BE1030223B1 - Auf Biomarkern basierende Produkte zur Diagnose von pulmonaler Hypertonie (PH) und ihre Anwendungen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt Biomarkern basierende Produkte zur Diagnose von pulmonaler Hypertonie (PH) und ihre Anwendungen. Die Biomarker sind aus KCNA5, SPNS3 und PVALB entnommen. Im Vergleich zu normalen Kontrollen sind bei KCNA5, SPNS3, und PVALB signifikante Unterschiede zu erkennen, die wirksamen Ergebnisse der Diagnosen zeigen, wobei bei der Anwendung von KCNA5, SPNS3 und PVALB bei pulmonaler Hypertonie eine höhere Genauigkeit, Sensitivität und Spezifität erzielt werden.

Description

1 BE2023/5240

Auf Biomarkern basierende Produkte zur Diagnose von pulmonaler Hypertonie (PH) und ihre Anwendungen

Fachgebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biomedizin, und auf Biomarkern basierende Produkte zur Diagnose von pulmonaler Hypertonie (PH) und ihre Anwendungen.

Technischer Hintergrund

Verschiedene Arten PH kommen immer klinisch mit gewissen Unterschieden zum Ausdruck, es gibt momentan noch keine einheitlichen Kriterien zur Diagnose, die im Allgemeinen eng mit der komorbiden Erkrankung und der Rechtherzfunktion zusammenhängt. Die aktuellen

Herzkatheter- und bildgebenden Untersuchungen weisen bei der früheren PH-Diagnose

Schwierigkeit auf. Deshalb ist die Suche nach neuen Biomarkern zur Ergänzung der aktuellen

Diagnostik klinisch von großer Bedeutung.

Beschreibung der Erfindung

Um die Mängel des aktuellen technischen Stand zu beheben, basierend auf der Verhalten- und Funktionsweise der Gene unter pulmonaler Hypertonie befasst sich die vorliegende

Erfindung mit PH relevanten Biomarkern, um die Behandlung und Diagnose von PH auf neuem technischen Stand zu bringen.

Die vorliegende Erfindung stellt einerseits ein Produkt zum Diagnostizieren der PH zur

Verfügung, das Produkt umfasst Reagenzien zur Bestimmung der KCNA5, SPNS3, und PVALB-

Spiegel der Biomarkern in der Probe.

Des weiteren erfolgt die Bestimmung von KCNA5, SPNS3 und PVALB-Spiegel in der Probe durch die Bestimmung der Protein- und mRNA-Spiegel von KCNA5, SPNS3 und PVALB.

Des weiteren erfolgt die Bestimmung der Proteinspiegel von KCNA5, SPNS3 und PVALB in der Probe durch Immunfärbung, Immunfluoreszenz, Western-Blotting und ELISA-Verfahren.

Des weiteren erfolgt die Bestimmung des mRNA-Spiegels von KCNA5, SPNS3, und PVALB in der Probe durch Microarray, RNA-seg, In- situ- Hybridisierung, RNA-scope und reguläre halbquantitativen oder quantitativen RT-PCR Test.

Des weiteren umfasst das Produkt ein Reagenz zur Handhabung der Probe.

Andererseits findet die vorliegende Erfindung Anwendung zur Herstellung der diagnostischen

Instrumente.

Drittens findet die vorliegende Erfindung Anwendung von Reagenzien zur Identifizierung von

Biomarkern bei Herstellung von Produkten zur Diagnose der pulmonaler Hypertonie, der

Biomarker umfasst KVN5,SPNS3, und PVALB.

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Des weiteren umfasst das s.g. Reagenz Reagenzien zur Bestimmung der Biomarkerspiegel durch Sequenzierungsverfahren, Verfahren der Nukleinsäurenhybridisierung,

Amplifikationsverfahren der Nukleinsäuren und Proteinimmunoassay-Verfahren.

Des weiteren besteht das Reagenz aus folgenden: Sonden zur spezifischen Identifizierung der Biomarkern; Initiatoren zur spezifischen Amplifikation für Biomarker; oder Antikörper der

Biomarkern aus spezifischer Kombination.

Des weiteren umfasst /ist nicht beschränkt auf die s.g. Probe nicht nur auf Gewebe oder

Flüssigkeiten, sowie Gewebe, Blut, Plasma, Serum, Lymphe, Urin, seröse Hohlraumflüssigkeit,

Rückenmarkflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Kammerwasser, Tränen, Speichel oder andere

Bestandteile davon, oder vorbehandeltes Material.

Probe wird vorzugsweise aus Gewebe und Blut entnommen.

Nutzen der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung ist dazu in der Lage, durch den Test auf die Expressionsniveaus von KCNA5,SPNS3, und PVALB die Diagnose zu einem früheren Zeitpunkt zu realisieren, die

Sensitivität der Testung zu erhöhen, die Testfähigkeit- und Effizienz zu steigern, und sowie durch aktives Eingreifen, den PH-Verlauf zu verzögern, die Sterberate dementsprechend zu senken.

Beschreibung der Figuren

Es zeigen

Fig. 1: die Unterschiede der KCNA5 Genexpressionen;

Fig. 2: die Unterschied der SPNS3 Genexpressionen;

Fig. 3: die Unterschiede der PVALB Genexpressionen;

Fig. 4: das ROC Diagramm der KCNA5 Gendiagnose der PH;

Fig. 5: das ROC Diagramm der SPNS3 Gendiagnose der PH;

Fig.6: das ROC Diagramm der PVALB Gendiagnose der PH

Fig. 7: das ROC Diagramm der KCNA5+SPNS3 Gendiagnose der PH;

Fig. 8: das ROC Diagramm der KCNA5+ PVALB Gendiagnose der PH;

Fig. 9: das ROC Diagramm der SPNS3+ PVALB Gendiagnose der PH;

Fig. 10: das ROC Diagramm der KCNA5+ SPNS3+ PVALB kombinierte Gendiagnose der PH;

Detaillierte Beschreibung

In der vorliegenden Erfindung umfasst der Biomarker KCNA5, SPNS3 und PVALB.

In der vorliegenden Erfindung umfasst KCNA5 (Kaliumspannungsgesteuerte

Kanalunterfamilie A Mitglied 5, Gen-ID: 3741) das KCNA5-Gen und seine Homologe, Mutationen und Äquivalente.

SPNS3 (Sphingolipid Transporter 3, Gen-ID: 201305) umfasst das SPNS3-Gen und seine

Homologe, Mutationen und Äquivalente.

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PVALB (Parvalbumin, Gen-ID: 5816) umfasst das PVALB-Gen und seine Homologe,

Mutationen und Äquivalente. Der Begriff umfasst unverarbeitetes PVALB in voller Länge sowie jede Form von PVALB, die aus der Verarbeitung in Zellen gewonnen wird.

Gen-IDs sind unter https://www.ncbi.nlm.nih. gov/gene/ verfügbar.

Testen auf Nukleinsäure der Biomarkern

Durch Bestimmung der Transkriptionsspiegel der Nukleinsäuren der Biomarker sind

Biomarker auszuwerten.

Nukleinsäuren werden durch schablonenabhängiges Amplifikationsverfahren amplifiziert, ein demonstratives Nukleinsäuren-Amplifikationsverfahren beruht auf PCR-Verfahren.

Bei gewissen günstigen Handhabungen bezieht sich die schablonenabhängige Amplifikation auf die Echtzeit- Quantifizierung der Transkripte. Zu den Instrumenten, die für die Erfassung und

Analyse von Echtzeit-PCR-Daten verwendet werden, gehören normalerweise Thermocycler,

Optiken für Fluoreszenzanregung und Emissionssammlung sowie optionale Computer- und

Datenerfassungs- und Analysesoftware.

Die Verwendung von Blotting zur Quantifizierung von Zielnukleinsäuren ist den Fachleute gut bekannt.

Die Chip-Hybridisierung verwendet Biomarker-spezifische Oligonukleotide, die an feste

Substrate gebunden sind, die aus körnigen festen Phasen bestehen können, die als Mikroarrays konzipiert sind, wie Nylonfilter, Objektträger oder Siliziumwafer. Microarrays sind dem Fachmann bekannt und bestehen aus Oberflächen, und Sonden, die Genprodukten (z. B. cDNA) mit

Sequenz entsprechen, können spezifisch hybridisiert oder an bekannten Stellen auf diesen

Oberflächen gebunden werden, um die Biomarker-Genexpression nachzuweisen.

Die Quantifizierung von Hybridisierungskomplexen ist auf dem Gebiet gut bekannt und kann durch eine von mehreren Methoden erreicht werden. Diese Verfahren basieren typischerweise auf dem Nachweis von Markern wie z. B. radioaktiven, fluoreszierenden, biologischen oder

Enzym-markierungen oder Markern, die auf dem Gebiet gebräuchlich verwendet werden. Die

Markierung kann bei Oligonukleotid-Sonden oder RNA aus biologischen Proben angewendet werden.

Im Allgemeinen kann die mRNA-Quantifizierung in Verbindung mit der Kalibrierkurve für eine genaue MRNA-Bestimmung durchgeführt werden. Weiterhin ist es bevorzugt, Transkripte aus biologischen Proben durch Vergleich mit Kontrollproben zu quantifizieren, die durch bekannte

Expressionsmuster der untersuchten Transkripte gekennzeichnet sind.

Nachweis von Biomarker-Proteinen

Bei einigen Ausführungsformen werden krankheitsbehandelnde-Biomarker auf dem

Proteinexpressionsniveau ausgewertet, indem das Vorhandensein eines Proteins (isoliert oder in

Zellen) oder durch eine oder mehrere bekannte funktionelle Eigenschaften des Biomarkers nachgewiesen wird.

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Bei einer besonderen Ausführungsform wird Immunfluoreszenz oder Immunzytochemie durchgeführt, um Proteine nachzuweisen.

Krankheitsbiomarker-spezifische Antikörper können direkt mit Fluoreszenzmarker, einschließlich Fluorescein, FITC, Rhodamin, Texas Red, Cy3, Cy5, Cy7 und andere fluoreszierende Marker, koppeln und den Filter unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten, das mit einer geeigneten Linse ausgestattet ist. Antikörper können auch an Enzyme gekoppelt werden, die nach Zugabe des entsprechenden Substrats zu reagieren beginnen und mit dem nachgewiesenen Biomarker-Protein einen farbigen Niederschlag auf der Zelle bereitzustellen.

Die Objektträger können dann mit einem Standard-Lichtmikroskop betrachtet werden. Alternativ können primäre Antikörper, die für krankheitsdiagnostische Biomarker spezifisch sind, weiter an sekundäre Antikörper gebunden werden, die an nachweisbare Fraktionen gekoppelt sind.

Die Immunhistochemie ist im Prinzip der Immunfluoreszenz oder Immunzytochemie sehr ähnlich, jedoch werden beispielsweise im Gegensatz zu Zellsuspensionen Gewebeproben mit

Antikörpern untersucht, die für Biomarker zur Krankheitsbehandlung spezifisch sind. Die

Biopsieprobe fixieren, verarbeiten und gegebenenfalls in Paraffin einbetten und ggf. schneiden, um einen Zell- oder Gewebeobjektträger bereitzustellen, der anschließend mit heparanase- spezifischen Antikörpern untersucht wird. Alternativ kann gefrorenes Gewebe auf einem

Kryostaten geschnitten werden und eine Antikörpersondierung wird durchgeführt, um eine fixierungsinduzierte Antigenmaske zu vermeiden.

Bei anderen Ausführungsformen werden Assays wie ELISA und RIA verwendet, die einem ähnlichen Prinzip zum Nachweis spezifischer Antigene. Veränderungen können durch

Spektrophotometrie leicht erkannt werden.

Die Protein-Biomarker-Expression kann auch durch Lumineszenz-Immunoassays nachgewiesen werden.

Die Western-Blotting-Analyse ist eine weitere Methode zur Bestimmung des Peptidgehalts von Krankheitsbiomarkern in biologischen Proben.

Bei einer besonderen Ausführungsform wird ein Proteinfangarray verwendet, das den gleichzeitigen Nachweis und/oder die Quantifizierung einer großen Anzahl von Proteinen ermöglicht.

Diagnostische Produkte

Die vorliegende Erfindung stellt ein Produkt zur Diagnose der pulmonaler Hypertonie bereit, das Produkt umfasst ein Reagenz zum Nachweis der Biomarker der vorliegenden Erfindung in einer Probe; und kann die Gebrauchsanweisung des genannten Produkts enthalten, um zu beurteilen, ob die Testperson pulmonale Hypertonie hat oder dafür anfällig ist.

Optional sind auch diagnostische Produkte erhältlich, die geeignete Reagenzien für die

Detektionsmarkierung, Positiv- und Negativkontrollen, Waschlösungen, Löschmembranen,

Mikrotitrationsplatten, Verdünnungspuffer und mehr enthalten.

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Jede Form von Probenassay, der ermôglicht die darin beschriebenen Biomarker der Probe nachzuweisen kann verwendet werden.

Beispiel 1: Nachweis von PH-relevanten Biomarkern 1. Probenentnahme

Blutproben von 7 Patienten mit chronisch thromboembolischer pulmonaler Hypertonie (CTEPH) und 5 gesunden Bevôlkerungskontrollgruppen wurden gesammelt, und die grundlegenden Informationen von Patienten und gesunden Kontrollgruppen, einschließlich Alter,

Geschlecht, BMI usw., wurden bei der Probenentnahme detailliert erfasst, unter denen es keine signifikanten Unterschiede zwischen Krankheitsgruppe und gesunder Gruppe in Alter,

Geschlecht, BMI usw. gab.

Einschlusskriterien für die Krankheitsgruppe: CTEPH-Diagnose durch

Rechtsherzkatheteruntersuchung, Lungenbeatmungsperfusionsuntersuchung oder CT-

Lungenangiographie (CTPA). Die Diagnose von CTEPH erfordert die folgenden 3 Punkte gleichzeitig: (1) wirksame Antikoagulationstherapie für mindestens 3 Monate, um subakute PTE auszuschließen; 2) Die WQ-Szintiographie zeigte mindestens einen Lungenperfusionsdefekt, oder die Computertomographie Pulmonar-Angiographie (CTPA), MRT oder direkte

Lungenangiographie und andere Untersuchungen ergaben spezifische Anzeichen einer CTEPH, wie Ringstenose, Gitterzeichen und Lückenzeichen und arterielle Verschlüsse; 3) Der hämodynamische Index der Lungenzirkulation, gemessen durch

Rechtsherzkatheteruntersuchung, erfüllte die diagnostischen Kriterien der pulmonaler Hypertonie [mittlerer Lungenarteriendruckz 25 mm Hg (1 mm Hg=0,133 kPa), pulmonaler arteriolischer

Keildruck <15 mm Hg)].

Ausschlusskriterien für die Krankheitsgruppe: Vorhandensein von Durchblutungsstörungen wie Malignität, Bluthochdruck, Diabetes, koronare Herzkrankheit oder zerebrovaskuläre

Erkrankung.

Einschlusskriterien für gesunde Gruppen: einschließlich gesunder Kontrollen, die auf das

Alter und Geschlecht der CTEPH-Gruppe abgestimmt sind, normale

Blutroutine/Urinroutine/biochemischer Test/karzinembryonales Antigen (CEA)/Alpha-Fetoprotein (AFP)/Erythrozytensedimentationsrate (ESR)/Thoraxröntgen.

Ausschlusskriterien für gesunde Gruppen: Menschen mit einer Vorerkrankung, Kopftrauma und Operation, Herzchirurgie oder neurologischen Störungen mit der Vorgeschichte ausschließen. 2. Experimentelle Methoden 2.1 Extraktion der gesamten Blut-RNA

Die gesamte Blut-RNA mit dem PAXgene Blood RNA Kit von BD extrahieren und den

Anweisungen folgen. 2.2 Probenerkennung

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Den Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent RNA 6000 Nano Kit) verwenden, um die Gesamt-

RNA-Konzentration, den RIN-Wert, 28S/18S und die Fragmentgröße zu bestimmen. 2.3 Datensammlung und Transkriptsequenzierung 1) DNase-Aufschluss zur Entfernung von DNA: DNase | wurde verwendet, um die in der gesamten RNA-Probe vorhandenen DNA-Fragmente zu verdauen, und die

Reaktionsnebenprodukte wurden durch magnetische Perlenreinigung wiederverwertet und schließlich in DEPC-Wasser gelöst; 2) rRNA entfernen: die gesamte RNA-Probe nehmen, das Kit benutzen, um rRNA zu entfernen, und nach der Entfernung eine Agilent 2100-Detektion durchführen, um den rRNA-

Entfemungseffekt zu überprüfen. 3) RNA-Unterbrechung: die vorherige Probe nehmen, den Unterbrechungspuffer hinzufügen und ihn zur thermischen Unterbrechung in das PCR-Instrument legen und auf 130-160nt unterbrechen; 4) Synthese des ersten Strangs der reversen Transkription: der unterbrochenen Probe eine geeignete Menge an Initiatoren hinzufügen, nach gründlicher Homogenisierung bei der

Thermomixer Temperatur für einen bestimmten Zeitraum reagieren lassen, so dass die

Sekundärstruktur geöffnet und mit den Initiatoren kombiniert wird, und dann wird das im Vorfeld vorbereitete einsträngige Synthesereaktionssystem hinzugefügt und die einsträngige cDNA wird auf dem PCR-Instrument nach dem entsprechenden Verfahren synthetisiert; 5) Synthese der zweisträngigen reversen Transkription: Herstellung eines zweisträngigen

Synthesereaktionssystems, bei einer geeigneten Temperatur auf Thermomixer für einen bestimmten Zeitraum reagieren lassen, Synthese von zweisträngiger cDNA und die

Reaktionsnebenprodukte werden gereinigt und mit magnetischen Kügelchen wiederverwertet. 6) Endreparatur: das Endreparaturreaktionssystem vorbereiten, bei einer geeigneten

Temperatur im Thermomixer für einen bestimmten Zeitraum reagieren lassen und das klebrige

Ende der cDNA reparieren, das durch umgekehrte Transkription unter Einwirkung von Enzymen erhalten wurde. Das Endprodukt wurde gereinigt und mit magnetischen Kügelchen zurückgewonnen, und schließlich wurde die Probe in EB-Lösung gelöst; 7) „A“ an das Ende der cDNA hinzufügen: das Reaktionssystem mit „A“ vorbereiten, für eine bestimmte Zeit bei einer geeigneten Temperatur im Thermomixer reagieren lassen und A-Basen zum 3'-Ende des Produkts der cDNA hinzufügen, die am Ende unter Einwirkung von Enzymen repariert wurden; 8) cDNA-Adapterverbindung: das Linkerligationsreaktionssystem vorbereiten, bei einer geeigneten Temperatur im Thermomixer für eine bestimmte Zeit reagieren lassen, unter der

Einwirkung von Enzymen den Linker und mit eine Base verbinden, und das Produkt wird gereinigt und mit magnetischen Perlen wiederverwertet; 9) PCR-Reaktion und Produktrückgewinnung: das PCR-Reaktionssystem vorbereiten, das geeignete PCR-Reaktionsprogramm aussuchen, und die im vorherigen Schritt erhaltenen

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Produkte amplifizieren. magnetische Perlenreinigung von PCR-Produkten. Das zurückgewonnene Produkt wird in EB-Lösung gelöst. Beschriftung, Datensammlung ist abgeschlossen; 10) Qualitätsprüfung der Datensammlung: den Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent DNA 1000Reagents) verwenden, um die Größe und Konzentration von Fragmenten in der

Datensammlung zu erkennen. 11) Cyclisierung von PCR-Produkten: Nach der Denaturierung der PCR-Produkte in

Einzelstränge ein Cyclisierungsreaktionssystem vorbereiten, nach gründlicher Homogenisierung bei der richtigen Temperatur für einen bestimmten Zeitraum reagieren lassen, einzelsträngige

Cycloprodukte erhalten und die linearen DNA-Moleküle verdauen, die nicht zyklisiert werden, d.h. die endgültige Datensammlung wird erhalten; 12) On-Machine-Sequenzierung: Einzelsträngige zirkuläre DNA-Moleküle werden durch

Walzringe repliziert, um eine DNA-Nanokugel (DNB) mit mehr als 200 Kopien zu bilden. Die resultierenden DNBs werden den Netzporen auf dem Chip mithilfe der High-Density-DNA-

Nanochip-Technologie hinzugefügt. Durch Sequenzierung während der Synthese wurde die

Sequenzierungsleselänge von 50bp/100bp erhalten. 2.4 Qualitätskontrolle von Sequenzierungsdaten

Die ursprüngliche Sequenzierungsdaten wie folgt filtern, um qualitativ hochwertige

Sequenzierungsdaten (saubere Daten) zu erhalten: die Adaptersequenz in Lesevorgängen entfernen ; vor dem Schneiden Nicht-AGCT-Basen am 5'-Ende entfernen; das Lese-Ende mit niedrigerer Sequenzierungsqualität abschneiden (Sequenzierungsqualitätswert kleiner als Q20);

Lesevorgänge entfernen, die 10% N enthalten. den Adapter verwerfen und kleine Fragmente mit einer Länge von weniger als 25 bp abschneiden. 2.5 Abgleich mit Referenzgenomen

Die Preissequenzierungsdaten wurden mit Hilfe der HISTAT2-Analysesoftware mit einem

Referenzgenom verglichen. Das Referenzgenom stammt aus der Ensembl-Datenbank, die

Genomversion ist GRCh38 und die Genannotationsinformationen sind Ensemble 92. 2.6 Analyse des Genexpressionsniveaus

Das Expressionsniveau eines Gens wird berechnet, indem die Anzahl der Sequenzen (Clean

Reads) mit der Referenzgenomregion verglichen wird. Die Stringenz wird berechnet, basiert auf den Vergleichsergebnissen der Hisat2-Software, den FPKM-Wert jedes Gens / Transkripts in der

Probe und diesen Wert als Expressionsmenge des Gens / Transkripts in der Probe verwenden. 2.7 MRNA differentielle Expressionsanalyse

Unter Verwendung von DESeq2 zum Vergleich der Expressionsunterschiede von MRNA zwischen der Kontrollgruppe und der Krankheitsgruppe sind die Differenzanalyseschritte wie folgt: Zuerst wird die ursprüngliche Lesezahl normalisiert, hauptsächlich um die

Sequenzierungstiefe zu korrigieren; Die Wahrscheinlichkeit des Hypothesentests (P-Wert) wurde durch statistisches Modell berechnet, eine Mehrfachhypothesentestkorrektur (BH) durchgeführt

© BE2023/5240 und der Padj-Wert (Falschentdeckungsrate) wurde erhalten, und die Screening-Kriterien für differentiell exprimierte Gene waren: P-Wert<0,05 und |log 2 foldchange|>1. 3. Ergebnisse und Analyse 3.1 das Datenvolumen der Sequenz zählen nach der Datenqualitätskontrolle, und die

Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: Statistik der Sequenzierungsdaten:

Erfassungen Basenpaare (1) Proben-ID: Probeninformationen; (2) gesamte Lesungen: die Anzahl der ursprünglichen

Sequenzdaten zählen; (3) gesamte Basen: Die Anzahl der Rohlesevorgänge wird mit der Länge multipliziert und in G umgerechnet; (4) Q20 und Q30: Berechnung des Prozentsatzes der Basen mit PH-red-Werten größer als 20 bzw. 30 an der Gesamtbasen; (5) GC-Gehalt: die Summe der

Anzahl der Basen G und C als Prozentsatz der Gesamtzahl der Basen berechnen. 3.2 Differentiell exprimierte Genanalyse

Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen wurden an allen Proben der Krankheitsgruppe und der gesunden Kontrolle durchgeführt, und im Vergleich zur gesunden Kontrolle gab es 437 Gene mit signifikanten Unterschieden, darunter 233 nach oben angeglichenen Gene und 204 nach unten angeglichenen Gene.

Unter ihnen war die Expression von PVALB und KCNA5 bei Patienten mit pulmonaler

Hypertonie signifikant nach oben korrigiert, und die Expression von SPNS3 bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie war signifikant nach unten korrigiert, wie in Tabelle 2 gezeigt.

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Tabelle 2: Differentielle Genexpression

PE EN

Basen wechsel abwärts

Beispiel 2 Verifikation und diagnostischer Wirksamkeitsnachweis von Differentialgenen 1. Daten und Vorverarbeitung

Die Genexpressionsdaten des GSE33463-Datensatzes der pulmonaler Hypertonie und ihrer

Kontrolle wurden aus der GEO-Datenbank heruntergeladen und durch Annotationsdateien annotiert, und mehrere Sonden sollten auf dasselbe Gen wie ihre Expressionsmenge gemittelt werden, und dann wurde die Genexpressionsmatrixdatei erhalten. 2. Differentielle Expressionsanalyse

Expressionsanalyse differentieller Gene mit dem Packet „limma“ in der R-Software.

Die Analyseergebnisse zeigten, dass die Expression von PVALB und KCNAS bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie signifikant nach oben korrigiert wurde und die Expression von SPNS3 bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie signifikant nach unten korrigiert, und ihre Expression wurde in Bild 1-3 gezeigt, wobei *: P<0,05;**: P<0,01;***: P<0,001. 3. Analyse der diagnostischen Leistung

Die R-pack „pROC“ ROC-Kurve wurde verwendet, um den AUC-Wert, die Sensitivität und die Spezifität der differentiell exprimierten Gene als Nachweisvariablen zu analysieren, um ihre diagnostische Wirksamkeit zu beurteilen. Bei der Auswertung der diagnostischen Wirksamkeit jedes Gens wird die Expression des Gens direkt für die Analyse verwendet. zuerst das pROC-

Packet abrufen, dann die Expressionsmatrix der Zielgenkonstruktion einlesen und den Befehl ausführen, um die ROC-Kurve zu zeichnen, und unter Einbeziehung von AUC, „thres“ (Schwellenwert), „glatt“ (Kurve) Befehl. Bei der Beurteilung der diagnostischen Wirksamkeit von

Genkombinationen ist zunächst „gImnet" zur logistischen Regression von Genen zu verwenden, das aufgestellte logistische Regressionsmodell wird dabei helfen, die „Predict“ Funktion (prognostizierte Funktion) zu bestimmen, und „auum“ den Einfluss einer Prädiktorvariablen auf die Ergebniswahrscheinlichkeit auf verschiedenen Ebenen zu beobachten, die prognostizierte

Wahrscheinlichkeit zu berechnen und die ROC-Kurve des prognostizierten Ergebnisses zu zeichnen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und Figuren 4 - 10 dargestellt, aus denen ersichtlich ist, dass KCNA5, SPNS3, PVALB und ihre Kombinationen bei der Diagnose der pulmonalen

Hypertonie eine hohe Genauigkeit aufweisen, insbesondere die Kombination der drei, mit hoher

Genauigkeit, Sensitivität und Spezifität.

Tabelle 3: Diagnostische Wirksamkeitsanalyse der differentiell exprimierten Gene

Claims (9)

" BE2023/5240 ANSPRÜCHE

1. Anwendung von Reagenzien zum Nachweis von Biomarkern in Proben zur Herstellung von Produkten zur Diagnose der pulmonalen Hypertonie, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzien Biomarker SPNS3 und PVALB umfassen.

2. Anwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzien ferner Biomarker KCNA5 umfassen.

3. Anwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzien Reagenzien zur Bestimmung der Biomarkerspiegel durch Sequenzierungsverfahren, Verfahren der Nukleinsäurenhybridisierung, Amplifikationsverfahren der Nukleinsäuren und Proteinimmunoassay-Verfahren umfassen.

4. Anwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzien Sonden zur spezifischen Identifizierung der Biomarkern; zur spezifischen Amplifikation von Initiatoren für Biomarker; oder Antikörper der Biomarkern aus spezifischer Kombination umfassen.

5. Anwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben aus Geweben und Blut entnommen sind.

6. Anwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung von KCNA5, SPNS3 und PVALB-Spiegel in der Probe durch die Bestimmung der Protein- und MRNA-spiegel von KCNA5, SPNS3 und PVALB erfolgt.

7. Anwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Proteinspiegel von KCNA5, SPNS3 und PVALB in der Probe durch Immunfärbung, Immunfluoreszenz, Western-Blotting und ELISA-Verfahren erfolgt.

8. Anwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung des mRNA- Spiegels von KCNA5, SPNS3, PVALB in der Probe durch Microarray, RNA-seg, In situ- Hybridisierung, RNA-scope und reguläre halbquantitativen oder quantitativen RT-PCR Test erfolgt.

9. Anwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt ein Reagenz zur Handhabung der Probe umfasst.