KR20160004265A - 무세포 dna를 이용하는 신장 상태의 평가를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

무세포 dna를 이용하는 신장 상태의 평가를 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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미니 엠. 사르왈
타라 시그델
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이뮤코 쥐티아이 다이아그노스틱스, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 소변 무세포 DNA를 이용하여 신장 상태 및 신장 건강을 평가하기 위한 비-침습적 도구 및 방법에 관한 것이다.

Description

무세포 DNA를 이용하는 신장 상태의 평가를 위한 방법 및 조성물{Methods and compositions for assessing renal status using urine cell free DNA}
본 명세서는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로서 통합된 2013년 3월 15일 출원된 출원번호 61/793,427의 미국 특허 가출원에 대하여 우선권의 이익을 주장한다.
총칭하여 신장계(renal system)라고도 알려진 콩팥은 혈액으로부터 노폐물을 제거하고 수분 유체 수준을 조절하는 근본적인 기능을 수행한다. 이들은 비뇨계(urinary system)에서 근본적인 것이지만, 또한 전해질의 조절, 산-염기 균형의 유지, 및 혈압의 조절과 같은 항상성 유지 기능을 제공한다. 이들은 혈액의 천연 필터로서 신체에 제공되고, 방광으로 전달되는 노폐물을 제거한다. 소변의 생성에있어서, 신장은 요소 및 암모늄과 같은 노폐물을 분비하고, 또한 수분, 글루코스, 및 아미노산의 재흡수에 대한 책임을 가지고 있다. 신장은 또한 칼시트리올(calcitriol), 에리트로포이에틴(erythropoietin)을 포함하는 호르몬, 및 효소 레닌을 생산한다.
신장 상태는 신장(renal) 질병 또는 손상(또한 콩팥(kidney) 손상, 병증으로도 언급됨)에 의해 영향받으며 급성 및 만성 상태로부터 기인할 수 있다. 또 다른 형태의 변경된 신장 상태는 이식된 신장의 거부 반응이다.
통상적으로, 신장 상태는 크레아티닌에 대한 혈액 검사를 이용하여 평가된다. 크레아티닌의 높은 수준은 낮은 사구체(glomerular) 여과율을 나타내고 그 결과 노폐물을 배출하기 위한 신장의 능력이 감소된다. 신장 피해의 근본적인 원인을 완전히 조사하기 위해, 신장의 오작동(malfunction)에 대한 가역적인 원인이 있다면 이를 찾아내기 위한 의료 영상, 혈액 검사 및 신장 생검(biopsy)(신장 조직의 작은 시료를 제거)의 다양한 형태가 종종 사용된다.
신장 손상 및 신장 이식 손상의 향상된 비-침투적 진단 및 일반적인 신장 상태 평가에 대한 중요한 요구가 아직 충족되지 않았다. 예를 들면, 신장 이식 손상에서, 기증자로부터 유래된 무세포 DNA(donor derived cell free DNA: dd-cfDNA)가 혈액 내에서 이식 손상의 대용(surrogate)이 되는 것으로 보여져 왔으나, 기증자 및 수혜자의 DNA 시퀀싱의 비용을 요구한다.
더욱 최근에는. 죽어가는 세포로부터의 무세포 DNA(cfDNA)가 인간 소변에서 발견되었다. 최근의 노력들은 동종 이식 거부 반응에 대한 마커로서 cfDNA에 대한 소변의 검사에 초점을 맞추고 있으나, 본 기술은 남성의 신장을 받은 여성 수혜자 내의 Y 염색체 특이적 서열을 검출하는 것 또는 기증자 및 수혜자 사이의 유전적 구성/분자 마커 내의 차이를 사전-결정하고 이러한 차이점을 탐색(probing)하는 것에만 제한된다. 이와 같이, 이러한 형태의 검사는 특정한 구성(configuration) 형태(예를 들면, 남성 기증자의 신장을 받은 여성 이식 수혜자)에 제한되고, 모든 이식 구성에 넓게 작용할 수 없다.
따라서, 모든 신장 이식 상황에 넓게 작용 가능한 비-침투적 검사를 위한 향상된 조성물 및 방법이 소변 cfDNA를 이용하여 신장 상태, 신장 손상 또는 신장 이식 거부 반응을 평가하기 위해 요구된다. 성별에 관계 없고, DNA 시퀀싱 비용이 없는, 모든 신장 손상 및 신장 이식 환자의 소변 무세포 DNA를 측정하기 위한 신속한 접근이 요구된다.
본 명세서는 이러한 접근을 위한 조성물 및 방법, 고-효율 접근 등을 제공한다.
본 명세서에서 인용된 모든 공개 문헌 및 특허 출원은, 각각의 개별적인 공개 문헌 또는 특허 출원이 특별하고 개별적으로 참조로서 통합된 것이라고 표시된 것과 같이, 본 명세서에 참조로서 통합된다.
소변 무세포 DNA(cfDNA)는 신장 상태, 신장 손상, 신장 이식 손상 및 고도의 급성 신장 거부 반응의 추정 및 평가를 위한 강력한 도구가 될 수 있다. 소변 cfDNA 양(load)의 일련의 분석을 기증자 및 수혜자의 DNA 시퀀싱에 대한 요구없이 디지털 또는 표준 qPCR로 수행할 수 있다.
본 발명은 소변 내에서 발견되는 cfDNA를 사용하여 개체의 신장 상태 및 신장 건강을 평가하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 변경된 신장 상태를 겪거나 또는 이를 가지고 있다고 의심되는 개체의 모니터링, 진단, 예후, 및 치료법의 평가를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
본 발명은, 특히(inter alia), 소변 내 상 염색체의 cfDNA를 측정하는 것에 기반한 신장 상태, 신장 손상 또는 신장 이식 거부 반응을 평가하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 개체의 신장 상태를 평가하기 위한 방법을 제공한다: 소변 시료 내 상염색체의 복제 수의 결정하는 단계, 및 상기 염색체의 복제 수를 정상 집단으로부터의 소변 시료 내 상기 염색체의 표준 복제 수와 비교하는 단계로서, 상기 복제 수의 변화는 변경된 신장 상태를 나타내는 것인 단계. 일 구체예에서, 상기 상염색체는 1번 염색체이다. 일 구체예에서, 1번 염색체의 복제 수는 EIF2C1 유전자좌(locus)를 이용하여 측정한다. 일 구체예에서, 상기 EIF2C1 유전자좌는 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT 및 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 측정한다. 일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 실시간 PCR에 사용되고 추가적으로 프로브를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 하기의 서열 및 리포터를 포함한다: 5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1.
본 명세서의 임의의 구체예에서, 표준 복제 수보다 높다고 결정된 복제 수는 손상된(compromised) 신장 상태를 나타낸다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 표준 복제 수와 동일 또는 낮다고 결정된 복제 수는 양호한 신장 건강을 나타낸다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 복제 수는 실시간 PCR, 정량적 PCR, 또는 디지털 PCR(dPCR)을 이용하여 결정된다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 복제 수는 BioMark 실시간 PCR 시스템을 이용하여 결정된다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 손상된 신장 상태는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 거부 반응, 또는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 거부 반응에 대한 치료에 무반응성(non-responsive)인 것을 포함할 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 신장 상태의 평가는 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응의 진행을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 신장 상태의 평가는 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응을 겪는 개체 및 치료를 받고 있거나 또는 받았던 개체에서 치료 반응을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서의 임의의 구체예에서, cfDNA는 소변으로부터 추출될 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 복제 수는 소변으로부터 추출된 cfDNA 내에서 결정된다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 방법은 추가적으로 다른 병리적 및 임상적 데이터의 측정을 포함할 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 방법은 추가적으로 크레아티닌의 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 방법은 추가적으로 단백뇨증(proteinuria) 또는 cGFR을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 방법은 추가적으로 신장 생검을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 위험이 있는 개체이다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 당뇨병 환자이다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 고혈압을 겪고 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 동종 신장 이식의 수혜자이다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료를 받는 자이다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 적어도 한 번의 급성 거부 반응 발생(episode)을 겪은 자이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 개체는 신장 상태를 평가하기 위한 방법을 제공한다: 소변 시료 내 ALU 반복 수를 결정하는 단계, 및 상기 ALU 반복 수를 정상 집단으로부터의 소변 시료 내 표준 ALU 반복 수와 비교하는 단계로서, 상기 ALU 반복 수의 변화는 변경된 신장 상태를 나타내는 것인 단계. 일 구체예에서, 표준 반복 수보다 높다고 결정된 ALU 반복 수는 손상된 신장 상태를 나타낸다. 일 구체예에서, 표준 반복 수와 동일 또는 낮다고 결정된 ALU 반복 수는 양호한 신장 건강을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 ALU 반복 수는 소변으로부터 추출된 cfDNA 내에서 결정된다. 또 다른 구체예에서, 상기 반복 수는 실시간 PCR, 정량적 PCR, 또는 디지털 PCR을 이용하여 결정된다. 또 다른 구체예에서, 상기 ALU 반복 수는 BioMark 실시간 PCR 시스템을 이용하여 결정된다. 또 다른 구체예에서, 상기 ALU 반복 수는 실시간 PCR을 이용하여 결정된다. 또 다른 구체예에서, 상기 ALU 반복 수는 ALU 유전자좌의 115 염기쌍 증폭절(amplicon)을 이용하여 측정된다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 방법은 추가적으로 동일한 시료 내의 상염색체의 복제 수를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 1번 염색체의 복제 수는 EIF2C1 유전자좌를 이용하여 측정된다. 또 다른 구체예에서, 상기 EIF2C1 유전자좌는 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT 및 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 측정된다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 실시간 PCR에 사용되고 프로브를 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 프로부는 하기의 서열 및 리포터를 포함한다: 5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ 1.
본 명세서의 임의의 구체예에서, 손상된 신장 상태는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 거부 반응, 또는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 거부 반응에 대한 치료에 무반응성인 것을 포함할 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 신장 상태의 평가는 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응의 진행을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 신장 상태의 평가는 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응을 겪는 개체 및 치료를 받고 있거나 또는 받았던 개체에서 치료 반응을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서의 임의의 구체예에서, cfDNA는 소변으로부터 추출될 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 복제 수는 소변으로부터 추출된 cfDNA에서 결정된다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 방법은 추가적으로 다른 병리적 및 임상적 데이터의 측정을 포함할 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 방법은 크레아티닌의 양을 측정하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 방법은 추가적으로 단백뇨증 또는 cGFR을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 방법은 추가적으로 신장 생검을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 위험에 있는 개체이다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 당뇨병 환자이다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 고혈압을 겪고 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 동종 신장 이식의 수혜자이다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료를 받는 자이다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 개체는 적어도 한 번의 급성 거부 반응 발생을 겪은 자이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 진단 분석 키트를 제공하며, 상기 키트는 하기를 포함한다: 시료로부터의 적어도 하나의 상염색체의 복제 수를 결정하기 위한 시약; 상기 복제 수를 결정하기 위해 사용되는 프라이머 세트; 및 상기 분석의 사용을 위한 지시서(instruction). 일 구체예에서, 상기 상염색체는 1번 염색체이다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 유전자좌 EIF2C1의 증폭절을 증폭시킬 수 있는 세트이다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT 및 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 프라이머 외에도 dPCR에 유용한 프로브를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 프로브의 서열은 하기의 서열 및 리포터를 포함한다: 5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1.
본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 키트는 시료로부터 cfDNA를 추출하기 위한 시약을 더 포함한다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 시료는 소변을 포함한다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 실시간 PCR, 정량적 PCR, 또는 디지털 PCR을 위해 사용될 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 추가적으로 디지털 PCR에 유용한 프로브를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 진단 분석 키트를 제공하며, 상기 키트는 하기를 포함한다: 시료 내 ALU 반복 수를 결정하기 위한 시약; 상기 ALU 반복 수를 결정하기 위해 사용되는 프라이머 세트, 및 상기 분석의 사용을 위한 지시서. 일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 ALU 유전자좌의 증폭절을 증폭시킬 수 있는 세트이다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 5'-GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3' 및 역방향 프라이머 5'-ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 외에도 디지털 PCR에 유용한 프로브를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 프로브의 서열은 하기의 서열 및 리포터를 포함한다: 5'-HEXTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3'. 또 다른 구체예에서, 상기 키트는 추가적으로 상염색체의 복제 수를 결정할 수 있는 프라이머 세트를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 상염색체는 1번 염색체이다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 유전자좌 EIF2C1의 증폭절을 증폭시킬 수 있는 세트이다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT 및 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 외에도 디지털 PCR에 유용한 프로브를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 프로브의 서열은 하기의 서열 및 리포터를 포함한다: 5'- HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1.
본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 키트는 시료로부터 cfDNA를 추출하기 위한 시약을 더 포함한다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 시료는 소변이다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 실시간 PCR, 정량적 PCR, 또는 디지털 PCR을 위해 사용될 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 추가적으로 디지털 PCR에 유용한 프로브를 포함한다.
도 1은 급성 거부 반응(AR) 발생이 있거나 또는 없는, 신장 이식을 겪은 개체로부터의 혈장 시료 내 1번 염색체 및 Y 염색체의 복제 수 사이의 연관성을 나타낸다.
도 2는 급성 거부 반응(AR) 발생이 있거나 또는 없는, 신장 이식을 겪은 개체로부터의 소변 시료 내 1번 염색체 및 Y 염색체의 복제 수 사이의 연관성을 나타낸다.
도 3은 질 관리(quality control) 결정을 나타낸다. 소변 시료 내의 1번 염색체 복제 수 분석의 견고함(robustness)을 평가하기 위해, 반복 실행으로 3명의 환자로부터의 9개 시료 중의 1번 염색체의 복제 수가 결정되었다. 중복 실행 사이에서 밀접한 연관성이 관찰되었다.
도 4는 소변 내 1번 염색체 복제 수와 연관성이 높은 단백질의 양을 보여준다.
도 5는 소변 시료 내 ALU 반복 수 및 1번 염색체 복제 수 사이의 연관성을 보여준다.
도 6은 실시예 4에서 사용된 연구 시료 및 방법을 도식적으로 보여준다. 본 연구에서는 신장 이식 환자의 소변 및 혈장 내 무세포 DNA의 측정의 유의의성(significance)을 평가하였다. 본 연구는 3기로 수행되었고, 1기에서는 소변 및 혈장 내 dd-cfDNA의 유의의성이 평가되었다. 2기에서는 상염색체(1번 염색체)의 유전자좌의 측정이 평가되었다. 3기에서는 특정 이식 손상 검출을 위한 소변 내 총 cfDNA 양의 정량화가 분석되었다.
도 7은 남성 이식자로부터의 19명의 여성 수혜자의 코호트(cohort)에서, 안정한(STA) 이식 기능을 보이는 동안 측정된 혈장 dd-cfDNA 수치에 비교하여 급성 거부 반응(AR)시에 혈장 dd-cfDNA의 양의 증가가 관찰된 것을 나타낸다.
도 8은 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수로서 결정된 소변 cfDNA 양으로 소변에서 검출된 상염색체 DNA가 기증자로부터 유래된 것임을 증명하였다. Y 염색체 유전자좌 SRY에 대한 소변 cfDNA는 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1에 대한 소변 cfDNA와 강하게 연관되었다.
도 9는 신장 이식 손상의 지표로서 소변 내 무세포 1번 염색체 복제 수를 나타낸다. (A) 신장 이식 손상이 없는 신장 이식 환자로부터의 소변 내 1번 염색체의 유전자좌 EIF2C1의 복제 수와 비교하였을 때, 이식 손상을 갖는 신장 이식 환자로부터의 소변 내 1번 염색체의 유전자좌 EIF2C1의 복제 수가 유의미하였다. (B) 데이터의 ROC 분석은 p 값<0.0001을 갖는 AUC 0.777의 결과를 나타냈다. (C) 이식 손상이 없는 환자로부터의 소변 내 크레아티닌에 대한 단백질 비율에 비교하여, 이식 손상 표현형의 소변 내 크레아티닌에 대한 단백질 비율이 현저하게 높았다. (D) ROC 분석은 p 값 0.004를 갖는 0.66 AUC의 결과를 나타냈다.
도 10은 이식 손상 지표로서 무세포 DNA를 보여준다. (A) 대표적인 환자로부터, ALU 분석 데이터로부터 게놈 등가물(genome equivalent)을 계산하였을 때, 심각한 AR 환자의 소변 내 cfDNA의 양이 낮은 정도의 AR 또는 다른 만성적 손상에 비교하여 증가한 데이터를 나타낸다. (B) 한 대표적인 경우, 높은 정도의 AR 및 역류성신증(reflux nephropathy) 환자의 소변 내에서, 다른 만성적 손상에 비교하여 소변 내 총 cfDNA가 현저하게 증가하였다. (C) 소변 cfDNA 양의 증가가 AR 전 및 후의 시료에 비교하여 AR 환자 내에서 특히 높았을 때의 시료 데이터를 보여준다. (D) BKVN 환자에서 cfDNA 양의 증가가 높았고, BKVN 이전의 소변에서 cfDNA 양의 증가가 관찰될 수 있었다.
도 11은 AR 발생자에서 소변 내 cfDNA 양의 상승이 AR 전 및 후에 비교하여 증가하였음을 보여준다. 3명의 환자(환자 #1, #2, 및 #3)에 대해 AR 전 및 후의 총 cfDNA를 평가하였고, 이는 AR 발생 동안 소변 내 cfDNA 양의 증가를 증명하였다.
본 명세서에 기재된 본 발명은, 특히, 신장 건강(콩팥 건강), 신장 질병, 및 신장 이식을 관리하기 위해 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 개체(환자 등)의 신장 건강을 평가, 신장 건강을 모니터링 및 치료적 개입을 위한 개체 및 개체의 하위군(sub-population)을 확인하기 위한 진단, 예후, 및/또는 치료 조성물 및 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 발명은 소변 내 cfDNA를 측정하는 것에 기반한다. 하기에 자세히 기재한 바와 같이, 신장 이식을 겪은 자들의 소변으로부터 소변 cfDNA 내 상염색체 복제 수의 결정 및/또는 cfDNA 내 ALU 반복 수의 결정은 정확하게 신장 이식 손상 또는 신장 거부 반응의 증상이 발병할 위험이 있는 개체를 확인, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 진행을 모니터링, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 퇴행을 모니터링, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료를 받는 개체의 치료에 대한 반응을 모니터링, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 개시의 위험을 확인 및/또는 예측, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료를 시작 또는 계속해야하는 환자의 하위군을 확인, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료의 효능을 평가, 및/또는 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 증상이 발병하는지에 대한 모니터링을 받아야하는 환자의 하위군을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 또한 하기에 더 자세히 기재한 바와 같이, 소변 cfDNA 내 상염색체의 복제 수 결정 및/또는 소변 cfDNA 내 ALU 반복 수의 결정은 정확하게 신장 질병 또는 신장 손상이 발병할 위험이 있는 개체를 확인, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 진행을 모니터링, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 퇴행을 모니터링, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료를 받는 개체의 치료에 대한 반응을 모니터링, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 개시의 위험을 확인 및/또는 예측, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료를 시작 또는 계속해야하는 환자의 하위군을 확인, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료의 효능을 평가, 및/또는 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 증상이 발병하는지에 대한 모니터링을 받아야 하는 환자의 하위군을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
정의
본 명세서를 해석하기 위한 목적으로, 하기의 정의들이 적용될 것이고, 적절한 경우에는 단수로 사용되는 용어들이 복수를 포함할 것이며 그 역도 동일하다.
본 명세서에 사용된 용어 "콩팥(kidney)" 및 "신장(renal)"은 상호 교환적으로 사용되고, 용어 "신장 건강(renal health)", "콩팥 건강(kidney health)", "신장 상태(renal status)", 및 "콩팥 상태(kidney status)"은 상호 교환적으로 사용되고, 용어 "신장 피해(renal damage)", "콩팥 피해(kidney damage)", "신장 손상(renal injury)", 및 "콩팥 손상(kidney injury)"은 상호 교환적으로 사용되고, 용어 "신장 질환(renal disorder)", "콩팥 질환(kidney disorder)", "신장 질병(renal disease)", 및 "콩팥 질병(kidney disease)"은 상호 교환적으로 사용되고, 및 용어 "신장 이식(renal graft)" 및 "콩팥 이식(kidney graft)"는 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "질환(disorder)" 또는 "질병(disease)" 및 "손상(injury)" 또는 "피해(damage)"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되고, 신체 또는 이의 장기 및/또는 조직의 상태에서의 모든 변경, 장기 기능 및/또는 조직 기능의 성능의 방해(interrupting 또는 disturbing)(예를 들면, 장기 장애의 원인) 및/또는 불편함, 장애, 고통, 또는 심지어 질병으로 고통받는 개체의 사망과 같은 증상을 초래하는 것을 의미한다.
신장 손상, 신장 질병 또는 신장 이식 거부 반응이 발병할 "위험(at risk)"이 있는 개체는, 본 명세서에 기재된 치료 방법에 앞서, 검출 가능한 질병 또는 증상을 갖거나 또는 갖고 있지 않을 수 있고, 검출 가능한 질병 또는 증상을 나타내거나 또는 나타내지 않을 수 있다. "위험(at risk)"은 개체가 하나 이상의, 본 명세서에 기재되고 당업계에 알려진 바와 같은 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응과 연관있는 측정 가능한 파라미터인, 위험 인자(risk factor)를 가지고 있는 것을 의미한다. 이러한 하나 이상의 위험 인자를 갖는 개체는, 이러한 하나 이상의 위험 인자가 없는 개체보다 매우 높은 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 발병 가능성을 가진다.
"개체(individual)"는 "환자(patient)"일 수 있다. "환자(patient)"는 치료 의사의 관리하에 있는 개체를 의미한다. 일 구체예에서, 상기 환자는 신장 피해 또는 신장 손상을 겪고 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 환자는 신장 질병 또는 질환을 겪고 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 환자는 신장 이식을 받고 신장 이식 거부 반응을 겪고 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 환자는 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응으로 진단 받았으나, 그 진단을 해결하기 위한 어떠한 치료도 하지 않은 자이다.
본 명세서에서 사용된 "환자 하위군(patient sub-population)" 및 이의 문법적 변형어들은, 그들이 속하는 넓은 질병 카테고리 내에서 다른 이들로부터 그들을 구분하는, 하나 이상의 독특한 측정 가능한 및/또는 확인 가능한 특징을 가진 것으로 특징화되는 환자의 하위 집합을 의미한다. 이러한 특징들은, 본 명세서에 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응, 선택적으로 본 명세서에 기재되고 치료 의사를 포함하는 당업자에게 알려진 임의의 증상의 조합을 갖거나, 또는 이들이 발병할 위험에 있는 것이 특징인 것으로서 기재된, 소변 cfDNA 양의 증가를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "생물학적 시료"는 예를 들면 물리학, 생화학, 화학 및/또는 생리적 특징에 기반을 두고 특정화되거나 및/또는 확인될 것인, 세포적 및/또는 다른 분자적 물질을 포함하는, 개체로로부터 얻거나 또는 유래된 조성물을 의미한다. 일 구체예에서, 상기 시료는 소변이다. 또 다른 구체예에서, 상기 시료는 유체(혈액, 혈청, 혈장, 침, 가래, 위액, 정액, 눈물, 땀 등), 피부, 모발, 세포, 생검(biopsy), 또는 조직 표본이다.
본 명세서에 사용된 "예측(predicting 및 prediction)"은 사건이 100% 확실하게 발생하는 것을 의미하지 않는다. 그 대신에 사건이 일어나지 않는 것보다는 일어나기 쉬운 것을 의미하는 것으로 의도된다. "예측하다(predict 또는 make a prediction)" 행위는 사건이 일어나지 않는 것 보다는 일어나기 쉬운 확률을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 여러 요소들의 평가는 이러한 결정 또는 예측을 하기 위해 사용될 수 있다.
"연관시키다(correlate 또는 correlating)"는, 어떤 방법으로든, 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 성과(performance) 및/또는 결과를 두 번째 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과와 비교하는 것을 의미한다. 예를 들면, 당업자는 두 번째 프로토콜을 수행하는 중 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있으며, 및/또는 특정인은 두 번째 분석 또는 프로토콜이 수행되어야 하는지 여부를 결정하기 위해 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있다. 게체로부터의 소변 시료 상에서 수행되는 상염색체 복제 수 결정 또는 ALU 복제 수 평가의 구체예와 관련하여, 당업자는 그 결과를 특정 치료 요법이 개체에게 수행되어야 하는지 여부를 결정하기 위해 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "진단(diagnosis)"은 의료적 또는 병리적 상태(state), 질병 또는 상태(condition)의 확인 또는 분류를 의미한다. 예를 들면, "진단"은 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 확인을 의미할 수 있다. "진단"은 또한 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 중증도(severity)의 분류를 의미할 수 있다. 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 진단은 당업자(예를 들면, 신장병학자)가 사용할 수 있는 임의의 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.
본 명에서에서 사용된 용어 "보조 진단(aiding diagnosis)는 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 특정 형태의 존재, 정도 또는 다른 특성과 관련한 임상적 진단을 내리는데 도움을 주는 방법을 의미한다. 예를 들면, 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 보조 진단 방법은 개체로부터의 소변 시료 내 임의의 상염색체, 1번 염색체, Y 염색체, 또는 ALU 반복의 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예후(prognosis)"는 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 발병 및/또는 재발의 가능성의 예측을 의미한다. 본 발명의 상기 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대한 가장 적절한 치료 양식을 선택하는 것으로 임상적으로 치료 결정을 내리기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 예측 방법은 환자의 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응이 발병할 가능성이 높은지, 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 재발이 일어날지, 및/또는 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응이 악화될지 여부에 관한 진단 및/또는 진단을 보조하는 가치있는 도구이다.
"치료(treating 및 treatment)"는 개체의 자연적 과정을 바꾸기 위한 시도 내의 임상적 개입(intervention)을 의미하고 임상적 진단 또는 예후 과정 전, 도중, 또는 후에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 신장 손상, 신장 질병 또는, 신장 이식 거부 반응 또는 이는 이들의 상태 또는 증상의 발생 또는 재발의 예측, 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 상태 또는 증상의 완화, 모든 직접적 또는 간접적 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 병리적 결과의 감소, 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 진행 속도 또는 중증도의 감소, 및/또는 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 개선 또는 증상 완화(palliating)를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 발병 위험이 있다고 확인된 환자 하위군에 사용된다. 일부 경우에, 본 발명의 방법 및 조성물은 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 발병을 지연시키는 시도에서 유용하다. 유익한 또는 바람직한 임상적 결과는 당업자에게 알려져 있거나 또는 쉽게 얻을 수 있다. 예를 들면, 유익한 또는 바람직한 임상적 결과는 하기의 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다: 신장 손상의 모니터링, 신장 손상의 검출, 신장 손상의 형태의 확인, 신장 이식 의사가 이식 환자를 생검을 진행하기 위해 보내고 임상적 관리 및 치료적 개입의 목적을 위한 결정을 내릴 것인지 여부를 결정하는데 도움.
"예방(Prophylaxis)", "예방적 치료(prophylactic treatment)" 또는 "예방적 치료(preventive treatment)"는 하나 이상의 증상 및/또는 이들의 근본적인 원인의 발생의 예방을 의미하고, 예를 들면, 질병 또는 상태가 발병할 의심이 드는 환자(예를 들면, 유전적 소인, 환경적 요인, 선행 질병 또는 질환, 또는 그와 유사한 것의 결과로 인한 고위험)의 질병 또는 상태의 예방이다.
본 명세서에 사용된 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 진행 또는 발병의 "지연(delaying)"은 상기 진행 또는 발병의 연기(defer), 방해(hinder), 감속(slow), 저지(retard), 안정화(stabilize), 및/또는 연기(postpone)를 의미한다. 이러한 지연은 질환 및/또는 치료 받은 개체의 역사에 의존하는 시간의 길이의 변화일 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 개체 또는 환자의 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응이 지연될 것인지를 결정하는데 도움을 줄 수 있다.
용어 "유효량(effective amount)"은 바람직한 치료 결과를 내기 위한 충분한 양의 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 치료를 위한 약학적 제제의 양을 의미한다. 유효량은 하나 이상의 용량, 즉, 바람직한 치료 지점에 도달하기 위해 일회 용량 또는 수회 용량이 요구되는 용량에 포함될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 개체 또는 환자가 약학적 제제의 유효량을 받을 수 있는지 또는 받아야 하는지를 결정하는데 도움을 줄 수 있다.
"치료학적으로 유효량(therapeutically effective amount)"은 바람직한 치료학적 결과(예를 들면, 질병 또는 상태의 중증도의 감소)를 만들기 위해 충분한, 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 치료를 위한 약학적 제제의 양을 의미한다. "예방학적으로 유효량(prophylactically effective amount)"은 질병 또는 상태가 의심되는 및/또는 발병할 수 있는 개체에게 투여시 추가적인 질병 또는 상태의 중증도를 예방 또는 감소시키기 위해 충분한, 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응의 치료를 위한 약학적 제제의 양을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "예측(predicting 또는 prediction)"은 개체가 치료 요법에 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성을 의미한다.
본 명세서에 사용된, "치료의 시작시(at the time of starting treatment)" 또는 "기준점(baseline)"은 치료에 처음 노출된 시기 또는 그 직전을 의미한다.
본 명세서에 사용된, "기반(based upon)"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 개체의 특성의 평가, 결정, 또는 측정(및 치료를 받기에 적합한 개체의 바람직한 선별)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 상염색체의 복제 수 또는 총 ALU 반복 수가 치료 및/또는 예방의 방법을 선별, 평가, 측정, 또는 결정하기 위한 기반으로 사용된 때, 그 마커는 치료 전 및/또는 도중에 측정되고, 얻어진 수치는 임상가에 의해 하기 중 임의의 것을 평가하는데 사용된다: (a) 치료를 최초로 받기 위한 개체의 가능한 또는 확률적 적합성; (b) 치료를 최초로 받기 위한 개체의 가능한 또는 확률적 적합성; (c) 치료에 대한 반응성; (d) 치료를 받는 것을 지속하기 위한 개체의 가능한 또는 확률적 적합성; (e) 치료를 받는 것을 지속하기 위한 개체의 가능한 또는 확률적 부적합성; 또는 (f) 임상적 이점의 가능성 예측.
당업자에게 명확하게 이해될 바와 같이, 임상적 환경에서의 개체의 삶의 건강 관련 질의 평가는 이러한 파라미터가 본 명세서에 기재된 치료의 투여의 시작, 지속, 및/또는 중단을 위한 기초로서 사용되는 명확한 지침이다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 측면 및 구체예는 "구성되는(consisting)" 및/또는 "필수적으로 구성되는(consisting essentially of)" 측면 및 구체예를 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 용어 "검출(detect)"은, 예를 들면 핵산, DNA, RNA, 게놈 DNA, dd-cfDNA, cfDNA, 소변 DNA, 및 이와 유사한 하나 이상의 바이오마커의 탐지되지 않는(undetectable), 낮은, 중간의, 또는 높은 혈청 농도의 정량적 측정을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "정량화(quantify 및 quantification)"는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 상대적 또는 절대적으로 시료 내 물질(예를 들어, 상염색체)의 양(quantity) 또는 풍부도(abundance)를 결정하는 단계를 의미한다.
본 명세서의 수치 또는 파라미터의 "약(about)"의 언급은 그 수치나 파라미터 그 자체(per se)를 가리키는 구체예를 포함(및 설명)한다. 예를 들면, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다. 용어 "약"은 바람직한 결과에 대한 영향 없이 주어진 수치가 "약간 위" 또는 "약간 아래"인 끝일 수도 있음을 제공하여 수적 범위의 끝에 유연함을 제공하기 위해 사용된다. 농도, 양(amount), 및 다른 수적 데이터가 본 명세서에 범위 형식으로 표현 또는 제시될 수 있다. 이러한 범위 형식은 단지 편리하고 간결함을 위해 사용된 것이고, 따라서 명시적으로 그 범위의 한계로서 언급된 수적 수치뿐만 아니라, 마치 각각의 수적 수치 및 하위 범위가 명시적으로 언급된 것과 같은 범위 내에 포함된 모든 개별적 수적 수치 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 유연하게 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단일("a", "an" 및 "the") 형식은 그 내용이 명시적으로 그렇지 않음을 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함한다.
"선택적(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 그 뒤에 기재된 사건 또는 상황이 발생하거나 또는 발생하지 않을 수 있음을 의미하고, 이 기재는 그 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다.
당업자에게 명확한 바와 같이, 치료의 평가된 개체, 치료를 위해 선별된 개체, 및/또는 치료를 받는 개체는 치료의 평가, 치료에 대한 선택 및/또는 치료를 받는 것을 필요로 하는 자일 수 있다.
일반적 기술
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 업계의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 실행은, 다르게 표시되지 않는 한, 당업계 내의 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술들을 채용할 것이다. 이러한 기술들은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sa`mbrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); 및 Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert, and N.A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)과 같은 문헌들에서 완전하게 설명된다. 본 발명의 실행은 또한 Aging Cell (2013 Feb 25, Characterization of the role of distinct plasma cfDNA (cfDNA) species in age-associated inflammation and frailty; Jylhava J, Nevalainen T, Marttila S, Jylha M, Hervonen A, Hurme M.), 및 Clinical Biochemistry (44 (2011) 1074-1079)에 기재된 바와 같은 ALU 반복의 측정의 다양한 접근법을 채용할 것이다.
신장 상태
본 발명은 개체의 신장 상태를 평가하기 위해 사용될 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 평가법은, 의료 문제를 해결하기 위해 더 많은 약제를 약제를 받는 것 또는 더 이상 의학적으로 필요하지 않아 약제를 감소(중단 포함)시키는 것과 같은 의료적 개입을 필요로 하는 개체가 있을 때, 진단에 도움이 된다. 본 발명의 조성물 및 방법은 개체가 변경된 신장 상태, 손상된 신장 상태, 신장 질병, 신장 피해, 신장 손상, 신장 이식 거부 반응을 갖고 있거나 또는 이러한 상태에 대한 치료에 무반응일 때를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 손상된 신장 상태는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 거부 반응, 또는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 거부 반응에 대한 치료에 무반응을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 손상된 신장 상태를 갖는 개체는 신장 질병 또는 손상의 증상이 발병할 위험이 있는 개체, 신장 질병 또는 손상이 퇴행한(regressed) 개체, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 증상이 발병할 위험이 있는 개체, 또는 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응이 퇴행한 개체일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 변경된 신장 상태는 개체의 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 거부 반응, 또는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 거부 반응에 대한 치료에 무반응성을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
신장 질병 또는 질환은 다양하지만, 신장 질병을 가진 개체들은 자주 특징적인 임상적 양상을 나타낸다. 일반적인 임상적 상태는 신염(nephritic) 및 신(nephrotic) 증후군, 신장낭종(renal cysts), 급성 콩팥 손상, 만성 콩팥 질병, 당뇨병-유도 신장병증(nephropathy), 요로감염(urinary tract infection), 신장 결석(nephrolithiasis), 및 요로 폐색(urinary tract obstruction), 사구체 신염(glomerular nephritis)(초점 분절 사구체 경화증(focal segmental glomerular sclerosis: FSGS), IgA 신장병증, 사구체간질모세관성(mesangiocapillary), 루푸스(lupus) 및 막성(membranous) 등), 고혈압성 신장병증 및 약물 유도성 신장병증을 포함하는 콩팥을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 신장 질병은 또한 존재하는 다양한 신장의 암을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 암은 신장 세포 암종, 신우(renal pelvis)의 요로상피(urothelial) 세포 암종, 편평 세포 암종, 방사구체 세포 종양(레닌종(reninoma)), 혈관근육지방종(angiomyolipoma), 신장 호산성과립세포종(renal oncocytoma), 벨리니관 암종(bellini duct carcinoma), 신장 투명세포육종(clear-cell sarcoma of the kidney), 중배엽성 신종(mesoblastic nephroma), 윌름스 종양(Wilms’ tumor), 혼합 상피 기질 종양(mixed epithelial stromal tumors), 투명 세포 선암(clear cell adenocarcinoma), 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma), 반전 유두종(inverted papilloma), 신장 림프종(renal lymphoma), 기형종(teratoma), 암육종(carcinosarcoma), 및 신우 유암종(carcinoid tumor of the renal pelvis)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 신장 질병은 또한 급속도로 유도될 수 있고, EBV 및 CMV에 의해 유도된 BKV 신장병증 및 신장병증을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 신장 질병은 또한 일부 약제가 신장 독성(신장에 손상을 줄 높은 위험성을 가짐)이 있기 때문에 약물-유도될 수 있다. 최악의 경우, 약제는 신부전(kidney faulure)을 초래할 수 있고, 반면 다른 경우에는 신장이 피해를 입으나 신부전에 이르지는 않는다. 일반적인 신장 독성 약물은 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAID), 일부 항생제, 일부 진통제, 및 일부 촬영 절차에 사용되는 조영제(radiocontrast dye)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
몇몇 신장 상태는 신장의 제거, 또는 신장절제술로 관리될 수 있다. 사구체 여과율로 측정된 신장 기능이, 영구적으로 나쁜 경우, 투석 및 신장 이식이 치료 옵션이 될 수 있다.
신장 이식에 대한 지표는, 최초의 원인과 관계 없이, 말기 신장 질병(ESRD)이다. 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응, 신장 동종 이식 손상 또는 신장 동종 이식 거부 반응은 신장 이식을 겪은 환자에게 발병할 수 있다. 이는, 예시로서 허혈성 재관류 손상, 크기 불일치, 기증자 관련 인자, 세포-매개 거부 반응, 및 항체-매개 거부 반응과 같은, 여러 면역 및 비-면역적 인자로 인해 발생할 수 있다. 이식 후 문제는 하기를 포함할 수 있다: 이식 거부 반응(초급성, 급성, 또는 만성), 거부 반응의 위험성을 감소시키기 위한 면역 억제제로 인한 감염 및 패혈증(sepsis), 이식 후 림프세포증식성 질환(면역 억제제로 인한 림프종의 일종), 무엇보다도 골 문제를 야기할 수 있는 칼슘 및 포스페이트를 포함한 전해질의 불균형, 위염 및 위장 및 식도의 궤양, 다모증(남성형 분포에서의 과도한 모발 성장), 탈모, 비만, 여드름, 2형 당뇨병, 고콜레스테롤혈증 및 골다공증을 포함하는 약제의 다른 부작용들.
개체 및/또는 환자군
본 발명의 조성물 및 방법은 모든 개체에게 적용 가능하다. 일 구체예에서, 상기 개체는 환자이다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물 및 방법은 개체(예를 들면, 환자) 중 의학적 개입을 필요로 하는 하위군을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 그의 소변 cfDNA가 상염색체 복제 수, 1번 염색체 복제 수, 또는 ALU 반복 수를 결정하기 위해 검사된 개체는 신장 질병, 신장 손상, 또는 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응이 발병할 위험이 있는 개체, 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 신장 이식 거부 반응을 겪는 개체, 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응에 대해 치료 받는 개체, 그의 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응이 진행된 개체, 또는 그의 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응이 퇴행한 개체일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 그의 소변 cfDNA가 상염색체 복제 수, 1번 염색체 복제 수, 또는 ALU 반복 수를 결정하기 위해 검사된 개체는 신장 이식또는 동종 신장 이식을 받은 개체, 또는 신장 질병 가족력이 있는 개체가다. 일 구체예에서, 그의 소변 cfDNA가 상염색체 복제 수, 1번 염색체 복제 수, 또는 ALU 반복 수를 결정하기 위해 검사된 개체는 신장 이식 후 급성 거부 반응(AR) 발생을 겪은 개체가다. 또 다른 구체예에서, 그의 소변 cfDNA가 상염색체 복제 수, 1번 염색체 복제 수, 또는 ALU 반복 수를 결정하기 위해 검사된 개체는 높은 혈압(고혈압을 겪는 개체, 당뇨병을 겪는 개체, 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus)를 격는 개체 또는 심혈관 질병을 겪는 개체가다. 또 다른 구체예에서, 상기 개체의 나이는 50세 초과, 55세 초과, 60세 초과, 65세 초과, 70세 초과, 또는 75세 초과이다.
사용 방법
본 명세서는 소변 cfDNA의 검사로 신장 상태를 평가 및 신장 건강을 평가하는 방법을 제공한다. 본 명세서는 또한 신장 이식 환자의 신장 이식 손상 및 신장 이식 거부 반응을 평가하는 방법을 제공한다.
특히 본 명세서는 개체의 cfDNA를 검사하여 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 증상이 발병할 위험이 있는 개체를 확인, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 진행을 모니터링, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 퇴행을 모니터링, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료를 받는 개체의 치료에 대한 반응을 모니터링, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응의 발병 위험을 확인 및/또는 예측, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료를 시작 또는 지속해야 하는 환자 하위군을 확인, 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료의 효율 평가, 및/또는 신장 이식 손상 또는 신장 거부 반응의 증상 발병을 모니터링 해야하는 환자 하위군을 확인하는 방법을 제공한다.
또한, 특히 본 명세서는 개체의 cfDNA를 검사하여 신장 질병 또는 신장 손상이 발병할 위험이 있는 개체를 확인, 신장 질병 또는 신장 손상의 진행을 모니터링, 신장 질병 또는 신장 손상의 퇴행을 모니터링, 신장 질병 또는 신장 손상에 대한 치료를 받는 개체의 치료에 대한 반응을 모니터링, 신장 질병 또는 신장 손상의 발병 위험을 확인 및/또는 예측, 신장 질병 또는 신장 손상에 대한 치료를 시작 또는 지속해야하는 환자 하위군을 확인, 신장 질병 또는 신장 손상에 대한 치료의 효율 평가, 및/또는 신장 질병 또는 신장 손상의 증상 발병을 모니터링 해야하는 환자 하위군을 확인하는 방법을 제공한다.
이러한 신장 상태 평가 방법은 개체의 소변 시료로부터 추출된 cfDNA를 측정하는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 개체의 신장 상태를 평가하기 위한 방법은 소변 시료 내 ALU 반복 수를 결정, 및 상기 ALU 반복 수를 정상군으로부터의 소변 시료 내 ALU 표준 반복 수 또는 그렇지 않으면 미리 정해진 표준 수준과 비교하는 것을 포함하고, 상기 ALU 반복 수의 변화는 변경된 신장 상태를 나타낸다. 만약 1번 염색체의 복제 수가 표준 복제 수보다 높은 것으로 결정되면, 이는 개체의 손상된 신장 상태를 나타낸다. 만약 1번 염색체의 복제 수가 표준 복제 수와 동등 또는 낮은 것으로 결정되면, 이는 좋은 신장 건강을 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 개체의 신장 상태를 평가하기 위한 방법은 소변 시료 내 임의의 염색체 복제 수를 결정, 및 상기 염색체 복제 수를 정상군으로부터의 소변 시료 내 염색체 표준 복제 수 또는 그렇지 않으면 미리 정해진 표준 수준과 비교하는 것을 포함하고, 상기 염색체 복제 수의 변화는 변경된 신장 상태를 나타낸다. 만약 상기 염색체 복제 수가 표준 복제 수보다 높은 것으로 결정되면, 이는 개체의 손상된 신장 상태를 나타낸다. 만약 상기 염색체 복제 수가 표준 복제 수와 동등 또는 낮은 것으로 결정되면, 이는 좋은 신장 건강을 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 개체의 신장 상태를 평가하기 위한 방법은 소변 시료 내 1번 염색체, 2번 염색체, 3번 염색체, 4번 염색체, 5번 염색체, 6번 염색체, 7번 염색체, 8번 염색체, 9번 염색체, 10번 염색체, 11번 염색체, 12번 염색체, 13번 염색체, 14번 염색체, 15번 염색체, 16번 염색체, 17번 염색체, 18번 염색체, 19번 염색체, 20번 염색체, 21번 염색체, 22번 염색체, X 염색체 및/또는 Y 염색체의 복제 수를 결정 및 상기 염색체 복제 수를 정상군으로부터의 소변 시료 내 염색체 표준 복제 수 또는 그렇지 않으면 미리 정해진 표준 수준과 비교하는 것을 포함하고, 상기 염색체 복제 수의 변화는 변경된 신장 상태를 나타낸다. 만약 상기 염색체 복제 수가 표준 복제 수보다 높은 것으로 결정되면, 이는 개체의 손상된 신장 상태를 나타낸다. 만약 상기 염색체 복제 수가 표준 복제 수와 동등 또는 낮은 것으로 결정되면, 이는 양호한 신장 건강을 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 개체의 신장 상태를 평가하기 위한 방법은 소변 시료 내 상염색체의 복제 수를 결정, 및 상기 염색체 복제 수를 정상군으로부터의 소변 시료 내 염색체 표준 복제 수 또는 그렇지 않으면 미리 정해진 표준 수준과 비교하는 것을 포함하고, 상기 염색체 복제 수의 변화는 변경된 신장 상태를 나타낸다. 만약 상기 염색체 복제 수가 표준 복제 수보다 높은 것으로 결정되면, 이는 개체의 손상된 신장 상태를 나타낸다. 만약 상기 염색체 복제 수가 표준 복제 수와 동등 또는 낮은 것으로 결정되면, 이는 양호한 신장 건강을 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 개체의 신장 상태를 평가하기 위한 방법은 소변 시료 내 임의의 성염색체의 복제 수를 결정, 및 상기 염색체 복제 수를 정상군으로부터의 소변 시료 내 염색체 표준 복제 수 또는 그렇지 않으면 미리 정해진 표준 수준과 비교하는 것을 포함하고, 상기 염색체 복제 수의 변화는 변경된 신장 상태를 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 개체의 신장 상태를 평가하기 위한 방법은 소변 시료 내 1번 염색체의 복제 수를 결정, 및 상기 1번 염색체 복제 수를 정상군으로부터의 소변 시료 내 1번 염색체 표준 복제 수 또는 그렇지 않으면 미리 정해진 표준 수준과 비교하는 것을 포함하고, 상기 1번 염색체 복제 수의 변화는 변경된 신장 상태를 나타낸다. 만약 상기 1번 염색체 복제 수가 표준 복제 수보다 높은 것으로 결정되면, 이는 개체의 손상된 신장 상태를 나타낸다. 만약 상기 1번 염색체 복제 수가 표준 복제 수와 동등 또는 낮은 것으로 결정되면, 이는 좋은 신장 건강을 나타낸다.
무세포 정량화, 염색체 복제 수 및 ALU 반복 수를 결정하는 방법
일 구체예에서, cfDNA는 개체의 소변으로부터 정량화될 수 있다. 소변은 당업자가 수행하는 임의의 표준적인 방법에 의해 모을 수 있다. 예를 들면, 소변은 클린 캐치법(clean catch method)을 이용하여 모을 수 있다. 상기 클린 캐치법은 소변 수집 방법의 하나로서, 환자가 성기를 위생 티슈로 닦은 후, 배뇨 중 소변의 처음 부분은 흘러가게 둔 후, 이후 소변의 중간 부분을 멸균 컵에 모으는 방법이다. 이러한 방법을 이용하여, 50-100ml 소변을 모으고 2000 x g로 20분간 원심분리한다. 상층액 5 ml에서 순환(circulating) cfDNA를 제조사의 지시서에 따라 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen)을 이용하여 정제하고 농축한다.
또 다른 구체예에서 순환 cfDNA는 개체의 혈장으로부터 정량화될 수 있다. 혈장은 당업자가 수행하는 임의의 표준적인 방법에 의해 모을 수 있다. 이러한 구체예에서, 상기 cfDNA는 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen) 또는 이와 유사한 제품을 사용하여 정제 및 농축될 수 있다. 소변 또는 혈장으로부터 얻어진 총 cfDNA는 이후 정량화할 수 있다. 총 cfDNA를 정량화 하기 위한 한가지 방법은 제조사의 지시서 및 in Clinica Chimica Acta (327 (2003) 95-101 by Chen et al, (2003))에서 제공된 프로토콜에 따라 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA Reagents and Kits(Invitrogen)를 이용하는 것이다. 일 구체예에서, 소변 시료로부터의 총 cfDNA가 정량화 된다. 또 다른 구체예에서, 혈장 시료로부터의 총 cfDNA가 정량화 된다.
또 다른 구체예에서, 염색체 복제 수 또는 ALU 반복 수가 결정된다. 특정 구체예에서, 이러한 복제 수 및 ALU 반복을 결정하기 위해, 실시간 PCR, 정량적 PCR, 및/또는 디지털 PCR이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 형광 제자리 부합법(fluorescent in situ hybridization), 비교 유전체 부합법(comparative genomic hybridization), 및 어레이 비교 유전체 부합법(aCGH) 및 SNP 어레이 기술에 기반한 고해상도 어레이 기반 분석법과 같은 방법이 사용된다.
일 구체예에서, 디지털 PCR이 임의의 염색체의 복제 수, 또는 임의의 상염색체의 복제 수, 또는 임의의 성염색체의 복제 수를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 더 구체적으로는 디지털 PCR이 1번 염색체, 2번 염색체, 3번 염색체, 4번 염색체, 5번 염색체, 6번 염색체, 7번 염색체, 8번 염색체, 9번 염색체, 10번 염색체, 11번 염색체, 12번 염색체, 13번 염색체, 14번 염색체, 15번 염색체, 16번 염색체, 17번 염색체, 18번 염색체, 19번 염색체, 20번 염색체, 21번 염색체, 22번 염색체의 복제 수를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 유사하게 디지털 PCR이 Y 염색체 또는 X 염색체의 복제 수를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일 특정 구체예에서, 디지털 PCR이 1번 염색체의 복제 수를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 일반적인 구체예에서, 디지털 PCR이 시료 내 ALU 반복 수를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 디지털 PCR, 실시간 PCR, 또는 정량적 PCR을 수행할 수 있는 프라이머 세트가, 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 또는 300 염기쌍의 증폭절을 증폭시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 디지털 PCR, 실시간 PCR, 또는 정량적 PCR을 수행할 수 있는 프라이머 세트가, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 또는 300 염기쌍 이하의 증폭절을 증폭시킬 수 있다. 본 명세서의 임의의 구체예에서, 상기 증폭절은 본 명세서에 기재된 임의의 하한 및 본 명세서에 기재된 임의의 상한으로부터 선택된 범위를 가질 수 있다. 일 특정 구체예에서, 상기 증폭절은 81 염기쌍의 길이를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 상기 증폭절은 84 염기쌍의 길이를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 상기 증폭절은 115 염기쌍의 길이를 갖는다.
일 구체예에서, 디지털 PCR, 실시간 PCR, 또는 정량적 PCR을 수행할 수 있는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 또는 프로브는 GC가 풍부하다. 일 구체예에서, 디지털 PCR, 실시간 PCR, 또는 정량적 PCR을 수행할 수 있는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 또는 프로브는 GC가 풍부하지 않다. 또 다른 구체예에서, 디지털 PCR, 실시간 PCR, 또는 정량적 PCR이 가능한 프라이머 세트는 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%의 GC 풍부도를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 디지털 PCR, 실시간 PCR, 또는 정량적 PCR이 가능한 프라이머 세트는 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% 이하의 GC 풍부도를 갖는다.
일 구체예에서, 디지털 PCR, 실시간 PCR, 또는 정량적 PCR을 수행할 수 있는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 또는 프로브는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 염기쌍 길이이다. 일 구체예에서, 디지털 PCR, 실시간 PCR, 또는 정량적 PCR을 수행할 수 있는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 또는 프로브는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 염기쌍 이하의 길이이다.
일 특정 구체예에서, 디지털 PCR은 ALU 반복 수를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 구체예를 수행하기 위해 FastStart TaqMan Probe Master Mix with Rox(Roche)를 관심있는 유전자좌의 증폭절을 증폭하기 위한 적절한 프라이머 및 프로브와 함께 준비한다. 일 구체예에서, ALU 유전자좌를 증폭시키기 위해 하기의 프라이머 세트가 사용될 수 있다: 정방향 프라이머 5'-GGAGGCTGAGGCAGGAGAA-3'; 역방향 프라이머 5'-ATCTCGGCTCACTGCAACCT-3', 및 프로브 5'-(FAM)CGCCTCCCGGGTTCAAGCG-3'. 또 다른 구체예에서, ALU 유전자좌 115 염기쌍을 증폭시키기 위해, 하기의 프라이머 세트가 사용될 수 있다: 정방향 프라이머 5'-GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3'; 역방향 프라이머 5'-ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'; 및 프로브 5'-HEXTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3'.
또 다른 특정 구체예에서, 디지털 PCR이 1번 염색체 복제 수를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 구체예를 수행하기 위해 FastStart TaqMan Probe Master Mix with Rox(Roche)를 관심있는 유전자좌의 증폭절을 증폭하기 위한 적절한 프라이머 및 프로브와 함께 준비한다. 예를 들면, 1번 염색체 상의 유전자좌 EIF2C1의 81 염기쌍 증폭절을 증폭시키기 위해 하기가 사용될 수 있다: 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT; 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC; 프로브 HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1.
또 다른 구체예에서, 디지털 PCR이 Y 염색체의 복제 수를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 구체예를 수행하기 위해 FastStart TaqMan Probe Master Mix with Rox(Roche)를 관심있는 유전자좌의 증폭절을 증폭하기 위한 적절한 프라이머 및 프로브와 함께 준비한다. 예를 들면 Y 염색체 상의 유전자좌 DYS 14(다중-복제 유전자좌(multi-copy locus))의 84 염기쌍 증폭절을 증폭시키기 위해 하기의 프라이머 세트가 사용될 수 있다: : 정방향 프라이머 5'-ATCGTCCATTTCCAGAATCA; 역방향 프라이머 5'-GTTGACAGCCGTGGAATC; 프로브: 5'-FAM-TGCCACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BHQ1.
또 다른 특정 구체예에서, 디지털 PCR이 Y 염색체의 복제 수를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 구체예를 수행하기 위해 FastStart TaqMan Probe Master Mix with Rox(Roche)를 관심있는 유전자좌의 증폭절을 증폭하기 위한 적절한 프라이머 및 프로브와 함께 준비한다. 예를 들면 Y 염색체 상의 유전자좌 SRY(단일-복제 유전자좌(single-copy locus))의 84 염기쌍 증폭절을 증폭시키기 위해 하기의 프라이머 세트가 사용될 수 있다: : 정방향 프라이머 5'-CGCTTAACATAGCAGAAGCA; 역방향 프라이머 5'-AGTTTCGAACTCTGGCACCT; 및 프로브 5'-FAM-TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACA-BHQ1.
디지털 PCR을 위해 준비된 시료를 BioMark real-time PCR system (Fluidigm)을 이용하는 12.765 디지털 어레이 칩 상에 로딩(load)할 수 있다. Digital PCR Analysis Software v3.0을 이용하여 데이터를 추출 및 추정할 수 있다. 각각의 염색체의 복제 수는 하기의 식을 이용하여 계산된다: (382/패널/4.59 μl/패널) X (8 μl 반응 혼합물/1 μl DNA) = 처음 시료 내 복제 수/μl.
한 염색체 및 다른 염색체의 복제 수 사이, 한 염색체 상의 한 유전자좌 및 동일한 염색체 상의 다른 유전자좌 사이, 또는 한 염색체의 복제 수 및 ALU 반복 수 사이의 연관성은 정량되고 및 표현될 수 있다. 이러한 연관성은 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응을 검출하기 위한 특정 프라이머 세트의 민감도 및 예측도를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 이러한 연관성은 또한 특정 체액, 또는 시료를 위한 프라이머 세트를 최적화 하기 위해 수행될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 총 cfDNA, 하나 이상의 염색체의 복제 수, 하나 이상의 상염색체의 복제 수, 1번 염색체의 복제 수, 하나 이상의 성염색체의 복제 수, 또는 ALU 반복 수의 정량화 및 결정은 소변 및/또는 혈장 시료를 이용하여 수행할 수 있고, 소변 단백질의 측정과 함께 결합할 수 있다. 일 특정 구체예에서, 상기 소변 단백질은 크레아티닌이다. 더욱이, 총 cfDNA, 하나 이상의 염색체의 복제 수, 하나 이상의 상염색체의 복제 수, 1번 염색체의 복제 수, 하나 이상의 성염색체의 복제 수, 또는 ALU 반복 수의 정량화 및 결정은 소변 및/또는 혈장 시료를 이용하여 수행할 수 있고, 다른 병리학적 및 임상적 데이터의 측정과 함께 결합할 수 있다. 이러한 병리학적 및 임상적 데이터는 의료적 촬영, 다른 혈액 검사, 신장 생검, 사구체 여과율(GFR) 측정(분당 여과되는 혈장액의 양), 보정된 GFR(corrected GFR: cGFR)(체표면적에 대한 수정된 인자로 보정한 GFR 측정), 단백뇨 측정, 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
표준 수준
본 명세서에서 제공된 바와 같이, 본 방법은
부분적으로, 소변 시료 내 하나 이상의 염색체의 복제 수를 결정, 하나 이상의 상염색체의 복제 수를 결정, 하나 이상의 성염색체의 복제 수를 결정, 특히 1번 염색체의 복제 수를 결정, 특히 Y 염색체의 복제 수를 결정, ALU 반복 수를 결정하고, 그 수를 정상군으로부터의 소변 시료 내 표준 복제 수 또는 그렇지 않으면 미리 정해진 표준 수준과 비교하여 개체의 신장 상태를 평가하기 위해 사용되고, 그 수의 변화는 변경된 신장 상태를 나타낸다.
일 구체예에서, 정상군으로부터의 소변 시료 내 염색체의 표준 복제 수는 정상군의 특정 염색체의 평균 복제 수를 측정하여 결정된다. 일 구체예에서, 정상군으로부터의 소변 시료 내 염색체의 표준 복제 수는 정상군의 특정 염색체의 복제 수 중간 값을 측정하여 결정된다. 일 구체예에서, 정상군으로부터의 소변 시료 내 염색체의 표준 복제 수는 정상군의 특정 염색체의 복제 수의 범위를 측정하여 결정된다.
일 구체예에서, 정상군으로부터의 소변 시료 내 1번 염색체의 표준 복제 수는 정상군의 1번 염색체의 평균 복제 수를 측정하여 결정된다. 일 구체예에서, 정상군으로부터의 소변 시료 내 1번 염색체의 표준 복제 수는 정상군의 1번 염색체의 복제 수 중간 값을 측정하여 결정된다. 일 구체예에서, 정상군으로부터의 소변 시료 내 1번 염색체의 표준 복제 수는 정상군의 1번 염색체의 복제 수의 범위를 측정하여 결정된다.
일 구체예에서, 정상군으로부터의 소변 시료 내 ALU 표준 반복 수는 정상군의 ALU 유전자좌의 평균 반복 수를 측정하여 결정된다. 일 구체예에서, 정상군으로부터의 소변 시료 내 ALU 표준 반복 수는 정상군의 ALU 유전자좌의 반복 수의 중간 값을 측정하여 결정된다. 일 구체예에서, 정상군으로부터의 소변 시료 내 ALU 표준 반복 수는 정상군의 ALU 유전자좌의 반복 수의 범위를 측정하여 결정된다.
일 구체예에서, 정상군은 신장 손상, 신장 질병, 또는 신장 이식 거부 반응을 겪지 않거나, 전혀 고통받지 않았던 개체의 집단이다. 또 다른 구체예에서, 정상군은 복제 수가 신장 손상, 신장 질병, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응에 앞서 결정된 개체의 집단이다. 또 다른 구체예에서, 정상군은 신장 손상, 신장 질병, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응을 겪었으나 이후 회복된 개체의 집단이다. 다양한 구체예에서, 정상군은 나이 일치, 성(sex) 일치, 질병 히스토리(당뇨병, 심혈관 질병, 고혈압, 이전의 바이러스 감염, 신장암, 또는 이와 유사한 것과 같은)의 일치, 혈액형 일치, 인종 기원 일치, 민족(ethnicity) 일치, 이식 히스토리 일치, 정상군에 대한 수치를 결정하는데 이질성(heterogeneity)을 야기할 수 있는 모든 것이 일치, 및 이들의 조합인 개체의 집단이다.
일 구체예에서, 시료로부터 결정된 수는 정상군으로부터의 소변 시료 내 복제 수 또는 그렇지 않으면 미리 결정된 표준 수준에 동등 또는 실질적으로 동일하다. 또 다른 구체예에서, 시료로부터 결정된 수는 정상군으로부터의 소변 시료 내 복제 수 또는 그렇지 않으면 미리 결정된 표준 수준보다 작다. 또 다른 구체예에서, 시료로부터 결정된 수는 정상군으로부터의 소변 시료 내 복제 수 또는 그렇지 않으면 미리 결정된 표준 수준보다 크다. 이와 관련한 구체예에서, 상기 시료로부터 결정된 수는 정상군으로부터의 소변 시료 내 복제 수 또는 그렇지 않으면 미리 결정된 표준 수준보다 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1000, 적어도 2500, 적어도 5000, 적어도 7500, 적어도 10,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000, 적어도 500,000, 적어도 1,000,000, 적어도 10,000,000, 또는 적어도 심지어 100,000,000배 더 크다. 또 다른 구체예에서, 시료로부터 결정된 수는 정상군으로부터의 소변 시료 내 복제 수 또는 그렇지 않으면 미리 결정된 표준 수준보다 작다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 진단적 및 예후적 방법을 수행하기 위해 유용한 물질들을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명에 기재된 절차는 임상 연구실, 실험 연구실, 또는 업계 종사자(practitioner)에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 이러한 여러 세팅에서 사용될 수 있는 키트를 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명의 키트는 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 염색체의 복제 수를 정량화하기 위한 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 키트는 개체로부터 얻은 시료 내 존재하는 임의의 염색체의 복제 수, 더욱 구체적으로는 임의의 상염색체의 복제 수, 1번 염색체의 복제 수, Y 염색체의 복제 수, 또는 ALU 반복 수를 정량화 하기 위해 사용되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함한다. 상기 프라이머 세트는 바람직하게는 소변 시료 내 cfDNA를 검출하기에 적절한 양으로 제공된다.
일 구체예에서, 본 발명의 키트는 소변 시료로부터 cfDNA 내 임의의 상염색체의 복제 수를 정량화 하기 위해 사용되는 프라이머 세트를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 인구에 걸쳐 상대적으로 일정한 염색체의 유전자좌를 표적으로 하도록 고안된다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 염색체, 또는 불변 영역(constant region)을 나타내는 염색체의 일부를 표적으로 하도록 고안된다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 염색체의 비-가변 영역(non-variable region), 또는 비-초가변(non-hypervariable) 영역을 표적으로 하도록 고안된다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 인구에 걸쳐 일정하지 않은 염색체의 유전자좌를 표적으로 하도록 고안된다. 또 다른 구체예에서, 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 염색체, 또는 가변 영역을 나타내는 염색체의 일부를 표적으로 하도록 고안된다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 염색체의 초가변 영역을 표적으로 하도록 고안된다. 현재 이용 가능한 유전적 방법 및 데이터베이스를 이용하는 당업자는 이러한 일정한, 일정하지 않은, 가변적인, 비가변적인, 초가변적인, 초가변적이지 않은, 및 이와 같은, 염색체 또는 유전자좌를 확인할 수 있을 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키트는 본 명세서에 기재된 개체로부터 얻은 소변 시료로부터 추출된 cfDNA 내 ALU 반복 수를 정량화 하기 위해 사용되는 프라이머 세트를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 ALU 유전자좌의 115 염기쌍 증폭절을 증폭하는 것이 가능하다. 이러한 구체예에서 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 5'-GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3' 및 역방향 프라이머 5'-ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'을 포함한다. 일 특정 구체예에서 이러한 프라이머 세트는 디지털 PCR에 사용될 수 있고, 상기 프라이머 세트는 추가적으로 디지털 PCR에 유용한 프로브를 포함한다. 이러한 프로브에 대한 한 예시적 서열은 5'-HEXTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3'이다.
또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 ALU 유전자좌의 또 다른 증폭절을 증폭시킬 수 있다. 이러한 구체예에서 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 5'-GGAGGCTGAGGCAGGAGAA-3' 및 역방향 프라이머 5'-ATCTCGGCTCACTGCAACCT -3'를 포함할 수 있다. 일 특정 구체예에서 이러한 프라이머 세트는 디지털 PCR에 사용될 수 있고 상기 프라이머 세트는 추가적으로 디지털 PCR에 유용한 프로브를 포함한다. 이러한 프로브의 한 예시적 서열은 5'(FAM)CGCCTCCCGGGTTCAAGCG -3'이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키트는 본 명세서에 기재된 개체로부터 얻은 소변 시료로부터 추출된 cfDNA 내 1번 염색체, 2번 염색체, 3번 염색체, 4번 염색체, 5번 염색체, 6번 염색체, 7번 염색체, 8번 염색체, 9번 염색체, 10번 염색체, 11번 염색체, 12번 염색체, 13번 염색체, 14번 염색체, 15번 염색체, 16번 염색체, 17번 염색체, 18번 염색체, 19번 염색체, 20번 염색체, 21번 염색체, 및/또는 22번 염색체의 복제 수를 정량화 하기 위해 사용되는 프라이머 세트를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키트는 본 명세서에 기재된 개체로부터 얻은 소변 시료로부터 추출된 cfDNA 내 1번 염색체의 복제 수를 정량화 하기 위해 사용되는 프라이머 세트를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 EIF2C1 유전자좌의 증폭절을 증폭시킬 수 있다. 이러한 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT 및 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 디지털 PCR에 사용될 수 있고 상기 프라이머 세트는 추가적으로 디지털 PCR에 유용한 프로브를 포함한다. 이러한 프로브의 한 예시적 서열은 5'- HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키트는 본 명세서에 기재된 개체로부터 얻은 소변 시료로부터 추출된 cfDNA 내 Y 염색체의 복제 수를 정량화 하기 위해 사용되는 프라이머 세트를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 DYS 14 유전자좌의 증폭절을 증폭시킬 수 있다. 이러한 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 5'-ATCGTCCATTTCCAGAATCA 및 역방향 프라이머 5'-GTTGACAGCCGTGGAATC를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 디지털 PCR에 사용될 수 있고 상기 프라이머 세트는 추가적으로 디지털 PCR에 유용한 프로브를 포함한다. 이러한 프로브의 한 예시적 서열은 5'- FAM-TGCCACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BHQ1이다. 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 SRY 유전자좌의 증폭절을 증폭시킬 수 있다. 이러한 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 5'-CGCTTAACATAGCAGAAGCA 및 역방향 프라이머 5'-AGTTTCGAACTCTGGCACCT를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 디지털 PCR에 사용될 수 있고 상기 프라이머 세트는 추가적으로 디지털 PCR에 유용한 프로브를 포함한다. 이러한 프로브의 한 예시적 서열은 5'- FAM-TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACA-BHQ1이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키트는 본 명세서에 기재된 개체로부터 얻은 소변 시료로부터 추출된 cfDNA 내 X 염색체의 복제 수를 정량화 하기 위해 사용되는 프라이머 세트를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 키트는 기질 표면(예를 들면, 비드, 어레이 및 이와 유사한 것) 상에 고정화될 수 있는 하나 이상의 프라이머를 포함한다.
익숙한 바와 같이, 이러한 제시된 키트 요소들은 당업자에 의해 사용을 위한 관례적인 방법으로 포장될 수 있다. 예를 들면, 이러한 제시된 키트 성분들은 용액 또는 액상 분산물(dispersion) 또는 이와 유사한 것으로서 제공될 수 있다. 본 발명의 키트에 포함된 여러 시약들은 고체(예를 들면, 동결 건조) 또는 액체 형태로 공급될 수 있다. 본 발명의 키트는, 각각의 개별적인 버퍼 및/또는 시약을 위한, 여러 용기(예를 들면, 바이알, 앰풀, 검사 튜브, 플라스크 또는 병)를 선택적으로 포함할 수 있다. 각각의 요소는 일반적으로 이의 각각의 용기 내에 나누어진 것으로서, 또는 농축된 형태로서 제공되는 것이 적합하다. 개시된 방법의 특정 단계를 수행하기 위해 적합한 다른 용기들이 또한 제공될 수 있다. 상기 키트의 개별적인 용기들은 바람직하게는 상업적 판매를 위해 모아두는 것이 바람직하다.
특정 구체예에서, 키트는 본 발명의 방법에 따른 개체의 신장 상태, 신장 이식 상태, 신장 질병, 신장 손상, 또는 신장 이식 거부 반응의 진단을 위한 이들 요소의 사용을 위한 지시서를 더 포함한다. 본 발명의 방법에 따른 키트를 사용하기 위한 지시서는 개체에 대해 얻어진 생물학적 시료의 처리 및/또는 검사 수행을 위한 지시서, 및/또는 그 결과를 해석하기 위한 지시서를 포함할 수 있다.
키트는 또한 의약품 또는 생물학적 제품의 생산, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의한 규정된 형태의 통지를 포함할 수 있다
컴퓨터 프로그램
상기의 임의의 방법이 컴퓨터 기록 가능한 매체에 기록된 컴퓨터 실행 가능한 논리를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 컴퓨터 프로그램은 하기의 기능 중 일부 또는 전부를 실행할 수 있다: (ⅰ) 시료로부터의 핵산의 분리의 제어, (ⅱ) 시료로부터의 핵산의 사전 증폭, (ⅲ) 시료 중 특정 부위의 증폭, (ⅳ) 시료 내 총 cfDNA, 염색체 복제 수, 또는 ALU 반복 수의 확인 및 정량화, (ⅴ) 시료로부터 검출된 데이터를 참조 기준과 비교, (ⅵ) 신장 상태 또는 임상 결과의 결정, (ⅶ) 정상적 또는 비정상적 신장 상태 또는 임상 결과의 선언.
상기 컴퓨터 실행 가능한 논리는 개별 컴퓨터, 네트워크 서버, 워크스테이션, 또는 현재 또는 이후 개발되는 다른 컴퓨터 플랫폼과 같은 일반적인 목적의 컴퓨터의 다양한 형태 모두일 수 있는 모든 컴퓨터에서 작동이 가능하다. 일부 구체예에서, 컴퓨터 프로그램 제품은 그 안에 저장된 컴퓨터 실행 가능한 논리(프로그램 코드를 포함하는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램)를 갖는 컴퓨터 사용 가능한 매체를 포함하는 것으로 설명된다. 상기 컴퓨터 실행가능한 논리는 프로세서가 본 명세서에 기재된 기능을 수행하도록 하여, 프로세서에 의해 실행될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 일부 기능은 주로 하드웨어, 예를 들면 하드웨어 상태 기계(state machine)를 사용하는 하드웨어에서 구현된다. 본 명세서에 기재된 기능을 수행하기 위한 하드웨어 상태 기계의 구현은 당업자에게 자명할 것이다.
상기 프로그램은 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응의 발병 위험에 있거나, 이를 겪는 개체의 신장 상태 또는 임상 결과를 평가하는 방법을 제공할 수 있다.
실시예
실시예 1: Y 염색체 및 1번 염색체의 복제 수의 결정에 의한 혈장 내 무세포 DNA의 검출
급성 거부 반응(AR) 발생이 있거나 또는 없는 10명의 신장 이식 환자로부터의 33개의 고유한 혈장 시료 내의 Y 염색체 및 1번 염색체 복제 수를 정량화하였다. 3명의 환자는 남성의 신장을 받은 여성 수혜자였다. 다른 7명의 환자는 다른 성별 조합을 가졌다. 10명 중 9명의 생검에서 손상이 있다고 증명되었다. 각각의 환자마다 2-4개의 일련의 혈장 시료를 분석하였다.
3 mL의 혈장으로부터 제조사의 지시서에 따라 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen)를 사용하여 순환 cfDNA를 정제하였고 농축하였다. 이후 총 DNA를 제조사의 지시서에 따라 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA Reagents and Kits (Invitrogen)를 사용하여 정량화하였다.
Y 염색체 및 1번 염색체의 복제 수를 결정하기 위해 디지털 PCR을 사용하였다. 하기의 프라이머 및 프로브와 함께 FastStart TaqMan Probe Master Mix with Rox (Roche)를 준비하였다. Y 염색체 상의 DYS 14 유전자좌(다중-복제 유전자좌)의 84 염기쌍 증폭절을 증폭시키기 위해, 하기가 사용되었다: 정방향 프라이머 5'-ATCGTCCATTTCCAGAATCA; 역방향 프라이머 5'-GTTGACAGCCGTGGAATC; 및 프로브 5'-FAM-TGCCACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BHQ1.
1번 염색체 상의 유전자좌 EIF2C1의 81 염기쌍 증폭절을 증폭시키기 위해 하기가 사용되었다: 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT; 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC; 프로브 HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1.
상기 시료를 BioMark real-time PCR system (Fluidigm)을 이용하는 12.765 디지털 어레이 칩 상에 로딩하였다. 상기 시료의 총 DNA 함량은, 동등한 로딩을 보장하기 위해 PicoGreen을 이용하여 결정하였다. 1번 염색체 및 Y 염색체 신호를 교정하기 위해 대조군 남성 및 여성의 게놈 DNA(Promega)를 사용하였다.
Digital PCR Analysis Software v3.0을 이용하여 데이터를 추출하고 추정하였다. 각각의 염색체의 복제 수는 하기의 식을 이용하여 계산하였다:
(382/패널/4.59 μl/패널) X (8 μl 반응 혼합물/1 μl DNA) = 처음 시료 내 복제 수/μl.
혈장 시료 내 1번 염색체의 복제 수가 Y 염색체의 복제 수와 연관이 있는지 여부를 평가하기 위해, 남성의 신장을 받은 여성 수혜자 4명의 환자(이들 중 3명의 생검 결과 이식 손상이 증명됨)로부터의 13개 혈장 시료를 분석하였다.
도 1은 급성 거부 반응(AR) 발생이 있거나 또는 없는, 신장 이식을 겪은 개체의 혈장 시료 내 1번 염색체와 Y 염색체 복제 수 사이의 연관성을 나타낸다. 혈장에서, 다중-유전자좌 유전자를 가리키는 DYS-14 프라이머로 Y 염색체가 검출되었다. 신장 손상을 검출하기 위해 측정으로서, 혈장의 cfDNA 측정에 의한 무세포의 1번 염색체 복제 수의 민감도는, 소변의 cfDNA 측정과 비교할 때 오직 33%의 민감도를 보였다.
이러한 데이터는 혈장이 신장 손상의 모니터링을 위한 cfDNA의 측정에 최적의 체액이 아님을 보여준다.
실시예 2: Y 염색체 및 1번 염색체 복제 수 결정에 의한 소변내 무세포 DNA의 검출
Y 염색체 및 1번 염색체 복제 수를 급성 거부 반응(AR) 발생이 있거나 또는 없는 40명의 신장 이식 환자로부터의 125개의 고유한 소변 시료에서 정량화하였다. 125개 시료 중 20개는 AR 발생이 있거나 또는 그 경계에 있었던 개체에게서 채취하였고, 105개 시료는 AR 발생이 없는 개체에게서 채취하였다. 125개 소변 시료 중 53개는 남성 신장을 받은 16명의 여성 수혜자로부터 채취된 것이었다. 남은 72개 소변 시료는 다른 성별 조합을 갖는 24명의 환자들로부터 채취된 것이었다. 각각의 환자마다 2-4개의 일련의 시료를 분석하였다. 50-100 mL 소변을 클린 캐치법으로 얻었다. 상기 클린 캐치법은 소변 수집 방법의 하나로서, 환자가 성기를 위생 티슈로 닦은 후, 배뇨 중 소변의 처음 부분은 흘러가게 둔 후, 이후 소변의 중간 부분을 멸균 컵에 모으는 방법이다. 그 시료는 2000 x g로 20분간 원심분리하였다. 상층액 5 ml에서 순환 cfDNA를 제조사의 지시서에 따라 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen)을 이용하여 정제하고 농축하였다. 이후 총 DNA를 제조사의 지시서에 따라 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA Reagents and Kits (Invitrogen)를 이용하여 정량화하였다.
Y 염색체 및 1번 염색체의 복제 수를 BioMark (Fluidigm) 실시간 PCR 시스템을 이용하여 결정하였다. 하기의 프라이머 및 프로브와 함께 FastStart TaqMan Probe Master Mix with Rox(Roche)를 준비하였다. Y 염색체 상의 SRY 유전자좌(단일-복제 유전자좌)의 84 염기쌍 증폭절을 증폭시키기 위해, 하기가 사용되었다: 정방향 프라이머 5'-ATCGTCCATTTCCAGAATCA; 역방향 프라이머 5'-GTTGACAGCCGTGGAATC; 및 프로브 5'-FAM-TGCCACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BHQ1. 1번 염색체 상의 유전자좌 EIF2C1의 81 염기쌍 증폭절을 증폭시키기 위해 하기가 사용되었다: 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT; 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC; 프로브 HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1. 상기 시료를 BioMark real-time PCR system (Fluidigm)을 이용하는 12.765 디지털 어레이 칩 상에 로딩하였다. 상기 기재한 바와 같이, 상기 시료의 총 DNA 함량은 동등한 로딩을 보장하기 위해 PicoGreen을 이용하여 결정하였다. 1번 염색체 및 Y 염색체 신호를 교정하기 위해 대조군 남성 및 여성의 게놈 DNA(Promega)를 사용하였다.
Digital PCR Analysis Software v3.0을 이용하여 데이터를 추출하고 추정하였다. 각각의 염색체의 복제 수는 하기의 식을 이용하여 계산하였다:
(382/패널/4.59 μl/패널) X (8 μl 반응 혼합물/1 μl DNA) = 처음 시료 내 복제 수/μl.
소변 시료 내 1번 염색체의 복제 수가 Y 염색체의 복제 수와 연관이 있는지 여부를 평가하기 위해, 이들 각각의 수를 도 2에서 비교하였다. 도 2는 급성 거부 반응(AR) 발생이 있거나 또는 없는, 신장 이식을 겪은 12명의 여성의 27개 소변 시료 내 1번 염색체와 Y 염색체 복제 수 사이의 연관성을 나타낸다. 질 관리로서, 및 소변 시료 내 1번 염색체 복제 수의 강력함을 평가하기 위해, 1번 염색체의 복제 수를 3명의 환자들로부터의 9개 시료에서 반복 실행하여 결정하였다. 반복 실행 사이에서 밀접한 연관성이 관찰되었고 이는 표 1 및 도 3에 나타나있다. 표 1은 예측된 목표의 관점에서 두 번의 실행 사이의 강력한 재현성을 보여준다. '예측된 목표(estimated target)'는 Fluidigm Biomark 기기로부터 얻는 단위 없는(unitless) 수이다. 더욱이, 여성 기증자로부터 신장 이식을 받은 여성 환자의 시료에서는 Y 염색체가 검출되지 않았다.
표 1:
Figure pct00001
이식을 받았으나 손상을 보이지 않은 개체(비-이식 손상 표현형)의 소변 당 mL 당 1번 염색체의 복제 수의 평균은 1681±3124(표준 편차)이다. 이식을 받았으나 손상을 보이지 않은 개체의 소변 당 mL 당 1번 염색체의 복제 수의 중간 값은 321이다. 이식을 받았으나 손상을 보이지 않은 개체의 소변 당 mL 당 1번 염색체의 복제 수의 범위는 0-12963 복제 수이다.
이식을 받고 손상을 보인 개체(손상 표현형)의 소변 당 mL 당 1번 염색체의 복제 수의 평균은 10728±30283(표준 편차)이다. 이식을 받았으나 손상을 보이지 않은 개체의 소변 당 mL 당 1번 염색체의 복제 수의 중간 값은 2009이다. 이식을 받았으나 손상을 보이지 않은 개체의 소변 당 mL 당 1번 염색체의 복제 수의 범위는 0-198496 복제 수이다.
신장 상태를 평가하기 위한 현재의 표준적인 방법은 소변 단백질을 측정하는 것이다(단백뇨증 측정). 소변 단백질의 측정과 1번 염색체 복제 수의 연관성을 평가하기 위해, 소변 단백질을 1번 염색체 복제 수와 비교하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 상기 기재된 분석법에서 결정된 바와 같이, 소변 단백질의 양은 1번 염색체 복제 수와 높은 연관이 있었다. 소변 단백질은 제조사의 프로토콜에 따라 표준 Bradford 분석법(Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay, Thermo Scientific)으로 측정하였고 소변 크레아티닌은 QuantiChromTM Creatinine Assay Kit (BioAssay Systems)를 이용하여 측정하였다.
소변 무세포 1번 염색체 복제 수는 병리학적 및 임상 데이터와 높은 연관이 있다. 이러한 데이터는 표 2에 나타나 있다. 단백뇨증과 cGFR보다, 1번 염색체 복제 수와 cGFR 사이이 더 나은 연관성이 있다. 유사하게, 단백뇨증과 급성 손상보다, 1번 염색체 복제 수와 급성 손상 사이에 더 나은 연관성이 있다. 1번 염색체 복제 수/소변 크레아티닌 μg은 r=0.32인 급성 손상 점수 (ⅰ)와 연관성이 있고, 이는 r=0.22인 통상적인 단백뇨증과 급성 손상 점수의 연관성보다 더 높다. 1번 염색체 복제 수/소변 크레아티닌 μg은 cGFR 측정과 r=-0.28로 연관성이 있고, 이는 r=-0.02인 통상적인 단백뇨증과 cGFR의 연관성보다 높다.
표 2:
Figure pct00002
(p)= p-값, (r)=상관 계수, 간질(i), 세관(t), 및 사구체(g);
CADI=급성 동종 이식 피해 지수(CADI)
실시예 3: ALU 반복 수 및 ALU 반복과 1번 염색체 복제 수 사이의 연관성의 결정에 의한 소변 내 무세포 DNA의 검출
실시예 2에 기재된 소변 시료 내의 ALU 반복 수를 표준 실시간 PCR로 결정하였다. ALU 반복 및 1번 염색체 복제 수는 급성 거부 반응(AR) 발생이 있거나 혹은 없는 40명의 신장 이식 환자로부터의 125개 고유의 시료 내에서 정량화하였다. 125개 시료 중 20개는 AR 발생이 있거나 또는 그 경계에 있었던 개체에게서 채취하였고, 105개 시료는 AR 발생이 없는 개체에게서 채취하였다. 각각의 환자마다 2-4개의 일련의 시료를 분석하였다. 실시예 2와 같이 cfDNA를 분리하고 정제하였다. 총 DNA는 제조사의 지시서에 따라 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA Reagents and Kits (Invitrogen)를 이용하여 정량화하였다.
Y 염색체 복제 수 및 ALU 반복 수를 BioMark (Fluidigm) real-time PCR system을 이용하여 결정하였다. 하기의 프라이머 및 프로브와 함께 FastStart TaqMan Probe Master Mix with Rox(Roche)를 준비하였다. 1번 염색체 상의 유전자좌 EIF2C1의 81 염기쌍 증폭절을 증폭시키기 위해 하기가 사용되었다: 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT; 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC; 프로브 HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1. ALU 유전자좌의 115 염기쌍 증폭절을 증폭시키기 위해 하기가 사용되었다: 정방향 프라이머 5'- GCCTGTAATCCCAGCTACTC; 역방향 프라이머 5'- ATCTCGGCTCACTGCAAC; 프로브 5'-HEX-TCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3'. 상기 시료는 이후 12,765 디지털 어레이 칩(Fluidigm) 상에 로딩하였다. 상기 기재한 바와 같이, 상기 시료의 총 DNA 함량은 동등한 로딩을 보장하기 위해 PicoGreen을 이용하여 결정하였다. 1번 염색체 및 ALU 반복 신호를 교정하기 위해 대조군 남성 및 여성의 게놈 DNA(Promega)를 사용하였다.
Digital PCR Analysis Software v3.0을 이용하여 데이터를 추출하고 추정하였다. 각각의 염색체의 복제 수는 하기의 식을 이용하여 계산하였다:
(382/패널/4.59 μl/패널) X (8 μl 반응 혼합물/1 μl DNA) = 처음 시료 내 복제 수/μl.
본 실시예는 신장 상태 및 신장 손상을 평가하는데에 있어서 게놈 상염색체 DNA를 사용하는 것의 유용성을 증명하였다. 도 5는 시료 내 ALU 반복 수 및 1번 염색체의 연관성을 보여준다. 총 DNA의 2 ng 당 1번 염색체 복제 수를 총 DNA의 0.02 ng 당 ALU 반복 수에 대응하여 그렸고, 이는 1번 염색체 수의 ALU 반복 수에 대한 높은 연관성을 보여주었다.
실시예 4: 대규모 연구
환자 및 시료: 본 연구에는 Lucile Packard Children's Hospital at Stanford에서 2004년부터 2010년까지 신장 이식을 받은 소아 및 젊은 성인 수혜자로부터의 신장 동종 이식의 징후(indicated), 또는 프로토콜 생검과 동시적으로 함께 수집된 신장 이식 환자 혈장 및 소변 시료가 포함된다. 환자들은 본 연구에 포함되어, 각각의 선택된 환자에 대한 소변 시료 기반의 모든 가능한 감시(surveillance) 및 징후(동종 이식 장애)를 포함하는 매칭된(matched) 이식 생검과 함께, 연구 기간 동안 적어도 2개 시료를 갖게 된다. 본 연구는 Ethics Committee of Stanford University Medical School and California Pacific Medical Center Research Institute (CPMCRI)에 의해 승인되었고, 모든 환자/보호자는 헬싱키 선언(Helsinki of Declaration)을 완전히 준수하고 본 연구에 참여한다는 사전 동의를 제공하였다. 292개 고유한 소변 시료를 75명의 신장 이식 환자들로부터 수집하였고, 이식 이후 3, 6, 12, 및 24월의 감시 시점 및 징후 생검(indication biopsy) 시점에서 수집되었다. 혈장 시료(n=40)를 12명의 환자로부터 이식 이후 3, 6, 12, 및 24월의 감시 시점 및 징후 생검 시점에서 수집하였다. 익명화된(deidentified) 임상 정보를 모든 참가 환자들에게서 수집하였다. 모든 매칭된 생검에 한 병리학자가 급성 및 만성 손상에 대한 가장 최근의 Banff 기준을 사용하여 블라인드로 점수를 매겼다. 급성 거부 반응(AR)은 최소, Banff Schema 당, 간질성(interstitial) 염증 점수≥1과 함께, 세뇨관염(tubulitis) 점수≥1로 정의되었다. 만성 동종 이식 손상(CAI)은 최소, 간질 섬유화(interstitial fibrosis) 점수≥1과 함께, 관 위축(tubular atrophy) 점수≥1로 정의되었다. BK 바이러스 신염(BKVN)은 동종 이식에서 소변 및 혈장 내 BK 바이러스의 존재 및 염증의 증명 및 양성 SV40 염색으로 확인되었다. 또한 급성 관 괴사(Acute tubular necrosis)를 진단하였다. 신우신염(Pyelonephritis)은 농뇨(pyuria) 및 세균성 요로 감염의 존재 및 세균성 패혈증에 대한 혈액 배양으로 정의된다. 안정한(STA) 동종 이식은 안정한 혈청 크레아티닌 수치를 갖고, 및 병리학적으로 주요한 손상이 없는 동종 이식으로 정의된다.
시료 수집 및 처리: 소변의 중간 부분 시료(50-100 mL)를 멸균 용기에 수집하고 그후 수집 1시간 이내에 2000 x g에서 20분간 상온에서 원심분리하였다. 세포 및 세포 파편을 포함하는 그 상층액을 소변 펠릿으로부터 분리하였다. 상층액의 pH는 TrisHCl을 이용하여 7.0으로 저정하였고, 추가적인 분석이 있기 전까지 -80℃에서 저장하였다. 소변 크레아티닌은 QuantichromTM Creatinine Assay Kit (DICT-500) (BioAssay Systems, Hayward, CA)를 이용하여 측정하였다. 각각의 소변 시료에 대한 총 단백질은 Coomassie Plus Beadford Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL)을 이용하여 측정하였다.
혈액 시료: dd-cfDNA의 평가를 위한 기증자 및 수혜자 DNA의 시퀀싱을 회피하기 위해, 남성 신장을 기증 받은 20명의 여성 수혜자의 첫 번째 평가 후 외삽법(extrapolation)에 의한 기증자 유래일 Y 염색체 cfDNA를 평가하는 모델을 사용하였다. 혈액 시료는 급성 거부 반응(AR, n=4) 생검 시점, 및 AR(n=16) 없는 시점에 수집하였다; AR 없는 시료는 급성 관 괴사(ATN, n=4), 세균성 패혈증 및 신우신염(n=4), 만성 동종 이식 손상(CAI; n=4) 및 안정한 이식 기능(n=4)으로 분류하였다. 전체 혈액을 소듐 헤파린 튜브(BD Biosciences, San Jose, CA)에 모았다. 세포(림프구)를 Ficoll(Ficoll-Pague PLUS, GE Healthcare, Waukesha, WI)을 이용하여 밀도 구배 원심 분리 방법에 기반하여 제거하였고, 혈장 분획은 피펫팅(pipetting)하여 -80℃에서 사용하기 전까지 냉동 저장하였다.
무세포 DNA 추출 및 정량화: 소변 및 혈장 시료로부터의 cfDNA를 QIAmp circulating nucleic acids kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 상온에서 완전한 해동 후 제거되는 소변 5 ml, 혈장 3 ml에서 수득하였다. 제조사의 프로토콜에 기재된 바와 같이, 이러한 시료들에 먼저 프로테이나제 K(공급됨)를 가하여 세포 파편들을 분해시키고 DNA아제 및 RNA아제를 제거한다. 이후 시료를 완충시키고 cfDNA의 침전을 돕기 위해 RNA 담체를 추가하였다. 이러한 용해물은 DNA 결합 칼럼을 통과하고, 이후 버퍼(공급됨) 및 100% 에탄올로 수회 세척하고 결합된 DNA를 50μl의 버퍼(공급됨)로 용출시킨다. 상기 DNA 함유 용출액은 DNA 정량화 및 디지털 PCR(dPCR)에 사용된다. 용출액 1μl를 제조사의 프로토콜에 기재된 바와 같이, Quant-iT Pico Green kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 1xTE 버퍼(공급됨)로 1/100 희석하여 이중가닥 cfDNA를 정량화하기 위해 사용하였다. 이는 각각의 웰 내에서 분광형광계(spectrofluorometer)(Gemini EM, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 판독되는 형광 산물을 갖는 Quant-iT 시약(검은 미세 적정 플레이트)의 1/200 희석제의 동등한 부피와 결합될 수 있다. 각각의 시료에 대한 농도(ng/ml)는 10배 표준 곡선(람다 DNA, 공급됨)과 비교하여 계산하였다.
무세포 DNA 측정: 디지털 PCR(dPCR)을 소변으로부터 추출된 dd-cfDNA 5ng을 사용하여 Biomark real-time PCR system (Fluidigm, South San Francisco, CA)으로 12.765 디지털 어레이 칩 상에서 수행하였다. 프라이머 및 표지된 프로브(IDT, Coralville, IA)는 하기에 따라 유래되었다: 1) 단일 복제 Y 염색체의 각각의 유전자좌 SRY(정방향 프라이머: 5'CGCTTAACATAGCAGAAGCA; 역방향 프라이머: 5'-AGTTTCGAACTCTCTGGCACCT; 프로브: 5'TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACA), 2) 다중 복제 Y 염색체의 각각의 유전자좌 DYS14(정방향 프라이머: 5'-ATCGTCCATTTCCAGAATCA; 역방향 프라이머: 5'-GTTGACAGCCGTGGAATC; 프로브: 5'-FAM-TGCCACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BHQ1); 3) 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1(정방향 프라이머: 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT; 역방향 프라이머: 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC; 프로브: 5'- HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1). 각각의 유전자좌의 복제 수는 추출된 시료의 ml 당 복제수에 대해 dPCR 분석 소프트웨어 v3.0으로 계산하였고, 측정된 소변 크레아티닌에 대하여 정규화(normalized)하였다. ALU 반복 수는 프라이머 및 표지된 프로브(IDT, Coralville, IA) (정방향 프라이머: 5'-GCC TGT AAT CCC AGC TAC TC-3'; Reverse primer: 5'-ATC TCG GCT CAC TGC AAC-3'; 프로브: 5'- 5HEXTTCA AGC GAT TCT CCT GCC TCA GC 3BHQ1-3')를 사용하여 정량적 PCR(qPCR)로 계산하였다. 표준 조건(95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 60℃에서 30초의 40사이클)하에서 ABI ViiA7(Applied Biosystems, Foster City, CA) 상의 qPCR 반응을 위한 표준 프로토콜을 사용하였다. 인간 게놈 DNA(Promega, WI)가 ALU 반복 수에 대한 교정 표준(calibration standard)으로서 사용되었다.
통계적 분석: 명목 임상 변수(Nominal clinical variable)를 독립 양측 꼬리 스튜던트 T-검정(unpaired two Students T-Test)(파라미터적) 또는 Mann-Whitney(비-파라미터적)을 사용하여 분석하였다. 카테고리적 임상 및 병리학적 데이터(Banff 점수≥1)를 양측 꼬리 p-값과 함께 Fisher 정확 검정을 이용하여 분석하였다. 상관 관계 분석은 상관 관계(correlation)≥0.3 및 p-값<0.05 유의 수준에서 Spearman's 순위 상관 계수(correlation coefficient)를 이용하여 수행하였다. GraphPad Prism(Graphpad Software Inc., La Jolla, CA)을 이용하여 계산한, 0.05 미만의 가능성이 모든 통계적 분석에서 유의한 것으로 고려되었다. 모든 수치는 다르게 명시되지 않는 한 평균±표준 편차로서 표현된다.
혈장 기증자 유래 무세포 DNA(dd-cfDNA)는 급성 신장 이식 손상에서 증가한다: 남성으로부터 이식받은 19명의 여성의 선택된 코호트에서, 안정한(STA) 이식 기능을 보이는 동안 측정된 혈장 dd-cfDNA 수치에 비교하여 AR시의 혈장 dd-cfDNA이 매우 많았다(다중-복제 유전자좌 DYS14/혈장 mL는 AR에서 3268±1917, 그에 비교하여 STA에서 1385±378이었다)(p=0.13)(도 7). 단일 유전자좌 1번 염색체 SRY를 평가하였을 때는 혈장 내 dd-cfDNA에 대한 신호가 거의 없었다. 혈장 내 단일 유전자좌 SRY 복제 수 검출을 3개의 분리된 혈장 시료에 대해 반복하였을 때, 3번 중 1번만 신호가 관찰되었고 계산된 평균 복제 수는 로딩된 DNA 시료 μL 당 0.65±1.12이었고, 반면 다중-유전자좌 DYS14에 대해선 동일한 시료 상의 복제 수가 82.82±73.52였다.
소변 내 dd-cfDNA의 분석: 이미 기재한 바와 같이, 혈장 내 단일 유전자좌 SRY의 검출은 불가능 하였다. 반면, Y 염색체의 유전자좌 SRY의 복제 수 분석에서의 dd-cfDNA에 대한 신호는 AR로 확인된 조직 생검에서 최고의 소변 중 양(urinary load)을 나타냈고, 소변 내 dd-cfDNA 양의 현저한 상승은 또한 ATN 및 BKVN과 같은 급성 신장 이식 손상을 갖는 다른 조건에서도 관찰되었다.
말기 신장 질병을 갖는 수혜자 본래의(native) 신장 조직은 비-기능적이다. 이를 염두에 두고, 단일-유전자좌 EIF2C1 1번 염색체 cfDNA(상염색체로부터의 cfDNA 양)을 동일한 20명의 여성 수혜자 또는 남성 신장 기증자에서 측정하였고, 그 결과, 시료와 유전자좌 SRY의 복제 수로부터 측정된 동일한 시료 내 소변 중 Y 염색체 dd-cfDNA로부터 얻어진 결과에 연관성이 있었다.
1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수 분석에 의해 결정된 소변 cfDNA 양은 거의 완전히 기증자로부터 유래된 것이다; Y 염색체 유전자좌 SRY 및 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1에 해당되는 소변 cfDNA는 매우 연관성이 있다(r=0.96, R2 0.88, p 값<0.0001; 도 8)
소변 1번 염색체 cfDNA 복제 수는 비-특이적 급성 신장 이식 손상과 연관이 있다. 소변 1번 염색체 cfDNA 양은 이후 다른 성별 조합으로 이루어진 37쌍의 기증자/수혜자의 독립적인 코호트에서 측정하였다. 표현형에 관계없이 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수는 중간 값이 0.97 및 범위가 0-21.57 복제 수/소변 크레아티닌μg인 넓은 편차가 있었다. AR 환자로부터의 소변 내 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수는 4.87±1.22 복제 수/소변 크레아티닌μg이었고, 이는 손상 없는 표현형(STA)으로부터의 소변 내 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수 0.93±0.15(p<0.0001)에 비교하여 유의하게 높았다. 그러나 AR 환자로부터의 소변 내 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수(4.87±1.22 복제 수/소변 크레아티닌μg)를 CAN 및 BKVN을 포함하는 다른 손상 표현형으로부터의 소변 내 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수(4.77 ± 1.07 copies/소변 크레아티닌μg)와 비교하였을 때는 0.94의 p 값을 갖는 0.93±0.15에서의 유의한 차이가 없었다. 급성 손상 표현형(예를 들면, AR 및 BKVN)으로부터의 소변 내 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수는 4.72±0.78 복제 수/소변 크레아티닌 μg이었고, 이는 p<0.0001의 0.93±0.15인 손상 없는 표현형(STA)으로부터의 소변 내 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수에 비교하여 유의하게 높았다(도 9a). ROC 분석은 손상 및 비-손상 표현형에 대한 ROC 곡선의 AUC가 0.0001 미만의 p-값을 갖는 0.77인 것을 보여준다. 1.15 복제 수/소변 크레아티닌 μg의 임계에서, 진양성율(민감도)는 77%, 특이도는 64%였다.
혈장 내 1번 염색체에 대해 dPCR을 수행했을 때, 상염색체 혈장 cfDNA가 기증자 및 수혜자 cfDNA의 혼합물임을 나타내는 데이터가 나왔다. 이식 손상에 대한 마커로서의 혈장 내 상염색체의 복제 수 값은 이식 손상이 있는 환자 및 이식 손상이 없는 환자의 혈장 내 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1 복제 수를 측정하여 평가하였다. AR 환자의 혈장 내 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수 12.34±0.97은 AR 없는 환자의 혈장 내 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수 10.25±0.71(p=0.13)과 유의하게 다르지 않았다. AR 환자의 혈장 내 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수는 만성 손상을 갖는 환자의 혈장 내 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1의 복제 수와 유의하게 다르지 않았다. AR 환자의 혈장 내 1번 염색체 복제 수와 손상 없는 환자의 혈장 내 1번 염색체의 복제 수를 비교한 경우에도 같았다.
소변 cfDNA는 급성 신장 이식 손상의 마커로서 소변 단백질의 크레아티닌에 대한 비율보다 더 낫다: 단백질뇨증은 이식 장애(dysfunction)의 훌륭한 마커이다. 소변 시료의 동일한 세트에서 총 단백질의 크레아티닌에 대한 비율을 분석하였다. 이식 손상군으로부터의 시료 내 소변 단백질의 크레아티닌에 대한 비율은 p-값 0.009에서 비-손상군(0.50±0.06)보다 손상 군(1.08±0.22)에서 더 높았다. 소변 단백질의 크레아티닌에 대한 비율에 대한 ROC 분석에서 0.66의 AUC 및 p-값 0.004의 결과가 나왔다. 0.45μg/소변 크레아티닌 μg의 임계에서, 진양성율(민감도)은 63%, 특이도는 64%였다(도 9). 크레아티닌에 대한 단백질 비율을 1번 염색체 유전자좌 EIF2C1 복제 수 데이터와 결합시켰을 때 AUC가 0.82로 향상되었고 p<0.0001 및 79% 민감도 및 68% 특이도였다.
소변 cfDNA는 신장 이식 조직학적 손상 및 신장 기능과 연관이 있다: 소변 cfDNA의 양이 기능적으로 이식에서의 조직 손상 및 기능적 동요(perturbation)와 연관이 있는지에 대한 평가에서, 손상 Banff 분류와 관계 없이, AR로부터의 소변 dd-cfDNA(Y 염색체 및 1번 염색체의 dPCR로 측정)와 다른 Banff 등급의 반-정량적 인 사구체의 조직학적 파라미터, 시간 일치 블라인드 생검 조직학의 관 및 조직간(interstitial) 손상 및 추정 사구체 여과율(eGFR)과 연관이 있었다. 소변 dd-cfDNA 복제 수/크레아티닌 mcg은 eGFR(p=7.70E-03, r=-0.28)및 염증의 일치 생검 조직학 마커(t-점수;p=1.3E-03, r=0.32), 및 사구체 염증 점수(g-점수; 2.30E-92, r=0.32)와 유의한 연관이 있었다.
소변 dd-cfDNA에 대한 dPCR의 양(burden)은 qPCR 측정된 소변 ALU 반복 수와 연관이 있다: 소변 내 총 염색체 DNA는 cfDNA로부터 ALU 반복 수를 측정하여 측정하였다. Y 염색체 및 1번 염색체에 의한 dd-cfDNA 측정은 ALU 반복 수 QPCR 분석(r=0.87; p<0.0001)에 의해 추정된 총 소변 cfDNA와 연관이 있다. 이러한 Y 염색체에 의해 추정된 dd-cfDNA 및 ALU 반복 수에 의한 총 cfDNA 사이의 연관성 때문에, ALU 반복 수 QPCR이 소변 시료의 독립적인 세트에 대해 수행되고 ALU 반복 수의 양은 일치 동종 이식 생검 Banff 점수에 의해 평가된 시료 표현형과 연관이 있었다.
ALU 반복 수 QPCR로 추정된 소변 총 cfDNA는 급성 신장 이식 손상의 지표이다: ALU 요소에 기반한 소변 내 게놈 DNA 복제 수를 모든 시료 표현형에 대해 계산하였다. ALU 분석 데이터로부터 계산된 게놈 균등물(genome equivalent: GE)에 기반할 때, 정상적인 신장 기능을 가진 건강한 정상 대조군(0.11±0.18 GE/소변 크레아틴 mg)과 비교하여 안정한 이식 환자의 소변 내 cfDNA의 양이 증가하였다(2.06±5.75 GE/소변 크레아틴 mg)(p=4.25x10-07). 상기 ALU 반복의 증가는 안정한 이식 기능을 갖고 및 정상적인 이식 조직학적 상태를 갖는 환자(STA;(2.06±5.75 GE/mg 소변 크레아틴))에 비교하여 AR로 확인된 생검시에 모아진 소변 시료에서 더 유의하게 높았다(10.55±25.43 GE/소변 크레아틴 mg)(p=0.002). BKVN과 같은 다른 급성 손상 표현형에 대한 소변 내 cfDNA의 증가 또한 STA 환자(p=0.04)의 그 수치보다 유의하게 높았다. 그러나 만성 및 다른 이식 손상 표현형을 갖는 환자의 cfDNA 양의 증가(5.85±23.24)는 안정한 이식 기능 및 정상적인 이식 조직학적인 상태를 갖는 환자의 프로토콜 생검보다 높았으나(STA;(2.06±5.75 GE/mg 소변 크레아틴)), 통계적으로 다르지는 않았다.(p=0.14).
이식 손상과 이식 손상이 아닌 시료의 ALU 분석에 기반한 cfDNA 데이터의 ROC 분석은 p-값 0.001의 AUC 0.73을 나타냈다.
소변 cfDNA의 일련의 분석은 이식 손상의 예측을 위한 민감한 모니터링 도구이다. 소변 내 cfDNA의 사용 가능성은 다른 환자들로부터 수집된 종단(longitudinal) 소변 시료의 분석에 의해 평가되었다. 모든 경우에서, AR 및 BKVN과 같은 급성 손상시 cfDNA의 양에서 뾰족한 점(spike)이 관찰되었다(도 10). 낮은 등급의 AR과 비교시 중증의 AR의 소변 내 cfDNA의 양의 증가가 있었다(도 10a). 모든 AR 발생 및 역류성 신병증과 같은 급성 손상의 다른 경우에서 안정한 이식 기능 및 다른 만성 손상과 비교하여 증가가 관찰되었다(도 10b). 높은 등급의 AR(Ⅱ 및 Ⅲ)에서 경계선(border line) 및 AR Ⅰ과 같은 낮은 등급의 AR과 비교하여 cfDNA의 현저한 증가가 있었다(도 10c). cfDNA의 양의 증가는 BKVN에서 더 높았고, cfDNA의 증가는 전-BKVN 소변에서 관찰될 수 있다(도 10d). 소변 내 cfDNA 양의 증가는 동일한 환자에서 AR 전 및 후와 비교하여 AR 발생 중에 증가하는 것이 관찰되었다. 3명의 환자(환자 #1, #2, 및 #3)의 AR 전 및 후의 소변 내 총 cfDNA를 평가하였고 이는 AR 발생 중 소변 내 cfDNA 양의 증가를 증명하였다(도 11).
비록 전술한 발명이 명확한 이해를 위한 목적으로 예시 및 실시예에 의해 상세히 설명되었지만, 사소한 변경 및 수정이 실시될 것임이 당업자에게 명확하다. 그러므로, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
<110> ORGAN-I, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR ASSESSING RENAL STATUS USING <130> PM032004 <150> US 61/793,427 <151> 2013-03-15 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 gttcggcttt caccagtct 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 ctccatagct ctcccactc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 cgccctgcca tgtggaagat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 gcctgtaatc ccagctactc 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 atctcggctc actgcaac 18 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 tcaagcgatt ctcctgcctc agc 23 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 ggaggctgag gcaggagaa 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 8 atctcggctc actgcaacct 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 9 cgcctcccgg gttcaagcg 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 10 atcgtccatt tccagaatca 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 11 gttgacagcc gtggaatc 18 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 12 tgccacagac tgaactgaat gattttc 27 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 13 cgcttaacat agcagaagca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 14 agtttcgaac tctggcacct 20 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 15 tgtcgcactc tccttgtttt tgaca 25 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 16 agtttcgaac tctctggcac ct 22 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 17 ttcaagcgat tctcctgcct cagc 24

Claims (77)

  1. 하기의 단계를 포함하는 개체의 신장 상태를 평가하기 위한 방법:
    a. 소변 시료 내 상염색체의 복제 수를 결정하는 단계, 및
    b. 상기 염색체의 복제 수를 정상군으로부터의 소변 시료 내 상기 염색체의 표준 복제 수와 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 복제 수의 변화는 변경된 신장 상태를 나타내는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 결정된 복제 수가 표준 복제 수보다 높은 경우 손상된 신장 상태를 나타내는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 손상된 신장 상태는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 거부 반응, 또는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료에 무반응인 상태를 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 신장 상태의 평가는 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응의 진행을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 신장 상태의 평가는 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응을 겪고 있고, 치료를 받고 있거나 또는 받았던 개체의 치료 반응(treatment response in and individual)을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 결정된 복제 수가 표준 복제 수와 동일 또는 낮은 경우 양호한 신장 건강을 나타내는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 무세포 DNA가 상기 소변으로부터 추출되는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 복제 수는 상기 소변으로부터 추출된 무세포 DNA에서 결정되는 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 복제 수는 실시간 PCR, 정량적 PCR, 또는 디지털 PCR을 이용하여 결정되는 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 복제 수는 BioMark 실시간 PCR 시스템을 이용하여 결정되는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 상염색체는 1번 염색체인 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 1번 염색체의 복제 수는 EIF2C1 유전자좌를 이용하여 측정하는 것인 방법.
  13. 청구항 8에 있어서, 상기 EIF2C1 유전자좌는 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT 및 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 측정하는 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 프라이머 세트는 실시간 PCR에서 사용되고 프로브를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 프로브는 하기의 서열 및 리포터를 포함하는 것인 방법: 5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1.
  16. 청구항 1에 있어서, 다른 병리학적 및 임상적 데이터의 측정을 더 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 방법은 크레아티닌의 양을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 방법은 단백뇨증 또는 cGFR을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 방법은 신장 생검(biopsy)을 수행하는 것을 포함하는 방법.
  20. 청구항 1에 있어서, 상기 개체는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응의 위험이 있는 개체인 것인 방법.
  21. 청구항 1에 있어서, 상기 개체는 당뇨병이 있는 개체인 방법.
  22. 청구항 1에 있어서, 상기 개체는 고혈압을 겪는 개체인 방법.
  23. 청구항 1에 있어서, 상기 개체는 동종 신장 이식의 수혜자인 것인 방법.
  24. 청구항 1에 있어서, 상기 개체는 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료를 받고 있는 개체인 방법.
  25. 청구항 1에 있어서, 상기 개체는 하나 이상의 급성 거부 반응 발생(episode)을 겪은 개체인 방법.
  26. 하기의 단계를 포함하는 개체의 신장 상태를 평가하기 위한 방법:
    a. 소변 시료 내 ALU 반복 수를 결정하는 단계, 및
    b. 상기 ALU 반복 수를 정상군으로부터의 소변 시료 내 표준 ALU 반복 수와 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 ALU 반복 수의 변화는 변경된 신장 상태를 나타내는 것인 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 ALU 반복 수가 표준 반복 수보다 높은 경우 손상된 신장 상태를 나타내는 것인 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 손상된 신장 상태는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 거부 반응, 또는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료에 무반응인 상태를 포함하는 것인 방법.
  29. 청구항 26에 있어서, 상기 신장 상태의 평가는 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응의 진행을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  30. 청구항 26에 있어서, 상기 신장 상태의 평가는 치료 반응 및 신장 질병, 신장 손상, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응을 겪고 있고 치료를 받고 있거나 또는 받았던 개체의 치료 반응(treatment response in and individual)을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  31. 청구항 26에 있어서, 상기 결정된 ALU 반복 수가 표준 반복 수와 동일 또는 낮은 경우 양호한 신장 건강을 나타내는 것인 방법.
  32. 청구항 26에 있어서, 무세포 DNA가 상기 소변으로부터 추출되는 것인 방법.
  33. 청구항 26에 있어서, 상기 ALU 반복 수는 상기 소변으로부터 추출된 무세포 DNA에서 결정되는 것인 방법.
  34. 청구항 26에 있어서, 상기 ALU 반복 수는 실시간 PCR, 정량적 PCR, 또는 디지털 PCR을 이용하여 결정하는 것인 방법
  35. 청구항 26에 있어서, 상기 ALU 반복 수는 BioMark 실시간 PCR 시스템을 이용하여 결정하는 것인 방법
  36. 청구항 26에 있어서, 상기 ALU 반복 수는 실시간 PCR을 이용하여 결정하는 것인 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 ALU 반복 수는 ALU 유전자좌의 115 염기쌍 증폭절(amplicon)을 이용하여 측정하는 것인 방법.
  38. 청구항 26에 있어서, 상기 방법은 동일한 시료 내 상염색체의 복제 수를 측정하는 것을 더 포함하는 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 1번 염색체의 복제 수가 측정되는 것인 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 1번 염색체의 복제 수는 EIF2C1 유전자좌를 이용하여 측정하는 것인 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 EIF2C1 유전자좌는 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT 및 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 측정하는 것인 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 프라이머 세트는 실시간 PCR에서 사용되고 프로브를 더 포함하는 것인 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 프로브는 하기의 서열 및 리포터를 포함하는 것인 방법: 5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1.
  44. 청구항 26에 있어서, 다른 병리학적 및 임상적 데이터의 측정을 더 포함하는 것인 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 방법은 크레아티닌의 양을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  46. 청구항 44에 있어서, 상기 방법은 단백뇨증 또는 cGFP을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  47. 청구항 44에 있어서, 상기 방법은 신장 생검을 수행하는 것을 포함하는 방법.
  48. 청구항 26에 있어서, 상기 개체는 신장 피해, 신장 손상, 신장 질병, 신장 질환, 신장 이식 손상, 또는 신장 이식 거부 반응의 위험이 있는 개체인 것인 방법.
  49. 청구항 26에 있어서, 상기 개체는 당뇨병이 있는 개체인 방법.
  50. 청구항 26에 있어서, 상기 개체는 고혈압을 겪는 개체인 방법.
  51. 청구항 26에 있어서, 상기 개체는 동종 신장 이식의 수혜자인 것인 방법.
  52. 청구항 26에 있어서, 상기 개체는 신장 이식 손상 또는 신장 이식 거부 반응에 대한 치료를 받고 있는 개체인 방법
  53. 청구항 26에 있어서, 상기 개체는 한번 이상의 급성 거부 반응 발생(episode)을 겪은 개체인 방법.
  54. 하기를 포함하는 진단 분석 키트:
    a. 시료로부터 하나 이상의 상염색체의 복제 수를 결정하기 위한 시약;
    b. 상기 복제 수를 결정하기 위해 사용되는 프라이머 세트; 및
    c. 상기 분석의 이용을 위한 지시서(instruction).
  55. 청구항 54에 있어서, 시료로부터 무세포 DNA를 추출하기 위한 시약을 더 포함하는 것인 키트.
  56. 청구항 54에 있어서, 상기 시료는 소변을 포함하는 것인 키트.
  57. 청구항 54에 있어서, 상기 상염색체는 1번 염색체인 것인 키트.
  58. 청구항 57에 있어서, 상기 프라이머 세트는 유전자좌 EIF2C1의 증폭절을 증폭시킬 수 있는 세트인 것인 키트.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT 및 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC를 포함하는 것인 키트.
  60. 청구항 54에 있어서, 상기 프라이머 세트는 실시간 PCR, 정량적 PCR, 또는 디지털 PCR에 사용될 수 있는 것인 키트.
  61. 청구항 59에 있어서, 상기 프라이머 세트는 디지털 PCR에 사용될 수 있는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  62. 청구항 61에 있어서, 상기 프로브의 서열은 하기의 서열 및 리포터를 포함하는 것인 키트: 5'- HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1.
  63. 하기를 포함하는 진단 분석 키트:
    a. 시료 내 ALU 반복 수를 결정하기 위한 시약;
    b. 상기 ALU 반복 수를 경정하기 위해 사용되는 프라이머 세트; 및
    c. 상기 분석의 이용을 위한 지시서.
  64. 청구항 63에 있어서, 시료로부터 무세포 DNA를 추출하기 위한 시약을 더 포함하는 것인 키트.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 시료는 소변을 포함하는 것인 키트.
  66. 청구항 63에 있어서, 상기 프라이머 세트는 ALU 유전자좌의 115 염기쌍 증폭절을 증폭시킬 수 있는 것인 키트.
  67. 청구항 66에 있어서, 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 5'-GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3' 및 역방향 프라이머 5'-ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'를 포함하는 것인 키트.
  68. 청구항 63에 있어서, 상기 프라이머 세트는 실시간 PCR, 정량적 PCR, 또는 디지털 PCR에 사용될 수 있는 프라이머 세트.
  69. 청구항 67에 있어서, 상기 프라이머 세트는 디지털 PCR에 사용될 수 있는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  70. 청구항 69에 있어서, 상기 프로브의 서열은 하기의 서열 및 리포터를 포함하는 것인 키트: 5'-HEX-TCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3'
  71. 청구항 63에 있어서, 상기 키트는 상염색체의 복제 수를 측정할 수 있는 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  72. 청구항 71에 있어서, 상기 상염색체는 1번 염색체인 것인 키트.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 프라이머 세트는 유전자좌 EIF2C1의 증폭절을 증폭시킬 수 있는 것인 키트.
  74. 청구항 73에 있어서, 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT 및 역방향 프라이머 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC를 포함하는 것인 키트.
  75. 청구항 74에 있어서, 상기 프라이머 세트는 실시간 PCR, 정량적 PCR, 또는 디지털 PCR에 사용될 수 있는 것인 키트.
  76. 청구항 74에 있어서, 상기 프라이머 세트는 디지털 PCR에 사용될 수 있는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  77. 청구항 76에 있어서, 상기 프로브의 서열은 하기의 서열 및 리포터를 포함하는 것인 키트: 5'- HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1.
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