CN109797212B

CN109797212B - 一种检测肺动脉高压的致病/易感基因的方法

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Publication number: CN109797212B
Application number: CN201910088721.5A
Authority: CN
Inventors: 何昆仑; 伍建; 石金龙; 贾倩; 贾志龙; 赵晓静; 于康; 王依慧; 马俊峰; 张润敏
Original assignee: Beijing Mygenostics Co ltd; Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Beijing Mygenostics Co ltd; Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: CN109797212A

Abstract

本发明提供了一种检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的试剂在制备诊断肺动脉高压的产品中的应用，所述的试剂可以捕获与肺动脉高压的致病和/或易感的多种基因，可最多检测27个相关基因。本发明所述的试剂、含有试剂的产品可以解释肺动脉高压患者的病因，评估患有肺动脉高压的风险、危险因素，为患病个体分子遗传学诊断，高发人群普查、筛查家属中的发病高危人群以及进行相应的遗传咨询及产前诊断干预提供参考，以期减少肺动脉高压的发病率。同时，本发明所述的探针组、芯片及试剂盒具有高效、检测位点多、准确、操作简便、特异性好、灵敏度高、快速、实用性强且成本低廉的优势。

Description

一种检测肺动脉高压的致病/易感基因的方法

技术领域

本发明涉及基因工程及分子遗传学技术领域，具体涉及一种用于肺动脉高压的致病和/或易感基因的个性化捕获、测序的探针组及试剂盒。

背景技术

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是最常见的一种肺血管疾病，以肺动脉压力进行性增高、弥漫性肺小动脉痉挛和肺血管重构为主要病理改变，最终导致患者因右心衰竭死亡。肺动脉高压定义为肺动脉平均压(mPAP)在静息状态下≥25mmHg(1mmHg＝0.133kPa)，同时肺毛细血管楔压(PCWP)或左心房压(LAP)≤15mmHg。目前将肺动脉高压分为(2013年尼斯第五次肺动脉高压会议)：动脉性肺动脉高压(包括特发性、遗传性、药物和/或毒素相关性、疾病相关性及新生儿持续性肺动脉高压等)、左心疾病相关性肺动脉高压、肺部疾病和/或缺氧相关的肺动脉高压、慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronicthromboembolism pulmonary hypertension，CTEPH)以及多种未明机制所致肺动脉高压。

其中，Adams-Oliver综合征或遗传性出血性毛细血管扩张症也是引起肺动脉高压的原因。Adams-Oliver综合征，是一种罕见的常染色体显性遗传的神经外胚叶综合征。症状表现包括严重的先天性头皮发育不良，可累及皮肤和颅骨，以及广泛的先天性毛细血管扩张性大理石样皮肤和肢体缺陷。其他表现还包括血管瘤、缩颌和小颌、斜视、房间隔缺损、肺动脉狭窄、肺动脉高压、肺狭窄等。此病预后较差，应加强保护，防止感染和出血。遗传性出血性毛细血管扩张症是遗传性血管壁结构异常所致的出血性疾病，患者部分毛细血管、小血管壁变薄，仅由一层内皮细胞组成，周围缺乏结缔组织支持，以致局部血管扩张，扭曲。常见于口腔、鼻粘膜、手掌、指甲床和耳部及消化道。相关表型有：结膜、舌、胃肠道、唇部、甲床、腭、鼻粘膜、指腹毛细血管扩张，腹腔及肠系膜血管动静脉瘘，脊髓、胃肠道、肺、脑、肝的动静脉畸形，蛛网膜下腔出血，黑便，腹腔及肠系膜血管静脉曲张，贫血，发绀，缺血性中风，自发反复性鼻衄。肺动静脉畸形可以引起严重的并发症，包括肺动脉高压，矛盾性栓塞，感染性心内膜炎，贫血、咯血、血胸、红细胞增多症、中风、偏头痛、短暂性脑缺血发作，脑脓肿，癫痫等，给患者的生命造成严重危害。

肺动脉高压是一类发病机制复杂、多方面因素参与的综合征，因其起病隐匿，患者就诊时多已处于肺动脉高压心功能的Ⅲ～Ⅳ级，治疗难度大，药物敏感性低，心脏结构不可逆程度高，预后极差，通常从确诊到死亡绝大多数患者生存不足2年。目前PAH发病机制尚未完全阐明。但各种类型的PAH在晚期拥有相同的病理表现，提示其发病机制可能共享相同的分子通路。目前发现基因ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4与遗传性出血性毛细血管扩张症相关。ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4基因与Adams-Oliver综合征也有关。数十个基因异常与PAH相关，如BMPR2、SMAD9、CAV1、ENG等。其中，专利CN104650214A公开了肺动脉高压致病基因ACVRL1突变位点，通过检测该突变位点，预测待测样本是否患有肺动脉高压，可以作为治疗肺动脉高压的靶点。专利CN107602690A公开了肺动脉高压相关的PTGIS基因突变，该发明通过全基因组测序，发现PTGIS基因上存在3种与肺动脉高压紧密相关的PTGIS罕见变异，突变位点分别为c.755G>A、c.1339G>A以及位于内含子-外显子剪接位点的g.23867G>A。该发明有助于解释肺动脉高压患者的病因、该基因作为肺动脉高压的生物标志物或用于评估患者患肺动脉高压的风险。专利CN107760779A公开了肺动脉高压相关的突变型BMP9基因及其应用，通过检测生物样本的突变型BMP9基因或蛋白来检测、评估肺动脉高压。但是，均未公开本发明所述的肺动脉高压的致病和/或易感基因的组合，本发明所述的基因的组合中含有很多现有技术中没有公开的基因，其检测更加准确。

随着基因测序技术的发展，基因组序列测定的费用越来越低，收集个体样本遗传信息的速度也越来越快。第二代高通量测序技术(next-generation sequencingtechnology)具有快速、准确、低成本的优点，可同时对多个基因的各种类型突变进行检测，已经被广泛应用于遗传缺陷的病因检测和分子遗传学诊断，然而到目前为止，一直尚未有专门针对肺动脉高压的致病和/或易感基因检测的高通量探针、芯片或试剂盒，使得本病相关领域的进展严重滞后，发病率高居不下，遗传咨询和必要的产前干预措施无法施行，本应早发现、早明确病因、早干预治疗甚至部分可治愈的本病患者不能及早得到关注，不仅给患者和其家庭带来的巨大的痛苦和沉重的经济负担，也严重阻碍了我国整体人口素质的大幅度提高。目前商售人类全基因组外显子测序的价格在6千到8千人民币之间，而本发明的探针组的基因测序成本只有2千到3千人民币，可以大大降低患者的经济负担，是一种非常实用的肺动脉高压的筛查工具。

综上所述，开发一种高效、准确、快速、低价的肺动脉高压的致病和/或易感基因的探针组、芯片或试剂盒，用于肺动脉高压的致病和/或易感基因的基因筛查和分子遗传学诊断，意义非常重大。

发明内容

本发明人通过创造性劳动筛选出约27种与肺动脉高压的致病和/或易感相关的基因，根据这些基因的任意组合提供相应组合的探针组、芯片或试剂盒，可以判断是否患有肺动脉高压、解释肺动脉高压患者的病因、评估个体患肺动脉高压的风险、用于孕前预警指示突变基因携带者的后代患有肺动脉高压的风险或以各基因的变异位点作为靶点，为治疗肺动脉高压提供一种全新的思路和手段。为个体提供分子学遗传诊断，对患病家属的家系筛查，以及对突变携带者的早期干预治疗具有重要的临床意义，也可对再次妊娠的风险进行精确评估。

同时，本发明所述的探针组、芯片及试剂盒具有高效、检测位点多、准确、快速、实用性强且成本低的优势。

优选的，所述筛选的方法为结合大量数据库检索和/或对患者基因测序结果进行筛选。进一步优选的，所述的数据库为OMIM数据库，通过查询OMIM数据库及权威文献，确定以肺动脉高压为临床表型的疾病的致病基因。

本发明的第一方面，提供了一种肺动脉高压的诊断标志物，所述的诊断标志物选自基因BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2或SMAD4中的一种或两种以上的组合以及各基因表达的蛋白或蛋白的组合。

优选的，所述的生物标志物选自基因BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2或SMAD4中的一种或两种以上的组合。

优选的，上述的各生物标志物的基因发生突变会使肺动脉高压发生的风险剧增。

本发明所述的各生物标志物均可单独作为诊断或评估肺动脉高压的依据。

优选的，肺动脉高压诊断的依据为各基因或其组合的突变，或者，各基因或其组合基因的表达量的多少。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的肺动脉高压诊断的依据为各基因或其组合的突变。

优选的，通过基因测序的方法进行各基因或其基因组合的突变检测。

本发明的第二方面，提供了一种检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的试剂在制备诊断/预防肺动脉高压的产品中的应用，或者，在诊断肺动脉高压患病与否、解释肺动脉高压患者的病因、肺动脉高压患病风险度评估、肺动脉高压患者预后评估、孕前预警指示后代患病的风险度、筛选治疗或预防肺动脉高压的药物及为临床治疗提供决策支持的产品中的应用。

优选的，所述的试剂选自探针组、引物组、试剂盒、基因芯片或药物。

优选的，所述肺动脉高压的致病和/或易感基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2或SMAD4中的两种或两种以上的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述肺动脉高压的致病和/或易感基因为KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ACVRL1、GDF2或SMAD4中的两种或两种以上的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述肺动脉高压的致病和/或易感基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4或ENG中的两种或两种以上的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述肺动脉高压的致病和/或易感基因为BMPR2、KCNK3、ACVRL1或ABCA3中的两种或两种以上的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的试剂为检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的突变位点试剂；优选的，所述的肺动脉高压的致病和/或易感基因的突变位点为BMPR2基因的p.Q458Tfs*13、BMPR2基因的c.968-1G>T、BMPR2基因的p.I153Mfs*9、BMPR2基因的p.E874Sfs*22、KCNK3基因的p.I200T、KCNK3基因的p.A114V、ACVRL1基因的p.Q201K或ABCA3基因的p.V443M。

本发明的第三方面，提供了一种筛选用于治疗或预防肺动脉高压的药物的方法，包括如下步骤：

a)将能够表达突变型的上述基因或其组合的生物样品置于存在候选药物的条件下培养；

b)将能够表达突变型的上述基因或其组合的生物样品置于不存在候选药物的条件下培养；

c)检测步骤a)和步骤b)的生物样品中的人-6-酮前列腺素F-1α的表达水平；若步骤a)中的人-6-酮前列腺素F-1α的表达水平高于所述的步骤b)中的水平，则指示所述候选药物可以作为治疗或预防肺动脉高压的药物。

或者c)确定生物样品在步骤a)和步骤b)两种情况下的肺动脉压力、肺血管阻力以及动物死亡率变化，以此结果指示候选药物是否可以用于治疗或预防肺动脉高压。

优选的，所述的生物样品为动物模型。进一步优选的，所述的动物模型选自大鼠、小鼠、兔或猴。

本发明的第四方面，提供了肺动脉高压的致病和/或易感基因在制备诊断肺动脉高压的产品中的应用，所述肺动脉高压的致病和/或易感基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2或SMAD4中的两种或两种以上的组合。

本发明的第五方面，提供了一种检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的试剂，所述的肺动脉高压的致病和/或易感基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2或SMAD4中的两种或两种以上的组合；或者，所述的试剂选自探针组、引物组、基因芯片或试剂盒。

本发明的第六方面，提供了一种治疗或预防肺动脉高压的药物，所述的药物以上述各诊断标志物基因或基因的组合作为靶点。

本发明的第七方面，提供了一种探针组，所述探针组检测的各基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2或SMAD4中的两种或两种以上的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述探针组检测的各基因为KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、、ACVRL1、GDF2或SMAD4中的两种或两种以上的组合。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述探针组检测的各基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4或ENG中的两种或两种以上的组合。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的探针组检测的各基因为KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、、ACVRL1、GDF2及SMAD4的组合。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的探针组检测的各基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4及ENG的组合。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的探针组包含能同时特异性捕获27个致病基因的探针，所述探针组检测的各致病基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2及SMAD4的组合。

优选的，所述的基因为肺动脉高压致病和/或易感相关的基因。

优选的，根据上述各基因通过公知、通用的方法设计并合成探针序列，对目的片段进行特异性捕获、扩增、测序，以达到检测样本的目的。

本发明所述的基因或各基因的组合可以用于治疗或预防肺动脉高压的药物的筛选。

本发明所述的治疗或预防肺动脉高压的药物以上述各生物标志物基因或基因的组合作为靶点。

优选的，所述的肺动脉高压可以为动脉性肺动脉高压、左心疾病相关性肺动脉高压、肺部疾病和/或缺氧相关的肺动脉高压、慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronicthromboembolism pulmonary hypertension，CTEPH)以及多种未明机制所致肺动脉高压。所述的动脉性肺动脉高压包括特发性、遗传性、药物和/或毒素相关性、疾病相关性及新生儿持续性肺动脉高压。

优选的，所述的未明机制所致肺动脉高压选自Adams-Oliver综合征所致的肺动脉高压或遗传性出血性毛细血管扩张症所致的肺动脉高压。

本发明的第八方面，提供了一种肺动脉高压的致病和/或易感基因检测的方法，包括将待检DNA与检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的试剂混合；优选的，所述的肺动脉高压的致病和/或易感基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2或SMAD4中的两种或两种以上的组合。

优选的，所述的基因检测包括检测所述基因的有或无，或者，突变的有或无。进一步优选的，所述的突变选自剪切位点突变、无义突变或移码突变。

优选的，所述的基因检测包括检测所述基因的水平。

本发明所述的基因检测的方法可以为非诊断目的或诊断目的。

本发明所述的非诊断目的为应用所述的探针组检测上述基因组合中各基因的突变有或无以及检测上述基因组合中各基因的水平。

本发明所述的诊断目的为应用所述的探针组检测上述基因后诊断或预测疾病。

本发明的第九方面，提供了一种含有本发明所述的探针组的基因芯片。

优选的，所述的基因芯片还包括固相载体。进一步优选的，所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片或聚丙烯膜中的一种或两种以上的组合。

优选的，所述的基因芯片还包括相应的引物组。

优选的，所述探针固定在固相载体上的方法选自原位合成法、点样法或其他固定方法。

其中，将基因芯片中的探针固定在所述的固相载体上。优选的，将探针序列密集有序地排列固定在固相载体预先设置的区域内，形成微型检测器件。

本发明的第十方面，提供了一种含有本发明所述的探针组或本发明所述的基因芯片的试剂盒。

优选的，所述的试剂盒还包括杂交液和/或缓冲液和/或洗涤液。

进一步优选的，所述试剂盒还包括富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗液、NaOH溶液、Tris-HCl缓冲液、PCR反应液、TE缓冲液。

本发明的第十一方面，提供了一种所述的含有探针组的试剂盒的制备方法，包括：

1)根据上述肺动脉高压的各致病和/或易感基因制备相应的探针序列；

2)为步骤1)获得的探针序列加上生物素标记；

3)配制所需杂交液和/或缓冲液和/或洗涤液。

本发明的第十二方面，提供了一种肺动脉高压的致病和/或易感基因的检测方法，包括：

(1)提取待检测的DNA，制备全基因组文库；

(2)将步骤(1)获得的全基因组文库与肺动脉高压的致病和/或易感基因检测的试剂混合，进行PCR；

(3)纯化步骤(2)所述的PCR产物；

(4)对步骤(3)纯化后的PCR产物进行测序；

(5)对步骤(4)的测序结果进行分析。

优选的，所述的分析包括SNP分析和/或InDel分析。

优选的，所述的试剂为探针组、引物组或基因芯片。

本发明的第十三方面，提供了一种本发明所述的探针组、或本发明所述的基因芯片，或本发明所述的试剂盒在制备检测/预防肺动脉高压的致病和/或易感基因的产品中的应用，或者，在诊断肺动脉高压患病与否、解释肺动脉高压患者的病因、肺动脉高压患病风险度评估、肺动脉高压患者预后评估、孕前预警指示后代患病的风险度及为临床治疗提供决策支持的产品中的应用。

本发明所述的产品包括本发明所述的试剂，优选的，所述的产品选自探针组、引物组、试剂盒、基因芯片或药物。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1本发明探针组的设计和制备

一、致病和/或易感基因的筛选

本实施例中的致病和/或易感基因为：BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2及SMAD4。

对100位肺动脉高压患者(患者为医院临床确诊的肺动脉高压疾病，各患者均签署知情及自愿协议，并经医院医学伦理委员会批准)进行全外显子组测序，覆盖、检测范围为人类基因组已知的全部3万余个基因的所有外显子，其中，肺动脉高压患者的突变基因高度集中，基因组的其余基因(占绝大多数)虽然也有累及，但突变频率非常低，很多甚至只在单一患者有发现，其与疾病的相关性难以确定。因此在设计本发明探针组时，纳入在本病患者发生突变概率最高的上述27个基因，其突变累及频率均大于5，这样能够在最大限度地增加检出致病和/或易感基因的同时合理控制检测成本。

二、探针的制备

根据上述致病和/或易感基因的基因组序列，本领域技术人员可以通过公知、通用的方法设计并合成探针序列(例如专利WO2013/003585)，本实施例中对合成的探针序列进行生物素标记，具体操作为：采用本领域公知方法合成探针序列，均匀混合在总体积1.2mL的dH₂O中，取其中15μL利用通用的PCR引物(5’端序列为GACTACATGGGACAT(SEQID NO：1)、3’端的序列为GGAACCTACGACGTA(SEQ ID NO：2))，分三管进行PCR扩增，其中引物GACTACATGGGACAT(SEQ ID NO：1)为带有生物素标记的引物。

PCR扩增体系：上述探针溶液，5μL；正向引物(25μM)，2μL；反向引物(25μM)，2μL；MgCl₂(50mM)，4μL；10x Platinum Taq聚合酶缓冲液(购自Life Technologies)，5μL；dNTPs(每种10mM)，4μL；Platinum Taq聚合酶(5U/μL，购自Life Technologies)，1μL；H₂O，27μL；总体积50μL。

扩增条件：98℃，30s；(98℃，30s，60℃，25s，72℃，45s)35个循环；72℃，5min。

将PCR产物用MinElute PCR纯化试剂盒(购自Life Technologies)纯化后，取500ng，用MyOne链酶亲和素磁珠(购自Invitrogen)将PCR产物结合下来。然后加入碱性NaOH将没有生物素的互补链变性、洗脱下来；然后将整个磁珠用100℃的甲酰胺液体洗涤，使探针从磁珠上分离下来。用乙醇沉淀后即得到生物素标记的本实施例的探针组。

实施例2：本发明试剂盒组成、制备及使用。

本实施例所述的用于检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的试剂盒，是通过检测上述27个致病和/或易感基因的突变来进行受检个体的分子遗传学诊断或发病风险预测的试剂盒。

一、试剂盒的组成

所述试剂盒包含的成分为：实施例1所获得的探针组(160μL，150ng/μL)、富集缓冲液(208μL)、杂交缓冲液(800μL)、结合缓冲液(3.2mL)、漂洗液1(9mL)、漂洗液2(45mL)、NaOH溶液(0.1M，1mL)、Tris-HCl缓冲液(1M，pH 7.5，1.2mL)、PCR反应液(580μL)、TE缓冲液(800μL，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调pH至8.0，水定容至500mL)。其中各缓冲液组成如下：

(1)富集缓冲液(每20μL)：

人cot-1DNA(购自Invitrogen)，7μL；鲑鱼精DNA(购自Invitrogen)，3μL；

特异性封闭引物，共10μL，每种引物浓度为1nmol/μL：

引物1：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT(SEQ ID NO：3)；

引物2：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGC(SEQ ID NO：4)；

(2)杂交缓冲液：5倍浓度的SSPE(购自AMRESCO公司)，5倍浓度的Denhardt(购自USB公司)溶液，5mM EDTA(0.5M，pH8.0，购自Mediatech公司)，0.1％SDS；

(3)结合缓冲液：1M NaCl，10mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA；

(4)漂洗液1：1倍浓度的SSC溶液(NaCl 175g，柠檬酸三钠88g，调pH至7.4，dH₂O定容至1升)，0.1％SDS；

(5)漂洗液2：0.1倍浓度的SSC溶液(NaCl 175g，柠檬酸三钠88g，调pH至7.4，dH₂O定容至1升)，0.1％SDS；

(6)PCR反应液：2μL dNTPs(每种10mM)，

0.5μL引物3(AATGATACGGCGACCACCGA*G(SEQ ID NO：5)，50pmol)，

0.5μL引物4(CAAGCAGAAGACGGCATACG*A(SEQ ID NO：6)，50pmol)，20μL 5倍浓度的Phusion缓冲液(购自New England Biolab公司)，1μL Hotstart Phusion酶(购自NewEngland Biolabs)，5μL DMSO，51μL dH₂O；*表示中间有硫代修饰。

二、试剂盒的应用

1、DNA提取及全基因组文库制备

使用Qiagen DNA mini kit(250)(购自Qiagen)试剂盒提取外周血中的DNA。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳检测样本质量，完整的基因组DNA电泳条带通常应不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到75ng/μL，总量3-5μg DNA随机打断、扩增，从而建立全基因组文库。

2、目标致病和/或易感基因片段的特异性捕获及测序

1)制备以下混合体系：取1μg步骤1的构建好的全基因组文库，13μL富集缓冲液，5μL实施例1的本发明探针组；置于PCR仪上：95℃，7min，之后65℃，2min；

2)取65℃预热的杂交缓冲液23μL加入到上述步骤1)得到的混合液中，然后于PCR仪上65℃杂交22小时，得到富集体系混合物。

3)将MyOne C1链霉亲和素磁珠(购自Invitrogen)漩涡震荡使磁珠充分悬浮，短暂离心，使磁珠离心至管底部，取50μL MyOne C1链霉亲和素磁珠到新的1.5mL的离心管。

4)将装有50μL MyOne C1链霉亲和素磁珠的1.5mL离心管漩涡震荡至少5s，使磁珠充分悬浮，短暂离心后放入磁力架上保持静止一分钟(不要旋转离心管)，小心吸弃上清。

5)取下离心管，加入50μL的1倍浓度的结合缓冲液，旋窝震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，小心吸弃上清，重复三次。

6)取下离心管，加入100μL的2倍浓度的结合缓冲液，旋窝震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟。

7)将步骤2)得到的富集体系混合物加入到骤6)的离心管中，旋窝震荡至少5s(不用离心)，置于旋转仪上室温旋转1小时(60转/分钟)。

8)然后，利用漂洗液1室温清洗步骤7)的磁珠一次，15分钟，然后再用漂洗液2清洗3次，65℃，每次15分钟。

9)将步骤8)的磁珠用0.1M NaOH室温下洗脱10分钟，然后将洗脱液漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，然后将上清液转移到含有70μL Tris-HCl缓冲液(1M，pH 7.5)的干净离心管中。

10)采用Qiagen MinElute Column(购自Qiagen)对步骤9)得到的DNA溶液进行纯化，其纯化步骤参照Qiagen MinElute Kit的实验操作手册。

11)纯化的DNA通过PCR最终扩增15个循环：

PCR反应液：2μL dNTPs(每种10mM)，

0.5μL引物1(AATGATACGGCGACCACCGA*G(SEQ ID NO：5)，50pmol)，

0.5μL引物2(CAAGCAGAAGACGGCATACG*A(SEQ ID NO：6)，50pmol)，20μL 5倍浓度的Phusion缓冲液(购自New England Biolabs)，1μL Hotstart Phusion酶(购自New EnglandBiolabs)，5μL DMSO，51μL dH₂O；*表示中间有硫代修饰。PCR程序：98℃，30s(1cycle)；98℃，

25s，65℃；30s，72℃；30s(15cycles)；72℃，5min(1cycle)。

12)利用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒(购自Beckman Coulter)，根据使用手册纯化步骤11)的PCR产物。

13)将步骤12)得到的DNA产物在Illumina Nexseq 500测序仪上进行测序。

3、生物信息学分析流程及结果输出：

(1)SNP分析流程

①获取原始短序列；

②去除测序数据中的接头和低质量数据等；

③把短序列用SOAPaligner软件定位到人MHC3.6M基因组数据相应的位置上，所用到参数：soap2.20-a-b-t-v 3-l 42-s 63-m100-x 400，其中序列错配数为3，具体参数含义参考：http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html；

④统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；

⑤SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，所用到参数：soapsnp-i-d-o-r0.00005-e 0.0001-M-t-u-L-s-2–T，具体参数含义参考：

http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；

⑥过滤低质量值(质量值>＝20)和低覆盖度(深度>＝10)的SNP；

⑦利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；

⑧根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs，在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人MHC3.6M基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs；

(2)InDel分析流程

①把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到人MHC3.6M基因组上，所用到参数：bwa aln-L-l 31-i 10-k2-t 7-e 40，具体参数含义参考：

http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；

②用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；

③利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)。

实施例3本发明试剂盒的使用效果验证

利用本发明所述试剂盒(实施例2制备获得的)检测72例样本，结果证实目的致病和/或易感基因的捕获率满意，97.7％以上的原始短序列都能被比对回目标区域的参考序列，目标区域的平均有效测序数据量达到343.78Mb，目标区域的平均测序深度为596X(见表1)，远远高于一般的遗传疾病诊断要求(一般为20X)。

表1目的致病和/或易感基因测序数据质量

实施例4：本发明探针组及试剂盒的临床诊断实例

利用本发明实施例1制备的探针组及实施例2制备的试剂盒对8例肺动脉高压患者做出的分子遗传学诊断。患者为医院临床确诊的肺动脉高压相关疾病，各患者均签署知情及自愿协议，并经医院医学伦理委员会批准。

按照实施例2所述的试剂盒的组成、制备及应用的步骤进行本实施例的患者的分子遗传学诊断。其分子遗传学诊断结果见表2。

表2分子遗传学诊断结果

1、两例肺动脉高压患者分子遗传学诊断

①患儿(编号：PAH17C067203)，男，7岁，临床诊断为肺动脉高压。利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了BMPR2基因的一个错义突变：p.Q458Tfs*13。根据ACMG指南，该变异为致病性突变。患儿父母、姐姐均无该突变，确定该突变为新生突变。

②患者(编号：PAH17C067225)，女，28岁，临床诊断为肺动脉高压。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了BMPR2基因的一个剪接突变：c.968-1G>T。根据ACMG指南，该变异为致病性突变。患者父亲该位点杂合突变，母亲该位点无变异，女儿该位点杂合突变。

2、四例肺动脉高压患者的可疑致病突变

①患儿(编号：PAH17C067160)，女，14岁，临床诊断为肺动脉高压。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了BMPR2基因的一个移码突变：

p.I153Mfs*9。根据ACMG指南，该变异为疑似致病性突变。患者父亲该位点杂合突变，母亲该位点无变异。

②患儿(编号：PAH17C067189)，男，5岁，临床诊断为肺动脉高压。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了BMPR2基因的一个移码突变：p.E874Sfs*22。根据ACMG指南，该变异为疑似致病性突变。患者父亲该位点杂合突变，母亲该位点无变异。

③患儿(编号：PHA18C048769)，女，8岁，临床诊断为肺动脉高压。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了KCNK3基因的突变：p.I200T。该变异为疑似致病性突变。患者父亲该位点杂合突变，母亲该位点无变异。

④患儿(编号：PAH17C067193)，男，7岁，临床诊断为肺动脉高压。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了KCNK3基因的突变：p.A114V。该变异为疑似致病性突变。患者父亲该位点杂合突变，母亲该位点无变异。

3、一例遗传性出血性毛细血管扩张症2型患者的可疑致病突变

患儿(编号：PAH17C067231)，女，15岁，临床诊断为肺动脉高压。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现ACVRL1基因的一个错义突变：p.Q201K。发现该变异为遗传性出血性毛细血管扩张症2型的可疑致病突变。。患者父亲未验证，母亲该位点无变异。

4、一例肺表面活性剂功能障碍3型患者的可疑致病突变

患者(编号：PAH17C067227)，女，33岁，临床诊断为肺动脉高压，其母有类似症状。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了ABCA3基因的一个错义突变：p.V443M，发现该变异为肺表面活性剂功能障碍3型的可疑致病突变。患者父亲该位点杂合突变，母亲该位点无变异，女儿该位点杂合突变。

以上8例患者，利用本发明试剂盒，检测出4个致病和/或易感基因的不同位点突变，突变类型包含移码突变、错义突变。这些突变对蛋白功能产生了影响，参与疾病发生，因而很可能为上述患者的致病突变。这些除已知致病基因之外的其他致病和/或易感基因的纳入，将可能为临床上约90％的患者的分子遗传学诊断提供机会，新的致病和/或易感基因突变类型、突变频率和突变谱的检出，对完善疾病病因学假说会有很大帮助。

综上所述，本发明提供的用于检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点，可以同时最多检测、明确27个致病和/或易感基因的各种类型突变，因此本发明的探针组和试剂盒可应用于患病个体的分子遗传学诊断，同时还可用筛查肺动脉高压患者家属中的发病高危人群以及进行相应的遗传咨询或产前干预提供参考。由于肺动脉高压的病因与遗传学密切相关，具有起病隐匿、病程进展快、晚期不可逆、死亡率高的的特点，早发现、早诊断、及时干预有着重要意义。本发明的使用可以为尽早确立诊断和对患者采取正确、合理的干预、治疗措施提供依据，符合精准医疗的发展趋势。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 中国人民解放军总医院

北京迈基诺基因科技股份有限公司

<120> 一种检测肺动脉高压的致病/易感基因的方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gactacatgg gacat 15

<210> 2

<211> 15

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaacctacg acgta 15

<210> 3

<211> 50

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaaccgc 50

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatgatacgg cgaccaccga g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caagcagaag acggcatacg a 21

Claims

1.一种检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的试剂在制备诊断肺动脉高压的产品中的应用，其特征在于，所述肺动脉高压的致病和/或易感基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2及SMAD4的组合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的试剂为检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的突变位点试剂。

3.一种肺动脉高压的诊断标志物，其特征在于，所述的诊断标志物为基因BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2及SMAD4的组合。

4.肺动脉高压的致病和/或易感基因在制备诊断肺动脉高压的产品中的应用，其特征在于，所述肺动脉高压的致病和/或易感基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2及SMAD4的组合。

5.一种检测肺动脉高压的致病和/或易感基因的试剂，其特征在于，所述的肺动脉高压的致病和/或易感基因为BMPR2、SMAD9、CAV1、KCNK3、ABCA3、SARS2、HTR2B、THBS1、TOPBP1、EIF2AK4、CPS1、KRT18、KRT8、ABCD4、PIEZO2、NFU1、BOLA3、ATP5A1、ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、DLL4、ENG、ACVRL1、GDF2及SMAD4的组合；其中，所述的试剂选自探针组、引物组或基因芯片。

6.一种肺动脉高压的致病和/或易感基因的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括：

(1)提取待检测的DNA，制备全基因组文库；

(2)将步骤(1)获得的全基因组文库与权利要求5所述的肺动脉高压的致病和/或易感基因检测的试剂混合，进行PCR；

(3)纯化步骤(2)所述的PCR产物；

(4)对步骤(3)纯化后的PCR产物进行测序；

(5)对步骤(4)的测序结果进行分析；

其中，所述的试剂为探针组、引物组或基因芯片，所述的检测方法为非诊断目的。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的分析包括SNP分析和/或InDel分析。