上,进而通过生物素和streptavidin的磁珠结合被吸附到磁珠上;通过洗脱处理就能将非目标区域的DNA片段洗掉,从而富集疾病基因片段,这样线粒体全基因捕获试剂盒就将线粒体全基因捕获出来了,(可同时混合捕获多个样品),再利用新一代测序仪IlluminaHiSeq2000进行高通量测序得到线粒体DNA全序列并分析找出相关基因的所有突变信息,从而得到个体线粒体基因的变异情况。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明设计了可进行快速准确捕获人类线粒体基因组全序列的的探针组,能够提高检测特异性,测序结果对线粒体基因的覆盖度可以达到100%。
2、本发明灵敏度高,一次性分析出线粒体DNA的扩增,缺失,突变等信息。由于该方法是以DNA文库的方式进行捕获测序,因此,样品DNA的部分降解对最后的结果几乎不会产生影响,而过量的探针,保证了对目标片段的完全捕获,所以,即使可能出现的某些丰度较低的变异DNA也能被捕获并检测出来,其灵敏度相对于传统的Sanger测序要高出许多。为全面检测准确的进行人类线粒体突变基因检测提供了更好的平台。
3、本发明可以一次性处理多个样本,耗时短,成本低。对于多样本的处理,可以对样品加入不同的barcode进行区分,混合上机测序,大大提高了其检测的通量。也节约了成本,使直接测序对线粒体DNA基因进行诊断应用在临床上成为了可能。
附图说明
图1样本1线粒体全基因捕获测序检测基因突变。
图2样本2线粒体全基因捕获测序检测大片段缺失突变。
图3样本3线粒体全基因捕获测序检测大片段重复突变。
图4样本4线粒体全基因捕获测序检测基因纯合突变。
具体实施方式
以下通过实施案例对本发明作进一步阐述。
实施例1:本发明探针组的设计和制备
根据人类线粒体全基因序列,见附件。对每个区域中非重复区域设计78bp的探针序列,每个序列沿着基因位置挪动设计,探针之间的挪动大小了3bp。利用原位合成技术,大量合成设计的探针(MyGenostics.US),并利用PCR的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针,成为mtDNA全基因捕获探针组。
所述PCR方法具体为:
将上述合成的探针均匀混合在总体积1.2ml的dH2O中,取其中15μl利用通用的PCR引物(5’端序列为GACTACATGGGACAT、3’端的序列为GGAACCTACGACGTA),分三管进行PCR扩增,其中引物GACTACATGGGACAT为带有生物素标记的引物。
PCR扩增体系:底物DNA,5μl;正向引物(25μM),2μl;反向引物(25μM),2μl;MgCl2(50mM),4μl;10xPlatinumTaq缓冲液(购自LifeTechnologies),5μl;dNTPs(每种10mM),4μl;PlatinumTaq(5U/μl,购自LifeTechnologies),1μl;H2O,27μl;总体积50μl。
扩增条件:98℃,30s;(98℃,30s,60℃,25s,72℃,45s)35个循环;72℃,5min。
将PCR产物用MinElutePCR纯化试剂盒(购自LifeTechnologies)纯化后,取500ng,用MyOne亲和素磁珠(购自Invitrogen)将PCR产物结合下来。然后加入碱性NaOH将没有生物素的互补链变性、洗脱下来;然后将整个磁珠用100℃的甲酰胺液体洗涤,使探针从磁珠上分离下来。用乙醇沉淀后即得到生物素标记的本实施例的探针组,所述探针组的碱基序列如SEQIDNo.1-213所示。所述具体探针序列为SEQIDNo.:1-213。
实施例2:本发明试剂盒组成、制备及使用
本实施例所述的用于人类线粒体全基因组序列检测试剂盒,是通过检测线粒体全基因组的突变来进行分子遗传学检测的试剂盒。
所述试剂盒包含的成分为:实施例1所获得的探针组、缓冲液HY、缓冲液BL、文库富集结合缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB3、缓冲液NE、PCR反应液、产物纯化洗脱液。具体组成为:
所述试剂盒的使用方法为:
1.样本文库制备:
(1)超声片段化:起始量为3μg,用1×lowTEBuffer稀释到30ng/μL。采用CovarisS2超声仪进行超声片段化,按标准设定Covaris系统的值,6次循环×60s,水浴温度:5℃,占空比:20%,强度:5,模式:Frequencysweeping。
(2)末端补平:分别取100μL片段化的DNA、8μLdNTPs、2μLEndPolishing酶Ⅰ(10U/μL,Agilent)、16μLEndPolishing酶Ⅱ(5U/μL,Agilent),加水到总体积200μL。25℃孵育30min。用PureLinkPCR纯化试剂盒(Invitrogen)纯化DNA。
(3)连接P1和P2接头:Illumina接头1(P1eA)50μmol/L和接头2(P2eA)50μmol/L各26μL(Illumina),末端补平的DNA48μL,T4DNA连接酶10μL(50U),加水到总体积200μL,室温孵育15min。产物纯化。采用预制的2%SizeSelectGel(AppliedBiosys-tems),放到E-GeliBase上。连接纯化后的DNA片段分3份各20μL加入上样孔,分子量对照用0.2μg的50bpladder,无样品孔及回收孔分别用20μL、25μL水填满,电泳约12min,吸出进入样品回收孔的150~200bp之间的DNA片段。
(4)DNA片段回收:采用预制的2%SizeSelectGel(AppliedBiosys-tems),放到E-GeliBase上。连接纯化后的DNA片段分3份各20μL加入上样孔,分子量对照用0.2μg的50bpladder,无样品孔及回收孔分别用20μL、25μL水填满,电泳约12min,吸出进入样品回收孔的150~200bp之间的DNA片段。
(5)缺口平移:回收的纯化片段需要采用切口平移法进行文库模板量的平衡的线性扩增。每100μL回收样品加400μL的mastermix(Agilent),按程序进行反应:72℃20min,95℃5min;然后95℃15s,54℃15s,70℃1min进行10到12个循环;70℃再延伸5min;4℃保存。纯化产物并定量,取1μL样本产物进行FlashGel(2.2%,Lonza公司)电泳,约10min。
2.样本富集杂交:
(1)杂交液制备:4μgDNA基因文库(20ul,200ng/μl)、13ul缓冲液BL、5μlGenCapTM混匀并放置在95℃7分钟,65℃2分钟,(注:探针必须在95℃的条件下加热)再加入22μl预热的缓冲液HY(65℃预热,使用前充分震荡重悬沉淀)。65℃杂交22小时。
注:缓冲液HY的体积根据所制备文库体积调整而调整,调整比例为HY缓冲液体积=总体积/1.8
(2)纯化:此步骤所用的缓冲液除了WB2外,均室温放置。
1)取1.5ml离心管,加入50ulMyOne磁珠,剧烈震荡至少5秒,短暂离心收集管壁的液体,将离心管放置在磁力架(例如:DynaMag)上1分钟;
2)保持离心管在磁力架上不动,弃清液;
3)取下离心管,加入50ul1XBinding缓冲液,剧烈震荡至少5秒,短暂离心收集管壁的液体,将将离心管放置在磁力架上1分钟,保持离心管在磁力架上不动,齐清液;
4)重复第三步两次(共三次洗涤);
5)用80ul1XBinding缓冲液重悬沉淀,剧烈震荡至少5秒,轻旋收集管壁的液体;
6)向杂交液中加入等体积Binding缓冲液,并转移进第五步所得的液体中。(总体积约200ul);
7)剧烈震荡混合液至少5秒钟,室温放置于旋转混匀仪上一小时;
8)剧烈震荡混合液至少5秒钟,短暂离心,并放置于磁力架上1分钟;
9)保持离心管于磁力架上,弃清液;
10)加入0.5ml洗涤缓冲液WB1,剧烈震荡混匀至少5秒,室温放置在旋转混匀仪上15分钟;
11)取下离心管,剧烈震荡至少5秒,短暂离心,放置于磁力架上一分钟;
12)保持离心管在磁力架上,弃清液;
13)加入0.5ml洗涤缓冲液WB3,剧烈震荡至少5秒;
14)将离心管至于恒温混匀仪(65℃,850rpm)15分钟;
15)重复步骤11-14四次(共5次WB3洗涤);
16)剧烈震荡5秒,短暂离心,放置于磁力架上一分钟;
17)保持离心管至于磁力架上,彻底弃清液;
18)加入50μlElute缓冲液重悬沉淀,剧烈震荡至少5秒,置于旋转混匀仪上至少10分钟;
19)取下离心管,震荡混匀5秒,短暂离心,置离心管于磁力架上1分钟;
20)将清液转移至加有70ulNE缓冲液的1.5ml离心管中;
21)用QIAquickMinElute试剂盒纯化所得溶液,最后得体积20μl模板DNA。
3.样本富集
(1)PCR反应体系
注:引物A为IlluminaforwardprimerPCRPE1.0,引物B为lluminareverseprimerPCRPE2.0,酶为HotstartPhusionenzyme(NewEnglandBiolabs);
(2)PCR循环条件:98℃预变性30秒;15个循环:98℃25秒,65℃30秒72℃30秒;72℃5分钟;4℃0分~1小时;
(3)PCR产物经由NucleoSpin纯化试剂盒纯化,最终产物由65℃预热的Elute缓冲液17.5μl分两次洗脱,最终得35ul富集DNA;
注:不同的纯化方法获得的产物浓度会有差别。根据不同的纯化方法,可是适当调整PCR的循环数。
(4)产物经1%琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop测浓度并做定量PCR。
4.以上得到的DNA通过IlluminaHiSeq2000测序,得到测序的数据。
5.SNP分析流程
(1)lluminaHiSeq2000获取原始短序列;
(2)去除测序数据中的接头和低质量数据等;
(3)把短序列用SOAPaligner软件定位到人类基因组数据相应的位置上,所用到参数:soap2.20-a-b-t-v3-l42-s63-m100-x400,其中序列错配数为3,具体参数含义请参考:http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html;
(4)统计测序结果信息,短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等;
(5)SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型,所用到参数:soapsnp-i-d-o-r0.00005-e0.0001-M-t-u-L-s-2-T,具体参数参考http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html;
(6)过滤低质量值(质量值>=20)和低覆盖度(深度>=10)的SNP;
(7)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对SNP进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等;
(8)根据待测样品和正常样品信息,选出待测样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs,在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时,过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后相关的候选SNPs。
6.InDel分析流程
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-WheelerAligner(BWA)比对到人类基因组上,所以到参数:bwaaln-L-l31-i10-k2-t7-e40,具体参数含义请参考:http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml;
(2)用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息;
(3)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对InDel进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变);
(4)根据待测样品和正常样品信息,选出待测样品所共有的而在正常组中不存在InDel作为候选的InDels,在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel,最后筛选出相关的候选InDels。
7.大片段扩增/缺失分析流程
(1)lluminaHiSeq2000获取原始短序列;
(2)去除测序数据中的接头和低质量数据等;
(3)把短序列用SOAPaligner软件定位到人类基因组数据相应的位置上,所用到参数:soap2.20-a-b-t-v3-l42-s63-m100-x400,其中序列错配数为3,具体参数含义请参考:http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html;
(4)统计目标区域覆盖大小,然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标,每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图,得出扩增和缺失的分析图。
实施例3:本发明试剂盒的使用效果验证
本次发明的试剂盒为国内唯一的用于线粒体全基因组捕获的试剂盒,相比于国外同类型试剂盒成本低,且检测突变的极限能达到0.01%。本次发明及所使用的试剂盒能够对线粒体全基因进行基因诊断,结果每例线粒体全基因组都实现了100%覆盖。准确的检测出突变缺失、重复,结果均和临床上的反应完全一致。
利用本发明所述试剂盒检测4例线粒体基因变异样本和正常人样本,签署书面的知情同意书。结果证实50%以上的原始短序列都能被比对回目标区域的参考序列,目标区域的平均有效测序数据量达到200Mb,目标区域的平均测序深度为300X,远远高于一般的遗传诊断要求(一般为100X)。
我们用本次发明的方法以及试剂盒对样本进行了处理和分析,结果显示:
1、一例线粒体基因突变检测
该样本经由本发明的线粒体全基因捕获测序,检测每个>2%以上的突变位点。线粒体全基因捕获测序结果显示,在明确的致病位点3243上发现A>G突变,突变频率为10.555%(如图1所示)。
2、一例线粒体基因大片段缺失检测
线粒体出现大片段缺失突变,通常在幼年便死亡,极少数存活至成年。该样本采用本发明的线粒体全基因捕获测序试剂盒进行检测,发现在线粒体全基因组中存在大片段(缺失如图2所示)。本发明试剂盒的应用有效地检测线粒体基因变异,可以为患儿的尽早、合理干预、治疗提供依据。
3、一例线粒体基因大片段重复突变检测
利用本发明的线粒体全基因捕获测序试剂盒进行检测发现,出现大片段重复(如图3所示),从测序原始图分析该患者的线粒体基因组存在明显的重复突变,重复位点为7294-7393区域有扩增(COI基因)。本发明的试剂盒的应用能够快速、准确的检测到少见的线粒体变异信息,可有效的提高线粒体基因检测效率。
4、一例线粒体基因纯合突变检测
该样本为1岁内不明原因死亡的孩子之前的遗留样本,利用本发明的线粒体全基因捕获测序试剂盒检测发现了该样本中DGUOK基因纯合突变。寻问中发现其父母有远亲关系。之后对再次怀孕的母亲进行胎儿羊水诊断发现为杂合携带者,不致病,鉴于首诊患儿的分子遗传学诊断已经明确,针对胎儿的相应基因进行目的性明确的检测以避免罹患相同综合征的患者出生。
综上所述,本发明提供的用于人类线粒体全基因检测的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点,可以同时检测突变、缺失、重复等各种类型突变,因此本发明的探针组和试剂盒可应用于分子遗传学检测。本发明的使用可以为尽早确立采取正确、合理的干预、治疗措施提供依据,符合精准医疗的发展趋势。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于检测人类线粒体全基因组的探针序列,其特征在于:所述探针为DNA序列,所述探针根据人类线粒体基因的全基因组区序列设计,所述具体探针序列为SEQIDNo:1-213,每条探针长度为78bp的寡核苷酸。
2.根据权利要求1的探针序列,其特征在于:所述具体探针序列为SEQIDNo:1-213。
3.一种检测人类线粒体基因的捕测序方获法,其特征在于:利用权利要求2所述的探针进行杂交捕获和测序分析。
4.根据权利要求3所述的方法,具体步骤为:
1)制备DNA全基因组文库:将从待测样品和对照正常样品中提取的DNA,将其打断,扩增,从而建立含人类线粒体相关目标基因区的全基因组文库;
2)捕获目标基因区域;
3)基因测序:利用新一代测序仪进行高通量测序;
4)基因序列的生物信息分析。
5.根据权利要求4的方法,其特征在于:其中步骤2)中的所述的捕获目标基因区域具体步骤为:
1)捕获探针的设计与制备;2)目标基因的杂交捕获;其中步骤3)中的测序采用第二代测序技术—如IlluminaNexseq500测序平台,LifeTech公司的IonProton测序仪等平台,从而获得样本中的核酸分子的核苷酸序列;其中步骤4)中所述的生物信息学分析具体为对DNA突变和扩增缺失进行分析。
6.一种人类线粒体基因多种突变检测分析试剂盒,其特征在于:所述试剂盒含有权利要求1中所述人类线粒体基因的全基因组捕获探针组、富集缓冲液BL、富集缓冲液HY、文库富集结合缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB3、文库富集洗脱液、缓冲液NE、PCR反应液、产物纯化洗脱液,用于对线粒体全基因组捕获产物进行检测。
7.如权利要求6所述的探针在制备检测人类线粒体基因多种突变的试剂盒中的应用。
8.一种如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于:在检测人类线粒体基因多种突变中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610151170.9A CN105779590A (zh) | 2016-03-16 | 2016-03-16 | 一种用于人类线粒体基因检测的捕获探针组及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610151170.9A CN105779590A (zh) | 2016-03-16 | 2016-03-16 | 一种用于人类线粒体基因检测的捕获探针组及试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105779590A true CN105779590A (zh) | 2016-07-20 |
Family
ID=56393843
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610151170.9A Pending CN105779590A (zh) | 2016-03-16 | 2016-03-16 | 一种用于人类线粒体基因检测的捕获探针组及试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105779590A (zh) |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107312776A (zh) * | 2017-08-07 | 2017-11-03 | 杭州祥音生物医药科技有限公司 | 用于构建人类线粒体dna文库的预捕获引物、捕获探针及构建方法、测序方法和应用 |
CN108265103A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-10 | 华中农业大学 | 一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒及其应用 |
CN109371119A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-02-22 | 北京纳诺基生物医药科技有限公司 | 用于检测人类线粒体dna删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法 |
CN109628573A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-04-16 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 一种用于无创产前检测12种染色体微缺失微重复综合征的试剂盒及其专用探针组 |
CN111118226A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-05-08 | 北京微未来科技有限公司 | 一种新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒 |
CN111172159A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-05-19 | 佛山科学技术学院 | 一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒 |
CN111304196A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-06-19 | 佛山科学技术学院 | 一种水牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒 |
CN111378735A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-07-07 | 迈基诺(重庆)基因科技有限责任公司 | Sma致病基因捕获试剂盒及应用 |
CN112301098A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-02-02 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 人线粒体dna全序列扩增的方法以及用于人线粒体dna全序列扩增的试剂盒 |
CN112322783A (zh) * | 2020-10-19 | 2021-02-05 | 郑州大学 | 一种用于乙肝病毒基因检测的捕获探针组 |
CN113308526A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-08-27 | 北京爱普益生物科技有限公司 | 融合引物直扩法人类线粒体全基因组高通量测序试剂盒 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103173441A (zh) * | 2013-02-05 | 2013-06-26 | 深圳华大基因研究院 | 线粒体全基因组dna扩增、引物、测序及突变检测 |
CN103305619A (zh) * | 2013-06-26 | 2013-09-18 | 北京迈基诺基因科技有限责任公司 | 一种线粒体病基因的筛查方法 |
CN104278022A (zh) * | 2014-09-12 | 2015-01-14 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种dna捕获探针的制备方法及应用 |
-
2016
- 2016-03-16 CN CN201610151170.9A patent/CN105779590A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103173441A (zh) * | 2013-02-05 | 2013-06-26 | 深圳华大基因研究院 | 线粒体全基因组dna扩增、引物、测序及突变检测 |
CN103305619A (zh) * | 2013-06-26 | 2013-09-18 | 北京迈基诺基因科技有限责任公司 | 一种线粒体病基因的筛查方法 |
CN104278022A (zh) * | 2014-09-12 | 2015-01-14 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种dna捕获探针的制备方法及应用 |
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108265103A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-10 | 华中农业大学 | 一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒及其应用 |
CN108265103B (zh) * | 2016-12-30 | 2021-07-09 | 华中农业大学 | 一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒及其应用 |
CN107312776A (zh) * | 2017-08-07 | 2017-11-03 | 杭州祥音生物医药科技有限公司 | 用于构建人类线粒体dna文库的预捕获引物、捕获探针及构建方法、测序方法和应用 |
CN109371119A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-02-22 | 北京纳诺基生物医药科技有限公司 | 用于检测人类线粒体dna删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法 |
CN109628573A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-04-16 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 一种用于无创产前检测12种染色体微缺失微重复综合征的试剂盒及其专用探针组 |
CN111378735A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-07-07 | 迈基诺(重庆)基因科技有限责任公司 | Sma致病基因捕获试剂盒及应用 |
CN111378735B (zh) * | 2018-12-28 | 2023-04-25 | 迈基诺(重庆)基因科技有限责任公司 | Sma致病基因捕获试剂盒及应用 |
CN111304196A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-06-19 | 佛山科学技术学院 | 一种水牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒 |
CN111172159A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-05-19 | 佛山科学技术学院 | 一种牛属动物线粒体基因组捕获探针试剂盒 |
CN111118226A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-05-08 | 北京微未来科技有限公司 | 一种新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒 |
CN112322783A (zh) * | 2020-10-19 | 2021-02-05 | 郑州大学 | 一种用于乙肝病毒基因检测的捕获探针组 |
CN112301098A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-02-02 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 人线粒体dna全序列扩增的方法以及用于人线粒体dna全序列扩增的试剂盒 |
CN113308526A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-08-27 | 北京爱普益生物科技有限公司 | 融合引物直扩法人类线粒体全基因组高通量测序试剂盒 |
WO2023284768A1 (zh) * | 2021-07-13 | 2023-01-19 | 北京爱普益生物科技有限公司 | 融合引物直扩法人类线粒体全基因组高通量测序试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105779590A (zh) | 一种用于人类线粒体基因检测的捕获探针组及试剂盒 | |
CN109797212B (zh) | 一种检测肺动脉高压的致病/易感基因的方法 | |
CN106834507B (zh) | Dmd基因捕获探针及其在dmd基因突变检测中的应用 | |
CN106834502A (zh) | 一种基于基因捕获和二代测序技术的脊髓性肌萎缩症相关基因拷贝数检测试剂盒及方法 | |
CN105671176A (zh) | 一种用于检测alk融合断裂点的探针组及试剂盒 | |
CN104498614B (zh) | 假肥大型肌营养不良症的检测探针及其无创检测试剂盒 | |
CN109371123B (zh) | 用于检测自身炎症性疾病致病基因的探针组及试剂盒 | |
US20210024999A1 (en) | Method of identifying risk for autism | |
CN106591273A (zh) | 一组与先天性代谢缺陷病相关的基因新突变及检测试剂盒 | |
CN107937513B (zh) | 新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法 | |
WO2015069954A1 (en) | Targeted screening for mutations | |
CN109852689A (zh) | 一组脉管畸形相关的生物标志物及相关检测试剂盒 | |
JP2022522565A (ja) | 短タンデム反復領域の変動を決定するための配列グラフ系ツール | |
CN109880895A (zh) | 一种探针组及其应用 | |
CN103290136A (zh) | 一种脑白质病基因的筛查方法 | |
CN103290135A (zh) | 一种自闭症基因的筛查方法 | |
CN105803054A (zh) | 试剂盒及其在检测唇腭裂相关基因中的用途 | |
CN105838720B (zh) | Ptprq基因突变体及其应用 | |
CN104232649A (zh) | 基因突变体及其应用 | |
CN104120186B (zh) | 先天性甲状腺功能减低症多基因测序引物及检测方法 | |
CN104232650B (zh) | 特发性基底节钙化新的致病基因及其编码蛋白质和应用 | |
CN112226440B (zh) | 一种遗传性原发不孕的致病突变及其检测试剂 | |
CN113564266B (zh) | Snp分型遗传标记组合、检测试剂盒及用途 | |
CN103509801B (zh) | 骨骼肌氯离子通道基因突变体及其应用 | |
CN107385076B (zh) | 一种甲状腺功能减退致病基因突变及基于此基因突变的诊断试剂 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160720 |