CN105802974B - Bcs1l基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了BCS1L基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码BCS1L突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患

综合症的生物样品的方法，筛选易患

综合症的生物样品的系统，以及用于筛选易患

综合症的生物样品的试剂盒。其中，该分离的编码BCS1L突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.556C>T突变，或者c.916C>T突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患

Description

BCS1L基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及BCS1L基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离编码BCS1L突变体的核酸、分离的多肽、筛选易患

综合症的生物样品的系统、用于筛选易患

综合症的生物样品的试剂盒、构建体、重组细胞以及构建药物筛选模型的方法。

背景技术

综合症的特点是先天感音神经性听力损失和卷曲的毛发。听力损失在生命的早期(通常在第一年)就表现出非常严重。卷曲的毛发，其中一个条件是平的，扭曲的头发轴，使毛发很脆，患者在生命的最初两年开发脱发。到目前为止，已报道的不到50例。

综合症是一种常染色体隐性遗传病。目前已报道BCS1L基因为

综合症的致病基因。虽然已经发现了该基因的一些突变会导致

综合症，但是仍有许多患者病因未明，该基因上的新突变或者其他基因的突变可能也是导致该综合症的病因。

因而，目前对

综合症尤其是其致病基因的研究仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易患

综合症的生物样品的手段。

本发明是基于发明人的下列工作完成的：

发明人发现，目前的致病基因和致病突变挖掘的研究中，多使用全外显子组测序法。全外显子组测序是利用特制的DNA序列探针将全基因组中的外显子区域捕获下来，然后针对每个外显子进行深度测序的技术，利用外显子组测序找出孟德尔遗传病致病基因的案例很多，比如Sarah等人在2009年利用外显子组测序成功定位出mile综合症的基因DHODH，找到米勒综合症的一个致病突变，这也是外显子组测序的首次成功应用；我国Wang等人利用外显子组测序发现了小脑共济失调的新的突变基因TGM6。随着外显子组测序技术的广泛应用和日渐成熟，一批新的致病基因(突变)被相继发现，极大地推动了相关疾病诊断及治疗的研究进展。

因而，发明人针对自行收集的一个

综合症患者家系，通过外显子组测序、连锁分析联合Sanger测序验证的方法进行致病突变挖掘和验证，最终确定了

综合症的2个新的致病突变位点——BCS1L基因的c.556C>T突变和c.916C>T突变，且c.556C>T和c.916C>T的复合杂合突变导致

综合症的发生。

进而，根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码BCS1L突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.556C>T突变，或者c.916C>T突变。根据本发明的实施例，发明人确定了BCS1L基因的突变体，这些新突变体与

综合症的发病密切相关，从而通过检测这些突变体在生物样品中是否同时存在，可以有效地检测生物样品是否易患

综合症。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.R186*突变，或者p.R306C突变。通过检测生物样品中是否同时表达上述多肽，可以有效地检测生物样品是否易患

综合症。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患

综合症的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.556C>T和c.916C>T的复合杂合突变，判断所述生物样品是否易患

综合症。利用该系统，能够有效地筛选易患

综合症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种用于筛选易患

综合症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测与SEQ ID NO：1相比具有c.556C>T突变的BCS1L基因突变体，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.916C>T突变的BCS1L基因突变体的试剂。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患

综合症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码BCS1L突变体的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的编码BCS1L突变体的核酸”表示，本发明的构建体包含与SEQ ID NO：1相比具有c.1229delT突变的BCS1L基因突变体的核酸序列，或者包含与SEQ ID NO：1相比具有c.5840C>G突变的BCS1L基因突变体的核酸序列，或者同时包含上述两种BCS1L基因突变体的核酸序列。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗

综合症的药物。

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗

综合症的药物。

根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞同时表达与SEQ ID NO：1相比具有c.556C>T突变的核酸，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.916C>T突变的核酸。由此，利用本发明的药物筛选模型，能够有效地筛选治疗

综合症的药物。

需要说明的是，本发明发现的

综合症致病基因BCS1L的两个新的致病位点，该突变位点可以用于早期筛查

综合症致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗；也可用于

综合症患者的分子诊断及与相关疾病的的鉴别诊断，并且快速、准确、高效、简便、早期诊断率高，检测结果可以为

综合症的早期诊断、鉴别诊断及开发

综合症治疗药物提供科学依据。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易患

综合症的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1I为根据本发明实施例的筛选易患

综合症的生物样品的系统的示意图，

图1II为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1III为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了根据本发明的一个实施例，

综合症患者家系中先证者的BCS1L基因c.556C>T、c.916C>T突变位点的代表性Sanger测序验证峰图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

BCS1L基因突变体

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码BCS1L突变体的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：1相比，所述核酸具有c.556C>T突变，或者c.916C>T突变。在本文中所使用的表达方式“编码BCS1L突变体的核酸”，是指与编码BCS1L突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与BCS1L突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码BCS1L突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了BCS1L基因的新突变体，这些突变体与

综合症的发病密切相关，从而通过检测上述突变体在生物样品中是否同时存在，可以有效地检测生物样品是否易患

综合症，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否同时存在，有效地预测生物体是否易患

综合症。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

这些编码BCS1L突变体的核酸，是本申请的发明人通过外显子组测序、连锁分析联合Sanger测序验证的方法确定的

综合症的致病基因BCS1L的新的致病突变。这些致病突变位点在现有技术中并未被提到。

其中，野生型BCS1L基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：

ATGCCACTTTCAGACTTTATTCTGGCTCTGAAGGACAATCCCTACTTTGGGGCTGGATTTGGGCTGGTGGGTGTGGGCACAGCCCTGGCCCTGGCCCGGAAGGGTGTCCAACTGGGCCTGGTGGCATTCCGGCGCCATTACATGATCACACTGGAAGTCCCTGCTCGAGACAGGAGCTATGCCTGGTTGCTTAGCTGGCTCACCCGCCACAGTACCCGTACTCAGCACCTCAGTGTCGAGACTTCGTACCTTCAGCATGAGAGTGGCCGCATTTCCACTAAGTTTGAATTTGTCCCCAGCCCTGGAAACCATTTTATCTGGTATCGGGGGAAATGGATTCGGGTAGAACGAAGTCGAGAGATGCAGATGATAGACTTGCAGACGGGGACTCCTTGGGAATCTGTCACCTTCACGGCCCTGGGCACTGACCGAAAGGTTTTCTTCAACATCCTGGAGGAAGCTCGAGAGCTAGCCTTGCAGCAGGAGGAAGGGAAGACCGTGATGTACACAGCTGTGGGCTCTGAATGGCGTCCCTTTGGCTATCCACGCCGCCGGCGACCACTGAATTCTGTGGTTCTACAACAGGGTCTGGCTGACCGAATTGTCAGAGACGTCCAGGAATTCATCGATAACCCCAAGTGGTACACTGACAGAGGCATTCCTTACAGACGTGGCTACCTGCTTTATGGGCCCCCTGGTTGCGGAAAGAGCAGTTTTATCACAGCCCTGGCTGGGGAACTGGAGCACAGCATCTGCCTGCTGAGCCTCACGGACTCCAGCCTCTCTGATGACCGACTCAACCACCTGCTGAGCGTGGCCCCGCAGCAGAGCCTGGTACTCCTGGAGGATGTGGATGCTGCTTTTCTCAGTCGAGACTTGGCTGTGGAGAACCCAGTAAAGTACCAAGGCCTAGGTCGCCTCACCTTCAGTGGACTGCTCAATGCCTTGGATGGTGTGGCTTCCACCGAGGCCCGCATCGTGTTCATGACCACCAACCACGTTGACAGGCTGGACCCTGCCCTGATACGCCCGGGGCGAGTGGACCTGAAGGAGTACGTGGGCTACTGCTCACACTGGCAGCTGACCCAGATGTTCCAGAGGTTCTATCCAGGGCAGGCACCTTCCTTAGCTGAGAACTTTGCAGAACATGTCCTTCGAGCTACAAACCAGATCAGTCCTGCCCAGGTGCAGGGCTACTTCATGCTGTATAAAAATGACCCTGTAGGGGCAATTCACAATGCTGAGTCTCTGAGGAGGTGA(SEQ ID NO：1)，

其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

MPLSDFILALKDNPYFGAGFGLVGVGTALALARKGVQLGLVAFRRHYMITLEVPARDRSYAWLLSWLTRHSTRTQHLSVETSYLQHESGRISTKFEFVPSPGNHFIWYRGKWIRVERSREMQMIDLQTGTPWESVTFTALGTDRKVFFNILEEARELALQQEEGKTVMYTAVGSEWRPFGYPRRRRPLNSVVLQQGLADRIVRDVQEFIDNPKWYTDRGIPYRRGYLLYGPPGCGKSSFITALAGELEHSICLLSLTDSSLSDDRLNHLLSVAPQQSLVLLEDVDAAFLSRDLAVENPVKYQGLGRLTFSGLLNALDGVASTEARIVFMTTNHVDRLDPALIRPGRVDLKEYVGYCSHWQLTQMFQRFYPGQAPSLAENFAEHVLRATNQISPAQVQGYFMLYKNDPVGAIHNAESLRR(SEQ ID NO：2)。

发明人发现的两种BCS1L基因突变体，其中之一与SEQ ID NO：1相比，具有c.556C>T突变，即相对于野生型BCS1L基因，该BCS1L基因突变体的cDNA中第556位碱基C突变为T，由此，其所编码的产物与野生型BCS1L(SEQ ID NO：2)相比，具有p.R186*突变，即该突变是由于c.556C>T突变而引起的无义突变，导致第186位氨基酸突变成终止码，终止密码子翻译成蛋白。

而另一种BCS1L基因突变体，其与SEQ ID NO：1相比，具有c.916C>T突变，即相对于野生型BCS1L基因，该BCS1L基因突变体的cDNA中第916位碱基C突变为T，由此，其所编码的产物与野生型BCS1L(SEQ ID NO：2)相比，具有p.R306C的错义突变，即其第306位氨基酸从精氨酸突变为半胱氨酸。

本发明的发明人首次提出BCS1L基因的c.556C>T和c.916C>T的复合杂合突变导致患者出现

综合症的症状。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与野生型BCS1L相比，该述分离的多肽具有p.R186*突变，或者p.R306C突变。根据本发明的一些具体示例，具有p.R186*突变的多肽是由前述分离的编码具有c.556C>T突变的BCS1L基因突变体的核酸编码的，具有p.R306C突变的多肽是由前述分离的编码具有c.916C>T突变的BCS1L基因突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否同时表达上述多肽，可以有效地检测生物样品是否易患

综合症，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否同时存在，有效地预测生物体是否易患

综合症。

筛选易患

综合症的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易患

综合症的生物样品的方法的系统。

参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易患

综合症的生物样品的系统1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品BCS1L是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患

综合症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中BCS1L是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含BCS1L编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患

综合症的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患

综合症的生物样品的效率。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序平台进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361；Feb 2010)或Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063；Feb 2010)，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应BCS1L的编码序列即可。

另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集BCS1L外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块(图中未示出)，在该PCR扩增模块中设置有BCS1L外显子特异性引物，以便利用BCS1L外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。由此，可以通过PCR扩增，富集BCS1L外显子，从而能够进一步提高筛选易患

综合症的生物样品的效率。根据本发明的具体实施例，针对c.556C>T突变，所述BCS1L基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列；针对c.916C>T突变，所述BCS1L基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列：

发明人惊奇地发现，通过采用上述引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对BCS1L外显子的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO：3-6所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

根据本发明的实施例，可以用于进行测序的设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序平台，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序平台。根据本发明的具体示例，测序单元202可以为选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的区别判断生物样品是否易患

综合症。由此，利用该系统，能够有效地筛选易患

综合症的生物样品。

具体地，基于核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.556C>T和c.916C>T的复合杂合突变，判断生物样品是否易患

综合症。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.556C>T和c.916C>T的复合杂合突变，是生物样品易患

综合症的指示。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种用于筛选易患

综合症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易患

综合症的生物样品的试剂盒包括：适于检测与SEQ ID NO：1相比具有c.556C>T突变的BCS1L基因突变体，以及与SEQID NO：1相比具有c.916C>T突变的BCS1L基因突变体的试剂。利用根据本发明实施例的试剂盒，通过筛选同时存在上述两种BCS1L基因突变体的生物样品，能够有效地筛选易患

综合症的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测与SEQ ID NO：1相比具有c.556C>T突变的BCS1L基因突变体，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.916C>T突变的BCS1L基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测两种BCS1L突变体编码基因的试剂，也可以是检测BCS1L突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针或引物，优选地，针对与SEQ ID NO：1相比具有c.556C>T突变的BCS1L基因突变体，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列；针对与SEQ ID NO：1相比具有c.916C>T突变的BCS1L基因突变体，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列。由此，可以高效地筛选易患

综合症的生物样品。

需要说明的是，在本文前面筛选易患

综合症的生物样品的系统部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易患

综合症的生物样品的试剂盒，在此不再赘述。

构建体及重组细胞

根据本发明的第五方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的编码BCS1L突变体的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的编码BCS1L突变体的核酸”表示，本发明的构建体包含与SEQ ID NO：1相比具有c.556C>T突变的BCS1L基因突变体的核酸序列，或者包含与SEQ ID NO：1相比具有c.916C>T突变的BCS1L基因突变体的核酸序列，或者同时包含上述两种BCS1L基因突变体的核酸序列。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗

综合症的药物。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而，本发明的重组细胞能够表达构建体所携带的BCS1L基因突变体。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗

综合症的药物。根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。

构建药物筛选模型的方法

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞同时表达与SEQ ID NO：1相比具有c.556C>T突变的核酸，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.916C>T突变的核酸。根据本发明的实施例，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。根据本发明的一些实施例，利用本发明的药物筛选模型，能够有效地筛选治疗

综合症的药物。

需要说明的是，本发明构建药物筛选模型的方法不受特别的限制，只要使动物的至少一部分细胞同时表达前述的两种BCS1L基因突变体(与SEQ ID NO：1相比具有c.556C>T突变的核酸，以及与SEQ ID NO：1相比具有c.916C>T突变的核酸)即可。例如，可以用采用转基因技术，将前面所述的本发明的构建体转入受体动物(非人)，从而使达动物的至少一部分细胞同时表达前述的两种BCS1L基因突变体；也可以采用无标记转基因技术、定点整合技术、基因组编辑技术等，使受体动物的KCNJ6(GIRK2)基因发生c.556C>T和c.916C>T的复合杂合突变，并有效表达前述的两种多肽，从而该受体动物能够发生

综合症，进而能够有效地用于筛选治疗

综合症的药物，也即能够有效用作药物筛选模型。

需要说明的是，本发明采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个

综合症患者家系进行全基因组外显子组测序分析，从而发现了2个

综合症致病基因BCS1L的新突变位点。与传统的连锁分析、候选基因关联分析技术相比，外显子组测序技术针对基因组内编码蛋白质的外显子区域，目标集中，测序深度和精度更高，可以更准确的定位

综合症的致病基因及其突变位点，进而为阐明

S综合症的分子发病机制，开发有效的早期致病基因筛查和干预治疗措施提供科学依据。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1确定

综合症致病突变

1、样本收集

发明人收集到一个中国汉族2代

综合症患者家系，该家系包含4个成员，包括正常的父母和一个17岁的患病女儿(先证者)，一个12岁的患病儿子。两个患者均表现为稀毛和听力损失。

发明人收集该家系内所有成员的外周血样，加入EDTA抗凝，-80摄氏度保存。所有血样均签属知情同意书，并获得北京大学第一医院伦理委员会批准。

2、DNA提取

取上述家系所有成员的外周血，分别采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得各基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀均应位于1.7-2.0之间，浓度不少于200纳克/微升，总量不少于30微克。

3、已知致病位点检测

由于两个患者均表现为稀毛和听力损失，发明人首先关注的是已报道突变可能引起听力丧失或/和稀毛的基因GJB2、GJB3和GJB6：在先证者中针对这三个基因进行PCR和sanger测序，结果并没有发现已报道的致病突变。

由此，发明人继续下述的致病突变挖掘。

4、外显子捕获测序

发明人利用NimbleGen SeqCap EZ Exome(64M)结合Solexa高通量测序技术，对上述

综合症患者家系中的先证者(17岁的患病女儿)的外显子组序列进行了测序。

具体如下：

1)利用超声波仪(CovarisS2,Massachusetts,USA)将各基因组DNA样本随机打断成200-300bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库(可参见：http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文)。

2)文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂Biotinylated DNA Library进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，测序平台为Illumina Hiseq 2000，读取长度为90bp，各样本的平均测序深度最少为50×。

3)变异检测、注释及数据库比较

利用Illumina basecalling Software 1.7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPaligner/SOAP2(可参见：Li R,Li Y,Kristiansen K,etal,SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y,ea al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short readalignment.Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967，通过参照将其全文并入本文)比对到参考基因组UCSC NCBI37/hg19，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNP detection for massivelyparallel whole-genome resequencing.Genome Res 2009,19(6):1124-1132，通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。

结果，在这个样本中发现146427个单核苷酸多态性(SNPs)和11537处的插入/缺失。随后通过dbSNP数据库(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp132.txt.gz)，HapMap数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)，千人基因组数据库(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)，炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异(变异MAF值高，通常为不致病的普通多态性)，并利用SIFT软件进行SNP功能预测。

具体地，发明人挑选来自于遗传性耳聋数据库的所有gene list(http://hereditaryhearingloss.org/)，在外显子测序结果中的这些基因的已知突变位点均没有被sift软件预测为有害。然后，查看导致稀毛的所有基因在外显子测序数据中被sift软件预测为有害的新的突变位点，结果只有BCS1L基因c.556C>T(p.R186*)和c.916C>T(p.R306C)。

进一步，对先证者和她的正常父母和患病弟弟进行sanger测序验证，结果发现上述突变位点符合常染色体隐性遗传模式的共分离。由此，发明人认为，BCS1L基因的c.556C>T(p.R186*)和c.916C>T(p.R306C)突变极可能为

综合症的新的致病突变。

实施例2 Sanger法测序验证

分别对实施例1中所述的

综合症患者家系中的所有家系成员(包括2个患者和2个正常家系成员)以及300名随机挑取的家系外正常人的BCS1L基因进行检测：针对BCS1L基因的c.556C>T和c.916C>T突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证BCS1L基因的c.556C>T和c.916C>T突变与

综合症之间的相关性。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1中所述的提取DNA的方法，分别提取制备受试者外周静脉血中的基因组DNA，备用。

2、引物设计及PCR反应

首先，参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，设计得到针对BCS1L基因的c.556C>T和c.916C>T突变的外显子特异性引物，具体序列如下：

接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应：

反应体系(25μl)：

PCR反应条件：

由此，获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。

3、测序

将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。其中，测序采用ABI3730型测序仪进行。

基于测序结果，在本发明的

综合症患者家系中对BCS1L基因的c.556C>T(p.R186*)和c.916C>T(p.R306C)突变位点进行突变排查，结果发现该家系中两个患者均携带c.556C>T(p.R186*)和c.916C>T(p.R306C)的复合杂合突变，而表现正常的父母分别携带其中的一种杂合突变。此外，家系外正常人均不携带这两种突变。其中，以先证者为例，图2显示了

综合症患者家系中先证者(17岁的患病女儿)的BCS1L基因c.556C>T、c.916C>T突变位点的代表性Sanger测序验证峰图。如图2所示，先证者同时携带c.556C>T(p.R186*)和c.916C>T(p.R306C)两种突变。

由此，进一步证明BCS1L基因的c.556C>T(p.R186*)和c.916C>T(p.R306C)是

综合症的新的致病位点，BCS1L基因的c.556C>T和c.916C>T的复合杂合突变，能够导致该病。

实施例3检测试剂盒

制备一检测试剂盒，其包含能够检测BCS1L基因的c.556C>T和c.916C>T突变的引物，用于筛选易患

综合症的生物样品，其中这些引物为BCS1L基因外显子特异性引物，其序列如实施例2中所述SEQ ID NO：3-6所示。

利用上述试剂盒筛选易患

综合症的生物样品的具体步骤为：按照实施例1的步骤2所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述BCS1L基因的外显子特异性引物进行PCR反应(PCR反应体系和反应条件参照实施例2)，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否同时具有c.556C>T和c.916C>T突变，能够有效地检测本发明的两种BCS1L基因突变体在待测者DNA中是否同时存在，从而能够有效地检测待测者是否易患

综合症，进一步，能够从待测者中筛选出易患

综合症的生物样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种分离的编码BCS1L突变体的核酸，其特征在于，与SEQ ID NO：1相比，所述核酸具有c.556C>T突变，或者c.916C>T突变。

2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸为DNA。

3.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.R186*突变，或者p.R306C突变。

4.试剂在制备用于筛选易患

综合症的生物样品的试剂盒中的用途，其特征在于，

所述试剂适于检测与SEQ ID NO：1相比具有c.556C>T突变的BCS1L基因突变体，或者适于检测与SEQ ID NO：1相比具有c.916C>T突变的BCS1L基因突变体。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂为核酸探针或引物。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，针对与SEQ ID NO：1相比具有c.556C>T突变的BCS1L基因突变体，所述引物为SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列；

针对与SEQ ID NO：1相比具有c.916C>T突变的BCS1L基因突变体，所述引物为SEQ IDNO：5-6所示的核苷酸序列。

7.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码BCS1L突变体的核酸。

8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求7所述的构建体转化受体细胞而获得的。

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