CN117965692A - 通过基于生物流体的无细胞dna(cfdna)测定评价器官损伤状态的基于免疫探针的新方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及通过基于生物流体的无细胞DNA(cfDNA)测定评价器官损伤状态的基于免疫探针的新方法。本公开提供了可用于使用杂交方法定量生物流体中cfDNA的组合物和方法。
Description
本申请是中国专利申请号201780063968.0的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年8月17日提交的美国临时申请62/376,299号的优先权,其通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术
二千六百万美国人患有器官损伤,例如与慢性肾病(CKD),以及器官移植排斥和功能障碍,例如肾移植或肺移植相关的器官损伤。治疗这些损伤是非常昂贵的。例如,每年医疗保险支出的28%(575亿美元)用于治疗CKD。然而,对于其中许多人来说,没有办法在临床症状出现之前预测损伤何时即将发生。与这些疾病相关的大部分成本是由于缺乏早期检测导致更严重的器官损伤所致并且需要更多和更昂贵的治疗干预。早期检测肾病的方法可以降低医疗费用和更有效的治疗干预。
传统上,器官损伤(例如肾损伤)的检测基于对活检物的检查,其既昂贵又具有侵入性。最近,在人尿液中发现了来自垂死细胞的无细胞DNA(cfDNA)。最近的努力集中在测试尿液的cfDNA作为同种异体移植物排斥而不是器官损伤的标志物;此外,该技术仅限于使用PCR或下一代测序来检测供体特异性SNP或测量Alu元件。这些方法具有局限性,因为它们仅限于测试肾脏排斥,在消耗品和设备上都是昂贵的,需要相对较大量的DNA,并且不是高通量的。此外,它们可能无法检测到短于150bp的片段长度,因为已发现尽管整个未片段化的DNA对于基于qPCR的Alu测量方法是最佳的,但片段大小<150bp的DNA在DNA定量中显著减少(减少75%)(Sedlackova等,Biol.Proced.Online(2013)15:5.doi:10.1186/1480-9222-15-5)。
发明内容
提供了一种用于定量分析生物流体,例如尿液和支气管肺泡灌洗液(BAL)中的无细胞DNA的新方法。本文描述的方面包括可以稳定生物流体细胞DNA的保存性试剂混合物,通过杂交测定测量cfDNA的方法,其量化生物流体中的人Alu重复,以及一种新分析方法,其在临床测定变量中提供因素以提供对肾脏损伤定量风险评分。在一些情况下,测量样品中其他标志物的量,例如甲基化标志物(例如,5-甲基胞嘧啶),组织炎症标志物(例如,CXCL10),细胞凋亡标志物(例如肾小管损伤标志物,例如簇蛋白),总蛋白质和/或肌酸酐。这些方面可用于评估肾移植和肾脏疾病中的肾脏健康。
在一个方面,本公开内容提供了溶液,例如无菌溶液,其包含浓度足以抑制细胞裂解和抑制尿液中核酸酶的甲醛供体,螯合剂,金精三羧酸和聚乙二醇(PEG)。在一些实施方式中,溶液还包含叠氮化钠和/或缓冲剂。在一些实施方式中,溶液还包含生物流体样品。在一些实施方式中,生物流体样品是尿液样品或BAL样品,作为用于肾脏或肺器官损伤的非侵入性测量的选择的流出物。在一些实施方式中,尿液样品来自已经接受肾移植或具有急性或慢性肾损伤的患者,在其他实施方式中,其是来自已经接受肺移植或具有肺损伤的患者的支气管肺泡灌洗液(BAL)。
在一个方面,本公开内容提供了检测生物流体样品中的Alu拷贝数的方法,该方法包括:从人体获得尿液或其他生物流体样品,从样品中提取cfDNA,通过使cfDNA与核酸探针在允许探针与与探针互补的cfDNA中的DNA杂交的条件下接触形成反应混合物,其中核酸探针具有有3′和5′末端的核酸序列,其中核酸探针与SEQ ID NO:1的连续20-292个核苷酸互补,其中3′或5′末端与可检测标记物共价连接;并定量与探针杂交的DNA的量。在一些实施方式中,探针与SEQ ID NO:2的至少50个连续核苷酸互补。在一些实施方式中,探针包含与SEQ ID NO:1互补的50-150、70-100、80-90或恰好81个核苷酸的序列。在一些实施方式中,可检测标记物是生物素,并且该方法包括使可检测标记物与链霉亲和素连接的信号产生剂接触。
在一些实施方式中,在形成反应混合物之前,将包含二偶氮烷基脲,EDTA,金精三羧酸和聚乙二醇(PEG)的溶液以足以抑制细胞裂解和抑制核酸酶的浓度混合到尿液样品中。在一些实施方式中,该方法还包括定量反应混合物中肌酸酐的量。在一些实施方式中,该方法还包括将与探针杂交的cfDNA的量相对于尿液样品中肌酸酐的量标准化,以产生cfDNA的标准化量。在一些实施方式中,该方法还包括将与探针杂交的cfDNA的量相对于尿液样品中肌酸酐的量标准化,以产生杂交的DNA的标准化量。在一些实施方式中,该方法还包括如果检测到的与探针杂交的靶DNA(例如cfDNA)的量或靶DNA(例如cfDNA)的标准化量大于截止值,则确定患者具有肾损伤。
在一些实施方式中,人是已经接受肾或肺移植的患者,并且肾或肺损伤的存在表明患者可能有急性排斥反应发作。在一些实施方式中,该方法还包括基于靶DNA(例如cfDNA)的标准化量和肾移植后的时间产生用于确定肾或肺健康的预测评分。当预测评分大于预测评分的截止值时,确定患者有急性排斥反应发作。在一些实施方式中,尿液或BAL样品在患者接受肾脏或肺移植后0-400天,或10-100天,或20-50天获取。
在一些实施方式中,尿液样品来自疑似患有由选自下组的疾病引起的肾损伤的个体:BK病毒性肾炎,局灶性节段性肾小球硬化(FSGS),肾结石,急性肾小管坏死(ATN),IgA肾病(IgAN),和糖尿病肾病,或来自全身性疾病,如高血压和自身免疫性疾病(如SLY,类风湿性关节炎)的肾病。在这些实施方式中,肾损伤的确定表明患者患有该疾病。
在一些实施方式中,该方法还包括通过添加反映炎性负荷的生物标志物来量化反应混合物中CXCL10的量以增加对测定的更高特异度和灵敏度。在一些实施方式中,该方法还包括定量甲基化的cfDNA和羟甲基化的cfDNA的比例或绝对量,以反映循环DNA的甲基化状态,其进一步定义了内在组织损伤的存在。
另一方面,本发明提供了一种反应混合物,其包含从尿液样品中提取的非扩增的无细胞DNA(cfDNA)(例如,在一些实施方式中,来自已经接受肾移植的患者)和ii)核酸探针,其具有核酸序列并具有3′和5′末端,其中核酸探针与SEQ ID NO:1的20-292个连续核苷酸互补,并且其中3′或5′末端与可检测标记物共价连接。反应混合物可包含本文所述的任何组分。
另一方面,本文提供了检测来自具有肺移植或肺移植临床病症的个体的生物流体样品中无细胞DNA(cfDNA)中的Alu拷贝数的方法。该方法包括从人体获得生物流体样品,例如支气管肺泡灌洗液(BAL)流体样品;从生物流体样品中提取cfDNA;通过使cfDNA与核酸探针在允许探针与与探针互补的cfDNA中的DNA杂交的条件下接触以形成反应混合物,其中核酸探针具有有3′和5′末端的核酸序列,其中核酸探针与SEQ ID NO:1的连续20-292个核苷酸互补,并且其中3′或5′末端是共价连接的可检测标记物;并定量与探针杂交的DNA量,从而检测生物流体样品中无细胞DNA(cfDNA)中的Alu拷贝数。在一些实施方式中,生物流体样品是支气管肺泡灌洗(BAL)流体样品,并且其中该方法还包括定量BAL流体的总体积。
在一些实施方式中,该方法还包括相对于总BAL流体样品体积标准化与探针杂交的cfDNA的量,以产生杂交的cfDNA的标准化量。
在一些实施方式中,该方法还包括将杂交的DNA的标准化量与指示肺状态的截止值进行比较。
在一些实施方式中,该方法还包括如果检测到的与探针杂交的靶DNA(例如cfDNA)的量或靶DNA(例如cfDNA)的标准化量大于截止值,则确定患者具有肺损伤。在一些实施方式中,人是接受肺移植的患者,其中肺损伤表明患者有排斥反应发作。
在一些实施方式中,该方法还包括基于反应混合物中肌酸酐的量和与探针杂交的cfDNA的量产生KIT评分。在一些实施方式中,使用与探针杂交的DNA量与肌酸酐量的比率产生KIT评分。在一些实施方式中,通过使用广义线性模型(例如逻辑回归),使用生物流体样品中存在的与探针杂交的cfDNA的量,肌酸酐的量,一种或多种炎症标志物(例如,CXCL10),一种或多种细胞凋亡标志物(例如,肾小管损伤标志物如簇蛋白),和/或一种或多种DNA甲基化标志物来产生KIT评分。在一些实施方式中,可以使用选自神经网络,广义加性模型,相似性最小二乘和递归分割方法的非线性回归模型来开发KIT评分。在一些实施方式中,使用选自CXCL10,簇蛋白和DNA甲基化标志物的其他生物标志物产生KIT评分,使得KIT评分对于器官损伤的诊断和预测产生比在KIT测定中使用个体标志物更高的灵敏度和特异度。KIT损伤评分也比肾功能的现用标志物(例如血清肌酐或尿蛋白)或肺功能的现用标志物(例如用力呼气量(“FEV”)和用力肺活量(“FVC”))更灵敏地检测器官损伤。在一些实施方式中,如上所述使用IT评分(例如,KIT评分)可以以至少85%,至少87%,至少88%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%的灵敏度,和/或至少85%,至少87%,至少88%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%的特异度检测肾损伤。在一些实施方式中,使用上述KIT评分可以至少85%,至少87%,至少88%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96.9%,或至少99.4%的AUC检测肾损伤。
在一些实施方式中,本公开内容提供了一种检测器官损伤的方法,包括测量从疑似有损伤或可能发生损伤的器官获得的生物流体样品中的cfDNA的量和一种或多种标志物的量,其中一种或多种标志物选自:i)一种或多种炎症标志物,ii)一种或多种细胞凋亡标志物,iii)总蛋白质,和iv)一种或多种DNA甲基化标志物;使用cfDNA的量和该一种或多种标志物的量产生IT评分,和,如果IT评分高于预定的截止值,则预测患者的器官中将发生损伤或确定患者有器官损伤。在一些实施方式中,器官损伤是肾损伤。在一些实施方式中,通过进一步包括肌酸酐来产生IT评分。在一些实施方式中,通过使用数学模型,使用生物流体样品中存在的与探针杂交的cfDNA的量,肌酸酐的量,一种或多种炎症标志物(例如,CXCL10),一种或多种细胞凋亡标志物(例如,肾小管损伤标志物如簇蛋白),肌酸酐,和/或一种或多种DNA甲基化标志物来产生IT评分。
附图说明
图1显示了电泳图,证明在不存在DNA保存溶液的情况下,DNA在72小时内完全降解和崩解;而DNA保存溶液有助于维持DNA完整性长达72小时。
图2比较了在Alu检测中使用本文公开的方法和使用基于标准PCR的方法进行cfDNA分析。
图3显示了与Alu重复序列互补的双重生物素化的寡核苷酸。
图4显示了使用化学发光测定系统具有至少5个数量级的本文公开的测定的动态范围。
图5A-5D显示了使用本文公开的测定来区分肾移植排斥(图5A-5B),天然肾病(图5C)及其在检测肾损伤方面优于蛋白尿的性能(图5D)。
图6显示了尿液中染色体Y和染色体1拷贝数之间的相关性验证了本公开中的方法。
图7显示了指数衰减曲线,其显示了使用来自9名接受肾移植并且未经历急性排斥反应发作的患者的数据,cfDNA/肌酸酐比率随移植后天数的变化。
图8A显示了cfDNA/肌酸酐比率随移植后天数的变化,并且图8B显示了肾脏损伤测试(KIT)评分随移植后天数的变化。
图9A和9B显示使用cfDNA/肌酸酐比率来预测患者2和患者3中的急性排斥反应。
图10A和10B显示使用本文公开的方法检测患者的IgA肾病(天然肾病)。在该研究中,使用本文公开的方法分析来自个体的尿液样品-其中117个是健康的,85个个体具有IgA肾病,如先前通过其他方法所确定。图10A显示了健康个体(“正常”)和具有IgA肾病(“IgA”)的那些之间检测到的cfDNA/肌酸酐比率的差异。ROC分析表明ROC曲线的AUC为0.9651,置信区间为0.9431至0.9871,P值<0.0001。图10B。
图11显示了来自具有稳定肺移植(“STA”)的个体与经历隐匿性,急性或慢性排斥(“排斥”)的那些的支气管肺泡灌洗液(BAL)中发现的cfDNA浓度之间的比较。p值为0.0427。
图12显示肾移植患者急性肾排斥概率的预测性曲线,作为KIT评分的函数,其通过使用来自尿液的cfDNA和肌酸酐的测量产生。如本文所公开的,收集来自41名接受肾移植的患者的尿液样品。从每位患者获得尿液中cfDNA和肌酸酐的测量值。
图13显示了使用KIT评分来基于具有多种肾损伤原因的490个临床样品的数据集来评估肾损伤。
图14A-E显示使用广义线性模型和相关的ROC曲线来预测肾损伤以及与肾损伤相关的各种疾病,即II型糖尿病,免疫应答,肾结石,移植排斥和高血压的概率。
发明详述
定义
本文所用术语“一个”、“一种”或“该/所述”不仅包括一个构建的方面,还包括一个以上构建的方面。”例如,除非上下文另外清楚地说明,否则,单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代。因此,例如,提到“一个细胞”则包括多个/种这样的细胞,且提到“该/所述试剂”则包括本领域技术人员已知的一个/种或多个/种试剂等等。
术语“对象”,“患者”或“个体”在本文中可互换使用以指人或动物。例如,动物对象可以是哺乳动物,灵长类动物(例如,猴),家畜动物(例如,马,牛,绵羊,猪或山羊),伴侣动物(例如,狗,猫),实验室试验动物(例如,小鼠,大鼠,豚鼠,鸟),具有兽医意义的动物或具有经济意义的动物。
术语“核酸”或“多核苷酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非明确限定,该术语涵盖含有结合特性与参比核酸类似且与以与天然存在核苷酸相似方式代谢的天然核苷酸的已知类似物。术语核酸与基因、cDNA、和基因编码的mRNA互换使用。
术语“肾损伤状态”是指患者是否在肾脏中显示损伤。出于本公开的目的,肾损伤可以由手术(例如肾移植)或任何肾病引起。
术语“肾移植”或“肾脏移植”是指肾脏器官移植到患者体内。供体肾的来源可以来自已故或活体供体。
术语“Alu”或“Alu元件”或“Alu重复”是指最初由藤黄节杆菌(Arthrobacterluteus)限制性内切核酸酶的作用表征的约300个碱基对的DNA。Alu元件是人类基因组中最丰富的重复元件。它们来自小胞质7SL RNA。SEQ ID NO:1代表示例性的人Alu重复序列。
术语“杂交”是指一个或多个探针与靶核苷酸序列的退火。杂交条件通常包括低于探针解链温度,但避免探针的非特异性杂交的温度。
术语“生物流体”或“生物流体样品”是指从待表征和/或鉴定的个体获得或衍生的流体组合物,例如基于物理,生物化学,化学和/或生理学特征。生物流体的非限制性实例包括血液,血清,血浆,唾液,痰,胃液,精液,泪液和汗液。在一个实施方式中,生物流体是尿液。在另一个实施方式中,生物流体是BAL。
术语“移植后”是指器官(例如肾或肺)从供体移植到患者体内后的时间。
如本文所用,术语“AUC”是指“曲线下面积”或C统计量,其在ROC(接收者-操作特征)曲线分析的范围内进行检查。AUC是一种指标,其允许在仅具有单一值的整个测试(或测定)切割点范围内表示测试,测定或方法的灵敏度和特异度。从图中确定测定的AUC,其中纵坐标上的测定的灵敏度相对于横坐标上的1-特异度作图。AUC越高表示测试的准确度越高;AUC值为1表示所有样品均已正确分配(特异度和灵敏度为1),AUC值为50%表示样本已被分配了猜测概率,因此参数无意义。
通过ROC曲线分析使用AUC来评估诊断或预后测试的准确性在本领域中是公知的,例如,如Pepe等,“测定诊断、预后或筛选标志物的性能的让步比的限制(Limitations ofthe Odds Ratio in Gauging the Performance of a Diagnostic,Prognostic,orScreening Marker)”,Am.J.Epidemiol 2004,159(9):882-890,和“ROC曲线分析:显示血清脂质和载脂蛋白水平在鉴定患有冠状动脉疾病的对象中的关系的实例(ROC CurveAnalysis:An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid AndApolipoprotein levels In Identifying Subjects With Coronary Artery Disease)”,Clin.Chem.,1992,38(8):1425-1428。另见CLSI文件EP24-A2:使用接收者操作特征曲线评估实验室测试的诊断准确度;验收导则《Approved Guideline》-第二版。临床和实验室标准研究所;2011;CLSI文件I/LA21-A2:免疫测定的临床评价;验收导则-第二版。临床和实验室标准研究所;2008。
如本文所用,术语“诊断”意指将症状或现象分配给疾病或损伤。为了本发明的目的,诊断意味着确定对象中器官损伤的存在。
如本文所用,术语“预测”是指预测器官损伤是否可能在对象中出现。
1.肾损伤状态
提供了可用于评估肾损伤状态,即个体中肾损伤的存在或不存在的组合物和方法。这样的评估有助于诊断个体何时需要医疗干预,例如给予更多药物以解决医学问题或者在医学上不再需要时减少(包括戒除)药物。例如,本文所述的组合物和方法可用于确定个体何时因肾移植或肾病而有肾损伤。
经历了肾移植的患者可能发生肾损伤。例如,这可能由于几种免疫和非免疫因素而发生,例如缺血再灌注损伤,大小差异,供体相关因子,细胞介导的排斥和抗体介导的排斥。移植后的问题可包括:移植排斥(超急性,急性或慢性),由于降低排斥风险所需的免疫抑制药物所致的脓毒症和感染,移植后淋巴组织增生性疾病(由免疫抑制剂引起的淋巴瘤形式),包括钙和磷酸盐的电解质不平衡,其可导致骨骼问题等,以及药物的其他副作用,包括胃肠炎症和胃和食道溃疡,多毛症(男性模式分布中过多的毛发生长),脱发,肥胖,痤疮,2型糖尿病,高胆固醇血症和骨质疏松症。
肾脏疾病患者也可能发生肾损伤。肾脏疾病是多种多样的,但患有肾脏疾病的个体经常表现出特征性的临床特征。涉及肾脏的常见临床病症包括但不限于肾脏和肾病综合征,肾囊肿,急性肾损伤,慢性肾病,糖尿病性肾病,尿路感染,肾结石和尿路梗阻,肾小球肾炎(GN),局灶性节段性肾小球硬化(FSGS),IgA肾病(IgAN),系膜毛细血管,狼疮和膜性等,高血压性肾病和药物性肾病。肾脏疾病还可包括现有的各种肾癌。例如,此类癌症包括但不限于肾细胞癌,肾盂尿路上皮细胞癌,鳞状细胞癌,肾小球旁细胞瘤(肾癌),血管平滑肌脂肪瘤,肾嗜酸细胞瘤,贝利尼管癌,肾透明细胞肉瘤,中胚层肾瘤,肾母细胞瘤,混合上皮间质瘤,透明细胞腺癌,移行细胞癌,乳头状瘤,肾淋巴瘤,畸胎瘤,癌肉瘤和肾盂类癌。肾病也可以是病毒诱导的,包括但不限于BKV肾病和由EBV和CMV诱导的肾病。肾脏疾病也可能是药物诱导的,因为一些药物是肾毒性的(它们具有增加的肾脏伤害风险)。在最坏的情况下,药物导致肾功能衰竭,而在其他情况下,肾脏受损,但不会功能衰竭。常见的肾毒性药物包括但不限于非甾体抗炎药(NSAID),一些抗生素,一些止痛药和用于某些成像程序的放射性造影染料。
在一些实施方式中,尿液样品来自具有肾移植的个体,或如本文所述测定上述肾病或肾移植临床病症之一。
2.肺损伤状态
本文提供了可用于评估肺损伤状态,即个体中肺损伤的存在或不存在的组合物和方法。这样的评估有助于诊断个体何时需要医疗干预,例如给予更多药物以解决医学问题或者在医学上不再需要时减少(包括戒除)药物。例如,本文所述的组合物和方法可用于确定个体何时因肺移植而有肺损伤。
经历了肺移植的患者可能发生肺损伤。例如,这可能由于几种免疫和非免疫因素而发生,例如缺血再灌注损伤,大小差异,供体相关因子,细胞介导的排斥和抗体介导的排斥。肺移植后的问题可包括超急性排斥反应,急性排斥反应,几种类型的慢性排斥反应或慢性肺同种异体移植物功能障碍(CLAD),例如限制性同种异体移植综合征(RAS)或闭塞性细支气管炎综合征(BOS),感染和由降低排斥风险所必需的免疫抑制药物引起的败血症。
在一些实施方式中,生物流体样品,例如支气管肺泡灌洗液(BAL)流体样品,来自具有肺移植,或如本文所述检定的肺移植临床病症的个体。因此,在一些实施方式中,本文提供了检测来自具有肺移植或肺移植临床病症的个体的生物流体样品中无细胞DNA(cfDNA)中的Alu拷贝数的方法。该方法包括从人体获得生物流体样品,例如支气管肺泡灌洗液(BAL)流体样品;从生物流体样品中提取cfDNA;通过使cfDNA与核酸探针在允许探针与与探针互补的cfDNA中的DNA杂交的条件下接触以形成反应混合物,其中核酸探针具有有3′和5′末端的核酸序列,其中核酸探针与SEQ ID NO:1的连续20-292个核苷酸互补,并且其中3′或5′末端是共价连接的可检测标记物;并定量与探针杂交的DNA量,从而检测生物流体样品中无细胞DNA(cfDNA)中的Alu拷贝数。
可以相对于总生物流体样品体积标准化与探针杂交的DNA的量,以产生杂交的DNA的标准化量。在一些情况下,将杂交的DNA的标准化量与指示肺状态的截止值进行比较。在一些情况中,该方法还包括如果检测到的与探针杂交的靶DNA(例如cfDNA)的量或靶DNA(例如cfDNA)的标准化量大于截止值,则确定患者具有肺损伤。
3.保存混合物
在一些方面,提供了可以稳定生物流体无细胞DNA(“cfDNA”)的试剂的保存性混合物。在一些实施方式中,保存性混合物是包含甲醛供体和螯合剂,例如钙螯合剂的溶液。甲醛供体的非限制性实例包括二偶氮烷基脲和咪唑烷基脲。螯合剂的非限制性实例包括EDTA和EGTA。在一些实施方式中,溶液还包含PEG,α-金精三羧酸中的一种或两种。在一些实施方式中,溶液还包含叠氮化钠和缓冲剂。缓冲剂的非限制性实例包括PBS,TAPS,N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸,Tris,N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸,HEPES,TES,MOPS,PIPES,卡可酸盐和MES。在一些实施方式中,溶液包含相应组分,其浓度可通过防止核酸酶降解cfDNA和/或通过抑制细胞裂解来保存生物流体(例如尿液)。除了稳定cfDNA之外,该溶液还可以通过稳定生物流体中存在的细胞来防止基因组DNA污染。各种分子量的PEG和各种形式的EDTA可用于该混合物中以提供上述所需的性质。在一个实施方式中,混合物中使用的PEG是PEG 35,000。在一个实施方式中,EDTA是Na2EDTA。在一个实施方式中,EDTA是K2EDTA。在一个实施方式中,EDTA是K3EDTA。
通常,将混合物制备为浓缩储备溶液,例如100x,20x,10x,5x或2x浓缩储备溶液,并与待测定的生物流体,例如尿液样品混合并用其稀释至最终工作浓度。例如,对于10x浓度的混合物,其在与尿液混合后将稀释10倍,二偶氮烷基脲的浓度可以是0.1g/L至50g/L,例如0.5g/L至30g/L,1g/L至20g/L,5g/L至20g/L,5g/L至15g/L,或5g/L至10g/L;PEG 35,0000的浓度可以是0.2g/L至50g/L,例如0.5g/L至40g/L,1g/L至30g/L,20g/L或15g/L至25g/L;金精三羧酸的浓度可以是0.1mM至10mM,例如,0.2mM至10mM,0.5mM至5mM,0.5mM至2mM,或1mM至2mM。EDTA的浓度可以是1mM至100mM,例如2mM至50m,5mM至40mM,5mM至20mM,或10mM至20mM。10x浓缩储备溶液还可以包含浓度为1mM至100mM,2mM至50mM,5mM至20mM或10mM至15mM的叠氮化钠。混合物可包含缓冲剂,例如磷酸盐缓冲盐水(PBS),例如10x浓缩储备溶液中的10x PBS。
在一些情况下,混合物以粉末或固体表格形式提供,并通过添加水或水性缓冲剂或生物流体本身重建成溶液。
在某些实施方式中,混合物包含约10g/L二偶氮烷基脲,约20g/L聚乙二醇缩合物,约1mM金精三羧酸,约10mM K2EDTA,约10mM叠氮化钠,和/或约1X磷酸盐缓冲盐水,pH7.4。
4.核酸探针
已经广泛研究了Alu基因用于扩增各种区域以评估癌症患者中cfDNA的量(BiolProced Online(2013);Park等,Oncol Lett (2012))。在一个方面,本发明提供了通过使用标记的核酸探针与cfDNA中的Alu重复序列杂交来评估生物流体中cfDNA的量的方法。
在一些实施方式中,核酸探针包含核苷酸序列,其包含SEQ ID NO:1的至少20-300个,例如,20-292,20-180,50-150,70-100,80-90个连续核苷酸或与其完全互补,SEQ IDNO:1如下:5’GGCCGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGCGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAA-3’。
在一些实施方式中,探针包含核苷酸序列,其包含SEQ ID NO:2的至少20、30、40、50、60、70、80或81个连续核苷酸或与其完全互补,SEQ ID NO:2如下:GCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGAT。
本文在核酸探针的内容中提及的核苷酸可以是天然核苷酸,例如胞嘧啶,鸟嘌呤,胸腺嘧啶,腺嘌呤或修饰的核苷酸。修饰的核苷酸是指这样的改变,其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被不同的核苷酸替换,所述核苷酸向寡核苷酸提供所需的性质(例如,与靶核酸中的互补核苷酸碱基配对的能力)。修饰的核苷酸的非限制性实例包括锁核酸(LNA),肽核酸(PNA),吗啉代,和美国专利公开号20160177377中描述的那些。
在一些实施方式中,探针的核苷酸序列与可检测标记物偶联。可检测标记物可以偶联到探针的任何核苷酸上,只要它不抑制探针与靶标(即cfDNA中的Alu重复序列)的杂交即可。在一些实施方式中,核苷酸序列的5′末端与一个或多个(例如,两个或更多个)可检测标记物偶联。在一些实施方式中,可检测标记物本身与信号产生剂偶联。在一些实施方式中,可检测标记物是可以结合结合伴侣的分子,并且结合伴侣与信号产生剂连接。例如,在一些实施方式中,可检测标记物是生物素,并且结合伴侣是链霉亲和素,反之亦然。在一些实施方式中,可检测标记物是异羟基洋地黄毒苷,其结合伴侣是抗异羟基洋地黄毒苷,反之亦然。在一些实施方式中,可检测标记物是2,4-二硝基苯酚(DNP),并且结合伴侣是抗DNP,反之亦然。本领域技术人员已知的其他标记物也可用于本文公开的核酸探针。信号产生剂可以是产生可量化信号,包括但不限于化学发光,颜色或荧光的任何试剂。信号产生剂的非限制性实例包括酶,荧光分子等。可检测标记物和信号产生剂的其他非限制性实例可以在US20130209990中找到,在此通过引用纳入。在一个优选的实施方式中,信号产生剂是辣根过氧化物酶(HRP)。
在一些情况下,探针的核苷酸序列的3′末端与一个或多个可检测标记物偶联。在一些情况下,核苷酸序列的5′和3′末端都与一个或多个可检测标记物偶联。与探针偶联的可检测标记物的数量可以变化,例如,该数量可以是至少一,二,三,四,五,六,七,十,十五,十八或更多。通常,更高数量的可检测标记物将在测定中产生更高的信号(Division等,Nucleic Acids Res.(1988)16:4077-4095)。普通技术人员可以基于在来自生物流体的无细胞DNA中检测靶标(例如Alu重复序列)所需的信号量,容易地确定待使用的可检测标记物的数量。
在一个实施方式中,探针核酸序列的5′或3′末端与一个生物素偶联。在一个实施方式中,与核酸序列偶联的生物素的总数是1或18,或其间的任何数。一个或多个生物素可以全部在核酸探针的相同5′或3′末端偶联。一个或多个生物素也可以在两端以任何组合偶联。在一些实施方式中,两个生物素与探针的核酸序列偶联。在一个实施方式中,两个生物素与探针核酸序列的5′末端偶联。
本文所述的核酸探针可以通过本领域已知的任何合适的方法产生,包括例如化学合成,从天然来源分离,重组产生和不对称PCR(McCabe,1990于:《PCR方案:方法和应用指南》(PCR Protocols:A guide to methods and applications),加利福尼亚州圣地亚哥,学术出版社,76-83)。可能优选在一个或多个区段中化学合成探针并随后连接区段。Narang等(1979Meth.Enzymol.68:90),Brown等(1979 Meth.Enzymol.68:109)和Caruthers等(1985 Meth.Enzymol.154:287)描述了几种化学合成方法,其通过引用纳入本文。或者,克隆方法可以提供方便的核酸片段,其可以被分离以用作启动子引物。在与生物流体中的cfDNA杂交之前,可以首先使用例如常规变性方法使双链DNA探针成为单链。
5.使用方法
在一些实施方式中,所述方法包括将cfDNA(未预先扩增的)与固体支持物连接,将对Alu重复序列特异的探针与cfDNA杂交,去除(例如,洗去)未结合的探针,然后检测特异性杂交探针的量,从而确定样品中cfDNA的量。
a.获得生物流体样品
来自个体(例如疑似有器官损伤的那些)的生物流体样品,例如尿液或BAL,可以医学专业人员推荐的任何方式收集,例如在收集流体中段在无菌容器中。在一些实施方式中,然后通过离心处理样品以除去细胞组分,从而产生无细胞样品。任选地,可以将样品与缓冲剂(例如PBS或Tris)和/或上述保存混合物混合。样品可以储存在-80℃,直到进一步分析。在一些实施方式中,将如上所述的保存混合物添加到生物流体样品中以产生混合物。在一些实施方式中,可以将混合物等分以提取cfDNA。
b.提取无细胞DNA
用于提取无细胞DNA的方法是本领域熟知的,并且商业试剂盒是容易获得的,例如来自凯杰公司(Qiagen)(加利福尼亚州瓦伦西亚)的循环核酸试剂盒。通常,可以处理样品以降解细胞碎片并除去DNA酶和RNA酶以产生裂解物。裂解物中的DNA可以通过例如使裂解物通过DNA结合柱来提取,并且可以用水或缓冲液洗脱结合的DNA。任选地,可以取一份洗脱液以确定回收的cfDNA的浓度。
随后将cfDNA与固体支持物连接。固体支持物可以是容纳容器,珠或任何其他固体支持物。在一些实施方式中,将cfDNA置于期望的容器中,例如,置于微孔板的孔中,并孵育一段时间,该时间足以使cfDNA结合孔的表面。在一些实施方式中,孵育在至少一小时,至少两小时,至少四小时的时间段内发生,任选地在室温下进行。一些实施方式中,孵育在4℃下持续至少8小时。在孵育后,可以用封闭溶液,例如含5%BSA的溶液洗涤并封闭容器,以使非特异性结合最小化。封闭溶液可包含缓冲剂(例如PBS)。然后可以在加入用于与靶标,即Alu重复序列杂交的核酸探针之前除去封闭溶液。
c.用Alu重复序列杂交核酸探针
可以在任何反应容器中进行核酸探针与cfDNA中的Alu重复序列的杂交测定,所述反应容器包括但不限于多孔板,例如96孔板,例如96孔LUMITRAC600(Greiner Bio-One)。与基于PCR的方法相比,期望使用杂交测定(即,在没有先前扩增靶核酸的情况下偶联至可检测标记物的探针的杂交)的检测cfDNA的测定,因为杂交测定是低成本的并且可以多重化至更高级别(例如,384个/批)。此外,杂交方法允许更完整和准确地定量cfDNA,因为探针将检测生物流体中的所有单链和双链cfDNA,而与片段长度无关。
在示例性杂交测定中,允许从如上所述的生物流体中提取的预定体积的cfDNA结合至支持物,例如微孔板孔的底部。在一些实施方式中,预先处理支持物表面以增加cfDNA对反应容器表面的结合亲和力。在一些实施方式中,加入缓冲剂(例如PBS)和盐(例如MgCl2)以促进探针和cfDNA之间的杂交。盐的最终工作浓度可以是0.05M-0.5M,例如0.05M-0.2M,或0.1M。任选地,可以使用已知量的人DNA提取物产生标准曲线。
cfDNA和核酸探针的杂交可以在标准杂交条件下进行。探针与核酸序列杂交的反应条件因探针而不同,这取决于诸如探针长度,序列中G和C核苷酸的数目以及杂交反应中使用的缓冲液的组成等因素。本领域技术人员通常将中等严格的杂交条件理解为约20℃~50℃的条件,例如,比完全碱基配对的双链DNA的解链温度低25℃~40℃。通常通过使用具有更高温度的培养条件,换句话说更严格的条件来实现更高的特异性。Sambrook等的著名实验室手册,《分子克隆:实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL),第二版,冷泉港实验室出版社,纽约(1990)(通过引用纳入本文)的第11章详细描述了寡核苷酸探针的杂交条件,包括所涉及因素和保证特异性杂交所必需的严格程度的描述。杂交通常在缓冲水溶液中进行,其中选择诸如温度,盐浓度和pH的条件以提供足够的严谨性,使得探针与它们各自的靶核酸序列特异性杂交,但不与任何其他序列杂交。
通常,核酸探针和靶标,例如cfDNA中的Alu重复序列之间的杂交效率在添加的探针量对模板摩尔过量的条件下得到改善。在一些实施方式中,本发明的核酸探针在5%BSA中以10ng/μl-200ng/μl,例如20ng/μl-100ng/μl,30ng/μl-75ng/μl,30ng/μl-50ng/μl的浓度稀释。在一个具体实施方式中,核酸探针是双重生物素化的并且以30-40ng/μl的浓度使用。可以孵育平板中的核酸探针和cfDNA以允许探针和cfDNA中的Alu重复序列杂交。然后可以洗涤板的孔(例如,用PBS或另一种缓冲液)并任选地在检测前干燥。
d.检测信号
检测由可检测标记产生的信号的方法是本领域公知的,并且该方法取决于用于产生信号的化学反应的性质而不同。如上所述,在一些实施方式中,可检测标记物本身是产生信号的信号产生剂,其可以使用适当的设备,例如酶标仪直接读取。在一些实施方式中,可检测标记物间接产生信号,将包含与信号产生剂偶联的标记物的结合伴侣的溶液加入板中以产生信号。信号产生剂包括,例如,酶或酶底物,反应性基团,发色团如染料或有色颗粒,包括生物发光,磷光或化学发光部分的发光部分,和荧光部分。在一个实施方式中,可检测标记物是生物素,结合伴侣是链霉亲和素,并且信号产生剂是辣根过氧化物酶(HRP)。在该特定实施方式中,信号是化学发光信号,其可以通过本领域熟知的方法容易地检测和定量。
e.检测肌酸酐水平
本文公开的cfDNA的定量可以与尿蛋白的测量组合。在一个具体实施方式中,尿蛋白是肌酸酐。肌酸酐可以使用基于吸光度的方法Jaffe反应来测量。用于测量肌酸酐的商业测定法是容易获得的,例如QuantiChromTM肌酸酐测定试剂盒(生物测定系统公司(BioAssaySystems)),其产生以毫克肌酸酐/分升尿液计的输出。参见例如www.bioassaysys.com/Datasheet/DICT.pdf。在一些实施方式中,在提取和定量尿液样品中的cfDNA之前或之后进行尿肌酸酐测量。在一些实施方式中,尿肌酸酐测量和cfDNA定量在相同的微孔板(但不同的孔)中进行,例如,通过将用于测量肌酸酐的尿液样品置于与从这些尿液样品中提取的cfDNA相同的微孔板中。与常规PCR方法相比,在相同平板/测定中测量肌酸酐和cfDNA节省了时间和成本,常规PCR方法需要一次测定来读取cfDNA的扩增产物的量,和一次测定来读取肌酸酐水平。
f.检测其他标志物
可以测量其他已知标志物以进一步改善器官损伤检测的灵敏度和/或特异性。在一些实施方式中,其他标志物包括一种或多种组织炎性标志物,例如CXCL10,例如,肾脏发炎。在一些实施方式中,检测并定量CXCL10。测量CXCL10的方法是众所周知的,例如,使用夹心ELISA方法,其中捕获抗体首先吸附在板上,然后加入样品以捕获样品中的CXCL10。然后,添加检测抗体,其将结合捕获的CXCL10。这可以使用文献中熟知的通用二抗-HRP偶联方法来检测。用标准浓度的纯化的CXCL10蛋白质产生标准曲线。商业试剂盒可用于测量CXCL10,例如,来自RD系统的人CXCL10/IP-10 Quantikine ELISA试剂盒。可以在cfDNA测量之前或之后测量尿液CXCL10。尿液CXCL10也可以在与cfDNA相同的微孔板中测量,例如,首先在微板中的指定孔中包被CXCL10捕获抗体,并将尿液样品放置在这些指定的孔中用于测量CXCL10。
此外,尿液中cfDNA的差异甲基化状态为肾损伤增加了额外的显著性,并且可以测量与甲基化状态相关的标志物并将其添加到上述用于检测肾损伤的测定中。因此,在一些实施方式中,其他标志物包括一种或多种DNA甲基化标志物。在一个特定的实施方式中,DNA甲基化标志物是5-甲基胞嘧啶,其掺入样品中的核酸中。
可以使用基于ELISA的方法检测和定量DNA甲基化标志物。用于测量DNA甲基化标志物的商业试剂盒是容易获得的,例如来自EpiGentek的MethylFlash尿液5-甲基胞嘧啶(5-mC)定量试剂盒,其用于测量掺入DNA中的5-甲基胞嘧啶的量。简而言之,将具有甲基化的DNA的平板与样品和识别甲基化标志物的抗体一起孵育。将该溶液孵育,然后洗涤并用检测抗体和/或底物进一步检测。
在一些实施方式中,其他标志物包括生物流体样品中的总蛋白质。可以使用本领域已知的可用于测量蛋白质的任何方法测量总蛋白质的量。在一个实施方式中,测量总蛋白的测定是比色测定,例如Bradford蛋白测定。
在一些实施方式中,其他标志物包括簇蛋白。簇蛋白是一种与清除细胞碎片和细胞凋亡有关的蛋白质。还可以使用基于ELISA的测定,例如Human Clusterin DuoSet ELISA来检测和测量簇蛋白的存在。与其他夹心ELISA一样,将具有与其结合的针对簇蛋白的捕获抗体的平板与尿液样品一起孵育,任选地在样品稀释剂中稀释。然后将针对簇蛋白的检测抗体与平板一起孵育,并使用HRP检测系统测量吸光度。
g.任选的试剂和装置
该方法可用于多种测定装置和/或形式。测定装置可包括例如测定板,药筒,多孔测定板,反应容器,试管,比色皿,流动池,测定芯片,侧向流动装置等,测定试剂(其可包括靶向剂或其他结合试剂)在测定进行时添加或预装到测定模块的孔,室或测定区域。这些装置可以采用多种测定形式用于特异性结合测定,例如免疫测定或免疫色谱测定。示例性测定装置,例如微孔板和形式,96孔板形式,在下文中描述。
在某些实施方式中,所述方法可以使用以干燥状态储存的测定试剂,并且测定装置/试剂盒可以进一步包含或提供干燥剂材料,用于将测定试剂保持在干燥状态。预装有测定试剂的测定装置可以大大提高速度并降低测定测量的复杂性,同时在储存期间保持优异的稳定性。测定试剂还可以包括不直接参与检测机制但在测定中起辅助作用的物质,包括但不限于封闭剂,稳定剂,去污剂,盐,pH缓冲剂,防腐剂等。试剂可以游离形式存在或支持在固相上,包括测定模块中的隔室(例如,室,通道,流动池,孔等)的表面或胶体,珠或其他颗粒支持物的表面。
在一些实施方式中,上述方法可以在侧向流动测定(“LFA”)中进行。LFA取决于流体样品穿过垫的毛细管作用,所述垫包含对感兴趣抗原的捕获试剂。在一些实施方式中,生物流体样品在应用于装置(例如,试纸或测试条)后与试剂一起混合,所述试剂是与竞争形式的可见标志物(例如胶体金)结合的纯化的感兴趣抗原或与可见标志物结合并以非竞争形式识别生物流体样品中的感兴趣抗原的抗体。感兴趣抗原可以是生物流体样品中的任何分子,例如,本申请中公开的任何标志物,例如肌酸酐,cfDNA,甲基化标志物,CXCL10,和/或簇蛋白。在一些实施方式中,竞争形式的LFA用于测量肌酸酐和/或甲基化标志物。在一些实施方式中,非竞争形式的LFA用于测量cfDNA,CXCL10和/或簇蛋白。
6.确定器官损伤状态
a.基于cfDNA的量确定器官健康
在一些实施方式中,确定个体的器官健康包括将生物流体样品中的cfDNA的量与指示器官损伤状态的截止值或预测概率估计进行比较。截止值可以是预定值或预测概率估计,例如,医疗专业人员推荐的值。根据情况,在某些情况下可能需要为确定建立截止值。为了建立用于实施本文公开的方法的这种截止值,选择一组健康个体,例如在器官移植后没有器官损伤的一组个体。如果适用,这些个体在适当的参数范围内,以便使用本发明的方法确定器官损伤状态。例如,个体可能具有相似的年龄,性别和相当的健康状态。
在一些实施方式中,为了评估肾损伤,首先将尿液中检测到的cfDNA的量,即与核酸探针杂交的DNA的量标准化至尿肌酸酐的量,以产生cfDNA的标准化量。在一些情况下,cfDNA的标准化量是尿液中cfDNA的检测量与肌酸酐量的比率。为了确定肾损伤状态,将cfDNA的标准化量与截断值进行比较,该截止值也是尿液中cfDNA量与肌酸酐量的相对比率,其被医疗专业人员确定为指示肾损伤状态或如上所述确定。
如果尿液中cfDNA的量或cfDNA的标准化量高于其各自的截断值,则确定患者有肾损伤;通常,较高的值表示较高程度的肾损伤。在一些情况下,如果cfDNA的量或cfDNA的标准化量高于但接近截止值,则确定患者有亚临床损伤。如果尿液中cfDNA的量或cfDNA的标准化量等于或低于其各自的截止值,则确定患者没有肾损伤,即良好的肾脏健康。对于已经接受肾脏移植的患者,从尿液检测肾脏损伤表明他们可能有急性排斥反应发作。对于疑似患有某些肾脏疾病的患者,在一些实施方式中,肾损伤的检测表明患者可能患有肾脏疾病。
与检测血液中cfDNA的常规方法相反,其可能被主要来自肾脏移植受体的cfDNA污染,尿液中检测到的cfDNA特异性地反映了供体来源的DNA,即使在测试总cfDNA时也是如此。图6显示了尿液中染色体Y和染色体1拷贝数之间的相关性。强线性相关性(R2=0.9253)表明总cfDNA的定量反映了供体来源的负荷,并且正确地反映了肾移植引起的肾损伤状态。
b.使用IT评分确定器官移植患者的器官损伤状态
在某些实施方式中,预测性评分,即IT评分,用于诊断已经接受器官移植的患者是否可能有器官损伤,或预测患者将来发生器官损伤的可能性。器官移植后发生的器官损伤通常与移植器官的急性排斥反应有关。
IT评分可以是复合值,其可以基于来自器官的生物流体样品中的cfDNA的量和可以用于标准化生物流体样品中的cfDNA的量的因子(“标准化因子”)来计算。在一个实施方式中,肌酸酐的量用于标准化尿液中的cfDNA。在另一个实施方式中,BAL的样品体积用于使来自肺的BAL中的cfDNA标准化。IT评分还可以包括时间点,即获取生物流体样品时的移植后天数。移植后的时间可能是器官损伤的混淆因素,因为患者经常会受到伤害,这种伤害不一定归因于对移植器官的排斥,例如,缺血再灌注对移植器官的肾毒性损伤和感染和钙调神经磷酸酶抑制剂药物暴露引起的肾毒性损伤。这些损伤并不表示急性排斥反应,这种损伤的程度可能在移植后的不同时间点发生变化。因此,IT评分,时间考虑包括移植后的时间点,可以准确地预测患者是否对移植器官有急性排斥反应。
在一些实施方式中,生物流体样品中cfDNA的测量值可以与生物流体样品中的其他生物标志物组合以形成可用于诊断和/或预测器官损伤的IT评分。在一些实施方式中,多变量方法可用于将这些其他生物标志物(例如,CXCL10和DNA甲基化标志物)掺入以计算IT评分。在一些实施方式中,通过取cfDNA与肌酸酐的比率或按比例缩放cfDNA和肌酸酐的对数测量值(例如通过回归分析),相对于样品中肌酸酐的量标准化cfDNA浓度。在一些实施方式中,通过取cfDNA与体积的比率或按比例缩放cfDNA和体积的对数测量值(例如通过回归分析),相对于BAL的样品体积标准化cfDNA浓度。在某些情况下,使用包含拟似然分布和逻辑链函数的广义线性模型对生成的值进行回归。在某些情况下,急性排斥的结果模型概率估计值从0到100重新调整以形成IT评分并用于生成预测性曲线。图12显示了一个说明性实施方式,其显示肾移植患者中急性肾排斥的概率,作为评估肾损伤(“KIT”)所得IT评分的函数。
在一些实施方式中,IT评分(例如KIT评分)可用于以高特异度和灵敏度预测或诊断器官损伤。在一些实施方式中,通过包括存在于来自怀疑受伤或未来可能发生损伤的器官的生物流体样品中的cfDNA的量,DNA甲基化标志物的量和/或炎症标志物来产生IT评分。在一些实施方式中,IT评分是用于评估肾损伤的KIT评分。在一些实施方式中,通过进一步包括肌酸酐的量和/或肾小管损伤标志物(例如,簇蛋白)的量来产生KIT评分。在一些实施方式中,通过包括如上所述的多种标志物产生的IT评分可以以至少85%,至少87%,至少88%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%的灵敏度,和/或至少85%,至少87%,至少88%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%的特异度检测器官损伤。在一些实施方式中,使用上述KIT评分可以至少85%,至少87%,至少88%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96.9%,或至少99.4%的AUC检测肾损伤。图13提供了说明性实施方式,其基于具有多种肾损伤原因的490个临床患者样品的数据集显示用于评估肾损伤的IT评分(“KIT”)。得到的KIT评分基于以下子集:具有cfDNA,肌酸酐,CXCL10,簇蛋白,蛋白质和DNA甲基化标志物的完整测量的299个临床患者样本;111例II型糖尿病,71例免疫,50例肾结石,20例移植排斥,19例高血压和28例对照。得到的KIT评分对于肾损伤的检测具有超过91%的灵敏度和特异度(AUC=96.9%)。
在一些实施方式中,使用数学模型/算法来使用如上所述的cfDNA的量和一种或多种标志物来开发IT评分。这些模型可包括广义线性模型,例如逻辑回归;和非线性回归模型,如神经网络,广义加性模型,相似最小二乘法和递归分割方法。在一些实施方式中,用于生成IT评分的数学模型/算法由一个或多个计算机处理器执行。优选地,用于开发IT评分的数学模型基于包括足够样本大小的数据库。在一些实施方式中,数据库包含至少50,至少60,至少70,至少100,至少200,至少300或至少400个样本。图14a-14e提供了使用广义线性模型拟合和相关ROC曲线的说明性实施方式,以提供肾损伤的概率,以及由于每种疾病原因引起的肾损伤的概率;即,II型糖尿病,免疫反应,肾结石,移植排斥和高血压。在如图14A-E所示的一个具体实施方式中,所得算法对于检测肾损伤的每种原因具有超过92%的灵敏度和特异度(AUC>99.4%)。
在一些实施方式中,可以通过测量来自一组健康个体,例如一组在选择器官移植之后没有器官损伤的个体的相同或相似类型器官的生物流体样品中存在的标志物来建立IT评分的截止值。如果适用,这些个体在适当的参数范围内,以便使用本发明的方法确定器官损伤状态。例如,个体可能具有相似的年龄,性别和相当的健康状况。然后使用数学模型和/或标志物产生IT评分的截止值,所述数学模型和/或标志物与用于生成待测患者的IT评分的数学模型和/或标志物相同。
在一些实施方式中,已使用多变量方法将多种生物标志物(例如,CXCL10和DNA甲基化标志物)与cfDNA和肌酸酐结合以进一步改善KIT评分,并且KIT评分可用于诊断和/或预测由多种临床病症,例如I型糖尿病,II型糖尿病,肾结石,癌症和免疫复合物如IgA肾病引起的肾损伤。
可以使用多种方式来产生KIT评分。在一些实施方式中,首先基于来自未显示排斥的肾移植患者的尿液样品的标准化cfDNA值(例如,标准化至肌酸酐水平)确定cfDNA/肌酸酐比率的截止值。可以在移植后期间的预定时间点收集这些尿液样品。然后可以基于患者的标准化cfDNA值确定患者的KIT评分。然后可以将这些标准化值与那些时间点的截止值进行比较,以确定标准化值是否可预测健康或患病的肾功能。如果需要,可以在计算机上执行这种比较。
在一些实施方式中,截止值是接受肾移植但在移植后期间的相应时间点未显示器官损伤的患者中的cfDNA/肌酸酐比率。在一些实施方式中,可以产生标准化cfDNA水平的预测谱带,并且可以将患者的实际标准化cfDNA值与对应于移植后相同时间点的预测谱带中的值进行比较。可以以多种方式建立预测谱带。在一些实施方式中,随时间检查许多稳定的,非排斥的患者,并且相对于移植后的时间,指数衰减曲线拟合cfDNA/肌酸酐值。随后基于规定的概率生成预测谱带,以覆盖来自被采样的相同组的未来观察值。例如,95%预测谱带由在移植后不同时间点检查的95%稳定的非排斥患者的cfDNA/肌酸酐比率的上限组成。然后基于cfDNA/肌酸酐的实际测量值和对应于该时间点的预测谱带值确定移植后特定时间的KIT评分。
在一些方法中,相对于肌酸酐值的cfDNA值被加工成其他形式的信息,例如,通过使用常见的数学变换(例如对数变换)或统计模型(例如逻辑或广义线性模型)。其他数据处理方法,例如参考群体的平均值的结果标准化等,也是本领域技术人员公知并且可以使用的。
KIT评分通常是在定义的比例内或在定义的值范围内的数字评分。可以将KIT评分与KIT评分的截止值进行比较,该截止值预测患者是否有急性排斥反应发作。如果KIT评分高于KIT评分的截止值,则预测患者有肾损伤,表明他或她可能有急性排斥反应(AR)发作。在某些情况下,较高的KIT评分表明由于AR发作引起的损伤程度较高。例如,在KIT评分是本专利的cfDNA/肌酸酐比率除以比率的截止值的对数的情况中,KIT评分的截止值是0。
KIT评分高度预测与急性排斥相关的器官损伤,并可用于确定患者是否有急性排斥反应。参见,图5A。接受者操作特征曲线(ROC)分析显示,使用KIT评分检测急性排斥反应的ROC曲线的AUC为0.9649,p值为0.0001,95%置信区间为0.9346-0.9952,表明该方法具有高灵敏度和特异度,图5B。相反,常规肾损伤预测方法,即检测蛋白尿,具有0.6498的低得多的AUC,p值为0.07479,置信区间为0.5032-0.7963。使用来自同一组患者的结果的McNemar′s配对卡方检验差异显著性。p值为0.021,表明KIT提供超出蛋白质的信息,并且它们的灵敏度显著不同。该比较表明KIT方法比蛋白尿方法在确定急性排斥反应中更准确。
McNemar检验结果:
KIT和蛋白质
a.McNemar检验
b.连续性修正
在一些实施方式中,除了cfDNA/肌酸酐比率之外,通过在移植后不同时间点进一步包括其他已知的肾损伤标志物的测量来产生KIT评分增加测定灵敏度。如上所述,这些标志物包括但不限于CXCL10和DNA甲基化标志物。对于任何感兴趣的生物标志物,可以为这些生物标志物中的每一个生成纵向趋势曲线,并且可以以与用于生成cfDNA/肌酸酐比率预测谱带的类似的方式建立指数衰减曲线,即90%或95%预测谱带。
类似于上面公开的方法,即产生KIT评分和使用所产生的KIT评分来评估肾损伤的方法可以用于产生KIT评分以评估任何其他器官的损伤,例如器官移植后发生的损伤。
因此,通过使用对应于移植后期间的指定时间点的cfDNA标准化量(例如,标准化至肌酸酐水平)或IT评分,本发明可用于方便地监测器官移植患者与急性排斥反应发作相关的器官损伤。该期间可以具有治疗医师认为必要的任何长度,例如,至少20天,至少50天,至少100天,至少150天,至少200天或至少400天,至少500天,或移植肾的寿命。测量cfDNA和肌酸酐可以根据需要以任何频率进行,例如,每年至少一次,每年至少两次,至少每三个月,至少每两个月,或至少每一个月,或至少每20天,或至少每10天。如此确定有急性排斥反应发作的患者可以尽快治疗,例如,通过给予免疫抑制药物。免疫抑制药物的非限制性实例包括神经钙蛋白抑制剂,例如他克莫司和环孢菌素;抗增殖剂,如吗替麦考酚酯,霉酚酸钠和硫唑嘌呤;mTOR抑制剂,例如西罗莫司,类固醇,例如泼尼松,和诱导剂,例如胸腺球蛋白,IL2R阻断剂或贝拉西普。另一方面,如果IT评分等于或低于截止值,则确定患者没有肾损伤,因此不需要干预。如果患者的IT评分接近截止值,则确定患者有亚临床损伤。IT评分可以帮助治疗医师确定肾移植是否成功以及是否以及何时需要干预。此外,还可以分析患者特定的IT评分趋势,以确定是否需要任何临床干预。例如,IT评分增加的趋势表明患者正在发生急性排斥反应发作,因此可能需要临床干预。
c.检测肾脏疾病
在与肾脏疾病相关的肾损伤的情况下,KIT评分不适用,并且该测定基于如上所述的cfDNA/肌酸酐比。在一些情况下,添加可以多重化到cfDNA板上的其他生物标志物,例如CXCL10,可以适用于创建用于检测的预测模型。该方法可用于检测肾脏疾病,如局灶性节段性肾小球硬化(FSGS),IgA肾病,早期糖尿病肾病,BK病毒性肾炎(BKVN),局灶性节段性肾小球硬化(FSGS),肾小球肾炎(GN),急性肾小管坏死(ATN),IgA疾病和糖尿病肾病。显示使用cfDNA/肌酸酐比率将患有BKVN的患者与未患有该疾病的患者分开。
d.计算机和智能手机装置
在一些实施方式中,来自本文所述的一种或多种标志物,例如cfDNA,肌酸酐的信号,例如,如通过侧向流动测定法检测的,被传递至计算机装置,照相机或智能手机。在一些实施方式中,信号被传送到智能手机app以进行处理。
实施例
实施例1.靶向Alu元件的探针
为了更全面地覆盖生物流体中的cfDNA库,选择长度<100bp的靶向Alu重复序列的核酸探针,以便可以同时捕获长片段长度和极短片段长度的cfDNA。在该特定测定中,探针长度为81bp(图2),尽管长度较短,例如18-22bp的PCR引物通常所用的长度,也应当起作用。
下文列出了参考ALU序列(SEQ ID NO:1),并且以粗体突出显示了靶向Alu探针的81bp位点(SEQ ID NO:2)。
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选择生物素是因为兼容试剂的广泛可获得性。然而,任何数量的扩增方案,例如地高辛-抗地高素抗体或甚至直接HRP偶联都可以使用。
设计并合成了与Alu元件互补的双生物素化的寡核苷酸(52-生物素/GCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGAT)。
使用基于化学发光的检测系统,使用链霉亲和素-HRP和化学发光底物(SuperSignalTM ELISA Femto底物)溶液(图3),将其用于定量cfDNA。
选择化学发光是因为它是微孔中可用的对HRP检测最灵敏的方法(图4),尽管比色法和荧光法也可以使用。比色法也证明是令人满意的。然而,比色法也需要更长的时间来孵育并产生结果。
实施例2.测试DNA稳定化溶液的效果
为了测试含有超声的基因组DNA的尿液中DNA稳定化溶液的效果,我们使用QiaAMPDNA Blood Mini试剂盒(凯杰公司)从全血中纯化基因组DNA,并使用550型号探针SonicDismembrator(赛默飞世尔科学公司(ThermoFisher Scientific))在强度设定3上对其进行超声处理10分钟。循环设定为10秒开和20秒关。样品在1%凝胶电泳上运行以确定获得的约150至250个碱基对的片段大小。通过超声处理,我们获得了约150到250个碱基对大小的DNA片段,这个范围最能代表移植排斥中的cfDNA(图1)。接下来,我们配制了含有10g/L二偶氮烷基脲,20g/L聚乙二醇,1mM金精三羧酸,10mM K2EDTA,10mM叠氮化钠和1X磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)的保存液。设计了一项实验来测试DNA保存溶液在保持DNA完整性方面的效果。将片段化的基因组DNA(约150至250个碱基对大小)加入含有和没有保存溶液的尿液的1000μL管中。实验在4℃和室温下平行进行。图1显示了电泳图,证明在不存在DNA保存溶液的情况下,DNA如何在72小时内完全降解和崩解;而DNA保存溶液有助于维持DNA完整性长达72小时。
实施例3.确定肾移植患者的疾病排斥状态
a.样品收集
在移植后期间的不同时间点,在中途,在无菌容器中收集来自接受肾移植的三名患者(患者1-3)的尿液样品。来自患者1的尿液样品在第1天,第16天,第22天,第51天和第180天获取;来自患者2的尿液样品在第23天,第41天和第103天获取;并且来自患者3的尿液样品在第100天,第132天,第185天和第337天获取。在列出的时间点,除了收集尿液之外,获取活检以确认急性排斥反应。例如,本研究中患者1列出的时间点为第22天。尿液样品等分至2mL用于按照制造商的说明用循环核酸试剂盒(凯杰公司)进行提取,洗脱体积为H2O中20μl。
使用白色不透明的ELISA板,例如96孔LUMITRAC 600(Greiner Bio-One),将5微升洗脱的cfDNA根据需要一式一份,一式两份或一式三份接种到板上。向这些样品孔中加入10微升5X PBS和0.5M MgCl2缓冲液,然后加入35微升分子级H2O,每孔总共50微升。为了产生标准曲线,将已知量的人DNA提取物以从200,000至约12GE/mL的1:3滴定系列一式两份加入,其中GE(基因组当量)定义为6.6pg人DNA。这也是在相同的缓冲液中,最终工作浓度为1XPBS和0.1M MgCl2。
将cfDNA板在4℃下孵育过夜或在室温下以300RPM摇动最少2小时。然后弃去液体,通过轻拍吸水纸巾干燥该板。然后将板在含有300微升/孔的PBS中的5%BSA中封闭,在室温下以300RPM摇动最少1小时。然后弃去液体,通过轻拍吸水纸巾干燥该板。然后将板在50微升我们的双生物素化Alu寡核苷酸探针中孵育,该探针在5%BSA中稀释,浓度为35.56ng/微升。将其在室温下以300RPM摇动孵育最少1小时。然后弃去液体,然后用300微升1X PBS洗涤孔三次。然后弃去洗涤液,通过轻拍吸水纸巾干燥该板。然后将平板在50微升按照制造商的说明书在5%BSA中以1∶200稀释的链霉亲和素-HRP孵育,并在室温下以300RPM摇动孵育不超过1小时。然后弃去液体,然后用300微升1X PBS洗涤孔三次。然后弃去洗涤液,通过轻拍吸水纸巾非常彻底地干燥该板。然后向每个孔中加入150μl SuperSignal ELISA Femto化学发光底物溶液(赛默飞世尔公司)。基于总发光,在混合1分钟时分析板。
然后使用5参数S形曲线拟合(例如GraphPad Prism中提供的值)对所生成的值进行回归,并且对于在微孔中进行的稀释以及从2mL尿液到20μl洗脱液中进行的浓度校正所得的无细胞浓度值。
使用QuantiChrom肌酸酐测定试剂盒(生物测定系统公司)根据制造商的说明测量肌酸酐,参见https://www.bioassaysys,com/Datasheet/DICT.pdf。
b.确定cfDNA/肌酸酐比率的截止值
在涉及患者1-3的研究之前,基于来自九(9)名患者的数据确定了cfDNA/肌酸酐比率的截止值,所述患者接受肾移植并且通过活检证实没有肾损伤。如本文所述测定来自这9名患者的尿液样品的cfDNA和肌酸酐量。首先将尿肌酐值转换为mg/mL,并通过无细胞DNA值除以该肌酸酐测量值以产生cfDNA/肌酸酐,单位为[GE/mg],其中GE(基因组当量)定义为6.6pg人DNA。如图7中所示绘制cfDNA/肌酸酐比率与移植后天数,并且将依靠移植后时间的95%预测谱带(虚线)建模为具有以下等式的指数衰减曲线。
cfDNA/肌酸酐[GE/mg]=10^((5.612-4.007)*EXP(-0.05977*(移植后天数))+4.007)/100
该单侧95%预测区间中的每个数据点对应于cfDNA/肌酸酐比率的上限的估计值,其具有95%置信度,经预测高于来自95%的未来在移植后的同一时间点无排斥患者的cfDNA/肌酸酐比率。首先将尿肌酐值转换为mg/mL,并通过无细胞DNA值除以该肌酸酐测量值以产生单位为[GE/mg]的cfDNA/肌酸酐。将cfDNA/肌酸酐比率对移植后天数作图。图8A。如上所述计算KIT预测评分,并对移植后天数作图。图8B。尽管在第一和第二点之间cfDNA/肌酸酐比率下降(图8A),但预测评分显示相对风险实际上在活检证实的急性排斥反应发作之前增加(图8B)KIT在时间点22处高于零,表明患者1有肾损伤和急性排斥反应发作。通过检查在列出的时间点进行的活检确认急性排斥状态。患者1-3在列出的时间点后全部被给予免疫抑制剂:向患者1给予他克莫司,MMF,类固醇,向患者2给予他克莫司,MMF,类固醇,以及向患者3给予他克莫司和西罗莫司。
将患者2-3尿液样品的cfDNA/肌酸酐比率对移植后天数作图。图9A和9B。对于两名患者,使用本文公开的方法在列出的时间点之前的时间点预测急性排斥,此时通过活检对其进行确认。另外,如图9B所示,从所列出的时间点给予免疫抑制剂导致cfDNA比率降低到稳定区域,表明成功治疗移植物损伤的临床决定因素可以基于cfDNA值高于确定的阈值的绝对升高以及使用患者特异性阈值数据cfDNA负荷随时间推移的增加进行。推测移植物损伤是由于次优免疫抑制暴露引起的,异常升高的cfDNA结果可能引发以下临床动作:1)患者返回诊所进行更密切的随访;2)考虑在预定患者中进行更早方案活检;3)考虑进行活检以评估亚临床急性排斥反应和/或其他移植物损伤原因;4)改变免疫抑制药物类型或剂量。相反,低稳定的cfDNA结果可能引发以下临床动作:1)降低临床随访频率;2)避免为寻找亚临床移植物损伤而进行不必要的方案活检;3)改变免疫抑制药物类型或剂量。
实施例4.确定肺移植患者的排斥状态
来自76名接受肺移植的患者的支气管肺泡灌洗(BAL)流体样品在稳定期或排斥期间收集在无菌容器中。BAL流体等分至400μL用于按照制造商的说明用QiaAmp循环核酸试剂盒(凯杰公司)进行提取,洗脱体积为H2O中20μl。如实施例2中所述测量cfDNA。
使用5参数S形曲线拟合(例如GraphPad Prism中提供的值)对所生成的值进行回归,并且对于在微孔中进行的稀释以及从400μL的BAL流体到20μl洗脱液中进行的浓度校正所得的无细胞浓度值。
比较稳定和排斥患者的BAL流体中标准化的cfDNA浓度。图10。排斥患者中cfDNA的平均水平显著高于稳定患者。如实施例2中所述,异常升高的cfDNA结果可以引发类似的临床动作。
实施例5.使用KIT评分确定肾损伤状态
图13提供了说明性实施方式,其基于具有多种肾损伤原因的490个临床患者样品的数据集显示用于评估肾损伤的IT评分(“KIT”)。得到的KIT评分基于以下子集:具有cfDNA,肌酸酐,CXCL10,簇蛋白,蛋白质和DNA甲基化标志物的完整测量的299个临床患者样本;111例II型糖尿病,71例免疫,50例肾结石,20例移植排斥,19例高血压和28例对照。得到的KIT评分对于肾损伤的检测具有超过91%的灵敏度和特异度(AUC=96.9%)。图14A-E提供了广义线性模型拟合和相关ROC曲线的结果。这些结果表明,除了显示肾损伤的概率之外,基础算法还可以准确地提供由于每种疾病原因引起的肾损伤的概率;即,II型糖尿病,免疫反应,肾结石,移植排斥和高血压。对于这些数据,所得算法对于检测肾损伤的每种原因显示出超过92%的灵敏度和特异度(AUC>99.4%)。
应理解,本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的,本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变,且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
Claims (21)
1.一种反应混合物,其包含:
i)从尿液样品中提取的非扩增的无细胞DNA(cfDNA);和
ii)核酸探针,其具有3′末端和5′末端,其中所述核酸探针与SEQ ID NO:1的至少70个连续核苷酸互补,并且其中所述3′末端和/或5′末端与至少一个可检测部分共价连接。
2.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述可检测部分是荧光分子。
3.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述可检测部分是生物素。
4.如权利要求3所述的反应混合物,其中所述反应混合物还包含链霉亲和素连接的信号产生剂。
5.如权利要求4所述的反应混合物,其中所述链霉亲和素连接的信号产生剂产生化学发光、颜色或荧光。
6.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述可检测部分是荧光素或地高辛(DIG)。
7.如权利要求6所述的反应混合物,其中所述荧光素或地高辛(DIG)偶联至辣根过氧化物酶(HRP)。
8.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述核酸探针的3′末端或5′末端与至少2个可检测部分共价连接。
9.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述核酸探针的3′末端和5′末端与至少2个可检测部分共价连接。
10.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述核酸探针的3′末端或5′末端与至少3个可检测部分共价连接。
11.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述核酸探针的3′末端和5′末端与至少3个可检测部分共价连接。
12.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述核酸探针与SEQ ID NO:1的81个核苷酸互补。
13.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述核酸探针与SEQ ID NO:1的至少70-290个核苷酸互补。
14.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述核酸探针与SEQ ID NO:1的至少70-180个连续核苷酸互补。
15.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述核酸探针与SEQ ID NO:1的至少70-150个连续核苷酸互补。
16.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述核酸探针与SEQ ID NO:1的至少70-100个连续核苷酸互补。
17.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述核酸探针与SEQ ID NO:1的至少80-90个连续核苷酸互补。
18.如权利要求1所述的反应混合物,其中所述尿液样品来自已经接受肾移植的人。
19.如权利要求18所述的反应混合物,其中所述尿液样品在人接受肾移植后0-400天,或10-100天,或20-50天获取。
20.如权利要求18所述的反应混合物,其中所述尿液样品在人接受肾移植后人的寿命期间获取。
21.一种检测尿液样品中无细胞DNA(cfDNA)中的Alu拷贝数的方法,所述方法包括:
形成如权利要求1所述的反应混合物;和
定量与所述核酸探针杂交的cfDNA的量,从而检测所述尿液样品中cfDNA中的A1u拷贝数。
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PB01 | Publication | ||
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