CN106591430A

CN106591430A - 一种自闭症致病基因、易感基因和可能相关基因变异检测试剂盒

Info

Publication number: CN106591430A
Application number: CN201610902692.8A
Authority: CN
Inventors: 滕花景; 梁加龙; 李津臣; 孙中生
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Tianjin Zhongke Andi Biotechnology Development Co.,Ltd.
Priority date: 2016-10-18
Filing date: 2016-10-18
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-10-18
Also published as: CN106591430B

Abstract

一种自闭症的致病基因、易感基因和可能相关基因变异检测试剂盒，其特征在于，包括以下部分：RNA探针组，引物，封闭缓冲液，RNA酶封闭液，杂交缓冲液，结合缓冲液，1倍浓度的SSC的漂洗液，0.1倍浓度的SSC的漂洗液，PCR反应液和TE缓冲液；所述的RNA探针组包括282条RNA探针，所述的RNA探针序列如Seq ID No1～Seq ID No282。本发明提供的一种用于检测自闭症的致病基因、易感基因和可能相关基因的试剂盒，可同时检测6个疾病相关的致病/易感基因，可以为自闭症患病个体进行分子遗传学诊断，也可以对自闭症患者的父母亲再生育时进行新生儿的自闭症患病风险评估。

Description

一种自闭症致病基因、易感基因和可能相关基因变异检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因变异检测领域，尤其涉及一种自闭症致病基因、易感基因和可能相关基因变异检测试剂盒。

背景技术

自闭症，又称孤独症(autism)或孤独性障碍(autistic disorder)等，是广泛性发育障碍(pervasive developmental disorder，PDD)的代表性疾病。自闭症对健康产生重大影响。对有自闭症患者的家族进行研究发现，儿童自闭症同胞患病率为2％～8％，是一般人群发病率的50～200倍。双生子研究则显示，同卵双生的同病一致率为60％，异卵双生的同病一致率为0。这些证据证明遗传因素是儿童自闭症发病的重要原因。

目前国际上自闭症诊断主要是依赖于自闭症行为量表(Autism BehaviorChecklist，ABC)、儿童自闭症评定量表量表(ChildhoodAutism Rating Scale，CARS)、自闭症诊断观察量表(Autism Diagnostic Observation Schedule Generic，ADOS—G)和自闭症诊断访谈量表修订版(Autism Diagnostic Interview—Revised，ADI—R)，而这些诊断所需的信息基本来源于父母的对患病儿童的描述，导致信息存在很多偏差，容易造成漏诊和误诊。并且由于患儿出现症状的年龄往往早于2周岁，而以上量表仅适用于2周岁以上的儿童，因此导致自闭症确诊时患儿的大脑发育基本成熟，很难通过行为干预等治疗措施进行自闭症症状的缓解。

准确地确定患者的基因型和表型数据，是精准医疗的前提，对自闭症患儿进行自闭症致病基因/易感/可能相关基因的检测，是有效诊断自闭症患者的必要前提，现有技术中，自闭症的基因的检测方法主要是通过sanger测序、荧光定量PCR、高通量测序等技术来实现，但这些技术一次只能检测少数位点(10个以内)或者只能检测单个基因拷贝数变化的区域，然而与自闭症遗传相关的基因已经报道了200多个，因此，采用sanger测序或者荧光定量PCR技术，要实现对这200多个基因进行全筛查，需要大量的费用。以sanger测序为例，按每个基因编码区域的长度平均为2000bp计算，sanger测序检测单个基因的成本约为人民币300元，总计需要大约人民币6万元。如此高昂的费用，是一般家庭所无法承受的；高通量测序可以对人的全基因组进行全部测序，但人类基因组的大小约为3Gb，进行全基因组测序总计约需90Gb测序数据，巨大的数据量要求所致高昂的测序成本(约1万元人民币)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种自闭症的基因、易感基因和可能相关基因变异检测试剂盒，可同时检测自闭症疾病相关的致病/易感基因/相关基因，可以为自闭症患病个体进行分子遗传学诊断。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种自闭症的基因、易感基因和可能相关基因变异检测试剂盒，包括以下部分：RNA探针组，引物，封闭缓冲液，RNA酶封闭液，杂交缓冲液，结合缓冲液，1倍浓度的SSC漂洗液，0.1倍浓度的SSC漂洗液，PCR反应液和TE缓冲液；

所述的RNA探针组包括282条RNA探针，所述的RNA探针序列如Seq ID No1～Seq IDNo282。

优选的，所述的RNA探针组能特异性捕获自闭症致病基因、自闭症易感基因和自闭症可能相关基因；

所述的自闭症致病基因包括CHD8和ASXL3；

所述的自闭症易感基因包括TCF7L2和ZC3H4；

所述的自闭症可能相关基因包括BSDC1和DLG2。

优选的，所述引物正向引物序列为Seq ID No283，所述引物正向引物序列为SeqID No284。

优选的，所述的RNA探针为生物素标记的RNA探针。

优选的，所述的封闭缓冲液成分包括人cot-1DNA、鲑鱼精DNA和特异性封闭引物。

优选的，所述的特异性封闭引物的序列为Seq ID No285～Seq ID No290。

优选的，所述的杂交缓冲液成分包括SSPE溶液、Denhardt溶液、EDTA和SDS。

优选的，所述的结合缓冲液成分包括NaCl，Tris～HCl和EDTA。

优选的，所述的RNA酶封闭液为RNA酶抑制剂。

优选的，所述的1倍浓度的SSC漂洗液包括1倍浓度的SSC溶液和0.1％SDS；

所述的0.1倍浓度的SSC漂洗液包括0.1倍浓度的SSC溶液和0.1％SDS。

本发明的有益效果：本发明提供的一种用于检测自闭症的致病基因、易感基因和可能相关基因的试剂盒，可同时检测6个疾病相关的致病/易感基因，可以为自闭症患病个体进行分子遗传学诊断，也可以对自闭症患者的父母亲再生育时进行新生儿的自闭症患病风险评估。

具体实施方式

本发明提供了一种自闭症的致病基因、易感基因和可能相关基因变异检测试剂盒，包括以下部分：RNA探针组，引物，封闭缓冲液，RNA酶封闭液，杂交缓冲液，结合缓冲液，1倍浓度的SSC漂洗液，0.1倍浓度的SSC漂洗液，PCR反应液和TE缓冲液；

本发明提供的试剂盒，可同时检测6个疾病相关的致病/易感基因，可以为自闭症患病个体进行分子遗传学诊断，也可以对自闭症患者的父母亲再生育时进行新生儿的自闭症患病风险评估。

本发明提供的试剂盒包括RNA探针组。所述的RNA探针组能特异性捕获自闭症致病基因、自闭症易感基因和自闭症可能相关基因。所述RNA探针组的浓度优选为150ng/μl。所述RNA探针组的体积优选为200μl。

本发明中，所述自闭症致病基因、易感基因和可能相关基因的获取方法优选通过调研医学文献检索服务系统PUBMED上截止目前所有有关自闭症的遗传学研究的论文，确定了自闭症相关的2个致病基因和2个易感基因。通过对国际范围内最大规模自闭症家系的全外显子组测序，分析自闭症患者的新生突变和罕见遗传性突变所在基因功能，筛选出基因功能和脑、神经发育相关的基因2个。

本发明中，所述的自闭症致病基因优选包括如下2个基因：CHD8和ASXL3。

本发明中，所述的自闭症易感基因包括如下2个基因：TCF7L2和ZC3H4；

本发明中，所述的自闭症可能相关基因包括如下2个基因：BSDC1和DLG2。

本发明中，所述RNA探针组优选分为三类探针组，分别为能特异性捕获自闭症致病基因的探针组，能特异性捕获自闭症易感基因的探针组和能特异性捕获自闭症可能相关基因的探针组。本发明中，所述能特异性捕获自闭症致病基因的探针组的核苷酸序列如SeqIDNo1～Seq ID No142所示。本发明中，所述能特异性捕获自闭症易感基因的探针组的核苷酸序列如Seq ID No143～Seq ID No213所示。本发明中，所述能特异性捕获自闭症可能相关基因的探针组的核苷酸序列如Seq ID No214～Seq ID No282所示。所述自闭症的致病基因、易感基因和相关基因与探针组对应关系如表1所示。

表1自闭症的致病基因和相关基因与探针组对应关系

本发明还提供了所述RNA探针组中探针的设计方法，优选包括以下内容：探针序列长度为55bp～120bp，且与目标区域序列一致；探针序列和目标区域序列的Tm值与探针序列和非目标区域序列Tm值的差值大于等于5℃；所述的探针自身形成发卡结构的Tm值小于等于47℃，所述的探针之间形成二聚体的Tm值小于等于47℃，所述的Tm值基于Santa Lucia2007热力学参数表的最邻近法计算；所述各个探针的拷贝数根据目标区域的GC含量调整，目标区域序列的GC含量为10～30％或70～90％的探针拷贝数为目标区域序列为40％～60％探针拷贝数的3～4倍，目标区域序列的GC含量为10～30％或70～90％的探针拷贝数为目标区域序列为40％～60％探针拷贝数的2.2～2.8倍。

本发明还提供了所述RNA探针组中探针的制备方法，优选包括以下步骤：

1)针对基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为110～130bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在50～70bp的重叠；

2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加序列为Seq ID No291的引物和序列为Seq ID No292的引物，形成两端带有同样序列的探针组序列列表；

3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针组序列列表中的序列；

4)将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物；

5)以寡核苷酸混合物为模板，以序列为Seq ID No291的引物和与序列为Seq IDNo293的反向互补的序列为引物，利用Taq聚合酶进行聚合酶链式反应扩增，获得大量的双链DNA池；

6)使用PCR纯化试剂盒，根据其操作说明书进行PCR产物纯化，获得纯化后的双链DNA池；

7)以1μl纯化后的双链DNA池为模板，使用序列为Seq ID No294和Seq ID No293为引物，利用Taq聚合酶进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，形成带T7序列的双链DNA池；

8)采用凝胶电泳对上一步PCR反应产物进行分离，去除非特异条带，回收170～180bp区域片段，采用胶回收试剂盒进行纯化；

9)采用T7大量RNA转录试剂盒，利用在dNTP中掺杂Biotin-UTP为底物，对上一步胶回收纯化产物进行体外转录，制备成含生物素标记的核糖核酸探针组：

37℃孵育8～12小时，得到最高产量含生物素标记的核糖核酸探针组，纯化后稀释至500ng/μl，置于-80℃冰箱保存。

本发明中，所述步骤5)优选采用PCR方法，具体操作步骤如下：

反应体系如下：

反应条件如下：

本发明中，所述步骤5)中Taq聚合酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的Taq聚合酶即可。本发明实施例中所述Taq聚合酶的来源为JumpStart TaqDNAPolymerase采购至Sigma，Catalog No.D6558。

本发明中，所述步骤6)PCR纯化试剂盒的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的PCR纯化试剂盒即可。本发明实施例中所述PCR纯化试剂盒的来源为QIAGEN公司，型号为CatNo./ID 28104。

本发明中，所述步骤7)所述PCR方法的反应体系如下：

所述步骤7)所述PCR方法的反应条件如下：

本发明中，所述步骤8)胶回收试剂盒来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的胶回收试剂盒即可。本发明实施例中所述胶回收试剂盒的来源为QIAGEN公司，型号为CatNo./ID 28704。

本发明中，所述T7大量RNA转录试剂盒来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的胶回收试剂盒即可。本发明实施例中所述T7大量RNA转录试剂盒购自Vazyme,型号为TR101～01/02。

本发明中，所述的RNA探针优选为生物素标记的RNA探针。

本发明提供的试剂盒包括引物。所述的引物包括1对DNA引物，所述的DNA引物正向序列为Seq ID No283，所述的DNA引物反向序列为Seq ID No284。所述引物正向序列和反向序列的来源委托生物工程公司合成。所述的引物的浓度优选为10μmol/L。所述的引物的体积优选为10μmol/L。

本发明提供的试剂盒包括封闭缓冲液。所述封闭缓冲液的体积优选为208μl。所述的封闭缓冲液包括人cot-1DNA、鲑鱼精DNA和特异性封闭引物。

所述封闭缓冲液每11μl包括2.5μl的1mg/mL的人cot～1DNA，2.5μl的1mg/mL鲑鱼精DNA和6种特异性封闭引物。所述的6种特异性封闭引物的浓度均为1mmol/L，各1μl，共6μl。

本发明中，所述特异性封闭引物的序列为Seq ID No285～Seq ID No290。本发明所述特异性封闭引物的序列的来源由发明人自己设计制备得到。本发明对引物合成的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的引物合成的方法即可。

本发明中，所述人cot-1DNA的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的人cot-1DNA即可。本发明实施例中所述人cot-1DNA购自Invitrogen公司。

本发明中，所述鲑鱼精DNA的浓来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的鲑鱼精DNA即可。本发明实施例中所述鲑鱼精DNA购自Invitrogen公司。

本发明提供的试剂盒包括杂交缓冲液。所述的杂交缓冲液包括浓度为5倍浓度的SSPE溶液、5倍浓度的Denhardt溶液(邓哈特溶液)、5mmol/L的EDTA和质量浓度为0.1％的SDS。所属的杂交缓冲液的pH值优选为7.8。所述的杂交缓冲液的体积优选为2ml。所述SSPE溶液购买时为20倍浓度的SSPE缓冲液，购自Invitrogen公司。所述Denhardt溶液购买时为50倍浓度的Denhardt溶液，购自Invitrogen公司。所述EDTA溶液购买时的浓度为0.5mol/L，pH为8.0，购自Invitrogen公司。所述SSC溶液购自Invitrogen公司。

本发明提供的试剂盒包括结合缓冲液。所述的结合缓冲液包括浓度为的1mol/LNaCl，浓度为10mmol/L的Tris-HCl和浓度为1mmol/L的EDTA。所述的结合缓冲液的体积优选为100ml。

本发明提供的试剂盒包括RNA酶封闭液。所述RNA酶封闭液的体积优选为500μl。所述RNA酶封闭液优选为RNA酶抑制剂。所述RNA酶抑制剂的浓度优选为2U/μl。本发明中，所述RNA酶抑制剂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的RNA酶抑制剂的来源即可。本发明实施例中，所述RNA酶抑制剂购自Invitrogen公司。

本发明提供的试剂盒包括1倍浓度的SSC漂洗液。所述的1倍浓度的SSC漂洗液包括1倍浓度的SSC溶液和质量浓度为0.1％SDS；所述漂洗液1的体积为25mL。

本发明提供的试剂盒包括0.1倍浓度的SSC漂洗液。所述的0.1倍浓度的SSC漂洗液包括0.1倍浓度的SSC溶液和0.1％SDS。所述0.1倍浓度的漂洗液的体积100ml。

本发明提供的试剂盒包括PCR反应液。所述的PCR反应液包括0.1μmol/LdNTPs，0.1U/μL高保真Hotstart DNA聚合酶和2倍浓度PCR反应缓冲液。所述的PCR反应液的体积为2.2ml。

本发明提供的试剂盒包括TE缓冲液。所述TE缓冲液优选包括10mmol/L的Tris-HCl，1mmol/L的EDTA，调pH至8.0，水定容至500ml。每个试剂盒中TE缓冲液的体积优选5ml。

在本发明中，使用所述试剂盒进行检测的方法优选包括以下步骤：

A、将人基因组DNA超声波破碎成小片段DNA；

B、将所述步骤A得到的小片段DNA进行捕获制备小片段文库；

C、将所述步骤B得到的小片段文库与封闭缓冲液混合；

D、将所述步骤C得到混合液进行PCR变性反应；

E、将探针组与RNA酶封闭缓冲液混合，放置于冰上；

F、待所述步骤D PCR反应至65℃恒温时将所述步骤E得到的探针与RNA酶封闭液的混合液和杂交缓冲液置于65℃恒温中；

G、将所述步骤F得到的杂交缓冲液、所述步骤F得到的探针与RNA酶封闭液的混合液和PCR反应后得到的小片段文库与封闭缓冲液的混合液进行混合，孵育过夜，得到杂交产物；

H、将磁珠重悬置于磁力架上1～2min，加入结合缓冲液，混合，如此重复3～4次，得到处理好的磁珠；

I、将所述步骤G中得到杂交产物与所述步骤H中得到磁珠进行混合；

J、向所述步骤I中得到的混合液中加入预热的1倍浓度的SSC漂洗液后放置于磁力架上吸附2～3min，分离除去上清液，得到磁珠杂交产物；

K、向所述步骤J中得到的磁珠杂交产物中加入预热的0.1倍浓度的SSC漂洗液，放置于磁力架上吸附2～3min，分离除去上清液，得到磁珠杂交产物；

L、将所述步骤K得到的磁珠杂交产物与结合缓冲液进行混合，得到混合液；

M、将所述步骤K得到的混合液用水重悬，

N、将所述步骤L得到的磁珠杂交产物进行富集；

O、将所述步骤M得到的富集的磁珠杂交产物进行纯化；

P、将所述步骤N得到的纯化的文库进行测序；

Q、将测序得到的数据进行生物信息学分析流程和结果输出；

所述步骤A～C与所述步骤D之间没有时间上的限制。

本发明将人基因组DNA超声波破碎成小片段DNA。所述人基因组DNA的用量优选为1～2μg。所述超声波破碎优选使用Bioruptor。所述超声波破碎的时间为20～30s；所述超声波破碎的间隔时间为30s。所述超声破碎循环数优选为20个循环。所述小片段DNA的长度优选为150～250bp小片段。

得到小片段DNA后，本发明将所述小片段DNA进行制备小片段文库。本发明中，所述文库制备的方法优选采用Illumina TruSeq DNA library preparation试剂盒。所述试剂盒的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的所述试剂盒即可。

得到小片段文库后，本发明将所述小片段文库与封闭缓冲液混合。所述小片段文库与封闭缓冲液的质量体积比为750～800：11～15(ng：μl)。本领域技术人员在所述混合后优选还包括浓缩。所述浓缩的方法优选采用真空浓缩离心机进行。所述浓缩的倍数优选为1～2倍。浓缩后体积为9μl。

得到小片段文库与封闭缓冲液混合液后，本发明将所述混合液进行PCR变性反应。所述PCR变性的反应程序优选为95℃，5min；65℃，保温。所述PCR变性反应优选在热盖开启状态下进行。

本发明将探针组与RNA酶封闭缓冲液混合，放置于冰上。本发明中，所述的探针组与RNA酶封闭缓冲液混合时的体积比优选为(1～3)：(4～6)，更优选为2：5。

待所述PCR反应至恒温后，本发明将所述步骤E得到的探针与RNA酶封闭液的混合液和杂交缓冲液置于恒温中。在本发明中，所述恒温的温度优选为60～70℃，更优选为65℃。所述探针与RNA酶封闭液的混合液和杂交缓冲液置于恒温中的时间优选2～7min，更优选为杂交缓冲液置于恒温中的时间优选为6～7min，所述探针与RNA酶封闭液的混合液置于恒温中的时间优选为2～3min。

杂交缓冲液达到恒温后，本发明将所述杂交缓冲液、所述步骤F得到的探针与RNA酶封闭液的混合液和PCR反应后得到的小片段文库与封闭缓冲液混合进行混合，孵育过夜，得到杂交产物。所述孵育的温度优选为60～70℃，更优选为65℃。所述孵育的时间优选为8～16h，更优选为12h。

本发明将磁珠重悬置于磁力架上1～2min，加入结合缓冲液，混合，得到处理好的磁珠。所述磁珠优选为Dynabeads MyOne Streptavidin T1magnetic beads(链霉亲和素磁珠)，购于Invitrogen。所述磁珠与结合缓冲液的体积比优选为(50～60)：(200～300)。所述磁珠优选重复3～4次。

得到处理好的磁珠后，本发明将所述杂交产物与所述磁珠进行混合，得到杂交液孵育后的磁珠。所述杂交产物与所述磁珠的比例优选为(25～34)：(45～60)，更优选为29：50。

杂交液孵育后的磁珠后，本发明向所述杂交液孵育后的磁珠中加入预热的1倍浓度的SSC漂洗液后放置于磁力架上吸附2～3min，分离除去上清液，得到第一次洗涤后的磁珠杂交产物。所述1倍浓度的SSC漂洗液的添加量优选为150～300μL，更优选为200μL。所述1倍浓度的SSC漂洗液的预热的温度优选为60～70℃，更优选为65℃。本发明中，所述分离前优选还包括涡旋混匀和置于旋转混匀仪上混匀。所述涡旋的时间优选为5s～8s，更优选为7s；所述涡旋的速度优选为120～150rpm，更优选为140rpm。所述旋转混匀速度优选为30～50rpm，更优选为40rpm。所述旋转混匀时间优选为室温15～25mins，更优选为20min。

得到第一次洗涤后的磁珠杂交产物后，本发明向所述磁珠杂交产物中加入预热的0.1倍浓度的SSC漂洗液，放置于磁力架上吸附2～3min，分离除去上清液，得到第二次漂洗后的磁珠杂交产物。所述0.1倍浓度的SSC漂洗液的添加量优选为150～300μL，更优选为200μL。所述0.1倍浓度的SSC漂洗液的预热的温度优选为60～70℃，更优选为65℃。所述0.1倍浓度的SSC漂洗液的添加量优选为150～300μL，更优选为200μL。本发明在分离之前优选进行涡旋混匀和孵育。所述涡旋的时间优选为5s～8s，所述涡旋的速度优选为120～150rpm。所述孵育优选在金属浴上孵育。所述孵育的时间优选为10mins～15min，更优选为12min。所述分离的方法优选为磁力架吸附，吸附时间优选为2～3min。分离前优选进行离心，所述离心的转速优选700rpm～1000rpm，更优选为800rpm，离心时间优选为10s。

得到第二次漂洗后磁珠杂交产物沉淀后，本发明将所述磁珠杂交产物沉淀用水重悬。所述水的加入量为30μL～50μL，更优选为40μL。

重悬后，本发明将所述重悬后的磁珠杂交产物进行富集。所述的富集优选采用PCR的方法进行。所述PCR的反应体系优选如下：21μl 2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix，20μl Captured on-～bead DNA，1μl各10μmol/mol/L的正反向引物。所述PCR反应条件优选为：98℃，5min；98℃，30s；65℃，30s；72℃，30s，16个循环；72℃，5min。

得到富集的杂交产物后，本发明将所述富集的磁珠杂交产物进行纯化。所述纯化优选采用磁珠纯化文库试剂盒。本发明对所述纯化磁珠纯化文库试剂盒没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的DNA纯化磁珠即可。本发明中，所述DNA纯化磁珠试剂盒为Beckman Agencourt AMPure XP磁珠纯化文库试剂盒。

得到纯化后的文库后，本发明将所述纯化的文库进行测序。所述测序优选采用Illumina Hiseq 4000进行测序。

得到测序结果后，本发明将所述测序数据进行生物信息学分析流程和结果输出。所述生物信息学分析流程包括SNP分析流程和InDel分析流程。

本发明中，所述的SNP分析流程包括以下步骤：

①获取原始短序列；

②去除测序数据中的接头、引物和低质量数据等；

③把短序列用SOAPaligner软件定位到人MHC3.6M基因组数据相应的位置上，所用到参数：soap2.20-a-b-t-v 3-l 42-s 63-m100-x 400，其中序列错配数为3，具体参数含义参考：http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html；

④统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；

⑤SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，所用到参数：

soapsnp-i-d-o-r0.00005-e 0.0001-M-t-u-L-s-2–T，具体参数含义参考

http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；

⑥过滤掉低质量值(质量值≥20)和低覆盖度(深度≥10)的SNP；

⑦利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；

⑧根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs，在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人MHC3.6M基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs；

本发明中，所述的InDel分析流程包括以下步骤：

①把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对

到人MHC3.6M基因组上，所用到参数：bwa aln-L-l 31-i 10-k2-t 7-e 40，具体参数含义参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；

②用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；

③利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)。

本发明利用BWAMEM软件，将测序数据与到人类参考基因组HG19进行比对，所用的参数为：bwamem-M-k40-t 8-R"@RG\tID:Hiseq\tPL:Illumina\tSM:sample"，从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变。

下面结合实施例对本发明提供的一种自闭症致病基因、易感基因和可能相关基因变异检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

自闭症致病基因、易感基因和可能相关基因的筛选

通过调研医学文献检索服务系统PUBMED上截止目前所有有关自闭症的遗传学研究的论文，确定了自闭症相关的2个致病基因(表5)和2个易感基因(表5)。通过对国际范围内最大规模自闭症家系的全外显子组测序，分析自闭症患者的新生突变和罕见遗传性突变所在基因功能，筛选出基因功能和脑、神经发育相关的基因共2个，分别为BSDC1和DLG2。

表5自闭症相关的6个基因列表

探针组的设计和制备

根据上述6个基因序列(HG19版本)，本领域技术人员可以通过公知、通用的方法设计并合成探针序列，本实施例中对合成的探针序列进行扩增，体外转录和生物素标记。具体步骤如下：

1、针对基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为110～130bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在50～70bp的重叠；

2、在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加TAGGTGTGTAGGCGC(SEQ ID NO.291)和GTCAGCTAGTACGCA(SEQ ID NO.295)序列，形成两端带有同样序列的探针组序列列表；

3、采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针组序列列表中的序列；

4、将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物；

5、以寡核苷酸混合物为模板，以SEQ ID NO.291和与序列为SEQ ID NO.293的反向互补的序列为引物，利用Taq聚合酶(JumpStartTaq DNA Polymerase采购至Sigma，CatalogNo.D6558)进行聚合酶链式反应扩增，获得大量的双链DNA池，具体操作步骤如下：

反应体系如下：

反应条件如下：

6、使用QIAGEN PCR纯化试剂盒，根据其操作说明书进行PCR产物纯化，获得纯化后的双链DNA池；

7、以1μl纯化后的双链DNA池为模板，使用序列为SEQ ID NO.294和SEQ ID NO.293为引物，利用Taq聚合酶进行聚合酶链式反应扩增，形成带T7序列的双链DNA池。操作如下：

反应体系：

反应条件如下：

8、采用凝胶电泳对上一步PCR反应产物进行分离，去除非特异条带，回收170～180bp区域片段，采用Qiagen胶回收试剂盒进行纯化；

9、采用T7高通量RNA转录试剂盒，利用在dNTP中掺杂Biotin-UTP为底物，对上一步胶回收纯化产物进行体外转录，制备成含生物素标记的核糖核酸探针组：

实施例2

本实施例所述的用于检测自闭症致病基因、易感基因和可能相关基因变异的试剂盒，可以为自闭症患病个体进行分子遗传学诊断，为自闭症患者的父母及亲属进行生育自闭症患儿的风险评估。

取人基因组DNA 1μg，使用超声波破碎仪Bioruptor pico进行随机打断至150～250bp小片段；

使用Illumina TruSeq DNA文库准备试剂盒进行捕获前小片段文库制备。

取750ng步骤2中构建好的小片段文库，与11μl封闭缓冲液混合，在真空浓缩离心机中浓缩至9μl。

将杂交缓冲液在室温下融化，混匀后置于65℃水浴锅中预热，预热期间拿出混匀一次。分装到PCR管中，20μl每管。

取2μl探针加入5μl RNA酶封闭缓冲液，混匀后短暂离心，置于冰上。

设置PCR仪参数，95℃，5min；65℃，hold(热盖开启)；

将步骤3中准备的样品置于PCR仪上，运行以上程序；

PCR仪温度降至65℃时，将步骤4中准备的杂交缓冲液置于PCR仪上；

杂交缓冲液65℃保温5min后，将步骤5中准备的探针和RNA酶封闭缓冲液置于PCR上2min；

吸取13μl杂交缓冲液移至探针中，吸取全部文库和封闭缓冲液移至探针中,轻轻吸打10次，充分混匀，盖上管盖，盖好PCR仪热盖,65℃孵育过夜(8～16h)；

将磁珠Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magneticbeads(购于Invitrogen)从4℃取出，涡旋震荡重悬；取50μl磁珠置于1.5mL EP管内，置于磁力架上1min，移除上清，从磁力架上取下EP管，加入200μL结合缓冲液，移液器吹打混匀；

置于磁力架上1min，吸弃上清。该步骤重复2次，共用结合缓冲液洗磁珠3次。加入200μL结合缓冲液，重悬磁珠；

将漂洗液2于水浴锅中65℃提前预热；

将杂交产物加入到200μl结合缓冲液重悬的磁珠中，用移液器吸打混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min；

加入200μL的漂洗液1，轻轻吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上室温15mins，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上吸附2min，移除上清；

加入65℃预热的漂洗液2，涡旋混匀5s，65℃震荡金属浴上孵育10mins,转速800转每分钟，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上吸附2min，移除上清；

重复上述步骤两次；

向PCR管加入42μL不含DNA酶的水轻轻吸打6次，重悬磁珠。

对捕获的目标区域进行富集，PCR反应体系如下：21μl 2×KAPA HiFi HotStartReadyMix，20μl Captured on-bead DNA，1μL引物。PCR反应条件为：98℃，5min；16个循环[98℃，30s；65℃，30s；72℃，30s]；72℃，5min。

文库纯化：用Beckman Agencourt AMPure XP磁珠纯化文库，用20μl Nuclease-free water溶解文库。

将步骤20得到的文库进行Illumina Hiseq 4000测序。

生物信息学分析流程和结果输出

(1)SNP分析流程

①获取原始短序列；

②去除测序数据中的接头、引物和低质量数据等；

⑤SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，所用到参数：

soapsnp-i-d-o-r0.00005-e 0.0001-M-t-u-L-s-2–T，具体参数含义参考

http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；

⑥过滤掉低质量值(质量值>＝20)和低覆盖度(深度>＝10)的SNP；

(2)InDel分析流程

②用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；

实施例4

对51例样本，按实施例3的描述获得测序数据。利用BWA MEM软件，将测序数据与到人类参考基因组HG19进行比对，所用的参数为：bwa mem-M-k40-t 8-R"@RG\tID:Hiseq\tPL:Illumina\tSM:sample"，从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变。

采用samtools-1.2软件中的samtools stats工具统计数据的大小、比对率、重复率、质量值，接着再用软件中的samtools depth工具，计算目标区域每个位置的测序深度；

根据目标区域每个位置的测序深度，分别统计测序深度≥1、≥4、≥10及≥20的碱基数量，再将该碱基数量除以目标区域的总碱基数量，从而得到1×覆盖率、4×覆盖率、10×覆盖率及20×覆盖率的参数。

利用本发明所述试剂盒检测51例样本，结果证实自闭症致病基因、易感基因和可能相关基因的捕获富集效果显著(见表6)，平均40.3％的序列都能被比对回目标区域的参考序列，目标区域的平均测序深度为493.6×，平均20×覆盖率为97.05％，从而实现6个基因全长的97.05％均能够得到准确检测。

表6测序数据质量统计

实施例5

患者1，男，4岁，送检人CHD8基因携带一个稀有的移码突变，在人群中极为罕见，将直接改变蛋白质编码，造成该蛋白质功能缺失；该突变属于新生突变(即不遗传于父亲，也不遗传于母亲)。该突变属于新生突变，即不遗传于父亲，也不遗传于母亲。

CHD8编码的是染色质解旋酶DNA结合蛋白8，CHD8属于CHD亚家族III，CHD家族蛋白(染色质解旋酶DNA结合蛋白)，是一类含有染色质结构域(chromodomains,chromatinorganization modifier)、SNF2相关解旋酶/ATP酶结构域以及特异性DNA结合结构域的蛋白质，主要参与染色质结构的重塑和基因转录调控。该基因通过改变核小体的位置重塑染色质结构，参与多个通路的转录与调控，对胎儿的发育起关键作用。该蛋白可以结合β-连环蛋白并参与调控Wnt信号通路，Wnt信号通路是参与基因表达以及转录、控制细胞行为、细胞黏附和细胞极性，对胎儿的早期发育与胚胎形成起关键作用。

已经有多篇科学文献报道,该基因同孤独症、智力低下、精神分裂症等神经精神疾病高度相关。CHD8的突变可以造成β-连环蛋白上调，使的头部过度生长，神经元发育异常，进而造成头大畸形以及孤独症的相关临床表型。在筛查到的众多孤独症相关新突变基因中，染色体结构域解旋酶DNA结合蛋白8(CHD8)突变频率最高，且具有重复性，因而CHD8是一个重要的孤独症候选致病基因。

实施例6

患者2，男，送检人的ASXL3基因携带一个稀有的错义突变，在人群中极为罕见，使用多款软件预测该错义突变是有害的，有可能造成蛋白质功能缺失。该突变属于遗传突变，来源于母亲；如果双亲继续生育下一个小孩，携带该突变的概率较高(大约为50％)。

ASXL3基因编码一种转录调控因子，是一个高风险孤独症基因。ASXL3基因新生突变、截断和移码突变是引起可能会导致发育迟缓，身材矮小，小头畸形，颅面畸形。截断突变可能是引起表型重叠Bohring-Opitz综合征的原因。ASXL3基因在脑、脊髓、肾脏、肝脏、骨髓中表达，但表达水平较低；在大脑的岛叶、扣带回、杏仁核，具有更高的表达水平。已经有多篇科学文献报道该基因同自闭症、神经神经分裂症相关。

实施例7

患者3，男，送检人的TCF7L2基因携带一个稀有的错义突变，在人群中极为罕见，使用多款软件预测该错义突变是有害的，有可能造成蛋白质功能缺失。该突变属于遗传突变，来源于母亲；如果双亲继续生育下一个小孩，携带该突变的概率较高(大约为50％)。

TCF7L2基因编码一种高转录(HMG)盒转录因子，在Wnt信号通路中起关键作用。Wnt信号通路参与基因表达，细胞行为、细胞黏附和细胞极性的控制，在胚胎发育、组织稳态和细胞命运决定中起着至关重要的作用。TCF7L2直接调节胆固醇的从头合成和代谢，选择性地富集在基因的启动子区参与胆固醇分子的生物合成。TCF7L2转录活性对于髓鞘再生后脱髓鞘以及大脑发育过程中正常髓鞘的形成是至关重要的。

实施例8

患者4，男，12岁，送检人的BSDC1基因携带一个稀有的错义突变，在人群中极为罕见，使用多款软件预测该错义突变是有害的，有可能造成蛋白质功能缺失。该突变也在父亲中检测到，属于遗传突变，来源于父亲。

BSDC1是一个孤独症可能相关基因，该基因编码的蛋白是BSD结构域蛋白1，该蛋白包含一种新的结构域BSD，BSD结构域存在于基本转录因子(basic transcriptionfactor)，突触相关蛋白以及预测蛋白质等基因表达、转录调节、信号传递等生物体重要功能蛋白中。

结构域BSD蛋白1的结构特点是由三个预测α螺旋组成，可形成三螺旋束，以及由保守的色氨酸和苯丙氨酸残基，位于结构域的C末端。BSD构域蛋白1参与细胞周期，DNA的结合，染色质分离。BSD域可以与U-BOX域共同出现，参与泛素化，在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。BSDC1基因的突变或缺失会影响包含BSD结构域，与BSDC1蛋白相关联的的很多重要蛋白的功能，从而影响基因表达、转录调节、信号传递等生物体重要功能。

实施例9

患者5，送检人的ZC3H4基因携带一个稀有的错义突变，在人群中极为罕见，使用多款软件预测该错义突变是有害的，有可能造成蛋白质功能缺失。该突变在母亲中检测到，属于遗传突变，来源于母亲，母亲虽携带突变基因，但未有临床表现。

ZC3H4编码的蛋白质属于含CCCH型锌指蛋白家族成员之一，含有C-x8-C-x5-C-x3-H基序。锌指蛋白是一类具有指状结构域、肽链中半胱氨酸和组氨酸保守残基的特征集团与Zn2+特异结合的转录因子，在蛋白质折叠、DNA识别、RNA包装、细胞凋亡调控和蛋白－蛋白互作中发挥重要作用，涉及参与脂肪代谢的调节。该基因编码的蛋白在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中发挥着极为重要的作用。

实施例10

患者6，男，送检人的DLG2基因携带一个稀有的错义突变，在人群中极为罕见，使用多款软件预测该错义突变是有害的，有可能造成蛋白质功能缺失。该突变属于遗传突变，来源于父亲；如果双亲继续生育下一个小孩，携带该突变的概率较高(大约为50％)。

DLG2是一个低风险孤独症基因，这个基因编码蛋白质是膜相关的鸟苷激酶家族的一员。编码的蛋白质会和相关家族成员形成异质二聚体，这些异质二聚体在突触后的位点相互作用为由受体、离子通道、先关信号蛋白组成的集群形成多聚体的蛋白质支架。该基因能够调节NMDA受体在脊髓背角神经元表面表达，参与调节胆碱能突触的突触稳定性。NMDA受体在神经系统发育过程中发挥重要的生理作用，调节神经元的树突，轴突结构发育并参与突触可塑性的形成。NMDA受体与学习，记忆过程有重大关系。

由以上实施例可知，本发明提供的用于检测自闭症致病基因、易感基因和可能相关基因变异的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点，可以同时检测6个基因的各种类型突变，因此本发明的探针组及试剂盒可应用于同时检测6个自闭症致病基因、易感基因和可能相关基因，可以为自闭症患病个体进行分子遗传学诊断，为自闭症患者的父母及亲属进行生育自闭症患儿的风险评估，符合精准医学发展的趋势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种自闭症的致病基因、易感基因和可能相关基因变异检测试剂盒，其特征在于，包括以下部分：RNA探针组，引物，封闭缓冲液，RNA酶封闭液，杂交缓冲液，结合缓冲液，1倍浓度的SSC的漂洗液，0.1倍浓度的SSC的漂洗液，PCR反应液和TE缓冲液；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的RNA探针组能特异性捕获自闭症的致病基因、自闭症易感基因和自闭症可能相关基因；

所述的自闭症致病基因包括：CHD8和ASXL3；

所述的自闭症易感基因包括TCF7L2和ZC3H4；

所述的自闭症可能相关基因包括BSDC1和DLG2。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物正向引物序列为Seq IDNo283，所述的引物正向引物序列为Seq ID No284。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的RNA探针为生物素标记的RNA探针。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的封闭缓冲液成分包括人cot～1DNA、鲑鱼精DNA和特异性封闭引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性封闭引物的序列为Seq IDNo285～Seq ID No290。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的杂交缓冲液成分包括SSPE溶液、Denhardt溶液、EDTA和SDS。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的结合缓冲液成分包括NaCl、Tris-HCl和EDTA。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的RNA酶封闭液为RNA酶抑制剂。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述1倍浓度的SSC漂洗液包括1倍浓度的SSC溶液和0.1％SDS；

所述0.1倍浓度的SSC漂洗液包括0.1倍浓度的SSC溶液和0.1％SDS。