CN103290135A - 一种自闭症基因的筛查方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速准确且能够覆盖最新的自闭症基因的所有外显子区域的自闭症基因的筛查方法。本发明的基本方案是从个体中抽取3-5ml的血液，从血液中提取3-5ugDNA，并将其打断，扩增，从而构建病人的全基因组文库，然后利用本发明的自闭症基因扫描试剂盒对相关致病基因进行捕获，然后利用新一代测序仪进行高通量测序，分析找出这些基因相关的突变信息，从而得到个体的自闭症相关基因的突变情况，已达到准确的基因诊断的目的。

Description

一种自闭症基因的筛查方法

技术领域

本发明涉及一种基因筛查方法，尤其是一种自闭症基因的筛查方法。

背景技术

自闭症这种疾病被认为是目前世界范围内影响儿童最严重的公共健康问题之一。现在，全球每20分钟就有一个孩子被诊断为自闭症，自闭症患者已达6700万。中国的自闭症患儿也已经超过100万，且患病率逐年上升，未被诊断发现和有自闭症倾向的孩子可能更多。美国国家精神卫生学院保守估计美国自闭症的发病率为每一千人有五至六人。总计男性患自闭症的比率，比女性高三至四倍，但女性发病时病征会较男性严重。联合国发布的数据表明，自闭症的发病率为1/150。病征需要在三岁前出现。自闭症是一种很难及时诊断的终身疾病，如今这种病的基因缺陷已被找到。人类染色体16pl1.2区域重复发生的小片段异常，导致自闭症发病风险急剧增高。属于外显子组CHD8、SNC2A和KATNAL2三个基因是自闭症的关键基因。并发现增加患风险的不是突变基因的规模，而是突变基因的位置。

对于此类智力落后相关的复杂性疾病成因，常常需要进行多方面多因素分析，基因组拷贝数变异(copy number variations，CNVs)就是其中的致病原因之一。基因组拷贝数变异CNVs是指染色体某段区域发生的重复(duplication)或者缺失，它与点突变(point mutation)的区别是前者是基因组某一段区域发生重复或缺失，而后者是基因组某一个位点发生变异。

目前研究发现某些疾病与点突变有关，如很多单基因疾病；而有些疾病与基因组拷贝数的变化有关，比如一些三体综合症、1q21微缺失综合征以及Miller-Dieker综合征等；更多情况下很多复杂性疾病由点突变和拷贝数变异共同组成其致病原因，如孤独症，先天性心脏病等。

基因检测是早期发现孩子患有自闭症的有效手段。目前第一线的遗传诊断方法(染色体核型分析)只能诊断出2，23％的儿童孤独症患者，采用染色体微阵列分析，即以基因芯片技术为基础的基因检测对整个基因组序列进行的检查，使自闭症的基因诊断效率一下提升到7.3％。近些年来，随着测序技术的飞跃式的发展，自闭症的基因诊断已成为近年自闭症研究的热点领域。随着分子生物学的发展，特别是人类基因组计划的顺利实施，人类基因组序列在不断的在被解读和剖析，不断有新的相关基因功能被识别，自闭症的发生发展有了很深入的了解。通过基因诊断，就能早期筛查出患自闭症的婴幼儿，并采取相应的干预措施，这对自闭症治疗是非常有意义的。这一成果开创了将基因捕获测序检测应用于儿童自闭症早期诊断的先河。

发明内容

本发明提供了一种预测性好、准确度高的自闭症基因的筛查方法。

实现本发明目的的一种自闭症基因的筛查方法，包括制作自闭症基因扫描试剂盒的方法和试剂盒筛查方法：

所述制作自闭症基因扫描试剂盒的方法包括如下步骤：

(1)根据人类基因组HG19，调取如下基因的外显子序列，即自闭症扫描基因列表：

此区域包含了所有自闭症基因的基因区域，以及已知各个transcript的启动子区域；

(2)对每个区域中非重复区域设计60bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小3bp；

(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针，并制作自闭症基因扫描试剂盒；

所述试剂盒筛查方法包括如下步骤：

从病人血液中提取3-5ug DNA，并将其打断，扩增，从而构建病人的全基因组文库，然后利用所述自闭症基因扫描试剂盒将目的基因捕获出来，再采用测序仪(IlluminaHiSeq2000)进行高通量测序，进而分析，找出这些疾病相关基因的所有突变信息，从而得到找到个体自闭症基因的变异情况，以达到准确基因诊断的目的。

采用测序仪(IlluminaHiSeq2000)进行高通量测序，分析的过程包括单核苷酸多态性分析(SNP分析)过程、插入缺失标记分析(InDel分析)流程和大片段扩增确实分析流程；

所述单核苷酸多态性分析(SNP分析)过程包括如下步骤：

(1)测序仪(IlluminaHiSeq2000)获取原始短序列；

(2)去除测序数据中的接头和低质量数据；

(3)把短序列(用SOAPaligner软件)定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数：soap2.20 -a -b -t -v 3 -l 42 -s 63 -m 100 -x 400，其中序列错配数为3)；

(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；

(5)过滤低质量值(质量值＞＝20)和低覆盖度(深度＞＝10)的单核苷酸；

(6)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对单核苷酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核苷酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核苷酸影响蛋白功能预测；

(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核苷酸作为候选的单核苷酸，在候选的单核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核苷酸。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核苷酸作为最后疾病相关的候选单核苷酸；

所述插入缺失标记分析(InDel分析)流程包括如下步骤：

(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到人类基因组上(所以到参数：bwaaln -L -l 31 -i 10 -k 2 -t 7-e 40)；

(2)(用GATK软件)找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；

(3)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)；

(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels；

所述大片段扩增确实分析流程包括如下步骤：

(1)测序仪(IlluminaHiSeq2000)获取原始短序列；

(2)去除测序数据中的接头和低质量数据；

(3)把短序列(用SOAPaligner软件)定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数：soap2.20 -a -b -t -v 3 -l 42 -s 63 -m 100 -x 400，其中序列错配数为3)；

(4)统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图。

本发明的一种自闭症基因的筛查方法的有益效果如下：

本发明的一种自闭症基因的筛查方法，是以DNA文库的方式进行捕获测序，因此，样品DNA的部分降解对最后的结果几乎不会产生影响，而过量的探针，保证了对目标片段的完全捕获。所以，即使可能出现的某些丰度较低的变异DNA也能被捕获并检测出来，其灵敏度相对于传统的sanger测序要高出许多。本方法对样本的质量要求不高，即使是石蜡包埋的样本也能满足测序的需要。相比于临床上传统的病理学诊断而言，本方法有以下优势：

1、对个体伤害小；本方法只需抽取个体少量的血液(3-5ml)既可完成整个的诊断流程，而不需要取个体患处的组织或细胞。

2、预测性强；临床诊断通常只能在患者身体已经出现病理改变(出现肿块，蛋白改变)时做出诊断，因此，临床上肿瘤患者的发现，特别是恶性肿瘤，往往发现时病人已经处于中晚期。而基因诊断不仅可以对已患病的个体进行准确的诊断，还可以根据高频突变基因的情况对个体未来可能的患病情况进行预测。

3、准确度高；本方法的提供的自闭症基因捕获试剂盒覆盖了目前最新的自闭症基因的所有外显子区域，能检测每个位点0.5％以上的及基因突变。

具体实施方式

本发明的一种自闭症基因的筛查方法，包括如下步骤：

1.样本文库制备：

1.1)超声片段化：起始量为3μg，用1×low TE Buffer稀释到30ng/μL。采用Covaris S2超声仪进行超声片段化，按标准设定Covaris系统的值，6次循环×60s，水浴温度：5℃，占空比：20％，强度：5，模式：Frequencysweeping。

1.2)末端补平：分别取100μL片段化的DNA、8μL dNTPs、2μL EndPolishing酶I(10U/μL，Agilent)、16μL End Polishing酶II(5U/μL，Agilent)，加水到总体积200μL。25℃孵育30min。用PureLink PCR纯化试剂盒(Invitrogen)纯化DNA。

1.3)连接P1和P2接头：SOLiD接头1(PleA)50μmol/L和接头2(P2eA)50μmol/L各26μL(Applied Biosystems)，末端补平的DNA48μL，T4DNA连接酶10μL(50U)，加水到总体积200μL，室温孵育15min。产物纯化。采用预制的2％SizeSelect Gel(Applied Biosys-tems)，放到E-GeliBase上。连接纯化后的DNA片段分3份各20μL加入上样孔，分子量对照用0.2μg的50bp ladder，无样品孔及回收孔分别用20μL、25μL水填满，电泳约12min，吸出进入样品回收孔的150～200bp之间的DNA片段。

1.4)DNA片段回收：采用预制的2％SizeSelect Gel(AppliedBiosys-tems)，放到E-Gel iBase上。连接纯化后的DNA片段分3份各20μL加入上样孔，分子量对照用0.2μg的50bp ladder，无样品孔及回收孔分别用20μL、25μL水填满，电泳约12min，吸出进入样品回收孔的150～200bp之间的DNA片段。

1.5)缺口平移：回收的纯化片段需要采用切口平移法进行文库模板量的平衡的线性扩增。每100μL回收样品加400μL的master mix(Agilent)，按程序进行反应：72℃ 20min，95℃ 5min；然后95℃ 15s，54℃ 15s，70℃1min进行10到12个循环；70℃再延伸5min；4℃保存。纯化产物并定量，取1μL样本产物进行Flash Gel(2.2％，Lonza公司)电泳，约10min。

2.样本富集液相杂交，以上得到的DNA通过Illumina HiSeq2000测序，得到测序的数据。

3.SNP分析流程

lluminaHiSeq2000获取原始短序列；

去除测序数据中的接头和低质量数据等；

(3)把短序列用SOAPaligner软件定位到人类基因组数据相应的位置上，所用到参数：soap2.20 -a -b -t -v 3 -l 42 -s 63 -m 100 -x 400，其中序列错配数为3；

(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；

(5)SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，所用到参数：soapsnp -i-d -o -r 0.00005 -e0.0001 -M -t -u -L -s -2 -T，具体参数含义请参考：http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；

(6)过滤低质量值(质量值＞＝20)和低覆盖度(深度＞＝10)的SNP；

利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；

(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs，在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs；

4.InDel分析流程

(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到人类基因组上，所以到参数：bwaaln -L -l 31 -i 10 -k 2 -t 7-e 40；

(2)用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；

利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)；

(3)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels.

5.大片段扩增确实分析流程

(1)lluminaHiSeq2000获取原始短序列；

(2)去除测序数据中的接头和低质量数据等；

(3)把短序列用SOAPaligner软件定位到人类基因组数据相应的位置上，所用到参数：soap2.20 -a -b -t -v 3 -l 42 -s 63 -m 100 -x 400，其中序列错配数为3；

(4)统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图。

上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种自闭症基因的筛查方法，包括制作自闭症基因扫描试剂盒的方法和试剂盒筛查方法：

所述制作自闭症基因扫描试剂盒的方法包括如下步骤：

(1)根据人类基因组HG19，调取如下基因的外显子序列，即自闭症扫描基因列表：

(2)对每个区域中非重复区域设计60bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小3bp；

(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针，并制作自闭症基因扫描试剂盒；

所述试剂盒筛查方法包括如下步骤：

从病人血液中提取3-5ug DNA，并将其打断，扩增，从而构建病人的全基因组文库，然后利用所述自闭症基因扫描试剂盒将目的基因捕获出来，再采用测序仪进行高通量测序，进而分析，找出这些疾病相关基因的所有突变信息，从而得到找到个体自闭症基因的变异情况，以达到准确基因诊断的目的。

2.根据权利要求1所述的一种自闭症基因的筛查方法，其特征在于：采用测序仪进行高通量测序，分析的过程包括单核苷酸多态性分析过程、所述插入缺失标记分析流程和大片段扩增确实分析流程；

所述单核苷酸多态性分析过程包括如下步骤：

(1)测序仪获取原始短序列；

(2)去除测序数据中的接头和低质量数据；

(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上；

(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；

(5)过滤低质量值和低覆盖度的单核苷酸；

(6)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对单核苷酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核苷酸功能、SIFT预测单核苷酸影响蛋白功能预测；

(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核苷酸作为候选的单核苷酸，在候选的单核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核苷酸。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核苷酸作为最后疾病相关的候选单核苷酸；

所述插入缺失标记分析过程包括如下步骤

(1)把去除接头序列和低质量的测序数据比对到人类基因组上；

(2)找出序列中所含有的插入/缺失的信息；

(3)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能；

(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels；

所述大片段扩增确实分析流程包括如下步骤：

(1)测序仪获取原始短序列；

(2)去除测序数据中的接头和低质量数据；

(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上；

(4)统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图。