CN113502326B - 基于生物标志物的肺动脉高压的诊断产品及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于生物标志物的肺动脉高压的诊断产品及其应用，所述生物标志物选自KCNA5、SPNS3和/或PVALB。相比正常对照，KCNA5、SPNS3、PVALB在肺动脉高压中呈现显著性差异，诊断效能结果显示，KCNA5、SPNS3和/或PVALB应用于肺动脉高压的诊断具有较高的准确性、敏感性和特异性。

Description

基于生物标志物的肺动脉高压的诊断产品及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，涉及基于生物标志物的肺动脉高压的诊断产品及其应用。
背景技术
肺动脉高压（Pulmonary hypertension, PH）是一组以肺血管阻力进行性增加和右心功能进行性衰竭为主要特征的慢性进展性疾病。其定义为在海平面上安静状态下右心导管测量肺动脉平均压（mPAP）大于25mmHg或在运动状态下大于30mmHg，而肺动脉楔压（PAWP）小于15mmHg。PH的病因及分类较为复杂，根据其病因可分为动脉性肺动脉高压、左心疾病所致肺动脉高压、缺氧和/或肺部疾病引起的肺动脉高压、慢性血栓栓塞性肺动脉高压、多种机制和/或不明机制引起的肺动脉高压。
不同类型肺动脉高压的表现具有一定的差异，目前尚无统一诊断标准，一般与患者合并疾病和右心功能密切相关。乏力和是持续性呼吸困难为最常见表现，几乎所有患者都会出现，甚至部分血流动力学仅为轻度异常的患者都有可能存在此类表现。RHC (RightHeart Catheterization，右心导管)是肺动脉高压的重要确诊手段，该检查方式具有一定的侵入性。研究人员通过对静息状态下患者进行测量，测得mPAP(肺动脉平均压)高于25mmHg，PCWP (Pulmonary Capillary Wedge Pressure，肺毛细血管楔压)低于15mmHg肺动脉高压即可确诊。其中，评估肺毛细血管楔压主要用于毛细血管前以及PCWP(毛细血管后肺动脉高压高于15mmHg)的区分。与此同时，超声心动图是诊断潜在疑似肺动脉高压病的检查方式，且需进一步结合不同类型的肺动脉高压分类筛查，明确形成肺动脉高压的原因，对预后作出判断，并指导治疗（张颖，刘双，杨京华.肺动脉高压诊断及分类[J].心肺血管病杂志2008, 27(3):191-192.）。但是，现有的心导管检查及影像学检查对早期PH的诊断较为困难。寻找新的可靠的生物标记物或方案辅助诊断肺动脉高压具有重要的临床意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明基于基因在肺动脉高压的发生发展中的作用，研究与肺动脉高压发生发展相关的生物标志物，从而为肺动脉高压的诊断和治疗提供新的手段。
本发明第一方面提供了一种诊断肺动脉高压的产品，所述产品包括检测样本中生物标志物KCNA5、SPNS3和/或PVALB水平的试剂。
进一步，所述样本中KCNA5、SPNS3和/或PVALB水平通过测量样本中KCNA5、SPNS3和/或PVALB的蛋白水平或mRNA水平来确定。
进一步，所述样本中KCNA5、SPNS3和/或PVALB的蛋白水平通过使用免疫染色、免疫荧光、蛋白质印迹或ELISA测量。
进一步，所述样本中的KCNA5、SPNS3和/或PVALB的mRNA水平通过使用微阵列、RNA-seq、原位杂交、RNA-scope以及常规的半定量或定量RT-PCR测量。
进一步，所述产品还包括处理样本的试剂。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的产品在制备诊断肺动脉高压的工具中的应用。
本发明第三方面提供了检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断肺动脉高压的产品中的应用，所述生物标志物包括KCNA5、SPNS3和/或PVALB。
进一步，所述试剂包括测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测生物标志物水平的试剂。
进一步，所述试剂选自：特异性识别所述生物标志物的探针；特异性扩增所述生物标志物的引物；或特异性结合所述生物标志物的抗体。
进一步，所述样本包括但不限于组织或流体，如组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其组分或经过处理的材料。
优选地，所述样本选自组织、血液。
本发明的有益效果：
本发明通过检测KCNA5、SPNS3和/或PVALB的表达水平，可以实现肺动脉高压的早期诊断，增加检测的敏感度，提高检测能力和效率，积极采取干预措施，延缓PH的进展，降低致残致死率。
附图说明
图1显示KCNA5基因差异表达图；
图2显示SPNS3基因差异表达图；
图3显示PVALB基因差异表达图；
图4显示KCNA5基因诊断肺动脉高压的ROC曲线图；
图5显示SPNS3基因诊断肺动脉高压的ROC曲线图；
图6显示PVALB基因诊断肺动脉高压的ROC曲线图；
图7显示KCNA5+SPNS3基因诊断肺动脉高压的ROC曲线图；
图8显示KCNA5+PVALB基因诊断肺动脉高压的ROC曲线图；
图9显示SPNS3+PVALB基因诊断肺动脉高压的ROC曲线图；
图10显示KCNA5+SPNS3+PVALB联合诊断肺动脉高压的ROC曲线图。
具体实施方式
以下将对本发明进一步详细说明，应理解，所述用语旨在描述目的，而非限制本发明。
术语“和/或”是指并且包括一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及在备选方案（或）中解释时缺少组合。
在本发明中，术语“生物标志物”意指化合物，优选是基因，与来自具有第二表型（例如没有疾病）的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型（例如患有疾病）的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在（即增加或减少）。术语“生物标志物”通常是指一种基因的存在/浓度/含量或两种或更多种基因的存在/浓度/含量。
术语 “生物标志物值” 或“生物标志物水平”是指针对受试者的至少一种相应的生物标志物测量或推导的值，并且其通常至少部分指示取自受试者的样品中的生物标志物的丰度或浓度。因此，生物标志物值可以是测量的生物标志物值，其是针对受试者测量的生物标志物值，或可替换地可以是推导的生物标志物值，其是推导自一个或多个测量的生物标志物值的值，例如，通过将函数应用于一个或多个测量的生物标志物值推导的。生物标志物值可以是任何合适的形式，这取决于其中确定值的方式。例如，可以使用高通量技术，诸如测序平台、阵列和杂交平台、质谱、免疫测定、免疫荧光、流式细胞术或这些技术的任意组合来确定生物标志物值。在一个优选的实例中，生物标志物值涉及表达产物或其他可测量分子的丰度或活性水平，使用如定量RT-PCR、测序等技术来定量。在这种情况中，如本领域技术人员已知的，生物标志物值可以是扩增含量或循环次数的形式，其是样品内生物标志物浓度的对数表示。在其他优选实例中，使用含有表达产物的细胞的免疫荧光来定量生物标志物值。
在本发明中，所述生物标志物包括KCNA5、SPNS3和/或PVALB。
在本发明中，KCNA5（potassium voltage-gated channel subfamily A member5，gene ID：3741）包括KCNA5基因及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的KCNA5，以及源自细胞中加工的任何形式的KCNA5。该术语涵盖KCNA5的天然发生变体（例如剪接变体或等位变体）。
SPNS3（sphingolipid transporter 3，gene ID：201305）包括SPNS3基因及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的SPNS3，以及源自细胞中加工的任何形式的SPNS3。该术语涵盖SPNS3的天然发生变体（例如剪接变体或等位变体）。
PVALB（parvalbumin，gene ID：5816）包括PVALB基因及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的PVALB，以及源自细胞中加工的任何形式的PVALB。该术语涵盖PVALB的天然发生变体（例如剪接变体或等位变体）。
gene ID可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得。
术语 “水平” 和 “含量” 在本文可互换使用，是指定量的含量（例如重量或摩尔）、半定量的含量、相对含量（例如，等级内的重量%或摩尔%）、浓度等。因此，这些术语涵盖样品中疾病治疗生物标志物的绝对或相对含量或浓度。
术语“引物”是指与DNA链配对时能够在合适的聚合剂存在下引发引物延伸产物合成的寡核苷酸。引物优选是单链的，以实现最大的扩增效率，但也可以是双链的。引物必须足够长，以在聚合剂存在下引发延伸产物的合成。引物的长度取决于许多因素，包括应用、待使用的温度、模板反应条件、其他试剂和引物来源。例如，根据靶序列的复杂性，引物可以为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500到引物3′ 端比模板序列短一个碱基的长度，以允许核酸链的延伸，尽管引物的5′ 端可以在长度上延伸超过模板序列的3′ 端。
在某些实施方案中，引物可以是大的多核苷酸，如约35个核苷酸至几千个碱基或更多。可以选择引物，以与模板上被设计成与其杂交的并且用作合成起始位点的序列 “基本上互补”。“基本上互补”表示引物足够互补以与靶多核苷酸杂交。理想地，引物不含与设计成与其杂交的模板的错配，但这不是必需的。例如，非互补核苷酸残基可以连接至引物的5′ 端，而引物序列的其余部分与模板互补。或者，可以将非互补核苷酸残基或一段非互补核苷酸残基链散布在引物中，只要该引物序列与模板序列具有足够的互补性以与其杂交，从而形成用于合成引物延伸产品的模板。
术语 “探针” 是指结合另一个分子的特定序列或子序列或其他部分的分子。除非另外指出，否则术语 “探针” 通常是指通过互补碱基配对结合另一个核酸（在本文也称为“靶多核苷酸” ）的核酸探针。探针可以结合缺少与探针的完整序列互补性的靶多核苷酸，这取决于杂交条件的严格性。探针可以直接或间接标记并且包括它们范围内的引物。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，且包括单克隆抗体（ 例如，全长或完整的单克隆抗体）、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体（ 例如，双特异性抗体，只要它们显示希望的生物学活性），且也可以包括某些抗体片段（ 如本文更详细地描述）。抗体可以是人、人源化和/或亲和力成熟的抗体。
生物标志物核酸的检测
在一些实施方案中，通过测定生物标志物核酸转录物水平来评估生物标志物。在说明性的基于核酸的测定中，根据标准方法从生物样品中所含的细胞分离核酸。核酸通常是分级后的或全细胞RNA。
在一些实施方案中，通过模板依赖性核酸扩增技术来扩增核酸。多种模板依赖性方法可用于扩增给定模板样品中存在的疾病治疗生物标志物序列。示例性核酸扩增技术是聚合酶链式反应（称为PCR）。
在某些有利的实施方案中，模板依赖性扩增涉及实时的转录物定量。例如，可以使用实时PCR技术来定量RNA或DNA。通过确定完成相同数目的循环并在其线性范围内的PCR反应中靶DNA扩增产物的浓度，可以确定原始DNA混合物中特定靶序列的相对浓度。如果DNA混合物是从不同组织或细胞分离的RNA合成的cDNA，则可以针对各个组织或细胞确定衍生该靶序列的特定mRNA的相对丰度。实时PCR通常使用本领域可用的任何PCR仪器进行。通常，用于实时PCR数据收集和分析的仪器包括热循环仪，用于荧光激发和发射收集的光学器件，和任选的计算机和数据采集与分析软件。
在某些实施方案中，使用印迹技术来定量靶核酸，这是本领域技术人员公知的。Southern印迹涉及使用DNA作为靶标，而Northern印迹涉及使用RNA作为靶标。各自提供不同类型的信息，尽管在许多方面，cDNA印迹与印迹或RNA物质类似。简而言之，使用探针来靶向已经固定于合适基质（常常是硝基纤维素滤器）上的DNA或RNA物质。不同的物质应在空间上分开，以利于分析。这通常是通过核酸物质的凝胶电泳，然后 “印迹” 到滤器上来完成的。随后，在促进变性和再杂交的条件下，将印迹的靶标与探针（通常是标记的）一起孵育。去除未结合的探针，完成检测。在检测/定量之后，可以将在给定受试者中观察到的结果与本文统计学显著的参照组或对照受试者群进行比较。这样，可以将检测到的疾病生物标志物核酸的量与疾病的进展或严重程度相关联。
芯片杂交利用连接固体基底的生物标志物特异性寡核苷酸，其可以由设计成微阵列的颗粒状固相组成，如尼龙滤器、载玻片或硅片。微阵列在本领域是已知的并且由表面组成，序列对应于基因产物（如cDNA）的探针可以在所述表面上的已知位置特异性杂交或结合，以检测生物标志物基因表达。
杂交复合物的定量是本领域公知的并且可以通过几种方法中的任何一种来实现。这些方法通常是基于标记或标志物的检测，如本领域标准使用的任何放射性、荧光、生物或酶标签或标记。可以将标记应用于寡核苷酸探针或源自生物样品的RNA。
通常，mRNA定量可与校准曲线一起合适地进行，以实现准确的mRNA测定。此外，优选通过与对照样品比较来对源自生物样品的转录物进行定量，所述样品的特征在于所检查的转录物的已知表达模式。
生物标志物蛋白的检测
在一些实施方案中，通过证明蛋白质的存在（分离的或一种或在细胞中） ，或通过生物标记物的一种或多种已知功能特性，在蛋白质表达水平上评估疾病治疗生物标记物。例如，用于KCNA5特异性或SPNS3特异性或PVALB特异性蛋白检测中的抗KCNA5、SPNS3、PVALB抗体是本领域已知的，可商购，并且也可以由本领域技术人员容易地生产。抗体和抗原-抗体复合物可以通过本领域几种熟知的测定法进行检测，包括免疫荧光测定法，免疫组织化学，荧光激活细胞分选（FACS）分析，酶联免疫吸附测定法（ELISA） ，放射免疫测定法（RIA），光发射免疫分析和蛋白质印迹分析。
在特定的实施方案中，进行免疫荧光或免疫细胞化学来检测蛋白质。细胞，如患病组织细胞，可以通过本领域已知的方法来分离或富集。细胞的分离或富集是指其中特定细胞（例如，患病组织细胞）的百分比相对于富集程序前样品中的百分比增加的过程。纯化是富集的一个实例。在其他实施方案中，可以将针对细胞上的表面标志物的抗体连接到固体支持物上，以进行分离。用于分离的程序可包括使用抗体磁珠（例如MiltenyiTM珠）的磁分离、亲和色谱法、使用连接固体基质的抗体 “淘选” 或任何其他方便的技术，例如LaserCapture Microdissection。提供特别精确的分离的其他技术包括FACS。一旦将细胞沉积在载玻片上，就可以将其固定，并用标记的抗体探测以检测疾病诊断生物标志物。
疾病生物标志物特异性的抗体可以直接缀合荧光标志物，包括荧光素、FITC、罗丹明、Texas Red、Cy3、Cy5、Cy7和其他荧光标志物，并在配备有合适滤镜的荧光显微镜下观察滤器。抗体也可以与酶缀合，酶在添加适当的底物后开始反应，从而在细胞上提供带有检测到的生物标记蛋白的有色沉淀。然后可以通过标准光学显微镜观察载玻片。或者，可以将疾病诊断生物标志物特异性的一抗进一步结合缀合至可检测部分的二抗。
免疫组织化学原理上与免疫荧光或免疫细胞化学非常相似，然而，例如，与细胞悬浮液相反，用疾病治疗生物标志物特异性的抗体探测组织标本。固定并处理活检标本，并任选将其包埋在石蜡中，如果需要，切片，以提供随后用乙酰肝素酶特异性抗体探测的细胞或组织载玻片。或者，可将冷冻组织低温恒温器上切片，然后进行抗体探测，从而避免了固定诱导的抗原掩盖。将抗体，如在免疫荧光或免疫细胞化学中的，偶联至荧光或酶联的可检测部分，并通过针对免疫荧光描述的方法用于探测组织切片，然后根据所用的检测方法通过荧光或共聚焦显微镜观察。反应产物形成后，如果利用了酶促可检测的部分，则可以通过标准光学显微镜观察反应产物沉淀物的可视化。
在其他实施方案中，使用如ELISA和RIA这样的测定，其遵循类似的原理用于检测特异性抗原。作为说明性实例，可以通过通常用125I放射性标记的KCNA5、SPNS3或PVALB特异性抗体使用RIA来测量KCNA5、SPNS3或PVALB。在ELISA测定中，KCNA5、SPNS3或PVALB特异性抗体与酶化学连接。KCNA5、SPNS3或PVALB特异性捕获抗体被固定在固体支持物上。然后在其中阻断非特异性结合的条件下，将未标记的样本，例如来自生物样品的蛋白质提取物，与固定的抗体一起温育，并通过洗涤除去未结合的抗体和/或蛋白质。结合的KCNA5、SPNS3或PVALB通过第二个KCNA5、SPNS3或PVALB特异性标记抗体来检测。在RIA中，通过测量放射性直接测量抗体结合，而在ELISA中，结合是通过将无色底物转化为有色反应产物的反应来检测的，作为连接的酶的活性的函数。因此，可以通过分光光度法容易地检测到变化。
蛋白质生物标志物表达也可以通过发光免疫测定来检测。与ELISA和RIA极为相似，在发光免疫测定中，将待测试的生物样品/蛋白质提取物固定在固体支持物上，并用特异性标记（标记的抗体）进行探测。该标记又是发光的，并在结合时发光，以作为特异性识别的指示。发光标记包括在通过电磁辐射、电化学激发或化学激活而在激活时发光的物质，并且可以包括荧光和磷光物质、闪烁体和化学发光物质。标记可以是催化反应系统的一部分，如酶、酶片段、酶底物、酶抑制剂、辅酶或催化剂；色原系统的一部分，如荧光团、染料、化学发光剂、发光剂或敏化剂；可分散颗粒（可以是非磁性或磁性的）、固体支持物、脂质体、配体、受体、半抗原放射性同位素等。
Western印迹分析是评估生物样品中疾病生物标志物多肽含量的另一种方法。来自细胞（例如患病组织细胞）的生物样品的蛋白质提取物在变性电离环境中溶解，并将等分试样施加到聚丙烯酰胺凝胶基质上。随着向阳极迁移，蛋白质会基于分子大小特性进行分离。然后将抗原转移到硝酸纤维素膜、PVDF或尼龙膜上，然后进行膜阻断以最小化非特异性结合。用与可检测部分直接偶联的抗体探查膜，或随后用含有可检测部分的二抗探查膜。通常，将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶与抗体偶联，并使用发色或发光底物使活性可视化。
在特定的实施方案中，使用允许同时检测和/或定量大量蛋白质的蛋白质捕获阵列。例如，滤膜上的低密度蛋白质阵列，现在有可能使用蛋白质阵列来分析体液中蛋白质的表达，如健康或患病受试者的血清中以及药物治疗前后的受试者中的蛋白质表达。示例性蛋白质捕获阵列包括包含空间寻址的抗原结合分子的阵列，通常称为抗体阵列，其可以促进限定蛋白质组或亚蛋白质组的多种蛋白质进行广泛的平行分析。已经显示抗体阵列具有所需的特异性和可接受背景的特性。
诊断产品
本发明提供了一种诊断肺动脉高压的产品，所述产品包括检测样本中本发明所述的生物标志物的试剂；并且可包括使用所述产品评估受试者是否患有或易患肺动脉高压的说明书。
诊断产品还可以任选包括合适的用于检测标记的试剂、阳性和阴性对照、洗涤溶液、印迹膜、微滴定平板、稀释缓冲液等。例如，基于蛋白质的检测诊断产品可以包括（i）至少一种疾病生物标志物多肽；和（ii）特异性地结合疾病治疗生物标志物多肽的抗体。或者，基于核酸的测试剂盒可以包括（i）疾病治疗生物标志物多核苷酸；和（ii）与疾病治疗生物标志物多核苷酸特异性地杂交的引物或探针。还可以包括适用于扩增核酸的酶，包括各种聚合酶（逆转录酶、Taq、SequenaseTM、DNA连接酶等），脱氧核糖核苷酸和缓冲液，以提供扩增所需的反应混合物。此类试剂盒通常还将以合适的方式包含用于每种单独的试剂和酶以及每种引物或探针的不同容器。
可使用本文所述的能够检测样本生物标志物的任何形式的样本测定。通常，所述测定将定量样本中生物标志物至一定的程度，例如它们的浓度或量是高于还是低于预定阈值。此类试剂盒可采取测试条、浸杆、盒、药筒、基于芯片或基于珠粒的阵列、多孔板或一系列容器等的形式。提供一种或多种试剂以检测所选样本生物标志物的存在和/或浓度和/或量。可将受试者的样本直接分配到测定中，或从存储的或先前获得的样品中间接分配到测定中。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1与肺动脉高压相关的生物标志物的检测
1、样本采集
收集7例慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）患者和5例健康人群对照组的血液样本，在收集样本时详细记录患者以及健康对照组的基本信息，包括年龄，性别，BMI等，其中疾病组和健康组在年龄、性别、BMI等无统计学差异。
疾病组纳入标准：经右心导管置入术、肺通气灌注扫描或CT肺血管造影(CTPA)诊断为CTEPH。CTEPH的诊断需同时满足以下3 条：①至少已行 3个月的有效抗凝治疗， 以排除亚急性 PTE；②V/Q 显像扫描显示至少1个肺段灌注缺损，或多层螺旋CT肺动脉成像（computed tomography pul-monaryangiography, CTPA）、MRI 或直接肺血管造影等检查发现CTEPH的特异性征象，如环状狭窄、网格征及缝隙征和动脉闭塞；③右心导管测定肺循环血流动力学指标符合肺高压诊断标准 [平均肺动脉压≥25 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、肺小动脉楔压≤15 mm Hg)]。
疾病组排除标准：存在循环系统疾病，如恶性肿瘤、高血压、糖尿病、冠心病或脑血管疾病。
健康组纳入标准：包括与CTEPH组年龄、性别相匹配的健康对照组和正常血常规/尿常规/生化试验/癌胚抗原(CEA)/甲胎蛋白(AFP)/血沉(ESR)/胸透。
健康组排除标准：排除既往该疾病病史、头部外伤及手术史、心脏手术史或神经系统疾病的人群。
2、实验方法
2.1 血液总RNA的提取
使用BD公司出产的PAXgene Blood RNA Kit试剂盒提取血液总RNA，操作步骤按说明书进行。
2.2样品检测
使用 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent RNA 6000 Nano Kit)检测 totalRNA 的浓度、RIN值、28S/18S 和片段大小。
2.3文库的构建与转录组测序
1）DNase 消化去除DNA：利用DNase I 消化Total RNA 样品中存在的DNA 片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC 水；
2）去除 rRNA：取消化好的Total RNA 样品，使用试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100 检测，验证rRNA 去除效果；
3） RNA 打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR 仪中进行热打断，打断到130-160nt；
4）反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer 适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系 Mix，在 PCR仪上按相应程序合成一链 cDNA；
5） 反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer 上适温反应一定时间，合成二链 cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收。产物用磁珠进行纯化回收；
6）末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer 中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA 双链的粘性末端进行修复。末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution ；
7）cDNA 末端加 “A”：配制加“A”反应体系，在 Thermomixer 中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物 cDNA 的 3’末端加上 A 碱基；
8）cDNA adapter 的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer 中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A 碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；
9）PCR 反应及产物回收：配制PCR 反应体系，选择适当的PCR 反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增。对PCR产物进行磁珠纯化回收。回收产物溶于EB 溶液中。贴上标签，文库制备至此完成；
10）文库质量检测：使用Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent DNA 1000Reagents)检测文库的片段大小及浓度；
11) PCR 产物环化：将PCR 产物变性为单链后，配制环化反应体系，充分混匀适温反应一定时间，得到单链环形产物，消化掉未被环化的线性DNA 分子后，即得到最终的文库；
12）上机测序：单链环状 DNA 分子通过滚环复制，形成一个包含 200 多个拷贝的DNA 纳米球（DNB）。将得到的 DNBs 采用高密度 DNA 纳米芯片技术，加到芯片上的网状小孔内。通过边合成边测序的方法，得到50bp/100bp 的测序读长。
2.4测序数据质量控制
对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据（clean data），步骤如下：去除reads中的adapter序列；剪切前去除5’端含有非AGCT的碱基；修剪测序质量较低的reads末端 (测序质量值小于Q20)；去除含N的比例达到10%的reads；舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。
2.5 与参考基因组比对
使用hisat2分析软件价格测序数据比对到参考基因组上。参考基因组来自于Ensembl数据库，基因组版本GRCh38，基因注释信息为Ensemble 92。
2.6基因表达水平分析
通过比对到参考基因组区域的序列（clean reads）的数量来计算基因的表达水平。使用Stringtie根据Hisat2软件的比对结果，计算每个基因/转录本在样本中的FPKM值，以该值作为基因/转录本在样本中的表达量。
2.7 mRNA差异表达分析
使用DESeq2比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异，差异分析步骤如下：首先对原始的read count进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正；通过统计学模型进行假设检验概率(P-value)的计算，进行多重假设检验校正(BH)，得到padj值(错误发现率)，差异表达基因的筛选标准为：pvalue<0.05 和 |log2foldchange|>1。
3、结果与分析
3.1对数据质控后的序列进行数据量统计，结果如表1所示。
表1 测序数据统计表
Figure 214535DEST_PATH_IMAGE001
(1) Sample ID：样品信息； (2) total_reads：统计原始序列数据的条数； (3)total_bases：Raw reads的条数乘以长度，并转化为以G为单位； (4) Q20、Q30：分别计算Phred 数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比； (5) GC content：计算碱基G和C的数量总和占总的碱基数量的百分比。
3.2 差异表达基因分析
对疾病组和健康对照全部样本进行高通量测序分析，与健康对照相比，呈现显著性差异的基因有437个，其中表达上调基因233个，表达下调的基因有204个。
其中，PVALB、KCNA5肺动脉高压患者中表达显著上调，SPNS3在肺动脉高压患者中表达显著下调，具体表达情况如表2所示。
表2 基因的差异表达
Figure 662834DEST_PATH_IMAGE002
实施例2 差异基因的验证及诊断效能检测
1、数据和预处理
从GEO数据库下载肺动脉高压及其对照的数据集GSE33463的基因表达数据，并利用注释文件对其注释，多个探针对应同一个基因的取平均值作为其表达量，然后获得基因表达矩阵文件。
2、差异表达分析
使用R软件中的“limma”包进行差异基因的表达分析。
分析结果显示，PVALB、KCNA5肺动脉高压患者中表达显著上调，SPNS3在肺动脉高压患者中表达显著下调，其表达情况如图1-3所示，其中，*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。
3、诊断效能分析
使用R包“pROC”ROC曲线，分析差异表达基因作为检测变量的AUC值、敏感性和特异性，判断其诊断效能。在判断每个基因的诊断效能时，直接使用基因的表达量进行分析。首先调用pROC包，然后读入目的基因构建的表达量矩阵，运行绘制ROC曲线的命令，同时涉及添加AUC，thres（阈值）、smooth（拟合曲线）的命令。在判断基因联合的诊断效能时，首先是使用glmnet对基因进行logistics回归，利用建立的Logistic回归模型，使用predict（预测）函数观察某个预测变量在各个水平对结果概率的影响，计算预测概率，绘制预测结果的ROC曲线。
结果如表3和图4-10所示，从表3中可以看出KCNA5、SPNS3、PVALB及其组合应用于肺动脉高压的诊断具有较高的准确性，尤其是三者的组合，具有较高的准确性、敏感性以及特异性。
表3 差异表达基因诊断效能分析
Figure 239309DEST_PATH_IMAGE003
以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。

Claims (9)

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断肺动脉高压的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括SPNS3和/或PVALB。
2.根据权利要求所述的应用，其特征在于，所述生物标志物还包括KCNA5。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测生物标志物水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：特异性识别所述生物标志物的探针；特异性扩增所述生物标志物的引物；或特异性结合所述生物标志物的抗体。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述样本选自组织、血液。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述样本中KCNA5、SPNS3和/或PVALB水平通过测量样本中KCNA5、SPNS3和/或PVALB的蛋白水平或mRNA水平来确定。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述样本中KCNA5、SPNS3和/或PVALB的蛋白水平通过使用免疫染色、免疫荧光、蛋白质印迹或ELISA测量。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述样本中的KCNA5、SPNS3和/或PVALB的mRNA水平通过使用微阵列、RNA-seq、原位杂交、RNA-scope以及常规的半定量或定量RT-PCR测量。
9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品还包括处理样本的试剂。
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