CN103571847B - Foxc1基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的编码FOXC1突变体的核酸，分离的多肽，筛选易感Axenfeld‑Rieger综合症的生物样品的方法，筛选易感Axenfeld‑Rieger综合症的生物样品的系统，用于筛选易感Axenfeld‑Rieger综合症的生物样品的试剂盒以及筛选治疗或预防Axenfeld‑Rieger综合症的药物的方法。其中，该分离的编码FOXC1突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.168delC突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感Axenfeld‑Rieger综合症。

Description

FOXC1基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及FOXC1基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码FOXC1突变体的核酸，分离的多肽，筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法，筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的系统，用于筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的试剂盒以及筛选治疗或预防Axenfeld-Rieger综合症的药物的方法。

背景技术

Axenfeld-Rieger综合症是以双眼发育性缺陷,伴有或者不伴有全身发育异常为特点的发育性疾病,表现为双眼发育性缺陷,继发性青光眼,可伴有全身发育异常,多为牙骨和面骨异常,为常染色体的显性遗传,多有家族史,男女相同。眼部的临床特点表现为:双眼发病,视力减退,角膜后胚胎环,前房角异常,虹膜角膜粘连,虹膜发育异常,无瞳,瞳孔异位,多瞳等。全身异常的临床特点主要表现为：牙齿异常如小牙、牙齿发育不全或少牙等；多余的脐周皮肤；颅面畸形如上颌骨发育不全。

到目前为止，已确定PITX2基因和FOXC1基因是与Axenfeld-Rieger综合症相关的基因，且其均为转录因子。但仍存在着相当一部分未知致病基因位点，预计在人类中可能仍然存在70多个位点与Axenfeld-Rieger综合症相关。

因而，目前对Axenfeld-Rieger综合症的研究仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法。

本发明是基于发明人的下列工作而完成的：发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了Axenfeld-Rieger综合症新的致病基因突变（FOXC1c.168delC）。

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码FOXC1突变体的核酸。根据本发明的实施例，该核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.168delC突变。根据本发明的实施例，发明人确定了FOXC1的新突变体，该新突变体与Axenfeld-Rieger综合症的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感Axenfeld-Rieger综合症。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该多肽是由根据本发明实施例的编码FOXC1突变体的核酸所编码的，其与SEQ ID NO：2相比，阅读框发生改变，即p.Pro56Argfs*22，具体地，从第56位氨基酸开始，由脯氨酸突变为精氨酸，新的读码框终止于第77位，即终止于从56位氨基酸开始算起的第22位氨基酸。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感Axenfeld-Rieger综合症。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.168delC突变是所述生物样品易感Axenfeld-Rieger综合症的指示。通过根据本发明实施例的筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法，可以有效地筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQID NO：1相比，是否具有c.168delC突变，判断所述生物样品是否易感Axenfeld-Rieger综合症。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测FOXC1基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，所述FOXC1基因突变体具有c.168delC突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品。

根据本发明的第六方面，本发明提出了一种筛选治疗或预防Axenfeld-Rieger综合症的药物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将能够表达FOXC1基因突变体的生物样品在存在候选试剂的情况下进行培养，其中所述FOXC1基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有c.168delC突变；将所述能够表达FOXC1基因突变体的生物样品在不存在所述候选试剂的情况下进行培养；确定所述能够表达FOXC1基因突变体的生物样品在存在所述候选试剂和不存在所述候选试剂的情况下，细胞凋亡率的变化，其中存在所述候选试剂时，所述细胞凋亡率低于不存在所述候选试剂时的细胞凋亡率，是所述候选试剂作为治疗或预防Axenfeld-Rieger综合症的药物的指示。

利用该筛选治疗或预防Axenfeld-Rieger综合症的药物的方法，能够有效地筛选治疗或预防Axenfeld-Rieger综合症的药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1A为根据本发明实施例的筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的系统的示意图，

图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了根据本发明实施例的6例Axenfeld-Rieger综合症患者的FOXC1基因突变位点DNA测序图；以及

图3显示了根据本发明实施例的Axenfeld-Rieger综合症患者1和2的FOXC1基因突变位点cDNA测序图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

FOXC1基因突变体

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码FOXC1突变体的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：1相比，该核酸具有c.168delC突变。在本文中所使用的表达方式“编码FOXC1突变体的核酸”，是指与编码FOXC1突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与FOXC1突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码FOXC1突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了FOXC1基因的新突变体，这些新突变体与Axenfeld-Rieger综合症的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感Axenfeld-Rieger综合症，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感Axenfeld-Rieger综合症。

该编码FOXC1突变体的核酸，是本申请的发明人高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定的Axenfeld-Rieger综合症的致病基因上的新突变，在现有技术中并未被提到。

野生型FOXC1基因的cDNA如下所示：

ATGCAGGCGCGCTACTCCGTGTCCAGCCCCAACTCCCTGGGAGTGGTGCCCTACCTCGGCGGCGAGCAGAGCTACTACCGCGCGGCGGCCGCGGCGGCCGGGGGCGGCTACACCGCCATGCCGGCCCCCATGAGCGTGTACTCGCACCCTGCGCACGCCGAGCAGTACCCGGGCGGCATGGCCCGCGCCTACGGGCCCTACACGCCGCAGCCGCAGCCCAAGGACATGGTGAAGCCGCCCTATAGCTACATCGCGCTCATCACCATGGCCATCCAGAACGCCCCGGACAAGAAGATCACCCTGAACGGCATCTACCAGTTCATCATGGACCGCTTCCCCTTCTACCGGGACAACAAGCAGGGCTGGCAGAACAGCATCCGCCACAACCTCTCGCTCAACGAGTGCTTCGTCAAGGTGCCGCGCGACGACAAGAAGCCGGGCAAGGGCAGCTACTGGACGCTGGACCCGGACTCCTACAACATGTTCGAGAACGGCAGCTTCCTGCGGCGGCGGCGGCGCTTCAAGAAGAAGGACGCGGTGAAGGACAAGGAGGAGAAGGACAGGCTGCACCTCAAGGAGCCGCCCCCGCCCGGCCGCCAGCCCCCGCCCGCGCCGCCGGAGCAGGCCGACGGCAACGCGCCCGGTCCGCAGCCGCCGCCCGTGCGCATCCAGGACATCAAGACCGAGAACGGTACGTGCCCCTCGCCGCCCCAGCCCCTGTCCCCGGCCGCCGCCCTGGGCAGCGGCAGCGCCGCCGCGGTGCCCAAGATCGAGAGCCCCGACAGCAGCAGCAGCAGCCTGTCCAGCGGGAGCAGCCCCCCGGGCAGCCTGCCGTCGGCGCGGCCGCTCAGCCTGGACGGTGCGGATTCCGCGCCGCCGCCGCCCGCGCCCTCCGCCCCGCCGCCGCACCATAGCCAGGGCTTCAGCGTGGACAACATCATGACGTCGCTGCGGGGGTCGCCGCAGAGCGCGGCCGCGGAGCTCAGCTCCGGCCTTCTGGCCTCGGCGGCCGCGTCCTCGCGCGCGGGGATCGCACCCCCGCTGGCGCTCGGCGCCTACTCGCCCGGCCAGAGCTCCCTCTACAGCTCCCCCTGCAGCCAGACCTCCAGCGCGGGCAGCTCGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCGGGGGCCGCGGGGGGCGCGGGCGGCGCCGGGACCTACCACTGCAACCTGCAAGCCATGAGCCTGTACGCGGCCGGCGAGCGCGGGGGCCACTTGCAGGGCGCGCCCGGGGGCGCGGGCGGCTCGGCCGTGGACGACCCCCTGCCCGACTACTCTCTGCCTCCGGTCACCAGCAGCAGCTCGTCGTCCCTGAGTCACGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGGGGAGGCCAGGAGGCCGGCCACCACCCTGCGGCCCACCAAGGCCGCCTCACCTCGTGGTACCTGAACCAGGCGGGCGGAGACCTGGGCCACTTGGCGAGCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCCGCAGGCTACCCGGGCCAGCAGCAGAACTTCCACTCGGTGCGGGAGATGTTCGAGTCACAGAGGATCGGCTTGAACAACTCTCCAGTGAACGGGAATAGTAGCTGTCAAATGGCCTTCCCTTCCAGCCAGTCTCTGTACCGCACGTCCGGAGCTTTCGTCTACGACTGTAGCAAGTTTTGA（SEQ ID NO：1），其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

MQARYSVSSPNSLGVVPYLGGEQSYYRAAAAAAGGGYTAMPAPMSVYSHPAHAEQYPGGMARAYGPYTPQPQPKDMVKPPYSYIALITMAIQNAPDKKITLNGIYQFIMDRFPFYRDNKQGWQNSIRHNLSLNECFVKVPRDDKKPGKGSYWTLDPDSYNMFENGSFLRRRRRFKKKDAVKDKEEKDRLHLKEPPPPGRQPPPAPPEQADGNAPGPQPPPVRIQDIKTENGTCPSPPQPLSPAAALGSGSAAAVPKIESPDSSSSSLSSGSSPPGSLPSARPLSLDGADSAPPPPAPSAPPPHHSQGFSVDNIMTSLRGSPQSAAAELSSGLLASAAASSRAGIAPPLALGAYSPGQSSLYSSPCSQTSSAGSSGGGGGGAGAAGGAGGAGTYHCNLQAMSLYAAGERGGHLQGAPGGAGGSAVDDPLPDYSLPPVTSSSSSSLSHGGGGGGGGGGQEAGHHPAAHQGRLTSWYLNQAGGDLGHLASAAAAAAAAGYPGQQQNFHSVREMFESQRIGLNNSPVNGNSSCQMAFPSSQSLYRTSGAFVYDCSKF*（SEQ ID NO：2）。

发明人发现的新突变体与SEQ ID NO：1相比，具有c.168delC突变，即相对于野生型FOXC1基因，本发明的FOXC1基因突变体的cDNA中第168位缺失C，由此，其所编码的产物与野生型FOXC1基因所编码的蛋白（SEQ ID NO：2）相比，阅读框发生改变，即p.Pro56Argfs*22，肽链第56位氨基酸残基由脯氨酸变为精氨酸，读码框提前终止于第77位氨基酸，即终止于从56位氨基酸开始算起的第22位氨基酸。其中，需要说明的是，相对于野生型FOXC1基因，本发明的FOXC1基因突变体具有c.168delC突变，而该第168位碱基的后两位碱基即第169位和第170位碱基也是C，因此“c.168delC”应作广义理解，该突变可以表示野生型FOXC1基因的cDNA中第168、169和170位的碱基C中的任意一个缺失，均能导致相同的移码突变。

已知，FOXC1蛋白属于FOXC亚族，该蛋白的功能尚未完全明确，目前认为它在胚胎发育和眼睛发育的调节中具有重要的作用。FOXC1基因参与胚胎发育过程中神经嵴细胞的发育，突变可以引起神级嵴细胞起源的房水引流结构的异常，从而导致眼压升高而致盲。动物实验表明，小鼠体内的Foxc1基因敲除之后，眼睛、心脏和血管流出道、肾脏、骨骼等多种组织和器官发育出现障碍。而FOXC1基因是控制眼前节发育的重要基因，其突变可能引起眼前节结构发构异常，导致Axenfeld-Rieger综合症。具体地，FOXC1基因的c.168delC突变，造成p.Pro56Argfs*22，即由于移码突变而翻译提前终止，其必需的蛋白功能结构域被缺失，产生无功能的蛋白产物，是其导致Axenfeld-Rieger综合症的重要原因。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该多肽是由前述分离的编码FOXC1突变体的核酸所编码的，其与SEQ ID NO：2相比，存在p.Pro56Argfs*22，即肽链第56位氨基酸残基由脯氨酸变为精氨酸，读码框提前终止于第77位氨基酸，即终止于从56位氨基酸开始算起的第22位氨基酸。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感Axenfeld-Rieger综合症，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感Axenfeld-Rieger综合症。

筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法可以包括以下步骤：

首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品FOXC1是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中FOXC1是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含FOXC1编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集FOXC1外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用FOXC1外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集FOXC1外显子，从而能够进一步提高筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，FOXC1外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些FOXC1外显子特异性引物具有SEQ ID NO：3和4所示的核苷酸序列：

GGACATCAAGACCGAGAACG（SEQ ID NO：3）

CTCACCTCGTGGTACCTGA（SEQ ID NO：4）

发明人惊奇地发现，通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对FOXC1外显子的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO：3和4所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide（Part#1005361;Feb2010）或Paired-End SamplePrep Guide（Part#1005063；Feb2010），通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads）作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应FOXC1的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQID NO：1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有c.168delC突变，则指示生物样品易感Axenfeld-Rieger综合症。由此，通过根据本发明实施例的筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法，可以有效地筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法的系统。

参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的系统1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增富集FOXC1外显子，进一步提高筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设置有FOXC1外显子特异性引物，以便利用FOXC1外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，FOXC1外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：3和4所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的区别判断生物样品是否易感Axenfeld-Rieger综合症。具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.168delC突变，判断生物样品是否易感Axenfeld-Rieger综合症。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.168delC突变，是生物样品易感Axenfeld-Rieger综合症的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的试剂盒包括：适于检测FOXC1基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该FOXC1基因突变体具有c.168delC突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测FOXC1基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测FOXC1编码基因的试剂，也可以是检测FOXC1突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的实施例，本发明的试剂盒可以进一步包括FOXC1基因的外显子特异性引物，该所述特异性引物具有如SEQ IDNO：3-4所示的核苷酸序列。根据本发明的一个实施例，适于检测FOXC1基因突变体的试剂为核酸探针，由此，可以高效地筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品。

需要说明的是，在本文前面筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易感Axenfeld-Rieger综合症的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

筛选治疗或预防Axenfeld-Rieger综合症的药物的方法

根据本发明的第六方面，本发明提出了一种筛选治疗或预防Axenfeld-Rieger综合症的药物的方法。根据本发明的实施例，该筛选治疗或预防Axenfeld-Rieger综合症的药物的方法可以包括以下步骤：

首先，将能够表达FOXC1基因突变体的生物样品在存在候选试剂的情况下进行培养，其中所述FOXC1基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有c.168delC突变。这里所使用的术语“培养”应做广义理解，是指使得生物样品以有活性的状态存在。根据本发明的实施例，生物样品的类型不受特别限制，只要该生物样品能够表达这样一种FOXC1基因突变体即可，该突变体与SEQ ID NO：1相比，具有c.168delC突变。

其次，将上述生物样品在不存在该候选试剂的情况下进行培养。

接着，确定上述生物样品在存在候选试剂和不存在候选试剂的情况下，细胞凋亡率的变化，其中存在所述候选试剂时，所述细胞凋亡率低于不存在所述候选试剂时的细胞凋亡率，是所述候选试剂作为治疗或预防Axenfeld-Rieger综合症的药物的指示。

利用本发明的筛选治疗或预防Axenfeld-Rieger综合症的药物的方法，能够有效地筛选治疗或预防Axenfeld-Rieger综合症的药物。

此外，本领域技术人员可以理解，在本文中所使用的术语“核酸序列”，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了描述方便，在本说明书和权利要求书中，多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。具体地，例如，在本文中所使用的表达方式“核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.168delC突变是所述生物样品易感Axenfeld-Rieger综合症的指示”，其中所述的“核酸样本的核酸序列”包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测与其互补的另一条链，反之亦然。并且，在本文中，“核酸序列”包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种形式的序列，则意味着另一种形式的序列也被公开。例如，公开了FOXC1基因的cDNA序列，实际也就公开了其相应的RNA序列。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。

一般方法

发明人近两年在国内收集到6例Axenfeld-Rieger综合症病例，均为家族性病例，患者表现为颅面发育异常，牙齿发育不良；眼部异常包含虹膜发育异常、房角异常以及角膜后胚胎环。该家系中同一代中患者与正常人分布大约为1:1，符合孟德尔常染色体显性遗传的特征。

随后，发明人用Agilent SureSelect HumanAll Exon Kit结合Solexa高通量测序技术对患者1（表1所示，下同）及其父母的外显子组序列进行了测序，具体如下：

1）将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库（可参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文）。

2）文库经纯化后经过ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与SureSelectBiotinylated RNA Library(BAITS)进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq2000，读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少为20×。

3）测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software1.7进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPaligner2.20（可参见：Li,R.,et al.,SOAP:shortoligonucleotide alignment program.Bioinformatics,2008.24(5):p.713-4.；Li,R.,etal.,SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics,2009.25(15):p.1966-7，通过参照将其全文并入本文）比对参考基因组，获得比对到基因组上的Unique mapped reads。靶区域的基因型由SOAPsnp（可参见：Li,R.,et al.,SNPdetection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res,2009.19(6):p.1124-32.，通过参照将其全文并入本文）确定。

结果，在患者1中发现有19593个单核苷酸变异（SNVs）和2757处的插入/缺失。随后对结果通过dbSNP数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ summary.cgi）,千人基因组数据库（www.1000genomes.org/）,HapMap8数据库（http:// hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/）等公共数据库的过滤，去掉所有已知变异。同时利用病例1的父母的外显子组测序的结果进行过滤，并利用SIFT软件进行SNV功能预测，并结合Geneontology注解进行蛋白功能分析，最终得到9个杂合可能具有致病意义的突变位点。

由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，发明人利用Sanger测序方法，对9个杂合可能具有致病意义的突变位点进行验证，其中8个为假阳性或缺少与疾病的共分离。假阳性指外显子测序发现的SNV用直接测序法检测患者并没有检测到。突变与疾病的共分离，指突变与疾病一起，由携带突变的患者传递给携带突变的患病子女，而不传递给非患病子女。结果显示，仅有1个SNV为真正的致病性突变位点，即FOXC1基因的c.168delC杂合突变，该突变导致FOXC1蛋白发生p.Pro56Argfs*22阅读框改变。

综上，具有c.168delC突变的FOXC1基因极有可能为患者1及其家系的Axenfeld-Rieger综合症的致病基因，因此，将c.168delC突变作为候选致病性突变位点。

实施例1

分别对6名患者（即表1中的患者1-6）、5名家系内正常人（即该6例患者的亲戚，他们均未发病）和200名家系外正常人（即与表1中所有患者无血缘关系的对照）基因进行外显子组测序，即针对foxc1基因所有外显子序列设计引物，通过PCR扩增、产物纯化以及测序的方法获得foxc1有关序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证foxc1与Axenfeld-Rieger综合症之间相关性。具体方法步骤如下：

1.1 基因组DNA制备：采集前述6名家系内患者、5名家系内正常人和200名家系外正常人外周静脉血，利用QIAmp Blood kit(Qiagen,Hilden,Germany)抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/微升，总量不少于30微克。

1.2 外显子特异性引物设计及PCR反应

参考人类基因组序列数据库hg18/build36.3设计FOXC1基因的外显子特异性引物，引物序列如下：

方向	引物序列(5’-3’，SEQ ID NO：)
		正向	GGACATCAAGACCGAGAACG(SEQ ID NO：3)
反向	CTCACCTCGTGGTACCTGA(SEQ ID NO：4)

然后，利用以上所述的外显子特异性引物，将获得的6名家系内患者、5名家系内正常人和200名家系外正常人的基因组DNA进行PCR反应，以便获得各自的PCR扩增产物，其中，PCR反应体系及反应条件如下所示：

PCR反应条件：

1.3 Sanger测序：

利用3130xl Genetic Analyzer（ABI，Foster City，CA）对6例Axenfeld-Rieger综合症患者、5名家系内正常人和200名家系外正常人PCR扩增产物直接进行DNA测序，以便获得外显子组测序结果。其中，图2显示了根据本发明实施例的6例Axenfeld-Rieger综合症患者的FOXC1基因突变位点DNA测序图。如图2所示，“正常”表示正常序列，“突变体”表示突变序列，黑色箭头指示缺失C的位置。图3显示了根据本发明实施例的Axenfeld-Rieger综合症患者1和2的FOXC1基因突变位点cDNA测序图。如图3所示“正常”表示正常序列，“突变体”表示突变序列，黑色箭头指示缺失C的位置。

1.4 外显子组测序数据分析：

基于外显子组测序结果，在患者家族成员中对FOXC1基因所有编码序列及侧翼序列进行突变排查，发现所有未受累的家族成员均不带有c.168delC突变。并且，发明人在收集到的6例Axenfeld-Rieger综合症病例的FOXC1基因中均检测到杂合性移码突变位点。同时，发明人所发现的c.168delC突变位点在5例家族正常人及200例同种族无关正常对照中均未能检测到，表明所检测到的位点很可能并非SNP。其中，下表1示出了6例Axenfeld-Rieger综合症患者的FOXC1基因突变位点以及其相应的编码蛋白突变：

表1.所有Axenfeld-Rieger综合症患者的基因突变位点

综上，发明人已从遗传学上证实具有c.168delC突变的FOXC1为Axenfeld-Rieger综合症致病基因，该突变位点以往文献尚未报道过。

实施例2

制备一检测试剂盒，其包含能够检测具有c.168delC突变的FOXC1基因突变体的引物，用于筛选易感Axenfeld-Rieger综合征的生物样品，其中这些引物为FOXC1基因的外显子特异性引物，其序列如实施例1中所述SEQ ID NO：3-4所示。

利用上述试剂盒筛选易感Axenfeld-Rieger综合征的生物样品的具体步骤为：按照实施例1的1.1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述FOXC1基因的外显子特异性引物进行PCR反应，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否有c.168delC突变，能够有效地检测本发明的FOXC1基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易感Axenfeld-Rieger综合症，进一步，能够从待测者中筛选出易感Axenfeld-Rieger综合征的生物样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种分离的编码FOXC1突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，发生c.168delC突变。

2.一种分离的多肽，其特征在于，其是由权利要求1所述的核酸所编码的。