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BEREICH DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Diagnose und die Prognose
von Prostatakrebs (CaP). Insbesondere verwendet diese Erfindung
die Pegel des Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) im Serum
als Marker für
CaP.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Prostatakrebs
ist die am häufigsten
verbreitete Form von Krebs unter Männern. Überwältigende klinische Beweise
zeigen, dass Prostatakrebs beim Menschen den Hang zum Metastasenbildung
bis auf den Knochen hat, und die Krankheit scheint unvermeidlich
vom Androgen-abhängigen
zum Androgen-unempfänglichen
Zustand fortzuschreiten, was zu einer gesteigerten Sterberate der
Patienten führt.
Diese verbreitete Krankheit ist gegenwärtig der zweithäufigste
Grund der Krebssterblichkeit unter Männern in den U.S. Trotz der beträchtlichen
Forschung bezüglich
Therapien gegen diese Krankheit bleibt Prostatakrebs schwierig zu
behandeln. Üblicherweise
basiert die Behandlung auf chirurgischer und/oder Bestrahlungstherapie,
aber diese Verfahren sind jedoch bei einem erheblichen Prozentsatz
der Fälle
ineffektiv. Zwei vorher identifizierte prostataspezifische Proteine – prostataspezifisches
Antigen (PSA) und Prostatasäurephosphatase
(PAP) haben ein beschränktes
therapeutisches und diagnostisches Potential. So korrelieren beispielsweise
Serum PSA Konzentrationen nicht immer gut mit dem Vorkommen von
Prostatakrebs, sind in einem Prozentsatz von Fällen positiv, in denen kein
Prostatakrebs vorliegt, und die Serum PSA Konzentrationen korrelieren
nicht mit der Schwere der Erkrankung an Krebs.
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Die
gegenwärtige
klinische Praxis umfasst Routineprostatakrebsuntersuchungen bezüglich Prostatakrebses
bei Männern
im Alter von über
vierzig. Diese Untersuchung involviert die Suche nach dem Protein-prostataspezifischen
Antigen (PSA) im Blut. Dieser Test identifiziert nicht immer Patienten
mit Prostatakrebs und kann aggressiven Prostatakrebs nicht identifizieren.
Die Patienten zeigen extreme Abweichungen bezüglich des Fortschritts ihres
Prostatakrebses. Bei einigen bleibt der Krebs abgegrenzt auf die
Prostata und verursacht dem Patienten keine Schmerzen.
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Bei
anderen verbreitet sich der Krebs schnell durch den Körper, insbesondere
zu den Knochen. Es gibt keine exakten Verfahren, um die Aggressivität des Prostatakrebses
zu bestimmen. Daher hat der Arzt, der diese Krankheit behandelt,
keine verlässlichen
Wege, festzustellen, ob der Prostatakrebs streuen wird. Die gegenwärtigen Behandlungsmethoden
des Prostatakrebses haben häufig
bedeutende negative Wirkungen auf die Lebensqualität des Patienten.
Diese Situation macht es schwierig für den Arzt, geeignete Behandlungsentscheidungen
zu treffen.
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Unter
Verwendung der Technik der Differenzialdisplay Polymerase Kettenreaktion
wurde herausgefunden, dass das Zytokin Makrophage Migration Inhibitory
Factor (MIF) ein Gen ist, dessen Expression im metastasischen Prostatakrebs
verändert
wird, verglichen mit normalem Gewebe (Meyer-Siegler et al. (1996),
Urology 48: 448–452).
Meyer-Siegler et al (Cancer, Band 94, NR 5. 1449–1456) haben außerdem vorgeschlagen, dass
MIF verwendet werden könnte,
um aggressiven Prostatakrebs vorherzusagen, und als prognostischer Marker.
MIF wurde dreißig
Jahre zuvor erstmals beschrieben und wurde als Zytokin bezeichnet,
einen chemischen Mediator, der das Zellwachstum reguliert, indem
er die Expression spezifischer Target-Gene induziert. Die anfänglich beschriebene
Funktion von MIF war die exprimiert eines Entzündungs- und Immun-Regulators. Er
wird im Hirn und den Augenlinsen und ist ein verzögertes Früh-Antwort-Gen
in Fibroblasten, und es wurde berichtet, dass dieses Protein in
Prostatageweben gefunden werden kann. Es wurde gezeigt, dass MIF
ein hypophisäres,
genauso wie ein Makrophagen-Zytokin und ein kritischer Mediator
beim septischen Schock ist. Jüngere
Studien deuten ebenfalls an, dass MIF eine autokrine Funktion für die Embryonenentwicklung
haben könnte
und von den Leydig-Zellen der Testpersonen produziert wurde. Daher
scheint es, dass dieses Zytokin eine fundamentale Rolle bei der
Regulierung des Zellwachstums und möglicherweise bei der Entwicklung
spielen könnte.
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U.S. Patent Nr. 6,043,044 offenbart
die Verwendung von Prostatagewebeextrakten als Patientenprobe zur
Bestimmung der Menge von MIF. Immun- und RNA-Blot Analysen, die
durchgeführt
wurden unter der Verwendung von homogenisiertem Gewebe, welches
variable Anteile von epithelischen und stromalen Zellen enthält, ergab
immer noch bedeutende Unterschiede bezüglich der Mengen von MIF-Protein,
welches durch metastasisches Gewebe erzeugt wurde (490,3 +/– 71,3 ng/mg
Gesamtprotein). In der Praxis war dieser Test aufgrund der Kontamination
mit umgebendem Binde- und Stromalgewebe unzuverlässig und schwierig durchzuführen. Er
ist für
die Patientendiagnose oder Prognose nicht brauchbar.
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Ferner
werden in dem Patent keine Serum MIF-Pegel mit Prostatakrebs erwähnt oder
korreliert. Daher besteht eine Notwendigkeit eines verbesserten
Assays zur kommerziellen Anwendung, welches weniger invasiv ist
als das aus dem Stand der Technik.
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Bergen
et al (klinische Krebsforschung, Amerikanische Vereinigung für Krebsforschung,
US, Band 5, Nr. 9 (1999) 2366–2373)
offenbaren die Wirkung, die Tamoxifen bei der Behandlung von Prostatakrebs
hat. Vor der Fortführung
der Beprobungen wurde das Ausmaß von
Prostatakrebs der teilnehmenden Individuen entweder durch Knochenultraschall,
CAT-Ultraschall oder PSA-Bestimmung bestimmt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Diese
Anmeldung beschreibt einen Serum basierten Test für die Diagnose
und Prognose von Prostatakrebs. Er ist empfindlicher und zuverlässiger als
die des Standes der Technik. Da es ein Serum basierter Test ist,
erfordert er keine Prostatabiopsien. Das Biopsieverfahren legt häufig kein
verwendbares Gewebe frei. Zusätzlich
verwendet die vorliegende Erfindung Serumproben aus Routineuntersuchungstests
auf prostataspezifisches Antigen (PSA), daher ist bei Patienten,
die sich diesem Prostatakrebsuntersuchungstest unterworfen haben,
eine separate Biopsie der Prostata nicht erforderlich. Daher ist
es wahrscheinlicher, dass Patienten einverstanden sein werden, unter
Verwendung dieses Tests untersucht und beobachtet zu werden. Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Detektion oder Diagnose
oder Prognostizierung von Prostatakrebs bereit. Die Verfahren umfassen
die Bestimmung der Pegel des Magrophage Migration Inhibitory Factor
(MIF) im Serum eines Individuums.
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In
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden die Pegel des Serum MIF bestimmt,
indem das MIF Genprodukt in dem Serum unter Verwendung von Immunassays
oder Nukleinsäureanalyse,
vorzugsweise mRNA-Analyse, detektiert wird. Genprodukte wie hierin
rezitiert, können
Nukleinsäuren
(DNA oder RNA) und/oder Proteine sein. Für den Fall der DNA und RNA
erfolgt die Detektion durch Hybridisierung mit Oligonukleotid-Sonden.
Im Fall von Proteinen erfolgt die Detektion durch verschiedene Proteininteraktionen. Weil
MIF in Serum gemessen wird, stellt die vorliegende Erfindung einen
nicht-invasiven Bluttest für
Prostatakrebs bereit.
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Der
Serumtest für
die vorliegende Erfindung kann allein oder in Verbindung mit dem üblicherweise
verwendeten PSA-Test verwendet werden. Wenn er in Verbindung mit
dem PSA-Test eingesetzt wird, würden
Risikopatienten bezüglich
Prostatakrebs erhöhte
Pegel sowohl von PSA als auch von MIF aufweisen; Patienten, bei
denen bereits Prostatakrebs mit kontinuierlich erhöhten Pegeln
von MIF im Blut diagnostiziert wurde, haben wahrscheinlich eine
aggressive Krankheit und würden
Nutzen ziehen aus einer aggressiven Behandlung.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
ein Standarddiagramm für
die ELISA aus Beispiel 1.
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2 zeigt
eine MIF ROC Analyse.
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3 zeigt
den MIF Prostataproteinkomplex. LNCaP MIF Antikörper affinitätsgereinigtes
Zelllysat, isoliert durch nicht reduzierende PAGE, resultierte in
einer hohen MW-Bande (Reihe 1), die mit MIF polyklonalem Antikörper (Reihe
2) immunreaktiv war. Behandlung mit Lysat mit reduzierenden Agenzien
deckte multiple Proteine auf SDS-PAGE-Gelen (Reihe 3) auf, von denen
nur eines mit MIF polyklonalem Antikörper (Reihe 4) Immunreaktivität zeigte.
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4 zeigt
MIF, identifiziert durch Immun-Präzipitatbildung A20 monoklonalem
Antikörper.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORM
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Viele
biologische Funktionen werden ausgeführt durch Veränderungen
der Expression verschiedener Gene durch transkriptionale (beispielsweise
durch Kontrolle der Initiierung, Bereitstellung von RNA Prekursoren,
RNA-Processing, usw.) und/oder translationale Kontrolle. Beispielsweise
sind fundamentale biologische Prozesse wie der Zellzyklus, die Zellunterscheidung
und der Zelltod häufig
durch die Variationen der Expressionsmengen individueller Gene oder
Gruppen von Genen bestimmt.
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Veränderungen
bei der Genexpression sind auch mit Pathogenese verbunden. Beispielsweise
könnte das
Fehlen ausreichender Expression funktionaler Tumorunterdrückungsgene
und/oder die Überexpression von
Onkogenen/Protoonkogenen zu Tumorgenesen oder hyperplastischem Wachstum
von Zellen führen (Marshall
(1991) Cell 64: 313–326;
Weinberg (1991), Science 254: 1138–1146). Daher dienen Veränderungen bezüglich der
Expressionsmengen bestimmter Gene oder Gruppen von Genen (beispielsweise
Onkogenen oder Tumorunterdrückern)
als Wegweiser für
das Vorliegen und Fortschreiten unterschiedlicher Krankheiten.
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Die
vorliegenden Erfinder haben Serum MIF als ein Genmarker identifiziert,
der mit Prostata in Verbindung steht. Veränderungen im Serum MIF können daher
nützliche
Marker zu diagnostischen Zwecken, genauso wie Marker bereit stellen,
die verwendet werden können,
um Krankheitsstadien und Fortschreiten der Krankheit zu beobachten.
Der vorliegende Erfinder hat außerdem
einen genetischen Polymorphismus in dem MIF Gen identifiziert, der
mit Prostatakrebs in Verbindung steht.
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VERWENDUNG VON SERUM MIF ZUR
DIAGNOSTIK
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Wie
vorliegend beschrieben, kann das Serum MIF als Diagnosemarker zur
Vorhersage oder Identifizierung von Prostatakrebs verwendet werden.
Beispielsweise kann eine Serumprobe eines Patienten mit irgendeiner
der hierin beschriebenen Methoden oder durch eine andere Methode,
die dem Fachmann bekannt ist, untersucht werden, und die Expressionsmengen
von MIF können
mit den Expressionsmengen verglichen werden, die in normalem Serum
gefunden werden. Die Serumexpressionsmengen von MIF, die im Wesentlichen
einer Expressionsmenge des Serums von normaler oder von erkrankter
Prostata gleichen, können
beispielsweise verwendet werden, um bei der Diagnose und/oder Prognose
von Erkrankung zu helfen.
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Vergleich
der Serum MIF Mengen kann durch einen Forscher oder Diagnostiker
durchgeführt
werden oder kann mithilfe eines Computers und Datenbanken ausgeführt werden.
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Serum
MIF Mengen, die über
etwa 5 bis etwa 10 ng/ml, am meisten bevorzugt über etwa 6 ng/ml liegen, indizieren
das Vorliegen von Prostatakrebs. Serum MIF Mengen können ebenfalls
in Verbindung mit den üblicherweise
verwendeten PSA Tests verwendet werden, um das Vorliegen von Prostatakrebs
exakt zu detektieren.
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VERWENDUNG VON SERUM MIF ZUM BEOBACHTEN
DES FORTSCHREITENS DER KRANKHEIT
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Wie
oben beschrieben kann die Expression von Serum MIF als Marker für die Beobachtung
des Fortschreitens der Erkrankung, beispielsweise der Entwicklung
von Prostatakrebs verwendet werden. Beispielsweise kann eine Serumprobe
eines Patienten durch irgendeine der oben beschriebenen Methoden
untersucht werden, und die Expressionsmengen in der MIF Probe können mit
den Expressionsmengen, die in normalem Serum gefunden werden, verglichen
werden. Das MIF im Serum kann über
eine Zeit beobachtet werden, um fortschreitende Erkrankung zu verfolgen.
Vergleich der Serum MIF Mengen kann durch einen Forscher oder Diagnostiker
oder kann mit der Hilfe eines Computers und Datenbanken erfolgen.
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ASSAY FORMATE
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Die Überexpression
von MIF wird offenbar sowohl durch den Pegel von Messenger Ribonukleinsäure (mRNA)
als auch von Protein. Es wurde herausgefunden, dass erhöhtes Serum
MIF, entweder bestimmt durch mRNA Mengen oder biochemischen Messungen
von Proteinmengen unter Verwendung von Immunassays mit Prostatakrebs
in Verbindung steht.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden MIF Mengen durch Immunassays detektiert.
Grundsätzlich
involvieren Immunassays die Bindung des MIF und Anti-MIF-Anktikörpers. Die
Gegenwart und Menge der Bindungen zeigt das Vorliegen und die Menge
von MIF, das in der Probe vorliegt, an. Beispiele von Immunassays
umfassen ELISAs Radioimmunassays und Immun-Blots, die aus dem Stand
der Technik wohl bekannt sind, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein.
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Der
Antikörper
kann polyklonal oder monoklonal sein und wird vorzugsweise zur leichten
Detektion markiert. Die Markierungen können, ohne darauf beschränkt zu sein,
Biotin, Fluoreszenzmoleküle,
radioaktive Moleküle,
chromogene Substrate, Chemilumineszenz-Substanzen und Enzyme sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird ELISA, basierend auf dem Erfassen von MIF durch immobilisierte
monoklonale Anti-MIF-Antikörper,
gefolgt von der Detektion mit biotinylierten polyklonalen Anti-MIF Antikörpern verwendet,
um Serum MIF zu detektieren. In diesem System sind die Kavitäten einer
Multi-Kavitätenplatte
mit monoklonalem Antikörper
beschichtet und mit Milch blockiert (Blocken durch Albumin sollte
vermieden werden, weil gezeigt wurde, dass MIF Albumin bindet).
Die Serumproben werden dann in die Kavitäten gegeben und inkubiert,
um MIF durch die monoklonalen Antikörper zu erfassen. Die Platte
wird dann mit dem polyklonalen Antikörper und Strepavidin/alkalisches
Phosphatasekonjugat detektiert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
werden MIF Mengen durch Messung von Nukleinsäuremengen in dem Serum, vorzugsweise
MIF mRNA detektiert. Dies wird ausgeführt, indem Nukleinsäure in dem
Serum mit Oligonukleotidsonde, die spezifisch für das MIF Gen ist, hybridisiert
wird.
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Nukleinsäureproben,
die in den Verfahren und Assays der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, können
durch jede zur Verfügung
stehende Methode oder Verfahren hergestellt werden. Verfahren zur
Isolierung von Gesamt-RNA sind dem Fachmann ebenfalls gut bekannt.
Beispielsweise sind Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren detailliert
in Kapithel 3 beschrieben in: Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part
I – Theory
and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, (1993) (Herausgeber) Elsevier
Press. Solche Gruppen umfassen RNA Proben, umfassen jedoch ebenfalls
cDNA, synthetisiert aus einer mRNA Probe, isoliert aus einer Zelle
oder Gewebe von Interesse. Solche Proben umfassen ebenfalls DNA,
die aus der cDNA amplifiziert wurde, und eine RNA, die aus der amplifizierten
DNA transkribiert wurde. Der Fachmann würde annehmen, dass es wünschenswert
ist, RNAse die in den Homogenisaten vorliegt, zu inhibieren oder
zu zerstören,
bevor Homogenisate verwendet werden können.
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Nukleinsäurenhybridisierung
umfasst einfach das In-Kontaktbringen einer Sonde und einer Target-Nukleinsäure unter
Bedingungen, bei welchen die Sonde und ihr komplementäres Target
stabile Hybrid-Duplexe durch Komplementär-Rasenpaarung bilden können (siehe
US-Patent 6,333,155 von
Lockhart et al, welches durch in Bezugnahme hierin umfasst ist).
Verfahren zur Nukleinsäurenhybridisierung
sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. In einem bevorzugten
Ausführungsbeispiel
sind die Sonden auf Feststoffträgern
wie Kügelchen,
Mikroarrays oder Gen-Chips immobilisiert.
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Die
hybridisierten Nukleinsäuren
werden typischerweise detektiert, indem eine oder mehrere Marker an
die Proben Nukleinsäuren
oder die Sonden gebunden werden. Die Markierungen können durch
eine beliebige Anzahl dem Fachmann bekannter Mittel inkorporiert
werden (siehe
US-Patent Nr. 6,333,155 von
Lockhart et al, welches durch Inbezugnahme hierin umfasst ist). Üblicherweise
verwendete Marker schließen,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Biotin, Fluoreszenzmoleküle, radioaktive Moleküle, chromogene
Substrate, Chemilumineszenzmarker, Enzyme und ähnliches ein. Die Verfahren
zur Biotinylierung von Nukleinsäuren
sind im Stand der Technik gut bekannt, genauso wie die Verfahren
zum Einführen
von fluoreszierenden Molekülen
und radioaktiven Molekülen
in Oligo-Nukleotide und Nukleotide.
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Detektionsverfahren
sowohl für
die Immunassays und die Nukleinsäurenassays
sind gut bekannt für Fluoreszenz,
radioaktive, Chemilumineszenz, chromogene Marker, genauso wie für andere üblicherweise
verwendete Marker. Kurz, Fluoreszenzmarker können am direktesten identifiziert
und quantifiziert werden durch ihre Absorption und Fluoreszenzemissionswellenlängen und
Intensität.
Ein Mikroskop/eine Kameraanordnung, die eine Lichtquelle der geeigneten
Wellenlänge
verwendet, ist ein bequemes Mittel, um Fluoreszenzmarker zu detektieren.
Radioaktive Marker können
durch Standard-Audioradiographie, durch Phosphor-Image-Analysis
oder CCD-Detektoren visualisiert werden. Andere Detektionssysteme
sind erhältlich
und im Stand der Technik bekannt.
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Ohne
weitere Beschreibung wird angenommen, dass der gewöhnliche
Fachmann unter Verwendung der vorangegangenen Beschreibung und der
nachfolgenden illustrativen Beispiele die Komponenten der vorliegenden
Erfindung machen und verwenden und die beanspruchten Verfahren ausüben kann.
Das folgende Beispiel ist angegeben, um die vorliegende Erfindung
zu illustrieren. Es muss verstanden werden, dass die Erfindung nicht
auf spezielle Bedingungen oder Details, die in diesem Beispiel beschrieben
sind, beschränkt ist.
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Beispiel 1 – ELISA
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Ein
MIF-spezifisches ELISA-Assay wurde entwickelt basierend auf dem
Erfassen von MIF durch immobilisierte monoklonale Anti-MIF Antikörper gefolgt
durch die Detektion mit polyklonalen Anti-MIF affinitätsgereinigten
IgG von der Ziege. Diese Untersuchung wurde wie folgt ausgeführt:
- 1. ELISA-Platten Kavitäten wurden mit 2 μg/ml monoklonalem
Antikörper
in PBS (100 μl/Kavität) beschichtet,
unmittelbar folgend auf die Herstellung von funktionierender monoklonaler
Antikörper
(MAb)-Lösung, 100 μl Aliquots
von funktionierender Antikörperlösung werden
in jede Kavität
einer ELISA-Platte übertragen.
Die Platten werden verschlossen und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
- 2. ELISA-Platten Kavitäten
werden gewaschen. Dieser Prozess involviert das „Ausspülen" der Inhalte der Platte in eine Spüle und dreimaliges
Ausklopfen der Platten auf einen Stapel Papierhandtücher, die
obenauf auf ein gefaltetes Handtuch gelegt worden sind. Die Kavitäten wurden
gewaschen, indem die Kavitäten
individuell mit Waschpuffer unter Verwendung einer Spülflasche
gefüllt
werden, gefolgt von Entfernen des Inhaltes durch „Auskippen" und Trocknen auf
Papierhandtüchern.
Der Waschvorgang wird insgesamt viermal wiederholt. Am Ende des
letzten Auswaschens wird die Platte auf das Papierhandtuch eine
Minute lang umgestülpt,
um zu ermöglichen,
dass zurückgebliebener
Waschpuffer ablaufen kann.
- 3. Die Kavitäten
wurden dann mit einer 1:20 Verdünnung
von Milchverdünnungsmittel
(50-82-01, Kirkegaard und Perry) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur
geblockt (die Platten wurden in einen Einschub gesetzt, um Temperaturschwankungen
zu verhindern). Blocker, die Albumin enthalten, sind zu vermeiden.
Es
wurde gezeigt, dass MIF an Albumin und Albumin-ähnliche Moleküle, die
Sarcolectin genannt werden, bindet.
- 4. Die Platten wurden gewaschen wie in Schritt 2 beschrieben.
- 5. MIF-Standards wurden in 1,5 ml Polypropylen Mikroreagenzgläsern hergestellt,
indem 500 μl
Milchverdünnungsmittel
zugefügt
wurden und indem die Verdünnung
bis zur Verdopplung laufen gelassen wurde. Die Serumproben wurden
auf ähnliche
Weise verdünnt,
wenn nötig.
Weil hämolysierte
Serumproben künstlich
erhöhte
MIF-Konzentrationen enthalten, sollte ihre Verwendung vermieden
werden.
- 6. Proben und Standards werden auf die Platte gebracht (100 μl/Kavität,) und
die Platte wurde verschlossen und über Nacht bei 4 °C unter mildem
Schütteln
inkubiert.
- 7. Die Platte wurde dann, wie in Schritt 2 beschrieben, gewaschen
und der zweite Antikörper
(BAF289, R&D Systems)
mit 100 μl/Kavität zugefügt. Die
optimale Verdünnung
dieses Antikörpers
muss empirisch jedes Mal bestimmt werden, wenn ein neues Aliquot
verwendet wird. Jede Abweichung von der Standardkurve war üblicherweise
auf den Abbau dieses Reagens zurückzuführen.
- 8. Die Platten wurden verschlossen und zwei Stunden lang bei
Raumtemperatur mit mildem Schütteln
inkubiert.
- 9. Alle Kavitäten
wurden fünfmal
gewaschen, wie in Schritt 2 beschrieben, und das Strepavidin/Alkalische Phosphatase-Konjugat
(optimale Verdünnung
dieses Reagens' wurde
ebenfalls empirisch bestimmt, betrug für gewöhnlich 1:1.000) wurde mit 100 μl/Kavität zugegeben.
- 10. Die Platte wurde bedeckt, 35 Minuten lang bei Raumtemperatur
inkubiert und dann 5 Mal gewaschen, wie in Schritt 2 beschrieben.
- 11. Die Kavitäten
wurden dann mit BluPhos entwickeln gelassen (Kirkegaard and Perry
Laborstories, Gaithersburg, Maryland). Das Reaktionsprodukt wurde
im Dunklen bei Raumtemperatur sich entwickeln gelassen und bei 630
nm innerhalb von 15–30
Minuten abgelesen.
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Die
Untersuchung ergibt einen Empfindlichkeitsbereich von etwa 50 pg/ml–1,5 ng/ml. 1 zeigt
die Standardkurve für
die Untersuchung. Es sollte bemerkt werden, dass für die Anwendung
dieser ELISA unterschiedliche Kombinationen von zwei oder mehr MIF-spezifischen
Antikörpern
verwendet werden können,
um MIF in einer Probe zu erfassen und zu detektieren.
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Beispiel 2 – Serum MIF und Prostata-Pathologie
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Vier
pathologische Gruppen wurden bestimmt: Benigne prostatische Hyperplasie
(BPH), CaP, hochgradige prostatische intraepithelische Neoplasie
(HGPIN) und nicht zur Verfügung
stehend (Patienten ohne aufgenommene Diagnose oder Bericht über den
prostatischen Krankheitsverlauf). Das mittlere Serum MIF wurde für jede Gruppe
bestimmt und ist in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst:
| Tabelle
1 – Serum
MIF und Prostata-Pathologie |
| Prostata-Pathologie | Probengröße (n) | Serum
MIF (Mittelwert ± SE) |
| Nicht
zur Verfügung
stehend | 357 | 1,9 ± 0,28 |
| Benigne
prostatische Hyperplasie | 84 | 2,7 ± 0,58 |
| CaP | 61 | 6,8 ± 0,87 |
| Hochgradige
PIN | 7 | 10,1 ± 3,35 |
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Unter
Verwendung von Serum von Patienten, die auf schilddrüsenstimulierende
Hormonkonzentrationen (N = 14) untersucht worden sind, identifizierte
als Kontrolle Dunns paarweiser Mehrfach-Vergleichstest von Krudkal-Wallis
ANOVA auf Vergleichslisten signifikante Unterschiede bei den Serum-MIF-Pegeln
zwischen den Kontrollen und den hochgradigen PIN, genauso wie bei
Kontrollen und CaP (P < 0,001).
Diese Daten suggerieren eine Korrelation zwischen CaP und erhöhtem Serum-MIF.
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Es
wurde herausgefunden, dass Serum-MIF-Konzentrationen nicht mit der
Prostata-Tumor TMN-Klassifizierung
(ANOVA, P = 0,116; dies kann der kleinen Probengröße, die
für die
Untersuchung erhältlich
war, zugeschrieben werden) korrelieren. ANOVA derselben CaP-Kohorte,
stratifiziert gemäß dem Gleason
Score (G ≤ 4,
G5/6, G ≥ 7),
ergaben jedoch einen signifikanten Unterschied (P = 0,012) bei den
durchschnittlichen Serum-MIF-Konzentrationen. Dunns paarweiser Vergleich
ergab einen signifikanten Anstieg (P < 0.05) bei den Serum-MIF-Konzentrationen
bei den G5/6 und G ≥ 7,
wenn sie mit G ≤ 4
verglichen wurden. Wie aus der folgenden Tabelle ersehen werden
kann, indizieren diese Daten, dass gesteigerte Serum-MIF-Konzentrationen mit
höheren
Tumoren gemäß dem Gleason
Score in Verbindung stehen.
| Tabelle
2 – CaP
Pathologie korreliert mit Serum-MIF und PSA |
| Gleason
Score | Probengröße in (%) | Serum
PSA (Mittelwert ng/ml) | Serum
MIF (Mittelwert ng/ml) |
| ≤ 4 | 16
(26,2) | 3,23 ± 2,11 | 2,13 ± 0,73 |
| 5
oder 6 | 24
(39,3) | 3,78 ± 1,20 | 6,44 ± 0,51 |
| ≥ 7 | 21
(34,4) | 4,49 ± 1.59 | 8,67 ± 1,34 |
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Receiver
Operating Characteristic Kurven (ROC) sind statistische Standardverfahren,
die bei der Bewertung von Biomarkern bei der Krankheitsdiagnose
verwendet werden. Diese Analyse bestimmt die Eignung eines Tests,
Krankheitsfälle
von normalen Fällen
zu unterscheiden. Der Wert dieses Bereichs unter der ROC-Kurve ist
ein Maß der
Exaktheit des Tests. Eine ROC-Analyse von 460 Patienten (383 normalen
und 77 CaP-Patienten) identifizierte den Bereich unter der Kurve
mit 87,5 %, was anzeigte, dass Serum-MIF für Prostata-Krebs (P = 0,0001)
vorhersagend ist (siehe 2). Die 95 % Vertrauensintervall
(0,821 bis 0,929) indizieren, dass Serum-MIF die Eignung aufweist,
Prostata-Krebspatienten von gesunden zu unterscheiden. Vorliegen
von Krankheit (CaP) wurde definiert wie bei den Prostata-Krebspatienten
mit positiver Biopsie (n = 77, mittlerer MIF 10,82 ng/ml, mittlerer
PSA 5,5 ng/ml). Dass eine Erkrankung CaP nicht vorlag, wurde definiert wie
bei Patienten ohne dokumentierte Prostata-Pathologie. Das waren
die Patienten, die nicht in die ursprüngliche Analyse einbezogen
waren (n = 383, mittlerer MIF 3,46 ng/ml, mittlerer PSA 1,79 ng/ml).
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Beispiel 3 – Detektion von MIF-Proteinen
in Prostatagewebe
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Vorhergegangene
Experimente identifizierten, dass MIF innerhalb der Prostataepithelzellen
lokalisiert ist (Meyer-Siegler (1998), Diagnostic and Molecular
Path. 7:44–50).
Analysen von MIF-Anfärbungen
innerhalb des Prostatagewebes unter Verwendung von Biopsieproben
(dieselben wie die für
Serumanalyse verwendeten, Tabelle 2) zeigten eine Verbindung zwischen
MIF-Immunperoxidaseanfärbung
und Prostatatumor Gleason Score (n = 61, P < 0,001). Interessanterweise zeigen
Gleason Score 5 oder 6 Tumore (n = 24) intensive MIF-Immunperoxidaseanfärbung. Die
diffuse Anfärbungsverteilung
wird in dem Zytoplasma um den Kern vorgefunden. Hingegen zeigen
G > 7-Tumore eine
geringe positive Immunanfärbung
(n = 21), was suggeriert, dass höhere
Gleason Score Tumorzellen weniger intrazelluläres MIF-Protein enthalten.
Die IHC-Ergebnisse zusammen mit den Ergebnissen der Serumuntersuchung
suggerieren, dass G > 7-Tumore
eine gesteigerte MIF-Sekretion zeigen. Die Ergebnisse einer ähnlichen
Untersuchung durch ein anderes Labor demonstrierte, dass mit histologischer
Dedifferenzierung Prostata-Adenokarzinomzellen
veränderte
MIF-Proteinkonzentration zeigen (Arcuri et al. (1999) Prostate 39:
159–165).
Diese Autoren schlagen vor, dass dieses Ergebnis die Folge der Veränderungen
bei der MIF-Synthese oder das Ergebnis einer gesteigerten und/oder
veränderten Sekretion
durch Tumorzellen in das umgebende Stroms (Arcuri et al.) sein könnte. Interessanterweise
fand die vorgenannte Untersuchung keine signifikant verringerte
intrazelluläre
MIF-Konzentration bei Prostatatumorzellen, nachdem die Patienten
einer kombinierten Endokrin-Behandlung (Arcuri et al.) unterzogen
worden sind. Diese Ergebnisse und diejenigen, die erhöhte Serum-MIF
bei einigen CaP-Patienten zeigten, die endokriner Behandlung unterzogen
worden sind, die reduzierte Serum-PSA bis zu normalen Pegeln aufwiesen,
scheinen androgene Regulierung der MIF-Sekretion in die Prostata
auszuschließen
(Arcuri et al.; Meyer-Siegler et al. (2002), Cancer 94:1449–56). Zusätzliche
Untersuchungen von Lungenadenokarzinom-Patienten bestimmten eine
starke Assoziation zwischen der schlechten Prognose und gesteigerter
MIF-IHC-Anfärbung
(Kayser et al. (1998), Anal. Quant. Cytol. Histol. 20:313–320), ferner
unterstützten
sie die Rolle von MIF bezüglich
der Tumoraggressivität.
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Beispiel 4 – Detektion von MIF mRNA in
Prostatagewebe
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Vorhergegangene
Untersuchungen dokumentierten, dass in vitro kultivierte Prostatazellen
MIF mRNA exprimieren und dass MIF Message-Mengen signifikant in
CaP-Zelllinien höher
sind (Meyer-Siegler (2000b), Cytokine 12:914–921). Erhöhte MIF mRNA-Expression innerhalb
von CaP-Epithelzellen wurde jedoch nicht in vivo dokumentiert. Um
veränderte
Serum-MIF mit MIF mRNA-Expression in Verbindung zu bringen, wurde
Laser-Scanning-Mikroskopie (LCM) von Prostata-Epithelzellen verwendet,
um MIF mRNA-Mengen durch Q-RT-PCR zu bestimmen. Expressionsanalyse
von LCM-präparierten
Zellen schließt
mRNA aus, die durch stromale oder durch Immunzellen beigetragen
wird. Diese Studien untersuchten MIF-Expressionen in Drüsenepithelzellen. MIF mRNA-Mengen
normalisiert auf 18S rRNA sind höher
in den Zellen, die auf die Ränder übergreifen,
im Vergleich zu normalen und fokalen Krebszellen aus derselben Biopsie.
Arbiträre
MIF mRNA-Expressionsverhältnisse
(MIF-Bereichsintensität/18S
rRNA-Bereichsintensität)
für jede
Gewebskategorie (normal, CaP, auf den Rand übergreifen) aus 3 getrennten
Q-RT-PCR-Analysen
dreier unterschiedlicher Patienten (alle mit Stadium pT3b Tumoren)
wurden mittels ANOVA analysiert. ANOVA ergab signifikante Unterschiede
(P < 0,001) zwischen
normalen Prostata-Epithelzellen MIF-Expressionsraten (0,38 ± 0,06),
fokalen CaP MIF-Expressionsverhältnissen
(1,88 ± 0,12)
und invasiven CaP Expressionsverhältnissen (2,48 ± 0,23). Paarweise
Tukey-Mehrfachvergleiche ergaben, dass MIF-Expressionsverhältnisse
signifikant höher
waren (P < 0,05)
bei CaP und invasiven CaP-Prostata-Epithelzellen im Vergleich zu
normalen Epithelzellen aus derselben Biopsie. Negativ-Kontrollen
(RNA-freies Wasser) zeigte kein amplifiziertes Produkt, es war auch
keine Bande sichtbar, die aus direkter Amplifizierung gereinigter
genomischer DNA folgte (Meyer-Siegler et al. (2002)). Diese Ergebnisse
indizieren, dass die erhöhte
Serum-MIF, die bei Patienten detektiert wird, mit CaP teilweise
aufgrund von erhöhter
MIF-Genexpression in CaP-Epithelzellen vorliegt. Diese Ergebnisse
dokumentieren erhöhte
in vivo MIF mRNA-Expressionen in CaP.
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Beispiel 5 – erhöhte Serum-MIF steht in Verbindung
mit PSA-Versagen
-
Die
Verbindung zwischen erhöhter
Serum-MIF (> 6 ng/ml)
und PSA-Versagen 6 Monate und 12 Monate auf den Beginn der Untersuchung
folgend, wurde bestimmt. Die Prognose von CaP-Patienten steht in
engem Bezug zu Erhöhungen
bei Serum-PSA (PSA-Versagen).
PSA-Versagen (in dieser Untersuchung als ein Minimum von 0,5 ng/ml
Anstieg des PSA über
6 Monate) wird oft als ein frühzeitiger
Indikator zum „Rückfall" des Prostatakrebses.
Das Ziel dieser Machbarkeitsuntersuchung war es, Serum-MIF bezüglich der
Vorhersage der CaP-Prognose durch Bemessen seiner Verbindung mit
PSA-Versagen in einer CaP Veteranenpopulation zu evaluieren. Ein
computerbasiertes Patientendatenaufnahmesystem (CPRS) wurde verwendet,
um die CaP-Kohorte zu suchen, die in der Anfangsuntersuchung identifiziert
worden sind, um die nachfolgenden PSA-Bestimmungen für diese
Kohorte 6 Monate und 12 Monate auf den Beginn der Untersuchung folgend
zu bestimmen. Verbindungen zwischen PSA-Versagen und anfänglicher
MIF-Konzentration wurden durch den Fishers Exakt-Test bestimmt. Die Suche der Datenaufzeichnungen
identifizierte 67 CaP-Patienten mit dokumentierter PSA bei 6 und
12 Monaten auf die Serum-MIF-Bestimmung zu Untersuchungsbeginn folgend.
Mittlere PSA-Werte wurden für
CaP-Kohortengruppen 1 bis 4 [bestimmt durch Serum-Konzentrationen
von PSA (niedrig < 4
ng/ml gegen hoch > 4
ng/ml) und MIF (< 6
ng/ml gegen hoch > 6
ng/ml) bei Studienbeginn] berechnet. Die Daten sind in der nachfolgenden
Tabelle beschrieben:
| Tabelle
3 – Änderungen
des mittleren PSA bei CaP-Patienten, stratifiziert gemäß MIF/PSA |
| Gruppe | Beschreibung | n | MIF
Untersuchungsbeginn | PSA
Untersuchungsbeginn | PSA
6 Monate | PSA
12 Monate |
| 1 | Niedrige
PSA gegen niedrigen MIF | 15 | 3,15 ± 042 | 0,87 ± 0,15 | 0,86 ± 0,72 | 1,23 ± 1,17 |
| 2 | Hoher
PSA gegen niedrigen MIF | 2 | 1,30 ± 0,25 | 7,05 ± 1,95 | 5,35 ± 3,65 | 6,85 ± 1,85 |
| 3 | Niedriger
PSA gegenhohen MIF | 38 | 13,06 ± 2,09 | 1,27 ± 0,20 | 1,17 ± 0,24 | 2,22 ± 0,36 |
| 4 | Hoher
PSA gegenhohen MIF | 12 | 11,91 ± 1,38 | 11,03 ± 2,02 | 4,47 ± 1,38 | 5,78 ± 1,38 |
-
Die
Daten sind angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. ANOVA der
PSA-Werte bei der Untersuchungseröffnung, bei 6 Monaten und bei
12 Monaten wurden verwendet, um signifikante Unterschiede bezüglich der
mittleren PSA-Werte unter den Gruppen zu bestimmen. Für alle Fälle wurden
bedeutende Unterschiede gefunden (P < 0,001). Paarweise Mehrfachvergleiche
nach Tukey bestimmten einen bedeutenden Unterschied nur zwischen
den Gruppen 1 & 4
und 3 & 4 (P < 0,05). Diese Daten
ergaben keinen bedeutenden Unterschied zwischen mittlerem PSA zwischen
Gruppen 1 & 3,
was erwartet werden könnte,
wenn erhöhte MIF-Konzentrationen
unabhängig
einen CaP-Rückfall
voraussagen würden.
Da die Patienten in dieser CaP-Kohorte verschiedenen Behandlungsmodalitäten unterzogen
wurden, welche Serum-PSA verändern,
bestimmten hier die Verbindung zwischen Serum-MIF-Konzentration bei
Untersuchungsbeginn und den Anstieg des Serum-PSA (0.05 ng/ml oder
größer über 6 Monatsintervalle).
Ein ANOVA-Vergleich der Änderung
des PSA über
die Zeit (0, 6 und 12 Monate) der Patienten mit niedrigem PSA bestimmte
einen signifikanten Unterschied des mittleren PSA zwischen den Gruppen
1 & 3, P = 0,033.
Paarweiser Mehrfachvergleich nach Tukey ergab einen signifikanten
Unterschied zwischen den PSA-Werten der beiden Gruppen bei 12 Monaten
(P < 0,05). Diese
Daten indizieren, dass ein Anstieg des Serum-PSA in Verbindung steht
mit einer anfänglich
hohen Serum-MIF-Konzentration.
-
Beispiel 6 – PSA-Anstieg gegen die Zeit
seit Untersuchungsbeginn bei CaP-Patienten
mit hohem und niedrigem Serum-MIF
-
Patienten
(n = 67) in der CaP-Kohorte wurden unterteilt in Niedrig-MIF (< 6 ng/ml, n = 17)
und Hoch-MIF (> 6
ng/ml, n = 50) Gruppen, abhängig
von der PSA-Konzentration, basierend auf der Serum-MIF-Konzentration
bei Untersuchungsbeginn. Die Anzahl der Patienten, die einen 0,5
ng/ml-Anstieg des PSA bei 6 Monaten und 12 Monaten zeigten, auf
den Beginn der Untersuchung folgend, wurden bestimmt.
| Tabelle
4 – Anzahl
der Patienten mit steigendem PSA |
| Monate | Niedriger
MIF
n = 17 | Hoher MIF
n
= 50 |
| #
mit ansteigendem PSA | Prozentsatz | #
mit ansteigendem PSA | Prozentsatz |
| 6 | 2 | 11,8 | 5 | 10,0 |
| 12 | 5 | 29,4 | 30 | 60,0 |
-
Bei
Verwendung eines 0,5 ng/ml-Anstiegs bezüglich des PSA als Ergebnis,
ergab sich ein signifikanter Anstieg (30,6 %) bezüglich PSA-Versagen
bei CaP-Patienten mit hohem Serum-MIF eingangs der Untersuchung.
Fishers Exakt-Test ergab einen signifikanten Unterschied bezüglich der
Anzahl der Patienten mit ansteigendem PSA in dem niedrigen MIF gegen
Hoch-MIF-Gruppen (P = 0,048). Erhöhter Serum-MIF (> 6 ng/ml) ist voraussagend
für einen
Krankheitsfortschritt unter Verwendung von 0,5 ng/ml-Anstieg bezüglich des
PSA über
6 Monatsintervalle als Krankheitsfortschrittskriterium. Es ist machbar,
Serum-MIF-Konzentrationen als Vorgehensweise zur Bestimmung des
Risikos biochemischer Fortschritte mit der Zeit zu verwenden. Daher kann
dieses ein Werkzeug sein, um Patienten mit indolenter Erkrankung
von denen mit biologisch aktiver Erkrankung zu unterscheiden.
-
Beispiel 7 – MIF Single Nucleotide Polymorphism
(SNP) wurde in aggressiven CaP-Zelllinien identifiziert.
-
Die
vorhergehenden Daten etablierten eine Steigerung bezüglich der
MIF-Transkription
bei aggressiven CaP-Zellen (Meyer-Siegler (2000a), J. Interferon
and Cytokine Res. 20(9):769–778)
zu der Zeit, als ein molekularer Mechanismus für die gesteigerte MIF mRNA-Konzentrationen
nicht bekannt war. Eine jüngere
Publikation brachte eine MIF SNP in der MIF-Promoter Region in Verbindung
mit Systemischer Juveniler Arthritis (Donn et al. (2001), Arthritis
and Rheum. 44:1782–1785)
und mit der Bildung einer AP-4-transkriptionsfaktorbindenden Steile.
Die Gegenwart einer zusätzlichen
transkriptionsfaktorbindenden Stelle resultiert in erhöhter MIF-Genexpression und
könnte
daher in Verbindung gebracht werden mit der Aggressivität des Prostatatumors.
Die Analyse dieser Region in normalen, BPH-1, LNCaP, C4-2b, DU-145
und PC-3-Zellen wurde unternommen. Genomische DNA wurde aus Zellen
isoliert und 0,1 μg
DNA mittels PCR mit den folgenden Primern amplifiziert:
5'ACTAAGAAAGACCCGAGGC3' (SEQ ID Nr: 1) und
5'GGGGCACGTTGGTGTTTAC3' (SEQ ID Nr: 2) über 30 Zyklen
bei 95 °C
1 Minute lang, 60 °C
1 Minute lang und bei 72 °C
1 Minute lang. Die resultierenden 366 bp PCR-Produkte wurden gereinigt
und 1 μg
des PCR-Produktes wurde mit 3U Alu I über Nacht verdaut. Die resultierenden
Restriktionsverdauungsprodukte wurden mittels Agarose Elektrophorese
isoliert und fotografiert. Diese SNP liegt in den aggressiveren
CaP-Zelllinien (C4-2b, DU-145 und PC-3) vor, ist jedoch in normalen
und weniger aggressiven LNCaP-Zelllinien abwesend. Genbankanalysen
bestimmten das Vorliegen eines exprimierten Sequenztags für AP-4 in
der Prostata (A1669905). Diese Daten suggerieren, dass der MIF-Polymorphismus
mit einer positiven Rolle bei der Genexpression in Verbindung steht,
und sie erbringen einen zusätzlichen
Beweis einer funktionalen SNP bei dem 3'-Regulatorbereich des Gens. Dies ist
ein potenzieller genetischer Mechanismus, um die erhöhte MIF-Expression
zu erklären,
die in aggressiven Gleason Score Tumoren (Meyer-Siegler et al. (2002))
und CaP-Zelllinien (Meyer-Siegler
(2000a); Meyer-Siegler (2000b); Meyer-Siegler (2001), Molec. Med.
7:850–860)
gesehen wird.
-
Beispiel 8 – MIF Prostata Proteinkomplex
Identifizierung
-
Untersuchungen
zur Bestimmung der MIF-intrazellulären Natur identifizierten einen
Multiproteinkomplex. LNCaP-Protatakrebszellen (5 × 106) wurden lysiert (10 mM CHAPS, 2 mM EDTA,
4 mM Jodacetat in PBS pH 7,2 mit Protease-Inhibitor-Cocktail), die
Zelldebris wurde pelletiert und das gereinigte Lysat auf MIF-Polyglonalen
Antikörper
(von R&D Systems,
Minneapolis, MN) Affinitätssäule appliziert.
Die gereinigten Antikörperfraktionen
wurden 10-fach konzentriert (YM-3 Centricon) und durch nicht-reduktive
PAGE analysiert, welche eine hohe MW-Bande (178 kDa) identifizierte,
erkannt durch MIF-polyglonale (3, Reihe
2) aber nicht durch MIF-monoglonale
Antikörper
(R&D Systems).
MIF bildet Oligomere (Sun et al. (1996), Protein Engineering 9: 631–635), so
dass der ursprüngliche
Gedanke der war, dass dies eine oligomere MIF-Form war. Reduzierende SDS-PAGE
identifizierte jedoch einen Multiproteinkomplex mit nur einer 12
kDa-Bande, die von beiden MIF-Antikörpern (3,
Reihe 4 polyglonale Ab) erkannt wurde.
-
MALDI-TOF
Massenspektroskopie und die Edmans Degradations tryptische Peptidsequenzanalyse wurden
verwendet, um Komponenten dieses neuen Proteinkomplexes zu identifizieren.
Die komplexen Proteine sind N-terminal blockiert und machen weniger
teures Proteinsequenzieren aus PVDF-Membranen unmöglich. Ein
Protein, das identifiziert wurde, ist A20, ein Zytokin-induzierendes
Zink-Fingerprotein,
welches NF-κβ Aktivität reguliert
(Heynick and Beyaert (1999), FEBS Lett. 442:147–150). Ein anderes ist ein
unbekanntes 70-kDa-Protein mit einer Peptidsequenz GAAKKGAVGGI (SEQ
ID Nr: 3). Eine Datenbankrecherche in der SwissPro deckte keine
bekannten homologen Proteinsequenzen zu dem unbekannten Proteinpeptid
auf. Eine dritte Komponente dieses Komplexes wurde als Glandular
Kallikrein-2 (hK2) identifiziert. Diese neuen Daten stützen diejenigen
einer vorangegangenen Untersuchung, welche die Verbindung von MIF
und hK2 bei Experimenten dokumentierte, die geschaffen wurden, um
hK2 aus humanem Seminal Fluid zu reinigen (Meinhardt et al. (1999),
J. Cell Sci. 112: 1337–1344).
Kallikrein-Gen Familienproteine sind Serinproteasen (Yousef and Diamandis
(2001), Endocr. Rev. 22:184–204).
In der menschlichen Prostata codiert KLK3 Kallikrein-Gen-PSA (aka
menschliches Kallikrein 3, hK3) (Riegman et al. (1992), Genomics
14:6–11).
hK2 hat eine Trypsin-ähnliche
Aktivität
und kann die Vorform von PSA zu ihrer aktiven Form aktivieren (Kumar
et al. (1997), Cancer Res. 57:3111–3114). Die Expression von
KLK2, dem Gen, welches hK2-Protein codiert, wird im Prostatakarzinom hochreguliert
(Darson et al. (1997), Urology 49:857–862). hK2 kann beim Prostatawachstumsfaktor
und den Zytokinnetzwerken teilhaben (Rittenhouse et al. (1998),
Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 35:275–368). Diese Daten sind verblüffend, wenn
die etablierte Interaktion zwischen PSA und hK2 angegeben ist und
Interaktion des letzteren mit Zytokin offensichtlich ist, wie beispielsweise
MIF. A20-Identität
in dem MIF-Komplex wurde durch Co-Immunpräzipitation Pulldown-Experimente
bestätigt.
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A20-Monoglonale
Antikörper
(von Dr. Vincenz, University of Michigan) wurde verwendet, um A20-Protein
aus LNCaP-Zelllysaten zu immunopräzipitieren. Das resultierende
Protein wurde der Western-Blot-Analyse unterzogen, unter Verwendung
reduzierender SDS-PAGE und MIF-monoklonalem Antikörper, wobei
eine 12 kDa MIF-Bande (4) identifiziert wurde.
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Obwohl
bestimmte, gegenwärtig
bevorzugte, Ausführungsformen
der Erfindung hierin besonders beschrieben worden sind, wird es
für den
Fachmann offensichtlich sein, an den sich die Erfindung richtet,
dass Variationen und Modifikationen der verschiedenen Ausführungsformen,
die hierin gezeigt und beschrieben sind, durchgeführt werden
können,
ohne vom Ziel- und Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Entsprechend
beabsichtigt ist es, dass die Erfindung lediglich auf den erforderlichen
Umfang durch die angefügten
Ansprüche
und die anzuwendenden gesetzlichen Normen beschränkt ist.
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