CN104178489B - Aagab基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了AAGAB基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码AAGAB突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法，筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的系统，用于筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的试剂盒，构建体以及重组细胞。其中，该分离的编码AAGAB突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患I型点状掌跖角化症。

Description

AAGAB基因突变体及其应用

优先权信息

本申请请求2013年5月23日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为201310234269.1的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。

技术领域

本发明涉及AAGAB基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离编码AAGAB突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法，筛选遗憾I型点状掌跖角化症的生物样品的系统，用于筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的试剂盒，构建体以及重组细胞。

背景技术

点状掌跖角化病（PPPK；OMIM：148600）是一种以不规则分布于掌跖的大量的角化性斑块为特征的罕见的常染色体显性遗传性疾病，其典型临床表现为双手掌与足跖部位的圆形或卵圆形、较硬的黄色或淡黄色角质丘疹，若去除角质丘疹后，局部可留有火山口样的凹坑，可以伴有甲变形，典型的点状皮损可以融合成块，可能与遭受连续性高压有关，一般足跖部位皮疹比掌部较大，少数患者也可不仅累及掌跖部位，其他部位如膝部、手足背部、肘部也可受累。其中，I型点状掌跖角化症（Punctate palmoplantar keratoderma type I，PPKP1），又称为点状掌跖角化病Buschke-Fischer-Brauer型，其发病机制复杂、并且具有高度遗传异质性。

现阶段，寻找致病基因对疾病诊断或治疗意义重大。虽然目前已发现多个PPKP1的致病基因，涉及较多致病突变，但仍存在着相当一部分未知的致病基因及致病位点。

因而，目前对I型点状掌跖角化症的研究仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法。

本发明是基于发明人的下列工作完成的：发明人通过目标区域捕获测序联合候选基因突变验证的方法确定了I型点状掌跖角化症的新的致病基因——AAGAB基因，并发现了六个AAGAB基因上的治病突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T。

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码AAGAB突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T。根据本发明的实施例，发明人确定了AAGAB基因的新突变体，该突变体与I型点状掌跖角化症的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患I型点状掌跖角化症。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：2相比，所述分离的多肽具有选自下列的至少一种突变：p.Phe184Leufs*6、p.Leu252Leufs*14、p.Leu242*、p.Ser118Lysfs*3和p.Arg161*。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患I型点状掌跖角化症。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T是所述生物样品易患I型点状掌跖角化症的指示。通过根据本发明实施例的筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法，可以有效地筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ IDNO：1相比，是否具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T，判断所述生物样品是否易患I型点状掌跖角化症。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测AAGAB基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该AAGAB基因突变体具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品。

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码AAGAB突变体的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的编码AAGAB突变体的核酸”表示，本发明的构建体包含与SEQ ID NO：1相比具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T的AAGAB基因突变体的核酸序列。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗I型点状掌跖角化症的药物。

根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗I型点状掌跖角化症的药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1A为根据本发明实施例的筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的系统的示意图，

图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2-图9依次显示了根据本发明一个实施例的I型点状掌跖角化症患者家系Family1-Family8的家系图；

图10-图15依次显示了实施例2中检测获得的I型点状掌跖角化症患者的AAGAB基因的突变位点的Sanger测序验证峰图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

AAGAB基因突变体

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码AAGAB突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T。在本文中所使用的表达方式“编码AAGAB突变体的核酸”，是指与编码AAGAB（即p34蛋白）突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与AAGAB突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码AAGAB突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了AAGAB基因的新突变体，这些新突变体与I型点状掌跖角化症的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患I型点状掌跖角化症，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患I型点状掌跖角化症。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

该编码AAGAB突变体的核酸，是本申请的发明人通过目标区域捕获测序联合候选基因突变验证的方法确定的I型点状掌跖角化症的新的致病基因AAGAB的突变体。该致病基因及上述的致病突变位点在现有技术中并未被提到。

其中，野生型AAGAB基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：

ATGGCTGCTGGCGTACCCTGTGCGTTAGTCACCAGCTGCTCCTCCGTCTTCTCAGGAGACCAGCTGGTCCAACATATCCTTGGAACAGAAGATCTTATTGTGGAAGTGACTTCCAATGATGCTGTGAGATTTTATCCCTGGACCATTGATAATAAATACTATTCAGCAGACATCAATCTATGTGTGGTGCCAAACAAATTTCTTGTTACTGCAGAGATTGCAGAATCTGTCCAAGCATTTGTGGTTTACTTTGACAGCACACAAAAATCGGGCCTTGATAGTGTCTCCTCATGGCTTCCACTGGCAAAAGCATGGTTACCTGAGGTGATGATCTTGGTCTGCGATAGAGTGTCTGAAGATGGTATAAACCGACAAAAAGCTCAAGAATGGTGCATCAAACATGGCTTTGAATTGGTAGAACTTAGTCCAGAGGAGTTGCCTGAGGAGGATGATGACTTCCCAGAATCTACAGGAGTAAAGCGAATTGTCCAAGCCCTGAATGCCAATGTGTGGTCCAATGTAGTGATGAAGAATGATAGGAACCAAGGCTTTAGCCTTCTCAACTCATTGACTGGAACAAACCATAGCATTGGGTCAGCAGATCCCTGTCACCCAGAGCAACCCCATTTGCCAGCAGCAGATAGTACTGAATCCCTCTCTGATCATCGGGGTGGTGCATCTAACACAACAGATGCCCAGGTTGATAGCATTGTGGATCCCATGTTAGATCTGGATATTCAAGAATTAGCCAGTCTTACCACTGGAGGAGGAGATGTGGAGAATTTTGAAAGACTCTTTTCAAAGTTAAAGGAAATGAAAGACAAGGCTGCGACGCTTCCTCATGAGCAAAGAAAAGTGCATGCAGAAAAGGTGGCCAAAGCATTCTGGATGGCAATCGGGGGAGACAGAGATGAAATTGAAGGCCTTTCATCTGATGAAGAGCACTGA(SEQ ID NO：1)，

其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

MAAGVPCALVTSCSSVFSGDQLVQHILGTEDLIVEVTSNDAVRFYPWTIDNKYYSADINLCVVPNKFLVTAEIAESVQAFVVYFDSTQKSGLDSVSSWLPLAKAWLPEVMILVCDRVSEDGINRQKAQEWCIKHGFELVELSPEELPEEDDDFPESTGVKRIVQALNANVWSNVVMKNDRNQGFSLLNSLTGTNHSIGSADPCHPEQPHLPAADSTESLSDHRGGASNTTDAQVDSIVDPMLDLDIQELASLTTGGGDVENFERLFSKLKEMKDKAATLPHEQRKVHAEKVAKAFWMAIGGDRDEIEGLSSDEEH(SEQ ID NO：2)。

发明人发现的AAGAB基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T，即相对于野生型AAGAB基因，本发明的AAGAB基因突变体发生下列的至少一种突变：其cDNA的第552位碱基到554位碱基由TAG突变为AT（c.552_554TAG>AT），第535位碱基往后推一个碱基处由G突变为A（C.535+1G>A，剪切位点突变），第755到756位碱基之间插入了AAGCCAGTCT10个碱基（c.755_756insAAGCCAGTCT），第725位碱基从T突变为G（c.725T>G），第352位碱基到355位碱基之间缺失了TCTG4个碱基（c.352_355delTCTG），第481位碱基从C突变为T。由此，其所编码的产物与野生型的AAGAB相比，具有相应的突变：p.Phe184Leufs*6（c.552_554TAG>AT）、p.Leu252Leufs*14（c.755_756insAAGCCAGTCT）、p.Leu242*（c.725T>G）、p.Ser118Lysfs*3（c.352_355delTCTG）和p.Arg161*（c.481C>T），即上述突变是由于AAGAB基因的相应突变而引起的。具体地，p.Phe184Leufs*6突变表示：第184位氨基酸处由苯丙氨酸变为亮氨酸，后推6个变为终止子密码；p.Leu252Leufs*14突变表示：第252位氨基酸处开始发生改变（252密码子处依然为亮氨酸），后推14位碱基突变为终止子；p.Leu242*突变表示：第242位氨基酸处由亮氨酸密码子突变为终止密码子；p.Ser118Lysfs*3突变表示：第118位氨基酸处由丝氨酸突变为赖氨酸，后推3位突变为终止密码子；p.Arg161*突变表示：第161位氨基酸处由精氨酸直接突变为终止密码子。其中，c.535+1G>A对应的蛋白突变，是一个剪切位点突变，其后面的氨基酸变异无法预知。

AAGAB基因编码一种由315个氨基酸组成的衔接素结合蛋白p34（在本文中有时也称为“AAGAB”），α-和γ-衔接蛋白是两种可溶性配体复合体AP-1/AP-2的组成成分,而p34蛋白通常以配体的方式与α-和γ-衔接蛋白的NH2端相结合，从而通过与AP-1/AP-2结合来引导可溶性配体到达细胞膜的位置。另外AP-2通常还发挥一个EGFR信号的配体作用，此通路在形成胞内小泡系统中发挥一个重要作用。有研究表明在HaCaT细胞系中对AAGAB基因进行敲除可以使得EGFR信号表达升高20倍，p34蛋白的缺失可以导致与AP-2的结合受到抑制从而减少EGFR蛋白转化，诱导小泡重新回到细胞表面。通过这个机制，p34蛋白在表皮角质细胞的增殖过程中发挥重要作用。因而，从机制方面，也可以证明发明人的发现，即AAGAB的突变会引起I型点状掌跖角化症。但是，本发明发现的I型点状掌跖角化症的致病新基因AAGAB以及上述的致病突变位点并未见报道。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与野生型AAGAB相比，该分离的多肽具有选自下列的至少一种突变：p.Phe184Leufs*6、p.Leu252Leufs*14、p.Leu242*、p.Ser118Lysfs*3和p.Arg161*，即该突变是由于AAGAB基因的c.552_554TAG>AT、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T突变的至少一种而引起的。具体地，p.Phe184Leufs*6突变表示：第184位氨基酸处由苯丙氨酸变为亮氨酸，后推6个变为终止子密码；p.Leu252Leufs*14突变表示：第252位氨基酸处开始发生改变（252密码子处依然为亮氨酸），后推14位碱基突变为终止子；p.Leu242*突变表示：第242位氨基酸处由亮氨酸密码子突变为终止密码子；p.Ser118Lysfs*3突变表示：第118位氨基酸处由丝氨酸突变为赖氨酸，后推3位突变为终止密码子；p.Arg161*突变表示：第161位氨基酸处由精氨酸直接突变为终止密码子。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码AAGAB突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患I型点状掌跖角化症，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患I型点状掌跖角化症。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

从所述生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品AAGAB是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中AAGAB是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含AAGAB编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集AAGAB外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用AAGAB外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集AAGAB外显子（尤其是第3、5、6、8号外显子），从而能够进一步提高筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，AAGAB外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些AAGAB外显子特异性引物（针对AAGAB的第3、5、6、8号外显子）具有SEQ ID NO：5-12所示的核苷酸序列：

发明人惊奇地发现，通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对AAGAB第3、5、6、8号外显子的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO：5-12所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide（Part#1005361;Feb2010）或Paired-End SamplePrep Guide（Part#1005063；Feb2010），通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads）作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应AAGAB的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQID NO：1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T，则指示生物样品易患I型点状掌跖角化症。由此，通过根据本发明实施例的筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法，可以有效地筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法的系统。

参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的系统1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增，富集AAGAB外显子，进一步提高筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设置有AAGAB外显子特异性引物，以便利用AAGAB外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，AAGAB外显子特异性引物（针对AAGAB的3、5、6、8号外显子）具有如SEQ ID NO：5-12所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的区别判断生物样品是否易患I型点状掌跖角化症。具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T，判断生物样品是否易患I型点状掌跖角化症。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T，是生物样品易患I型点状掌跖角化症的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的试剂盒包括：适于检测AAGAB基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该AAGAB基因突变体具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测AAGAB基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测AAGAB编码基因的试剂，也可以是检测AAGAB突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针或引物，优选地，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：5-12所示的核苷酸序列。由此，可以高效地筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品。

需要说明的是，在本文前面筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

构建体及重组细胞

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码AAGAB突变体的核酸，即本发明的AAGAB基因突变体。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的编码AAGAB突变体的核酸”表示，本发明的构建体包含与SEQ ID NO：1相比具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T的AAGAB基因突变体的核酸序列。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗I型点状掌跖角化症的药物。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒（Cosmid）、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而，本发明的重组细胞能够表达构建体所携带的AAGAB基因突变体。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗I型点状掌跖角化症的药物。根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

需要说明的是，发明人收集到70个PPKP1病例，其中42例为家族性PPKP1病例，包含在8个家系（在本文中有时也称为“Family1-Family8”，其家系图谱依次见图2-图8）中，另外28例为散发病例（在本文中有时也称为“Sporadic Patient1-28”）。上述70个PPKP1病例均表现为掌跖部位出现圆形或椭圆形的角质丘疹，随年龄增长，皮损明显增多。

其中，图2-图9依次显示了本发明收集到的上述I型点状掌跖角化症患者家系Family1-Family8的家系图。如图2-图9所示，*代表选入实施例2中进行Sanger测序验证的样本；□表示家系内健康男性，■表示家系内男性患者；○表示家系内健康女性，●表示家系内女性患者；表示家系内已经去世的男性患者；表示家系内已经去世的男性正常人；表示家系内已经去世的女性患者；表示家系内已经去世的女性正常人；表示家系内已经去世的男性个体，但患病与否不清楚；表示家系内已经去世的女性个体，但患病与否不清楚。其中，Family1家系的先证者为III5，Family2家系的先证者为II1，Family3家系的先证者为III4，Family4家系的先证者为III5，Family5家系的先证者为III4，Family6家系的先证者为III7，Family7家系的先证者为III7，Family8家系的先证者为III2。

下面将基于这些收集到的病例进行研究。

实施例1 确定PPKP1致病基因及致病突变

1、样本收集

发明人选取上述收集到的其中一个PPKP1患者家系Family1（其家系图谱如图2所示）进行外显子组测序研究。如图2所示，该家系共有6男3女9个患者（其中先证者为III9），以及16个表现正常的成员，症状如前所述。对上述9个患者进行组织病理学检查显示，表皮高度角化过度、角质层明显增厚、其下方马尔匹基层被压凹陷低于一般表皮水平，颗粒层和棘层增厚。发明人根据该家系的患者情况以及文献既往所报道的PPKP1患者家系的内容分析认为此病符合常染色体显性遗传。

发明人收集获得上述PPKP1患者家系Family1中患者及家系内正常人的外周血样本。

2、全外显子组测序

发明人利用Agilent SureSelect Human All Exon Kit结合Solexa高通量测序技术对PPKP1患者家系Family1中具备典型临床表型的病例III9及其表型正常的姐姐（III8）进行了全外显子组测序。

具体如下：

2.1DNA提取

采集图2所示PPKP1患者家系Family1中的病例III9及其表型正常的姐姐（III8）的外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得各基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀均应位于1.7-2.0之间，浓度不少于200纳克/微升，总量不少于30微克。

2.2外显子捕获与测序

利用超声波仪（CovarisS2,Massachusetts,USA）将各基因组DNA样本随机打断成150-200bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库（可参见：http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文）。文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂SureSelect Biotiny lated RNA Library(BAITS)进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，测序平台为Illumina Hiseq2000，读取长度为90bp，各样本的平均测序深度最少为20×。

3、变异检测、注释及数据库比较

利用Illumina basecalling Software1.7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPaligner/SOAP2（可参见：Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008,24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y,ea al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short readalignment.Bioinformatics2009,25(15):1966-1967，通过参照将其全文并入本文）比对到UCSC人类参考基因组（hg19,build37.1，http://genome.ucsc.edu/)，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNPdetection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res2009,19(6):1124-1132，通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。

结果，发明人在病例III9中发现有51,685个单核苷酸多态性（SNPs）和3126处的插入/缺失。随后通过dbSNP数据库（http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp135.txt.gz.）、HapMap数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap）、千人基因组数据库（ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp）、炎黄数据库（http://yh.genomics.org.cn/）等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。同时利用病例III9表现正常的姐姐III8的外显子组测序的结果进行过滤，并利用SIFT软件进行SNP功能预测，最终得到5个可能具有致病意义的de novo位点，其分别位于1522.2-15q24连锁区域范围之内的5个基因（DAPK2,IGDCC4,RPL4,TPM1和AAGAB）上。

由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，随后发明人在图2所示的上述PPKP1患者家系Family1中对AAGAB基因进行突变排查，即利用Sanger测序方法，对上述获得的5个杂合可能具有致病意义的de novo SNP位点在Family1的剩余样本（8例患者和15例家系内对照）中进行验证。结果，发明人发现其中4个de novo位点是假阳性的，具体表现为：这4个denovo位点，要么父母一方携带了（但是外显子组测序没检测出来），要么就是患者并没有这个突变，而外显子组测序因为假阳性的问题认为它是突变。而Sanger测序验证结果证明了仅有1个插入/缺失突变为真正的de novo变异位点，即AAGAB基因的c.552_554TAG>AT杂合突变，该突变导致其编码产物p34蛋白发生移码变异Phe184Leufs*6。

由此，初步判定AAGAB基因中的c.552_554TAG>AT突变为该I型点状掌跖角化症家系中患者的致病原因，进而，发明人认为AAGAB基因为I型点状掌跖角化症的致病基因，AAGAB基因的c.552_554TAG>AT突变为I型点状掌跖角化症的致病突变。

实施例2 Sanger法测序验证

基于实施例1中针对PPKP1家系Family1的研究结果，分别对发明人收集到的PPKP1病例中剩余的7个PPKP1家系（Family 2-Family 8）的家系成员（共33名家系内患者、26名家系内对照）及28例散发病例（在本文中有时也称为“Sporadic Patient 1-28”）的AAGAB基因进行检测：针对AAGAB基因的所有外显子设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得AAGAB有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证AAGAB基因与I型点状掌跖角化症之间的相关性。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1中所述的提取DNA的方法，分别提取制备受试者外周静脉血中的基因组DNA，备用。

2、引物设计及PCR反应

首先，参考人类基因组序列数据库GRCh37/hg19，设计得到具有SEQ ID NO：3-16所示的核苷酸序列的AAGAB基因外显子特异性引物，具体序列见下表：

接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应：

反应体系：15μL

PCR反应条件：

由此，获得各受试者的PCR扩增产物。

3、测序

将步骤2中获得的各受试者的PCR扩增产物直接进行DNA测序。其中，测序采用ABI3730型测序仪进行。

结果，发明人收集到的PPKP1病例均在AAGAB基因中检测到杂合性无义/移码突变位点。同时发明人所发现的突变位点在家系内对照及27例PPKP1散发病例均未能检测到，提示所检测到的位点很可能并非SNP。发明人认为AAGAB基因为PPKP1的致病基因。

具体检测结果见下表：

其中，图10-图15依次显示了本实施例检测到的患者的AAGAB基因的突变位点（c.352_355delTCTG、c.481C>T、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、C.535+1G>A、c.552_554TAG>AT）的Sanger测序验证峰图。

由此，进一步证明AAGAB基因为I型点状掌跖角化症的致病基因。

实施例3 针对家系外正常人的突变验证

发明人参照实施例2的方法，对100例同种族无关正常人（即家系外正常人）进行AAGAB基因的上述6种突变位点检测，结果均未能检测到该突变。

综合上述结果，发明人确定AAGAB基因为I型点状掌跖角化症的致病基因，AAGAB基因的c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T突变为I型点状掌跖角化症的致病突变。

实施例4 检测试剂盒

制备一检测试剂盒，其包含能够检测AAGAB基因c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T突变（位于3、5、6、8号外显子）的引物，用于筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品，其中这些引物为AAGAB基因外显子特异性引物，其序列如实施例1中所述SEQ ID NO：5-12所示。

利用上述试剂盒筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的具体步骤为：按照实施例2的步骤1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述AAGAB基因的外显子特异性引物进行PCR反应，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否具有选自下列的至少一种突变：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T，能够有效地检测本发明的AAGAB基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患I型点状掌跖角化症，进一步，能够从待测者中筛选出易患I型点状掌跖角化症的生物样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种分离的编码AAGAB突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有下列突变：c.352_355delTCTG，

任选地，所述核酸为DNA。

2.一种筛选易患I型点状掌跖角化症的生物样品的系统，其特征在于，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有下列突变：c.352_355delTCTG，判断所述生物样品是否易患I型点状掌跖角化症，

任选地，所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及

反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，

任选地，所述文库构建单元进一步包括：

PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有AAGAB基因外显子特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，

任选地，所述特异性引物具有如SEQ ID NO：5-12所示的核苷酸序列，

任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

4.具有如SEQ ID NO：5-12所示的核苷酸序列在制备检测AAGAB基因突变体的试剂盒中的用途，其特征在于，所述AAGAB基因突变体具有下列突变：c.352_355delTCTG。

5.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码AAGAB突变体的核酸。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求5所述的构建体转化受体细胞而获得的。