CN110878346B

CN110878346B - 基因突变体及其应用

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Publication number: CN110878346B
Application number: CN201811039162.0A
Authority: CN
Inventors: 覃玉蓉; 郭健; 周静; 严海生; 张通达; 尹珍珍; 谢建生; 王勤
Original assignee: Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital; BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital; BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2038-09-06
Also published as: CN110878346A

Abstract

本发明公开了一种X‑连锁智力障碍相关的核酸、基因突变体及其应用。该X‑连锁智力障碍相关的核酸，与野生型OPHN1基因相比，具有c.1534G>T突变。本发明的核酸是X‑连锁智力障碍相关的OPHN1基因上的一种新的突变后的核酸，通过检测该核酸在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患X‑连锁智力障碍。OPHN1基因上的致病突变位点的发现，进一步拓展和完善了X‑连锁智力障碍的检测和研究，为该疾病的诊断或治疗提供了新的检测位点，以及新的检测方法和途径。

Description

基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及基因突变体及其应用，更具体地，本发明涉及核酸、基因突变、多肽、生物模型、用于治疗X-连锁智力障碍的药物、用于检测患X-连锁智力障碍的试剂盒、构建体及重组细胞。

背景技术

先天性智力障碍主要是由中枢神经系统发育异常引起的并可能伴有代谢紊乱等症状的复杂性疾病，据统计，智力障碍患者占总人口的1％～3％，男女比例为(1.4～1.6):1。引起先天性智力障碍的因素包括基因拷贝数发生变化、核苷酸小片段的缺失或插入、调控元件功能异常、表观遗传改变等。10％～15％智力障碍与X染色体连锁有关，X染色体的基因约占人类基因组的4％，这说明与智力相关的基因相对集中于X染色体上，并且研究发现人类X染色体基因在中枢神经系统中的表达量是其它组织中的2.8倍，进一步表明X染色体基因在大脑正常发育和功能中的重要作用。

早期通过连锁分析和候选基因测序确定X-连锁智力障碍(X-linkedIntellectual Disability,XLID)相关基因，高通量技术的出现加快了这一进程，自2007年更新10年来，与XLID相关的基因数量从72个增长到141个，增长了96％，主要通过高通量微芯片及下一代测序发现。这些基因中有多个基因与神经系统的突触连接、信号传递和其他信号通路有关，也有基因与脂肪酸代谢、基因转录、染色体加工以及氨基酸合成等有关。其中定位于Xq12并由25个外显子组成的OPHN1(oligophrenin-1)是X连锁的与智力障碍有关的基因之一，它编码91-kd Rho-GTP酶激活蛋白(RhoGAP)，参与调节RhoGTP酶的传导信号传导过程，与神经系统正常发育密切相关。OPHN1广泛表达于机体神经系统的各个部分，人们推断这个基因中的突变可导致除认知损害外还有其他临床症状的复杂的综合症。由于大脑中OPHN1被表达的地方具有高度可塑性的结构特点，与其它组织相比，大脑对于OPHN1功能的损伤具有更高的敏感性。OPHN1基因内突变如SNV、插入缺失、易位都会影响传导信号的传导过程，使大脑处理信息的能力被限制，从而导致智力障碍。

随着测序技术的发展，越来越多的X连锁智力障碍相关基因及其变异得到鉴定，为遗传性X连锁智力障碍的分子学诊断提供了基础，使得更多的遗传性X连锁智力障碍患者得到诊断与治疗。然而，由于遗传性X连锁智力障碍具有很强的遗传异质性，目前仍有大量的致病基因及突变未被鉴定，所以这方面的研究还有很大的空间，仍需要继续加强基因及突变鉴定方面的研究。

发明内容

OPHN1基因编码RhoGTP酶激活蛋白(RhoGAP)，参与调节RhoGTP酶的信号传导过程，与神经系统正常发育密切相关。OPHN1广泛表达于机体神经系统的各个部分，人们推断这个基因中的突变可导致除认知损害外还有其他临床症状的复杂的综合症。但是由于大脑中OPHN1被表达的地方具有高度可塑性的结构特点，与其它组织相比，大脑对于OPHN1功能的损伤具有更高的敏感性。

基于上述事实的发现，发明人收集了一个智力障碍男性先证者及其正常父母的trios家系，男性先证者通过全基因组测序技术，获得样本的变异数据，发明人结合先证者全基因组测序及sanger验证的结果，在基因OPHN1上发现一个半合子无义突变：c.1534G>T(p.Glu512Stop)。进而发明人通过对先证者父母样本进行PCR-Sanger测序法验证，OPHN1c.1534G>T(p.Glu512Stop)在父亲中未发现，在母亲中为杂合携带，此突变位点为X-连锁隐性遗传模式，且这个半合子无义突变在研究的家系中男性先证者及其父母出现了表型-基因型共分离的现象，因而发明人认为该变异很可能为X连锁智力障碍的致病变异。进而，发明人首次提出了在基因OPHN1上发生半合子无义突变：c.1534G>T(p.Glu512Stop)是X连锁智力障碍的致病基因突变。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，与野生型OPHN1基因相比，所述核酸具有c.1534G>T突变。发明人首次发现了OPHN1基因的c.1534G>T突变与X连锁智力障碍(如X-连锁隐性遗传智力障碍)的发病密切相关，从而通过检测具有c.1534G>T突变的核酸在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患X连锁智力障碍(如X-连锁隐性遗传智力障碍)。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种基因突变。根据本发明的实施例，与野生型OPHN1基因相比，具有c.1534G>T突变。发明人首次发现了OPHN1基因的c.1534G>T突变与X连锁智力障碍(如X-连锁隐性遗传智力障碍)的发病密切相关，从而通过检测上述基因突变在生物样品中是否发生，可以有效地检测生物样品是否患X连锁智力障碍，尤其是是否患X-连锁隐性遗传智力障碍。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种多肽。根据本发明的实施例，与所述野生型OPHN1基因表达的多肽的氨基酸序列相比，所述多肽的氨基酸序列具有p.Glu512Stop的突变。如前所述，OPHN1基因的c.1534G>T突变与X连锁智力障碍(如X-连锁隐性遗传智力障碍)的发病密切相关，因而，可以说具有c.1534G>T突变的OPHN1基因所表达的蛋白-具有p.Glu512Stop的突变的多肽(即多肽在512位Glu位点翻译终止)与X连锁智力障碍(如X-连锁隐性遗传智力障碍)的发病密切相关，进而通过检测上述多肽在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患X连锁智力障碍，尤其是是否患X-连锁隐性遗传智力障碍。

在本发明的第四方面，本发明提出了检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂在制备试剂盒或者设备中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒或者设备用于诊断X-连锁智力障碍。如前所述，前面所述的核酸、基因突变、多肽与X-连锁智力障碍的发病密切相关，进而检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂用于制备试剂盒或者设备，所得到的试剂盒或者设备能有效筛选出患X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的生物样品。

在本发明的第五方面，本发明提出了生物模型在筛选药物中的用途。根据本发明的实施例，所述生物模型携带下列至少之一：(1)权利要求1所述的核酸；(2)权利要求2所述的基因突变；(3)表达权利要求3所述的多肽。需要说明的是，“生物模型携带前面所述的核酸”表示，本发明的生物模型携带与野生型OPHN1基因相比具有c.1534G>T突变的OPHN1基因突变体的核酸序列；“生物模型携带前面所述的基因突变”表示，本发明的生物模型携带的OPHN1基因与野生型OPHN1基因相比具有c.1534G>T的突变。“生物模型携带前面所述的多肽”表示，本发明的生物模型携带与野生型OPHN1基因表达的蛋白相比具有p.Glu512Stop突变(即多肽在512位Glu位点翻译终止)的多肽。根据本发明的实施例的生物模型能有效地用作X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的相关研究的模型。

在本发明的第六方面，本发明提出了特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于X-连锁智力障碍。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的发病密切相关，由此，特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂制备的药物能有效用于治疗X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍。

在本发明的第七方面，本发明提出了一种用于治疗X-连锁智力障碍的药物。根据本发明的实施例，所述药物含有：特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的发病密切相关，由此，包含特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂的药物能有效用于治疗X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍。

在本发明的第八方面，本发明提出了一种筛选患X-连锁智力障碍的生物样品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型OPHN1基因相比是否具有c.1534G>T突变，判断所述生物样品是否患X-连锁智力障碍，其中，所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，其1534位点有且仅有c.1534G>T突变，是所述生物样品是否患X-连锁智力障碍的指示。根据本发明的实施例，“与野生型OPHN1基因相比，其1534位点有且仅有c.1534G>T突变”是指，对于男性而言，是指其X染色体上的OPHN1基因与野生型OPHN1基因相比，其1534位的碱基由G突变为T；对于女性而言，是指其两条X染色体上的OPHN1等位基因上的1534位的碱基均由G突变为T。通过根据本发明实施例的筛选患X-连锁智力障碍的生物样品的方法，可以有效地筛选患X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的生物样品。

在本发明的第九方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包含前面所述的核酸或前面所述的基因突变。需要说明的是，“构建体包含前面所述的核酸”表示，本发明的构建体包含与野生型OPHN1基因相比，核酸具有c.1534G>T突变。“构建体包含前面所述的基因突变”表示，本发明的构建体包含的OPHN1基因与野生型OPHN1基因相比具有c.1534G>T突变。由此，根据本发明实施例的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的相关研究的模型。

在本发明的第十方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞或者表达前面所述的多肽而获得的。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的相关研究的模型。

在本发明的第十一方面，本发明提出了一种检测X-连锁智力障碍的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒中包括检测前面所述的核酸的试剂，和/或检测前面所述的基因突变的试剂，和/或检测前面所述的多肽的试剂。如前所述，前面所述的核酸、基因突变、多肽与X-连锁智力障碍的发病密切相关，进而能用于包含能有效地检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂的试剂盒能有效筛选出患X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的生物样品。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明实施例的患者的脑磁共振成像(MRI)，轴位(A)，矢状位T2WI(B)和冠状位反转恢复(C)，注意扩大的脑池(A)和第四脑室下部与小脑池的连接(B)，小脑发育不全(C)；

图2为根据本发明实施例的Sanger验证峰图显示OPHN1基因的无义突变c.1534G>T，其通过先证者及父母样本的Sanger测序证实，其中先证者X染色体有无义突变c.1534G>T，母亲为杂合G/T位点，而父亲没有突变。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，本领域技术人员能够理解，在本发明中所使用的野生型OPHN1基因序列位置是以人类基因组中野生型OPHN1基因的序列为准，但当该野生型OPHN1基因存在与其他物种中时，该序列可能会有差异，可以通过将该物种的野生型OPHN1基因与人野生型OPHN1基因进行比对获得该物种的野生型OPHN1基因中所对应的位置。

需要说明的是，X-连锁智力障碍是性染色体隐性遗传病，是指对于男性而言，X染色体上的OPHN1基因的相应位点发生c.1534G>T突变即可致病，例如，将OPHN1基因的等位基因发生c.1534G>T突变记为a，不发生c.1534G>T突变记为A，对于男性而言，如果基因型表现为a，则该男性患有X-连锁智力障碍，对于女性而言，如果基因型表现为aa，即X染色体上的OPHN1基因两个等位基因的相应位点均发生c.1534G>T突变，则该女性患有X-连锁智力障碍，在本发明中筛选患X-连锁智力障碍的生物样品的方法中，所涉及的“与野生型OPHN1基因相比具有c.1534G>T突变”是指对于男性患者而言，其X染色体上的OPHN1基因具有c.1534G>T突变，对于女性患者而言，其两条X染色体上的OPHN1基因的两个等位基因均具有c.1534G>T突变。

核酸

对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及OPHN1基因的序列，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

发明人发现的OPHN1基因突变体，与野生型OPHN1基因相比具有c.1534G>T突变。其中，野生型OPHN1基因的序列的获取网址如下所示：http://grch37.ensembl.org/Homo_ sapiens/Transcript/Summary？db＝core；g＝ENSG00000079482；r＝X:6726218667653647； t＝ENST00000355520。本发明所述的c.1534G>T突变是以上述网址所对应的cDNA序列进行定位的。

发明人首次发现了OPHN1基因的c.1534G>T突变能够导致患者患X-连锁智力障碍的致病基因。

基因突变

多肽

发明人发现的OPHN1基因突变体所表达的多肽，与野生型OPHN1基因表达的多肽相比具有p.Glu512Stop突变(即多肽在512位Glu位点翻译终止)。其中，野生型OPHN1基因表达的多肽的序列的获取网址如下所示：

http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Summary？db＝core；g ＝ENSG00000079482；r＝X:6726218667653647；t＝ENST00000355520。本发明具有p.Glu512Stop突变(即多肽在512位Glu位点翻译终止)是以上述网址所对应的多肽的氨基酸序列进行定位的。

检测前面所述的核酸、基因突变、多肽的试剂在制备试剂盒或设备中的用途

在本发明的第四方面，本发明提出了检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽在制备试剂盒或者设备中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒或者设备用于诊断X-连锁智力障碍。如前所述，前面所述的核酸、基因突变、多肽与X-连锁智力障碍的发病密切相关，进而检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂能用于制备试剂盒或者设备，所得到的试剂盒或者设备能有效筛选出患X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的生物样品。

根据本发明的实施例，所述X-连锁智力障碍为X-连锁隐性遗传智力障碍。

根据本发明的实施例，所述试剂包括特异性针对所述核酸、所述基因突变和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。例如，发明人可通过特异性识别所述多肽的抗体与所述多肽的特异性结合来检测待测样品中是否存在上述突变，即通过特异性抗体与抗原的相互作用来检测上述多肽是否存在；发明人还可以通过预先设计特异性识别所述核酸或基因突变的探针，通过探针与上述核酸或基因突变位点所在的核酸片段发生互补配对，来鉴别上述核酸或基因突变的存在；发明人还可以设计用于扩增上述基因突变所在外显子的特异性引物，进而通过基因扩增以及测序，确定上述基因突变是否存在；发明人还可以通过质谱来检测多肽的m/z来判断，上述p.Glu512Stop突变(即多肽在512位Glu位点翻译终止)的多肽是否存在。根据本发明的具体实施例的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一能特异性、高灵敏性地检测出前面所述的核酸或者前面所述的基因突变或者前面所述的多肽，进而特异性、高灵敏性地筛选出患X-连锁智力障碍，尤其是患X-连锁隐性遗传智力障碍的生物样品，进而能有效用于制备筛选患X-连锁智力障碍，尤其是患X-连锁隐性遗传智力障碍的生物样品的试剂盒或者设备。

生物模型

在本发明的第五方面，本发明提出了生物模型在筛选药物中的用途。根据本发明的实施例，所述生物模型携带下列至少之一：(1)权利要求1所述的核酸；(2)权利要求2所述的基因突变；(3)表达权利要求3所述的多肽。需要说明的是，“生物模型携带前面所述的核酸”表示，本发明的生物模型携带与野生型OPHN1基因相比具有c.1534G>T突变的OPHN1基因突变体的核酸序列；“生物模型携带前面所述的基因突变”表示，本发明的生物模型携带的OPHN1基因与野生型OPHN1基因相比具有c.1534G>T突变。“生物模型携带前面所述的多肽”表示，本发明的生物模型携带与野生型OPHN1基因表达的蛋白相比具有p.Glu512Stop突变的多肽，即与野生型OPHN1基因表达的蛋白相比，该多肽在第512位Glu翻译终止。根据本发明的实施例的生物模型能有效地用作X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的相关研究的模型。

根据本发明的实施例，所述生物模型为细胞模型或者动物模型。

试剂在制备药物中的用途

根据本发明的实施例，所述试剂为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一的试剂。例如，CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，CRISPR-Cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于CRISPR-Cas9的方法，发明人可以设计出sgRNA并合成该序列的gRNA，然后将gRNA与d Cas9在细胞中共表达，通过gRNA介导d Cas9蛋白与目标DNA区域结合，进而实现特定位点的修复或改变。

治疗X-连锁智力障碍的药物

筛选患非X-连锁智力障碍的生物样品的方法

在本发明的第八方面，本发明提出了一种筛选患X-连锁智力障碍的生物样品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型OPHN1基因相比是否具有c.1534G>T突变，判断所述生物样品是否患X-连锁智力障碍，其中，所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，其1534位点有且仅有c.1534G>T突变，是所述生物样品是否患X-连锁智力障碍的指示。根据本发明的实施例，“与野生型OPHN1基因相比，其1534位点有且仅有c.1534G>T突变”是指对于男性而言，是指其X染色体上的OPHN1基因与野生型OPHN1基因相比，其1534位的碱基由G突变为T；对于女性而言，是指其两条X染色体上的OPHN1等位基因上的1534位的碱基均由G突变为T。通过根据本发明实施例的筛选患X-连锁智力障碍的生物样品的方法，可以有效地筛选患X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的生物样品。

首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品OPHN1基因是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选患X-连锁智力障碍的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中OPHN1基因是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含OPHN1基因编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选患X-连锁智力障碍的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选患X-连锁智力障碍的生物样品的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体实施例，可以利用选BGISEQ-500、BGISEQ-500RS、HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自BGISEQ-500、BGISEQ-500RS、HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集OPHN1基因外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。可以采用外显子靶向序列富集系统如：华大自主外显子捕获芯片，Aglient SureSelect，Nimblegen等其他外显子或目标区域捕获平台，对目标片段进行富集。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用选自OPHN1基因特异性引物的至少一种，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集OPHN1基因外显子，从而能够进一步提高筛选患X-连锁智力障碍的生物样品的效率。根据本发明的实施例，OPHN1基因特异性引物的序列不受特别限制，例如可以参考人类基因组序列数据库GRCh37.1/hg19，采用Primer3.0在线设计获得，例如可以参考UCSC(http://genome.ucsc.edu/)，应用Primer3(version 0.4.0,http://primer3.ut.ee/)设计候选基因的引物并合成(生工生物工程公司合成)，并利用Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)验证引物特异性。根据本发明的一些具体示例，针对c.1534G>T突变，所述OPHN1基因特异性引物具有如SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，通过采用SEQID NO：1-2所示的引物如所示，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对OPHN1基因突变的全基因组序列的扩增。需要说明的是，SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

正向引物：AGCTTTAGTCCCTCCCCACA(SEQ ID NO：1)，

反向引物：AAAGGCAGTTGGGGGAAAGT(SEQ ID NO：2)。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361；Feb 2010)或Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063；Feb 2010)，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应OPHN1基因的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列相应的参考序列进行比对，当所得到的核酸序列中具有前述的突变时，即指示生物样品患X-连锁智力障碍。由此，通过根据本发明实施例的筛选患X-连锁智力障碍的生物样品的方法，可以有效地筛选患X-连锁智力障碍的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与相应野生型基因序列进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAPALIGNER/SOAP2进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选患X-连锁智力障碍的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

构建体及重组细胞

在本发明的第九方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包含前面所述的核酸或前面所述的基因突变。需要说明的是，“构建体包含前面所述的核酸”表示，本发明的构建体包含与野生型OPHN1基因相比，核酸具有c.1534G>T突变。“构建体包含前面所述的基因突变”表示，本发明的构建体包含的OPHN1基因与野生型OPHN1基因相比具有c.1534G>T突变。由此，根据本发明实施例的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作X-连锁智力障碍，尤其是X-连锁隐性遗传智力障碍的相关研究的模型。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。

检测X-连锁智力障碍的试剂盒

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例

发明人通过对男性先证者全基因组测序及trios(男性先证者+正常父母)家系样本Sanger验证技术筛选一个X-连锁智力障碍患者的候选变异，通过对男性先证者全基因组测序数据进行生物信息学分析，筛除非致病核苷酸变异，缩小候选变异数目，对候选变异设计引物，进行PCR扩增，产物纯化，Sanger测序，对家系内成员进行候选变异检测，共分离分析，明确基因突变与疾病的关系。具体方法步骤如下：

1、样本收集：

发明人收集到一个中国汉族人智障先证者及其父母共3名成员样本，收集到的患者血液样本1例；收集到的表型正常的父母血液样本各1例。每个样本采集外周血样品2ml，加入EDTA抗凝，-80摄氏度保存。收集到的先证者是一名中国7岁男孩(2011年出生)，是健康无血缘关系父母的第一个孩子。没有家庭疾病史。通过产前B超检查观察到胎儿大脑发育畸形，父母拒绝胎儿羊膜穿刺术进行核型分析。患儿足月顺产，出生体重为3.2公斤(第70百分位)，身高49厘米(第31百分位)，头围(OFC)为34厘米(第30百分位)，出生史无异常。生活抬头、爬、站、行走等大运动较同龄儿发育缓慢，平衡力差，智力、语言发育落后，2岁时脑MRI显示脑室扩张，第四脑室下部与枕大池相通，小脑发育不良(图1)，脑积水，类似于Dandy-Walker综合征。患者出现脑积水并进行脑室腹腔分流术，术后到5岁时，他出现第一次癫痫发作，并用奥卡米尔治疗，癫痫发作得到良好控制。先证者在6岁时用核型分析和染色体微阵列分析(Chromosomal Microarray Analysis,CMA)进行了测试，两者均显示正常结果，现在7岁，他具有明显的面部畸形，有相对较大的耳朵。

2、DNA提取

(1)采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取DNA，提取步骤如下：

(2)取2mL全血样本，加入150uL OB Protease，2.1mL Buffer BL和20uL RNase A，最大速度漩涡1分钟，彻底混匀；

(3)65摄氏度水浴15-20分钟，并在水浴过程中漩涡5次；

(4)加入2.2mL无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀；

(5)将3.5mL裂解液移入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤；

(6)将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15mL离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；

(7)加入3mL HB Buffer，洗涤过滤柱，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；

(8)加入3mL DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；

(9)再次加入3mL DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；

(10)4000转离心15分钟，甩干过滤柱；

(11)将过滤柱移至新的15mL离心管，加入500uL 70摄氏度的Elution Buffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液；

(12)再次将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的ElutionBuffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。

3、全基因组测序与变异分析

发明人对先证者样本进行全基因组测序及数据分析。

其中，基于BGISEQ-500RS高通量测序平台，对上述先证者样本进行全基因组测序，具体步骤如下：

(1)样品制备

取上述先证者的外周血样品的基因组DNA，利用分光光度计及凝胶电泳法测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μL，总量不少于30μg，备用。

(2)文库构建及测序

利用自适应高聚焦超声技术(Covaris)将各基因组DNA样本随机打断成150-200bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库(可参见：http://www.mgitech.cn/product/6.html提供的MGIEasy DNA文库快速制备试剂盒说明书)。文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，参照BGISEQ-500RS标准的测序protocol进行测序，测序平台为BGISEQ-500RS，读取长度为100bp，样本的平均测序深度为30～40X。

(3)变异检测及筛选

将上述测序产出数据依次进行初步统计分析、SNP检测和注释及氨基酸替换的预测，主要步骤如下：

将测序产出数据进行基本数据分析统计：测得的序列reads长度分析、统计reads数量和数据的产量、reads序列与参考基因组序列的比对、统计目标区域比对到所要参考的基因组reads的覆盖度(Coverage)与测序深度(Depth)等。根据以上基本数据的统计结果，得到样本基本信息，并判断数据是否符合要求。

将各样本的高质量的原始reads通过edico genome公司的FPGA芯片比对到参考基因组(hg19)上并检测SNP和Indel，使用bcfanno对检测到的变异进行变异注释，同时添加1KG/ESP/HapMap/ExAC等频率数据库及OMIM、GO、KEGG、危害性预测等信息。过滤掉高频(1KG/ESP/HapMap/ExAC>0.01)及内含子区的变异。然后，根据先证者表型获取的HPO数据库中的HP ID对应的gene list，筛选出这些基因中含有的候选变异，根据ACMG(AmericanCollege of Medical Genetics)发布的类别1～3对候选变异进行判定，最后筛选出1个阳性变异位点。

(4)变异位点验证

采用Sanger测序对这个候选变异位点在trios(男性先证者+父母)基因组DNA样本中进行验证，验证过程如下所述：

a)所用到的扩增突变所在区域的PCR引物采用Primer3(version 0.4.0,http://primer3.ut.ee/)设计，引物由生工生物工程公司合成，利用Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)验证引物特异性，引物序列如下：

正向引物：5'-AGCTTTAGTCCCTCCCCACA-3'(SEQ ID NO：1)，

反向引物：5'-AAAGGCAGTTGGGGGAAAGT-3'(SEQ ID NO：2)；

b)利用所设计的引物对提取的DNA标本进行扩增，其中PCR扩增体系和扩增条件如下所述：

PCR反应体系：

dd H<sub>2</sub>O	15.3μl
		10X缓冲液	2.0μl
模板	1.0μl
		引物F	0.5μl
引物R	0.5μl
		dNTP	0.5μl
TransStart Taq聚合酶	0.2μl
		总体积	20.0μl

PCR反应条件：

c)PCR产物分析：将PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳(据扩增片段大小选择合适的电压)，分析电泳图谱；

d)选择带型单一且浓度较高的样本经PCR产物纯化后，

采用美国ABI公司自动基因分析仪3500测序分析PCR扩增产物，分析测序图，与标准序列进行对比，分析突变。鉴定致病基因及致病突变，表示OPHN1基因编码区第1534位碱基发生G→T改变(图2)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料的特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

深圳市妇幼保健院

<120> 基因突变体及其应用

<130> PIDC3183673

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物

<400> 1

agctttagtc cctccccaca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物

<400> 2

aaaggcagtt gggggaaagt 20

Claims

1.一种核酸，其特征在于，

与野生型OPHN1基因相比，所述核酸具有c.1534G>T突变；

所述核酸为DNA。

2.检测权利要求1所述的核酸的试剂在制备试剂盒或者设备中的用途，所述试剂盒或者设备用于诊断X-连锁智力障碍，所述X-连锁智力障碍为X-连锁隐性遗传智力障碍。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂包括特异性针对所述核酸的探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。

4.生物模型在筛选药物中的用途，所述生物模型携带权利要求1所述的核酸；

所述生物模型为细胞模型。

5.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求5所述的构建体转化受体细胞而获得的。

7.一种检测X-连锁智力障碍的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括检测权利要求1所述的核酸的试剂。