RU2719411C1 - Способ определения предрасположенности к нарушению репродуктивной функции у женщин в условиях избыточной контаминации фенолом - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, в частности к области гинекологии, молекулярной биологии и генетики, а именно к определению предрасположенности к нарушению репродуктивной функции у женщин в условиях избыточной контаминации фенолом. Для этого производят отбор проб крови у пациентки, определяют в пробе содержание фенола и уровень иммуноглобулина G (IgG) к фенолу, также у указанной пациентки отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма гена актинина ACTN3, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена актинина ACTN3 (rs1815739), устанавливая при этом для указанного гена ACTN3 (rs1815739) гетерозиготное С/Т, нормальное гомозиготное С/С, вариантное гомозиготное Т/Т состояние генотипа, и при одновременном обнаружении следующих диагностических критериев: наличие вариантного гомозиготного Т/Т или гетерозиготного С/Т генотипов гена ACTN3 (rs1815739). При условии одновременного превышения концентрации фенола в крови более чем в 2,5 раза по сравнению с референтным уровнем содержания фенола в крови, равным 0,01 мкг/см³, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к фенолу, делают вывод о предрасположенности женщины к нарушению репродуктивной функции в условиях избыточной контаминации фенолом. Изобретение обеспечивает достоверность оценки влияния фенола на реализацию предрасположенности к нарушениям репродуктивной функции у женщины. 1 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к области гинекологии, молекулярной биологии и генетики, и может быть использовано, в акушерстве и гинекологии при определении риска развития нарушений репродуктивной функции у женщин в доклинический период, проживающих в неблагоприятных условиях окружающей среды, способствующих формированию избыточной контаминации биологических сред фенолом.

Под репродуктивной функцией женщин в рамках настоящего изобретения понимается способность женского организма к зачатию и вынашиванию плода (беременности).

Репродуктивная система уязвима в отношении воздействия ксенобиотиков, а изменения, затрагивающие генетический материал генеративных клеток, приводят к серьезным патологиям плода, проявляющимся в виде мертворождений, врожденных пороков развития или отдаленных эффектов. Изучение генов, контролирующих активность ферментов микросомальной монооксигеназной системы, может выявить предрасположенность к заболеваниям репродуктивной системы, вызванным действием токсичных факторов.

Репродуктивное здоровье женщин, будучи важнейшей медико-социальной проблемой, в настоящее время довольно детально исследуется и с социальной, и с экономической, и с психологической, и с экологической, и с медицинской точек зрения. Медицинский аспект проблемы предусматривает изучение рисков нарушений репродуктивной функции, связанных с гормональными сдвигами, иммуногенетическими признаками, отклонениями в функциональном состоянии клеток и молекулярных факторов иммунной системы, развитием аутоиммунного компонента, влияющего на течение и исходы беременности. Проблема указанных нарушений на протяжении десятилетий продолжает оставаться актуальной в гинекологии.

Для задач оценки степени воздействия среды обитания на здоровье женщины, ранней диагностики нарушений здоровья, а также для выбора эффективной профилактики, актуальным является выделение маркерных показателей конкретных заболеваний или их предвестников под воздействием фенола, которые могут быть использованы в качестве индикаторов возможного нарушения репродуктивного здоровья и в качестве дополнительных диагностических критериев санитарно-эпидемиологической обстановки.

Фенол относится к гормоноподобным ксенобиотикам или «репротоксикантам». Благодаря своей «кольцевой» химической структуре, эти вещества (гидроксибензолы) способны связываться со специфическими рецепторами половых стероидов, маскируясь под естественные половые гормоны. Гормоноподобные ксенобиотики являются деструкторами эндокринной функции, запускающие целый каскад реакций, в конечном итоге способных вызвать нарушения в репродуктивной сфере и как следствие развитие феномена невынашивания беременности с сопутствующей патологией в виде эндометриоза и лейомиомы матки.

Из уровня техники известен целый ряд технических решений, посредством которых возможно диагностировать нарушение репродуктивной функции у женщин.

Из патента Украины UA №68686 известен метод определения нарушений репродуктивной функции при воздействии вредных факторов окружающей среды. Согласно этому способу, испытания проводили на беременных лабораторных мышах, которых подвергали внешнему вредному воздействию - облучению, и было установлено, что в случае, если в такие биохимические характеристики амниотической жидкости, как уровень липидов и антиоксидантной активности выходит за пределы физиологической нормы, то диагностируют нарушение репродуктивной функции через преждевременные роды.

Также известен ряд источников информации о способах прогнозирования нарушения репродуктивной функции, основанные на генетических данных.

Из патента РФ №2662918 известен способ прогнозирования нарушений репродуктивного здоровья у женщин фертильного возраста. Способ включает определение процента CD3+CD8+, CD16+CD56+, CD19+клеток среди лимфоцитов крови, уровней в сыворотке крови IgG иммуноглобулинов, IgG-аутоантител к β₂ гликопротеину-1, пролактина, эстрадиола, общего тироксина, кортизола. Рассчитывают Интегральные Маркеры Нарушений Репродукции (ИМНР1 и ИМНР2) по формулам: ИМНР1=0,257*[ЦТЛ]+0,266*[ЕК]+0,122*[В]+0,107*[IgG]+0,209*[AT β₂-ГП], где ЦТЛ - % CD3+CD8+клеток среди лимфоцитов крови, ЕК - % CD16+CD56+клеток среди лимфоцитов крови, В - % CD19+клеток среди лимфоцитов крови, IgG - уровень иммуноглобулина класса G в мг/мл сыворотки крови, AT β₂-ГП - уровень IgG-аутоантител к β₂-гликопротеину-1 в ЕД/мл сыворотки крови. ИМНР2=0,341*[ПЛ]+0,257*[Е₂]+0,184*[Т4]-0,153*[КТ], где ПЛ - уровень пролактина в нмоль/л сыворотки крови; Е₂ -уровень эстрадиола в пмоль/л сыворотки крови; Т4 - уровень общего тироксина в нмоль/л сыворотки крови; КТ - уровень кортизола в нмоль/д. При значениях ИМНР1>11,5 и/или ИМНР2>85 женщину относят к группе риска по нарушению репродуктивного здоровья.

Недостатком указанного способа является использование набора тестов, указывающих на вероятность репродуктивных нарушений в целом, не затрагивающих такой аспект нарушений репродукции, как невынашивание. Кроме того реализация способа не предполагает использование генотипирования, как приоритетную технологию оценки предрасположенности, а также не раскрываются и не анализируются экзогенные причины, реализующие предрасположенность к репродуктивным нарушениям, например избыточная контаминация фенолом.

Из патента РФ №2592204 известен способ раннего прогнозирования невынашивания беременности. Способ включает выделение РНК из эпителиальных клеток цервикального канала у женщин, проведение обратной транскрипции с получением мРНК, определение экспрессии CASP-3α (отн. ед.) и СОХ-2 с помощью количественной полимеразной цепной реакции и расчет у₁ и у₂ по уравнениям линейной дискриминантной функции следующего вида:

y₁=-0,8383+155,755*x₁+27,2986*x₂,

у₂=-207,714+3007,030*х₁+533,609*х₂,

где x₁ - уровень экспрессии мРНК CASP-3α (отн. ед.), х₂ - уровень экспрессии мРНК СОХ-2 (отн. ед.). Прогнозируют развитие невынашивания беременности ранних сроков, если y₁ больше у₂. Прогнозируют прогрессирование беременности в случае, если у₂ больше, чем y₁. Предложенное изобретение позволяет эффективно прогнозировать невынашивание беременности в 92,10% случаев. Однако данный способ не учитывает угрозу невынашивания в условиях экспозиции гормоноподобных ксенобиотиков (в частности, фенолов), корректирующих течение беременности и формирующих особенности репродуктивных нарушений и прерывания беременности.

В патенте РФ №2532367 описан способ определения наследственной предрасположенности к развитию привычного невынашивания беременности. Осуществляют выделение геномной ДНК из образца крови обследуемого лица. Проводят генотипирование полиморфных вариантов 34V/L гена FXIII, М235Т гена AGT, 4а/b гена eNOS, PLA1/A2 гена GpIIIa и 353R/Q гена FVII. После установления генотипа по всем 5 генам определяют влияние выявленных аллелей на формирование предрасположенности к ПНБ путем подсчета суммарного балла по формуле и составляют заключение на основании обработки полученных данных. Значение суммарного балла <0,16 является основанием для отнесения обследуемого лица к группе с низким риском, значение от 0,16 до 0,40 баллов - к группе со средним риском, а значение >0,40 баллов - к группе с высоким риском формирования ПНБ. Предлагаемый способ позволяет выделить группы женщин низкого, среднего или высокого риска развития ПНБ, что необходимо для своевременной профилактики или коррекции выявленных нарушений до наступления беременности.

Из патента РФ №2552302 известен способ прогнозирования риска невынашивания беременности. Способ состоит в выделении ДНК из лейкоцитов периферической крови пациентки и проведении генотипирования. При выявлении генотипов C/G и G/G полиморфизма rs1052133 гена 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (OGG1) прогнозируют высокий риск невынашивания беременности.

Все указанные известные способы используют для прогнозирования невынашивания беременности только исследования генетического статуса пациенток и не применяют для диагностики нарушений тестирование факторов, реализующих генетический полиморфизм, таких как эндогенные (медиаторы нейро-гормональной регуляции) и экзогенные факторы (гормоноподобные ксенобиотики) факторы, ассоциированные с репродуктивной функцией.

Из уровня техники известен способ прогнозирования бесплодия у женщин - работниц нефтехимических производств (Патент РФ №2386133), который направлен на определение риска развития нарушений репродуктивной функции у работниц нефтехимического производства, подвергшихся комбинированному комплексному воздействию химических веществ. При этом, согласно способу, выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят генотипирование полиморфизма A2455G и Т3801С гена CYP1A1 и -163С/А и -2467delT гена CYP1A2. При обнаружении гаплотипа CYP1A1*2A, генотипа *1А*1А полиморфных локусов -163С/А и -2467delT гена CYP1A2, гаплотипа CYP1A2*ID прогнозируют развитие бесплодия. При определении гаплотипа CYP1A2*1L прогнозируют устойчивость к формированию бесплодия у работниц.

Однако указанный известный способ является узконаправленным и позволяет устанавливать лишь генетический полиморфизм системы цитохрома р450. Этим способом невозможно идентифицировать полиморфизм генов, отвечающий за нарушение регуляции сократительной функции матки, ассоциированной с катехоламинами, а также модификацию процесса формирования и течения беременности гормоноподобными ксенобиотиками.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы диагностирования нарушения репродуктивной функции у женщин в условиях избыточной контаминации фенолом, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении достоверности оценки влияния фенола на реализацию предрасположенности к нарушениям репродуктивной функции у женщины в виде предлагаемой комплексной тест-системы, сформированной на основе выявления молекулярно-генетического маркера (вариантный генотип гена ACTN3 (rs1815739)), самого гаптена (фенола), модифицирующего (усиливающего) экспрессию медиатора серотонина и течение беременности как эстрогеноподобный ксенобиотик, а также, наличия антител (IgG) к фенолу, верифицирующих его эффекты, с обеспечением возможности в последующем судить о развитии нарушений репродукции уже на ранних стадиях их формирования.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом определения предрасположенности к нарушению репродуктивной функции у женщин в условиях избыточной контаминации фенолом, согласно которому производят отбор проб крови у пациентки, определяют в пробе содержание фенола и уровень иммуноглобулина G (IgG) к фенолу, также у указанной пациентки отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма гена актинина ACTN3, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена актинина ACTN3 (rs1815739), устанавливая при этом для указанного гена ACTN3 (rs1815739) гетерозиготное С/Т, нормальное гомозиготное С/С, вариантное гомозиготное Т/Т состояние генотипа, и при одновременном обнаружении следующих диагностических критериев: наличие вариантного гомозиготного Т/Т или гетерозиготного С/Т генотипов гена ACTN3 (rs1815739), при условии одновременного превышения концентрации фенола в крови более чем в 2,5 раза по сравнению с референтным уровнем содержания фенола в крови, равным 0,01 мкг/см³, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к фенолу, делают вывод о предрасположенности женщины к нарушению репродуктивной функции в условиях избыточной контаминации фенолом.

Поставленный технический результат обеспечивается за счет следующего.

Благодаря своей «кольцевой» химической структуре, фенолы (гидроксибензолы) способны связываться со специфическими рецепторами половых стероидов, маскируясь под естественные половые гормоны. Гормоноподобные ксенобиотики фенолы являются деструкторами эндокринной функции, запускающие целый каскад реакций, в конечном итоге способных вызвать нарушения в репродуктивной сфере и, как следствие, развитие феномена невынашивания беременности с сопутствующей патологией в виде миомы матки.

Влияние гормоноподобных ксенобиотиков имеет многообразные проявления, что обусловлено полиморфностью инициируемых ими регуляторных механизмов, их цикличностью, а также дисбалансом звеньев «гипоталамус-гипофиз-яичники» [Никитин А.И. Гормоноподобные ксенобиотики и их роль в патолгии репродуктивной функции человека/ Экология человека. №2. 2006. С. 17-23; Никитин А.И. Гормоноподобные загрязнители биосферы и их влияние на репродуктивную функцию человека/ Междисциплинарный научный и прикладной жирнула «биосфера». 2009. С. 218-229; Червов В.О., Артымук Н.В., Данилова Л.Н. Гормоноподобные ксенобиотики и гинекологические проблемы. Обзор литературы/Мать и дитя в Кузбассе. №2(73).2018. С. 20-26].

Референтное значение фенола в крови составляет 0,01 мкг/см³.

В качестве диагностического критерия диагностики формирования нарушений репродуктивной функции у женщин, например, в виде невынашивания беременности, в условиях избыточной контаминации фенолом, рекомендуется использовать измененный генотип гена актинина ACTN3 (rs1815739).

Актинин ACTN3 - это глобулярный белок, из которого образованы микрофиламенты, один из основных компонентов цитоскелета эукариотических клеток. Актинин состоит из 376 аминокислотных остатков, с молекулярной массой около 42-kDa диаметром 4-9 нм, его С-конец является щелочным и образован фенилаланином, участвующим в синтезе катехоламинов (серотонин, окситоцин), изоформа - альфа-актинин (Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах. Т. 2. Пер. с англ.: - М.: Мир, 1993. - 415 с.). Актинин гладкой мускулатуры несколько отличается по аминокислотной последовательности от актина скелетных мышц, но функциональное значение этих отличий неизвестно.

Ген ACTN3 регулирует синтез альфа-актинина-3 - белка, связывающего актиновые филаменты в быстрых мышечных волокнах и стабилизирующего сократительный аппарат на Z-линии в быстрых волокнах скелетных мышц. Мутация в гене приводит к появлению кодона преждевременного прекращения, который отменяет продукцию протеина альфа-актинина. [Harada N., Hatakeyama A., Okuyama М., Nakagawa., Tsutsumi R., Nakaya Y., Sakaue H. Readthough of ACTN 577X nonsense mutation produces full-length a-actinin-3 protein/ Biochem Biophys Res Commun, - 2018. - pp. 422-428].

Ген ACTN3 - ген структурного белка скелетных мышц α-актинина-3, для которого показана связь с проявлением физических качеств спортсменов. Например, об этом указано в патенте РФ №2414511, что генетическую предрасположенность к различным видам физических нагрузок и особенностей тренировочного процесса устанавливают путем анализа полиморфизма генов ACTN3 (R577X). Продукт этого гена отвечает за синтез α-актина-3, являющегося основным компонентом Z-линий мышечных саркомеров, который определяет развитие быстрых мышечных волокон II типа.

Серотонин - это один из основных нейромедиаторов, относится к биогенным аминам, классу триптаминов. Серотонин часто называют «гормоном хорошего настроения», однако он отвечает не только за уровень счастья, но еще и за ряд важнейших составляющих здоровой жизни, но и как катехоламин, за «физиологичность» течения гестационного периода у женщин.

Ассоциативные связи актинина и катехоламинов (серотонин, окситоцин) имеют важное значение для физиологического процесса гестации. Исследованиями установлено, что серотонин присутствует в гладкой мускулатуре и в скелетных мышечных волокнах [Suchismitra Chandara, Tingging Guo, Teresa Tolliver, Weiping Chen, Dennis L Murphy, Alexandra С McPherron. Effects of serotonin on skeletal muscle growth/ BMC Proc. -2012/-6 (Suppl 3)]. Исследование, где одновременно упоминались, но не связывались серотонин и актинин: Brian H.Ross. The psychology of learning and motivation.Vol. 64.2016.P.333. Ген ACTN присутствует в мышцах быстрого типа как и в гладкой мускулатуре, так и уровень серотонина ассоциирован и с физической активностью и с рефлекторной гормонассоциированной функцией гладкой мускулатуры, о чем сказано выше. "Серотонин облегчает двигательную активность, благодаря усилению секреции субстанции Р в окончаниях сенсорных нейронов путем воздействия на ионотропные и метаботропные рецепторы (Ашмарин и др., 2007)"-https://cyberleninka.ru/article/v/analiz-serotoninergicheskoy-sistemy-fiziologicheskih-i-psihofiziologicheskih-pokazateley-u-shkolnikov-s-raznymi-rezhimami. "Повышение концентрации глюкозы служит сигналом для высвобождения ряда нейротрансмиттеров - серотонина, норадреналина и др. и физиологически активных пептидов (эндорфинов, нейропептидаз)" https://cyberleninka.ru/article/v/ozhirenie-hronicheskaya-neinfektsionnaya-epidemiya, поскольку ACTN (актин) связан с уровнем глюкозы, прослеживается непрямая связь с серотонином.

Изучено влияние цитохалазина D, ингибитора полимеризации актина, на поглощающую активность транспортера серотонина (SET), чтобы выяснить, модулирует ли актиновый цитоскелет активность поглощения …."https://www.researchgate.net/publication/222917004_Involvement_of_the_actin_cvtoskeleton_ in_the_regulation_of_serotonin_transporter_SET_activity_Possible_mechanism_underlying_SET_regulation_by_protein_kinase_С "… исследования показали возможную роль α-актинина в адгезии транспортера серотонина путем опосредования образования α-актинин-серотониновых связей (Choi et al., 2008)…."

https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/alpha-actinin

Имеются публикации (англ), в которых упоминается одновременно серотонин и актинин, однако механизм взаимодействия авторам не ясен.

Фенол - техногенный эстроген. Эстрадиол блокирует моноаминооксидазу. Это приводит к накоплению моноаминов, в первую очередь серотонина, в синаптической щели. Основными биологическими эффектами эстрогенов (в первую очередь, они присущи эстрадиолу) являются: стимулирование развития матки и ее придатков, повышение сродства рецепторов к прогестерону, т.е. реализация прогестиновых эффектов невозможна без присутствия эстрадиола. Поэтому бесплодие и невынашивание может развиваться и при нормальном уровне прогестерона. Повышение эстрогенов - гиперплазия внутреннего слоя матки (гиперпластический процесс эндометрия); мастопатия - гиперплазия и нарушение равновесия между соединительнотканным и эпителиальными компонентами в молочной железе; поликистоз яичников. Эстрон - гормон который повышает вероятность развития гиперплазии (разрастания) внутреннего слоя матки, миомы и мастопатии (Эстрогены: основные функции в организме женщины:mabusten.com>estrogenyi_funktsii/44.html)

При высоком содержании фенола в биосредах и неизмененном полиморфизме гена актинина, фенолом блокируется, по принципу обратной связи, экспрессия эстрогенов и тормозится синтез тирозина (серотонин, окситоцин) из фенилаланина - стимуляция эндометрия не формируется. В том случае, если ген актинина полиморфно изменен, избыточные концентрации фенолов сами выступают в качестве адъювантов и, вызывая чрезмерную экспрессию катехоламинов, стимулируют эндометрий и вероятность выкидыша. Кроме того, раздражение эндометрия и миометрия эстрогеноподобными ксенобиотиками ведет к сценарию развития осложнений - сопутствующей патологии в виде миомы матки, что в дальнейшем ограничивает функцию репродукции, формируя бесплодие. В период 8-10 недели беременности, когда производство эстрогенов физиологически достигает своего пика, возрастает вероятность их аддитивного эффекта с мимикрирующими под эстрогены фенолами. А избыточная секреция серотонина, ассоциированная с генотипом Т/Т и С/Т альфа-актинина может привести к нежелательным репротоксичным результатам (невынашивание беременности).

При допустимом (референтном) содержании фенолов в крови полиморфно измененный ген актинина ACTN3 (rs1815739) приводит к угнетению экспрессии белка актинина и синтеза катехоламинов, а события невынашивания, если и имеют место, то определяются другими механизмами без инициации сопутствующей патологии в виде миомы и в дальнейшем «гинекологически» корректируются, заканчиваясь желанной беременностью.

В качестве критерия возникновения репродуктивных нарушений (невынашивание беременности) в условиях избыточной контаминации фенолом рекомендуется использовать измененный генотип (гетерозиготный, вариантный гомозиготный) гена актинина ACTN3 (rs1815739), отвечающего за сокращение мускулатуры через механизм синтеза из фенилаланина, являющегося рецептором альфа-актинина, катехоламинов, таких как серотонин и окситоцин, а в случае мутации (Т/Т; С/Т) и избыточного содержания контаминированного фенола, создаются условия для накопления катехоламинов, что приводит к феномену невынашивания, а в дальнейшем (или параллельно) к формированию осложнений в виде миомы матки, что приводит к бесплодию.

Совокупные проявления полиморфизма гена альфа-актинина, отвечающего за сокращению мускулатуры и синтез катехоламинов, а также контаминации биосред фенолом, напоминающего по структуре и выполняющего в какой-то мере функции эстрогенов, способствуют формированию репродуктивных нарушений. Фактором, характеризующим сам феномен нарушения репродуктивной функции, является серотонин, образующийся из тирозина, синтез которого опосредован участием аминокислоты фенилаланин, входящей в состав актина (альфа-актинина), регулирующего мышечные сокращения. Модулирующие данные процессы гидроксибензолы в данном изобретении будут характеризовать 2 критерия: содержание фенола в крови (более, чем в 2,5 раза выше референтного значения) и эффект его контаминации - уровень содержания IgG к фенолу (более 0,1 у.е.). Фактором вероятности репродуктивных нарушений будет служить измененный генотип гена актинина ACTN3 (rs1815739) (гетерозиготный, вариантный гомозиготный). Также подтверждающим показателем указанных нарушений служит нарастание уровней сывороточного серотонина более 80 нг/мл.

Таким образом, для установления вероятности формирования специфических репродуктивных нарушений в виде невынашивания беременности и бесплодия, ассоциированных с содержанием фенола в крови, рекомендуется использование методического подхода, основанного на определении генотипа кандидатного гена альфа-актининаЗ и в случае гетерозиготы или вариантной гомозиготы участков гена ACTN3 (rs1815739), отклонении от физиологической нормы содержания IgG специфического к фенолу в виде его гиперпродукции (более 0,1 у.е.), избыточном содержании фенола в крови, превышающем референтный уровень более, чем в 2,5 раза, прогнозируют наличие репродуктивных нарушений, выражающихся выкидышем и бесплодием с возможными в дальнейшем осложнениями в виде миомы матки, ассоциированных с контаминацией фенолом.

Применение данного способа позволит сформировать группу пациенток с повышенным риском развития заболеваний репродуктивной системы. Эти знания помогут разобраться врачу в конкретной клинической ситуации, вовремя назначить адекватную терапию, что послужит профилактикой дальнейшего прогрессирования/рецидивирования заболевания и улучшит качество жизни пациентки в целом.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала пробы крови, а также стандартных методик изучения генетических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Установление содержания химического контаминанта - фенола именно в крови обусловлено тем, что кровь является средой, имеющей реферируемые (фоновые) уровни в отношении техногенных химических веществ, а также стандартной средой используемой для протоколов интоксикаций, вызванных металлами.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведения генотипирования полиморфизма указанного гена ACTN3 (rs1815739).

Благодаря тому, что в заявляемом способе в качестве диагностических критериев предлагается использовать именно полиморфизм гена ACTN3 (rs1815739), обеспечивается точность диагностики. Поэтому по данным показателям можно судить о генетически детерминированном характере нарушений репродуктивного здоровья и разрабатывать в последующем индивидуальные программы профилактики и лечения.

Причем из уровня техники неизвестны методы выявления предрасположенности к риску нарушения репродуктивной функции в условиях избыточной контаминации фенолом с использованием именно полиморфизмов этого гена.

Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с полиморфным вариантом указанного гена, ассоциированных с генетическим дефектом, и врожденной чувствительностью к внешним факторам (например, фенол), одновременно с количеством химического токсиканта - фенола в крови, и превышением уровня IgG к фенолу по сравнению с физиологической нормой, будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния фенола на потенциальное развитие нарушения репродуктивной функции у женщины.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом 1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся избыточным содержанием фенолов в объектах окружающей среды как фактора риска здоровью, отличающуюся повышенным содержанием фенола в атмосферном воздухе и биологических средах. Исследования были проведены на территории одного из промышленных регионов Российской Федерации, характеризующейся наличием в атмосферном воздухе концентраций фенола, превышающих ПДК (более 1 ПДК).

2. На указанной территории проводят отбор группы женщин фертильного возраста (т.е. репродуктивного возраста), одной этнической популяции. Затем проводят отбор пробы крови у обследуемых пациенток для определения содержания фенола. Содержание фенола в крови определяют по Методике «Методы контроля. Химические факторы. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой», изложенной в МУК 4.1.1483-03, с использованием масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500 сх с октопольной реакционной ячейкой (USA). Устанавливают, имеется ли превышение концентрации этого контаминанта в пробе крови над его референтным уровнем (равен 0,01 мкг/см³).

3. Затем определяют в пробе крови содержание IgG к фенолу по методике: Зайцева Н.В., Беляев Е.Н., Долгих О.В. Способы диагностики сенсибилизации к низкомолекулярным химическим соединениям/ Методические рекомендации. - М., 2002. - С. 29. А также определяют в пробе крови содержание серотонина по методике иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора DRG C-Peptide ELISA (EIA-1293).

4. Также у пациентки отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки). После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК гена ACTN3 (rs1815739).

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния гена у отдельной пациентки готовят реакционную смесь. В пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранного гена ACTN3 (rs1815739) (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма указанного гена ЗАО «Синтол», Россия). В пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KC1, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап -активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранного гена по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена в исследуемом участке ДНК (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние гена.

5. И при выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена ACTN3 (rs1815739), при условии одновременного превышения концентрации фенола в крови более чем в 2,5 раза по сравнению с референтным уровнем содержания фенола в крови, равным 0,01 мкг/см³, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к фенолу, делают вывод о предрасположенности женщины к нарушению репродуктивной функции в условиях избыточной контаминации фенолом.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа выполнено обследование женщин при различных условиях по содержанию фенола в крови.

Были сформированы две группы: группа наблюдения, женщины с избыточным содержанием фенола в крови более 0,01 мкг/см, и группа сравнения, с содержанием фенола в крови равным и менее 0,01 мкг/см. В группу наблюдения вошли 65 женщин (средний возраст 35,2±3,7 года). В группу сравнения вошли 64 женщины (средний возраст 36,7±2,6 года). Группы исследования были сопоставимы по возрасту, этническому составу, патологии, социально-экономическому уровню, качеству и составу питания.

На территории проживания группы наблюдения отмечено превышение содержания фенола в атмосферном воздухе более 2,0 ПДК.

У всех обследуемых была взята проба венозной крови, исследование которой проводилось по вышеуказанной схеме. Также была взята проба буккального эпителия для установления по реакции ПЦР полиморфизма исследуемого гена.

Для доказательства достоверности заявляемых критериев диагностики предрасположенности к нарушению репродуктивной функции, ассоциированной с контаминацией фенолом, было установлено в пробе сыворотки крови содержание серотонина и IgG к фенолу. Эти показатели являются подтверждающим фактором избыточной нагрузки (контаминации) фенолом с одной стороны и с другой - мутации ACTN3 (rs1815739), которые формируют нарушения репродуктивной функции у женщин.

Данные, полученные в результате исследований, приведены в таблице 1.

Результаты приведены в таблице 1 в виде шести блоков, в каждом из которых показано различное сочетание полиморфизмов указанного гена, содержание фенола в крови, уровень IgG в сыворотке крови к фенолу и содержание серотонина в крови.

Данные, приведенные в указанной таблице 1, показывают, что при одновременном сочетании вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена ACTN3 (rs1815739), концентрации «виновного» фактора (фенола) в крови выше более, чем в 2,5 раза верхней границы референтной концентрации, т.е. более величины 0,01 мкг/см, и превышении выше физиологической нормы уровня IgG к фенолу (пациенты 1 -6), наблюдается повышение по сравнению с физиологической нормой содержания серотонина. А это значит, что при этом фиксируется реализация фенолом негативной генетической программы у женщины, выражающейся в риске формирования нарушения репродуктивной функции через проявление невынашивания, преждевременных родов, бесплодия. Было установлено, что 100% женщин, контаминированных фенолом, характеризовались невынашиванием беременности; у 80% наличием мимомы матки.

Тогда как при допустимом (на уровне референтной концентрации) содержании фенола в крови, даже в условиях наследования гетерозиготного или вариантного генотипа указанного гена (пациенты 7-9), уровень IgG к фенолу и содержание серотонина находятся в пределах физиологической нормы.

В случае превышения содержания фенола в крови даже более, чем 2,5 раза по сравнению с референтным уровнем, но при отсутствии полиморфных изменений указанного гена (пациенты 13-16), уровень IgG к фенолу и содержание серотонина находятся в пределах физиологической нормы.

У пациентов с нормальными гомозиготными генотипами гена ACTN3 (rs1815739) и уровнем фенола в крови в пределах референтной концентрации, содержание серотонина и IgG к фенолу находятся в пределах физиологической нормы (пациенты 19-21).

У пациентов 17-18, которые характеризуются превышением содержания фенола в крови более 0,01 мкг/см, превышением по сравнению с нормой уровня IgG к фенолу, но при этом не имеют полиморфизм гена ACTN3 (rs1815739), вывод о предрасположенности к нарушению репродуктивной функции не диагностирован, при этом содержание серотонина находится в пределах нормы, что указывает на отсутствие необходимых генетических условий (предрасположенности) для реализации имеющегося воздействия фенола в виде невынашивания.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам одного возраста и этнической принадлежности из группы с повышенным содержанием фенола в крови и с содержанием фенола в крови в пределах референтной концентрации.

Пример 1. Пациентка, 36 лет, русская, невынашивание беременности, бесплодие, миома матки. Установлен уровень фенола в крови более чем в 4 раза выше референтного уровня - 0,042 мкг/см³. Установлено наличие вариантного гомозиготного генотипа гена ACTN3 (rs1815739) - Т/Т. Значение содержания IgG к фенолу: 0,431 у.е., т.е. в 4,3 раза выше верхней границы нормы. Содержание серотонина в крови -маркера катехоламиновой регуляции 132,8 нг/см³, т.е. выше диапазона нормы (40-80 нг/см³). Таким образом, установлены высокие значения уровня IgG к фенолу и избыток продукции серотонина на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 2,5 раза содержания фенола в крови, а также наличие полиморфизма вышеуказанного гена ACTN3, кодирующего протеин, ответственный за сокращение мышечных волокон и продукцию катехоламинов. Избыточный уровень фенола в биосредах ведет к формированию миомы матки (фибромиома или лейомиома), характеризующаяся доброкачественным разрастанием мышечной ткани, так как эстрогеноподобный гаптен (фенол) оказывает мощное влияние на деление клеток. Одновременно фенол вызывает избыточную продукцию катехоламинов (серотонина), которые во время беременности в период максимального физиологического накопления эстрогенов - 8-10 недель, провоцируют феномен невынашивания.

Это свидетельствует о том, что, согласно предлагаемому способу, у данной пациентки физиологический статус в условиях контаминации фенолом оценивается, как имеющий генетическую предрасположенность к формированию невынашивания беременности, реализующуюся в условиях избыточной контаминации фенолом с осложнениями в виде миомы и бесплодия.

Пример 2. Пациентка, 34 года, русская, условно здоровая. Установлен уровень фенола в крови более чем в 9 раз выше референтного уровня - 0,099 мкг/см³. Установлено наличие нормального (дикого) гомозиготного генотипа гена ACTN3 (rs1815739) - С/С.Значение содержания IgG к фенолу: 0,1 у.е., т.е. в границах нормы. Содержание серотонина в крови - маркера катехоламиновой регуляции 76,5 нг/см³, т.е. в диапазоне нормы (40-80 нг/см³). Таким образом, отсутствие полиморфизма вышеуказанного гена на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 2,5 раза, содержания фенола в крови, не приводит к развитию негативных эффектов в виде отклонения от нормы уровня IgG к фенолу и серотонина, то есть в отсутствии негативной генетической программы превышение референтной концентрации фенола в крови не сопровождается формированием репродуктивной патологии и не приводит к развитию миомы и бесплодия у данной пациентки.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых критериев обеспечивается его назначение.

Заявляемый способ позволяет с достаточной достоверностью установить предвестники нарушений репродуктивного здоровья у женщин, ассоциированные с влиянием фенола, по заявляемым генетическим критериям, содержанию фенола в крови и по уровню IgG к фенолу, и начать заблаговременно профилактические мероприятия. Особенно это актуально для женщин фертильного возраста, проживающих на территориях, отличающихся риском формирования избыточной контаминации биологических сред фенолом.

Claims (1)

1. Способ определения предрасположенности к нарушению репродуктивной функции у женщин в условиях избыточной контаминации фенолом, характеризующийся тем, что производят отбор проб крови у пациентки, определяют в пробе содержание фенола и уровень иммуноглобулина G (IgG) к фенолу, также у указанной пациентки отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма гена актинина ACTN3, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена актинина ACTN3 (rs1815739), устанавливая при этом для указанного гена ACTN3 (rs1815739) гетерозиготное С/Т, нормальное гомозиготное С/С, вариантное гомозиготное Т/Т состояние генотипа, и при одновременном обнаружении следующих диагностических критериев: наличие вариантного гомозиготного Т/Т или гетерозиготного С/Т генотипов гена ACTN3 (rs1815739), при условии одновременного превышения концентрации фенола в крови более чем в 2,5 раза по сравнению с референтным уровнем содержания фенола в крови, равным 0,01 мкг/см³, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к фенолу, делают вывод о предрасположенности женщины к нарушению репродуктивной функции в условиях избыточной контаминации фенолом.