MX2007009562A - Identificacion de marcadores de diagnostico moleculares para endometriosis en linfocitos sanguineos. - Google Patents

Abstract

La invencion comprende un metodo para identificar o predecir la predisposicion a endometriosis en un sujeto hembra que comprende determinar el nivel de expresion genetica de por lo menos un gen o proteina o peptido diferencialmente de leucocitos de sangre periferica en una muestra de leucocitos de sangre periferica o sangre periferica en un sujeto para proporcionar un primer valor, determinar el nivel de expresion genetica del por lo menos un gen o proteina o peptido expresado diferencialmente de los leucocitos en un control o estandar de referencia para proporcionar un segundo valor y comparar si hay una diferencia entre el primer valor y el segundo valor.

Description

IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES DE DIAGNOSTICO MOLECULARES PARA ENDOMETRIOSIS EN LINFOCITOS SANGUÍNEOS CAMPO DE LA INVENCIÓN El análisis de patrones de expresión genética de leucocitos de sangre periférica de pacientes con endometposis utilizando objetivos genéticos microarreglo de ADN-ídentificados para análisis de diagnostico no invasivos por esta enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La endometriosis es una enfermedad ginecológica bastante común, que afecta a tanto como el 10% de las mujeres en sus años reproductivos (Mahmood, T. A. y Templeton, A. 1991 Hum Reprod 6:544-549). La patogénesis de endometriosis es todavía desconocida y los mecanismos mediante los cuales las lesiones endometpoticas se establecen, avanza y migran a los sitios extrapelvicos no están bien entendidos (Witz, CA. et al. 2003 Hum Fértil 6:34-40). La diagnosis de endometriosis se lleva a cabo en general mediante inspección visual de la pelvis durante laparoscopia (Attaran, M. et al. 2002 Cleve Clin J Med 69:647-653). Este procedimiento de diagnostico depende de la experiencia del cirujano y por consiguiente es intrínsecamente inexacto. También, la invasividad y morbidez asociada del procedimiento laparoscopico impide su uso para verificar recurrencias y respuesta a la terapia. A pesar de la urgente necesidad de diagnosticar endometriosis no quirúrgicamente y tener una herramienta no invasiva para la prognosis y verificación de tratamiento, todavía no hay pruebas de laboratorio específicas basadas en la identificación de marcadores en sangre (Falcone, T. y Mascha, E. 2003 Fértil Steril 80:886-888). Además, las mujeres afectadas que sufren dolor crónico, severo, infertilidad y angustia mental tienen pocas opciones terapéuticas, ninguna de las cuales puede curar la enfermedad fundamental. La búsqueda de genes candidatos en los cuales basar una prueba endometriosis-específica ha probado ser desafiante. Por consiguiente, se tuvo como objetivo utilizar la tecnología de microarreglo de ADN para acelerar la identificación de biomarcadores moleculares para endometriosis. Los microarreglos de ADN están siendo usados incrementadamente para identificar perfiles de expresión genética asociados con enfermedades genéticas complejas tales como cáncer, diabetes y alteraciones cardiovasculares (Hughes, T.R. y Shoemaker, D.D. 2001 Curr Opin Chem Biol 5:21-25). Esta tecnología poderosa revela patrones específicos de enfermedad en expresión genética, acelerando mediante esto la identificación de genes candidatos (Albertson, D.G. y Pinkel, D. 2003 Hum Mol Genet 12:R145-52). A la fecha, han habido solamente cinco reportes en cuanto a la aplicación de microarreglos de ADN al descubrimiento de genes endometriosis-relacionados. Todos los cinco estudios han comparado perfiles de expresión genética de tejidos endometrióticos obtenidos durante laparoscopia contra endometrio normal, pero que se enfocan en aspectos diferentes de la enfermedad (esto es, infertilidad, endometriosis aguda y endometriomas de ovario) . En un estudio de Eyster et al. (2002), ocho de 4,133 genes analizados se mostró que son sobreexpresados en endometriomas en comparación con endometrio uterino correspondiente (Eyster, K.M. et al. 2002 Fértil Steril 77:38-42). Los genes sobreexpresados ya sea con elementos citoesqueletales (vimentina, ß-actina y a-2- actina), genes de mantenimiento (proteína ribosomal 40S S23) o proteínas inmune-relacionadas (cadena ligera Ig?, cadena H de línea de germinación Ig, complemento, Clase I de complejo de histocompatibilidad mayor). Los autores sugirieron que el nivel incrementado de expresión de proteínas citoesqueletales tales como vimentina podría explicar el potencial de invasividad de células endometrióticas y que la infiltración de células inmunes en los implantes endometriales podría tomar en cuenta la expresión observada de genes de inmunoglobulina. Arimoto y otros (2003) también usaron microarreglos de ADN para identificar perfiles de expresión genética de endometriomas de ovario (Arimoto, T. et al. 2003 Int J Oncol 22:551-560) . Entre los genes que mostraron ser regulados ascendentemente en cistos endometriales estuvieron los antígenos HLA, factores de complemento, proteínas ribosomales y factor de crecimiento transformante Bl (TGFBI) .

Los genes que fueron regulados descendentemente incluía TP53, proteínas de detención de crecimiento y proteína ADN-daño-inducibles (GADD34, GADD45A y GADD45B) , proteína p53-inducida (PIG11) y glicoproteína oviductal (0VGP1). Lebovic y colegas (2002) compararon los niveles de expresión genética de 597 genes humanos inducidos mediante IL-lß en biopsias de endometriosis contra endometriales normales (Lebovic, D.l. et al. 2002 Fértil Steril 78:849-854). Observaron que el régimen regulatorio de ciclo celular Tob-1 fue regulado descendentemente mediante IL-lß en células estromales ectópicas y sugirieron que la inhibición en la expresión de este gen puede promover el crecimiento de célula endometriótica . Kao et al. (2003) utilizaron microarreglos de ADN para analizar la base molecular de la infertilidad endometriosis-relacionada (Kao, L.C. et al. 2003 Endocrinology 144:2870-2881). Los genes que son normalmente regulados ascendentemente en el endometrio normal durante la ventana de implante se encontró que eran disminuidos en endometriosis incluían IL-15 (un promotor fuerte de proliferación y función de célula NK, proteína de enlace de complemento 4 (C4BP; que puede interferir con la señalización de nt al interactuar con LRP5) y glicodelina (que está bajo la regulación de progesterona y se ha sugerido que interfiere con la fertilización) . Finalmente, se ha mostrado recientemente que las lesiones de endometriosis profundas tienen expresión incrementada de receptor alfa de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRA), cinasa de proteína C beta 1 (PKCßl) y cinasa janus 1 (JAK1), proporcionando evidencia por la implicación de las rutas RAS/RAF EVIAPK en la patofisiología de endometriosis (Matsuzaki, S. et al. 2004 Mol Hum Reprod 10:719-728).

OBJETIVO DE LA INVENCIÓN El objetivo del presente estudio fue identificar diferencias en perfiles de expresión genética en linfocito sanguíneos de pacientes de endometriosis y controles. Aunque la sangre puede no ser el objetivo primario en endometriosis, hay alguna evidencia que esta enfermedad está asociada con un componente inflamatorio y puede ser verificado y aún evaluado en linfocitos de sangre periférica (Bedai y, M.A. et al. 2002 Hum Reprod 17:426-431). Aún si los linfocitos sanguíneos no están involucrados directamente en el proceso de enfermedad, se ha demostrado que los perfiles de expresión genética de estas células son indicadores y diagnóstico de estados de enfermedad (Tang, Y. et al. 2001 Ann Neurol 50:699-707). Así, se tiene la hipótesis de que la identificación de genes diferencialmente-expresados en linfocitos de sangre periférica revelará objetivos genéticos con utilidad en el entendimiento de la patogénesis de la enfermedad y muy importantemente, en el diseño de pruebas moleculares específicas, no invasivas que podría facilitar la diagnosis. Se reporta la identifica de objetivos genéticos que son contemplados que forman la base para diagnosis de endometriosis utilizando muestras de sangre.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención comprende un método para identificación o de predicción de la predisposición a endometriosis en un sujeto femenino que comprende determinar el nivel de expresión genética de por lo menos un gen o proteína o péptido expresado diferencialmente de leucocitos de sangre periférica en una muestra de leucocitos de sangre periférica o sangre periférica en un sujeto para proporcionar un primer valor, determinar el nivel de expresión genética del por lo menos un gen o proteína o péptido expresado diferencialmente de los leucocitos en un control o estándar de referencia para proporcionar un segundo valor y comparar si hay una diferencia entre el primer valor y el segundo valor. La invención comprende un método en donde se determina el nivel de expresión genética de un miembro del grupo que consiste de LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 y PDGF. La invención también comprende un método en donde el nivel de proteína o péptido comparado es incrementado o diminuido para un miembro del grupo que consiste de LOXL1, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2 2 , P4HA1 y PDGF.

La invención también comprende un método para verificar a un sujeto al que se ha identificado como tener endometriosis antes y después del tratamiento que comprende determinar el nivel de expresión genética de por lo menos un gen expresado diferencialmente de leucocitos de sangre periférica en una muestra de leucocitos de sangre periférica o sangre periférica en el sujeto antes del tratamiento que proporciona un primer valor, determinar el nivel de expresión genética de por lo menos un gen expresado diferencialmente de los leucocitos después de tratamiento que proporciona un segundo valor y comparar la diferencia en el nivel de expresión genética del sujeto antes del tratamiento y después del tratamiento . La invención comprende además un método para seleccionar agentes candidatos para uso en el tratamiento de endometriosis, que comprende poner en contacto una célula capaz de expresar por lo menos un gen expresado diferencialmente con un agente candidato ex vivo, determinar el nivel de expresión genética del por lo menos un gen expresado diferencialmente en la célula para proporcionar un primer valor, determinar el nivel de expresión genética del mismo por lo menos un gen expresado diferencialmente en una célula en ausencia del agente candidato para proporcionar un segundo valor y comparar el primer valor con el segundo valor, en donde la diferencia en el nivel de expresión genética es indicadora de un agente potencialmente capaz de ser usado para el tratamiento de endometposis . La invención comprende además un método de tratamiento o prevención de endometriosis, que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un agente que puede inducir una disminución o incrementar en el nivel de expresión genética, síntesis o actividad de por lo menos un gen expresado diferencialmente o producto de expresión genética. La invención comprende además un método de manufactura de un medicamento para el tratamiento o prevención de endometriosis que comprende una cantidad efectiva de un agente que puede inducir una disminución o incremento en el nivel de expresión genética, síntesis o actividad de por lo menos un gen expresado diferencialmente o producto de expresión genética. La invención comprende además un equipo para identificar o predecir la predisposición a endometriosis en un sujeto femenino que comprende medios para determinación el nivel de expresión genética de por lo menos un gen expresado diferencialmente de leucocitos de sangre periférica en una muestra de leucocitos de sangre periférica o sangre periférica en un sujeto para proporcionar un primer valor, determinar el nivel de expresión genética del por lo menos un gen expresado diferencialmente de los leucocitos en un control o estándar de referencia para proporcionar un segundo valor y comparar si hay una diferencia entre el primer valor y el segundo valor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la expresión de los nueve genes más discriminatorios a base de un programa de selección genética (arrayanalysis.nih.gov, véase ejemplo 1). Cada flecha representa un gen y cada columna representa una muestra. Para cada gen, el color rojo (gris oscuro) indica un nivel más alto de expresión en relación con la media, verde (gris claro) indica un nivel más bajo de expresión en relación con la media. La escala inferior indica el número de desviaciones estándar de la media. (ID de clon en cursivas no es un clon de IMAGEN. Los símbolos de UniGene/Gene son de UniGene build #173). La figura 2 muestra la expresión genérica relativa en pacientes con endometriosis contra controles normales. El eje y muestra la expresión relativa promedio (2~??Ct) de los nueve genes más discriminatorios, después de la normalización contra la expresión del gen de mantenimiento GAPDH. Los valores de p fueron calculados mediante pruebas t sin aparear de dos colas. ** p<0.001; *p< 0.01. La figura 3 muestra la expresión de mARN de genes en pacientes con endometriosis contra controles normales (Conjunto 1) .

La figura 4 muestra la expresión de mRNA de genes en pacientes con endometriosis contra controles normales (Conjunto 2) . La figura 5 muestra la expresión genérica relativa en pacientes con endometriosis contra controles normales (Conjunto 2) . La figura 6 muestra la comparación de expresión relativa del conjunto 1 contra el conjunto 2. La figura 7 muestra la expresión relativa (todos) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA El objetivo de este estudio fue identificar biomarcadores moleculares para endometriosis en linfocitos de sangre periférica utilizando microarreglos de ADN. Se realizó un estudio de caso-control como parte de un programa de investigación académico de múltiples centros. Mujeres pre-menopáusicas con o sin endometriosis, tal como se determina por especialistas de OB-GYN durante la cirugía, fueron analizadas. El análisis de microarreglos incluyó seis pacientes con endometriosis y cinco controles; 15 pacientes con endometriosis y 15 controles fueron analizados mediante RT-PCR en tiempo real. Los pacientes con todas las etapas de la enfermedad fueron incluidos. Los niveles de expresión de mARN en linfocitos de sangre de pacientes con endometriosis y controles fueron comparados con aquellos de un ARN total estándar. Los datos de expresión genética fueron validados mediante análisis de RT-PCR en tiempo real. Un programa de selección genética identificó genes que fueron expresados diferencialmente en muestras de pacientes con endometriosis. Para validar los datos de expresión genética, los nueve genes más discriminatorios fueron analizados mediante RT-PCR en tiempo real. Dos de los nueve genes identificados, receptor gamma de interleucina 2 (inmunodeficiencia combinada severa) (IL2RG), con secuencias de nucleótidos y aminoácidos, por ejemplo, Número de acceso de Genbank AY692262 y semejante a lisil oxidasa 1 (LOXLl) con secuencias de nucleótidos y aminoácidos, por ejemplo Número de acceso de Genbank BCO15090, fueron mostrados que son expresados diferencialmente de manera significativa. Este es el primer reporte de genes que son expresados diferencialmente en linfocitos de sangre periférica de pacientes con endometriosis, que puede proporcionar pistas importantes con respecto a la patogénesis de esta enfermedad. Además, se contempla como objetivos considerados para análisis de diagnóstico no invasivos para endometriosis y se contemplan como siendo validados en una población más grande. A no ser que se defina de otra manera, los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por aquel de habilidad ordinaria en el arte a la cual esta invención pertenece. Véase, por ejemplo Singleton P y Sainsbury D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3a Edición., J. Wiley & Sons, Chichester, New York, 2001; y The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991). "Expresión diferencial" en el contexto de la presente invención se refiere a productos de expresión transcritos y productos de expresión genética (por ejemplo proteínas o péptidos, mRNA, cADN) que son expresados en una cantidad diferente en leucocitos de sangre periférica de sujetos que tienen endometriosis en comparación con sujetos de control (por ejemplo, una persona con una diagnosis negativa o endometriosis indetectable, sujeto normal o saludable). "Transcripto" se refiere a una hebra de ácido nucleico que ha sido sintetizada utilizando otra hebra de ácido nucleico como plantilla. "Proteínas o polipéptidos o péptidos" de la presente invención son contemplados para incluir cualquier fragmentos de los mismos, en particular, fragmentos inmunológicamente detectables. Al de habilidad en el arte reconocería que las proteínas que son liberadas por las células se podrían degradar o escindir a tales fragmentos. Adicionalmente, ciertas proteínas o polipéptidos son sintetizados en una forma desactivada, que puede subsecuente ser activada mediante proteólisis. Tales fragmentos de una proteína particular pueden ser detectados como un subrogado por la proteína misma.

Las proteínas pueden ser secretadas (exportadas) o no secretadas. Las proteínas no secretadas pueden ser intracelulares (al interior de la célula) o sobre la superficie de la célula. El termino "muestra" como se usa en la presente se refiere a una muestra de un sujeto obtenida por el proposito de identificación, diagnosis, predicción o verificación. En ciertos aspectos de la invención, tal muestra puede ser obtenida por el proposito de determinar el resultado de una condición en marcha o el efecto de un régimen de tratamiento sobre la endometriosis . Las muestras de prueba preferidas incluyen sangre, suero o plasma. Ademas, aquel de habilidad en el arte se daría cuenta que algunas muestras de prueba serian analizadas más fácilmente enseguida de un procedimiento de fracción o purificación, por ejemplo separación de sangre entera en componentes de suero o plasma. El término "sangre" como se usa en la presente se refiere a ya sea a sangre entera sin fraccionamiento previo, leucocitos de sangre periférica, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) u otra subfracción de sangre. El termino "sangre periférica" se refiere a sangre en la circulación sistemica. Una diferencia en el "nivel de expresión genética" o en el "nivel de péptido" es una diferencia relativa. Por ejemplo, puede ser una diferencia en el nivel de expresión genética de una muestra tomada de un sujeto que tiene endometposis en comparación con sujetos de control o un estándar de referencia. Se puede efectuar una comparación entre el nivel de expresión genética en un sujeto en riesgo de endometriosis con un sujeto conocido que esta libre de una condición dada, esto es "normal" o "control". Alternativamente, se puede efectuar una comparación con un "estándar de referencia" conocido para estar asociado con un resultado bueno (por ejemplo la ausencia de endometriosis ) tal como un nivel promedio encontrado en una población de individuos normales que sufren de endometriosis . De acuerdo con la presente invención, se puede efectuar una comparación entre el nivel de expresión genética y la identificación o predisposición de un sujeto para desarrollar endometriosis . El nivel de expresión genética o el nivel de proteínas / peptidos presentes en un muestra que es probada puede estar ya sea en una cantidad absoluta (por ejemplo, µg/ml) o una cantidad relativa (por ejemplo, intensidad relativa de señales) . Una diferencia está presente entre las dos muestras si la cantidad de expresión genética o el nivel de proteínas / péptidos es significativamente diferente estadísticamente de la cantidad de expresión genética o el nivel de proteínas / peptidos en la otra muestra. Por ejemplo, hay una diferencia en expresión genética o en el nivel de proteínas / péptidos entre las dos muestras si la cantidad de expresión genética o el nivel de proteínas / peptidos esta presente en por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 100%, por lo menos aproximadamente 200%, por lo menos aproximadamente 400%, por lo menos aproximadamente 600%, por lo menos aproximadamente 800% o por lo menos aproximadamente 1000% mayor que esta presente en la otra muestra. La identificación o predicción de la predisposición a endometposis puede ser considerada como una técnica de diagnostico. Los métodos de diagnostico difieren en su sensibilidad y especificidad. El técnico experimentado frecuentemente efectúa una diagnosis, por ejemplo en base a uno o mas indicadores de diagnostico. En la presente invención, estos son los niveles de expresión de un gen expresado diferencialmente y/o los niveles de polipeptido del mismo. La presencia, ausencia o cantidad del gen expresado diferencialmente o el polipeptido del mismo es indicadora de la presencia, severidad o ausencia de la endometposis . Se pueden efectuar múltiples determinación de la expresión genica de uno o mas de los genes y/o de los niveles de polipeptido también como determinación de un cambio temporal en la expresión genética o abundancia de polipéptido que se puede usar para verificar el avance de la enfermedad o un tratamiento de la enfermedad. Por ejemplo, la expresión genética / abundancia de polipéptido puede ser determinada a un tiempo inicial y otra vez a un segundo tiempo. En tales aspectos un incremento de la expresión genética y/o nivel de polipéptido del tiempo inicial al segundo tiempo puede ser diagnóstico de endometriosis. Asimismo, una disminución en la expresión genética y/o nivel de polipéptidos desde el tiempo inicial al segundo tiempo puede ser indicadora de la sensibilidad de un sujeto a un tipo particular de tratamiento de endometriosis. Además, el cambio en expresión genética de uno o más genes puede estar relacionada con la severidad de endometriosis y eventos adversos futuros. En una modalidad de la invención, el nivel de expresión genética de por o menos un gen es determinado y/o el nivel de polipéptido del mismo. En una modalidad, el niveles de expresión genética de la lisil oxidasa-semejante 1 (LOXLl), por ejemplo Número de Genbank BC015090; receptor de interleucina 2, gamma (inmunodeficiencia combinada severa) (IL2RG), por ejemplo, Número de Genbank AY692262; proteína 5 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP5), por ejemplo, Número de Genbank AF064548; proteína básica de mielina (MBP), por ejemplo, Número de Genbank L18866; factor de necrosis de tumor (miembro de superfamilia TNF 2; TNF), por ejemplo, Número de Genbank BC028148; manosidasa, alfa, Clase 2A, miembro 2 (MAN2A2), por ejemplo, Número de Genbank NM_006122; procolágono-prolina, 2-oxoglutarato 4-dioxigenasa (prolina 4-hidroxilasa) polipéptido alfa 1 (P4HA1), por ejemplo Número de Genbank AK222960; o factor de crecimiento derivado de plaquetas D/proteína 1 inducible de daños de ADN (PDGFD), por ejemplo, Número de Genbank AF336376, es determinado y/o el nivel de polipéptido del mismo. En otra modalidad, el nivel de expresión genética de una pluralidad de LOXLl, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 y PDGF son determinados. El técnico experimentado comprenderá que, en tanto que en ciertos aspectos se efectúan mediciones comparativas de expresión genética del mismo gen en múltiples puntos en el tiempo, también se podría medir un gen dado en un punto en el tiempo y un segundo gen en un segundo punto en el tiempo y una comparación de la expresión genética de estos genes puede proporcionar información de diagnóstico o verificar el avance de la enfermedad. En un aspecto de la invención, la expresión genética de uno o más genes puede ser medida comparativamente a diferentes puntos en el tiempo. La frase "probabilidad de la presencia de endometriosis" como se usa en la presente se refiere a métodos mediante los cuales el experimentado en el arte puede predecir la condición en un sujeto. No se refiere a la habilidad de predecir la endometriosis con una exactitud del 100%. Por supuesto, el experimentado en el arte comprenderá que se refiere a una probabilidad incrementada de que la endometriosis estará presente o se desarrollara. Por ejemplo, es más probable que la endometnosis se presente en un sujeto que tiene altos niveles de expresión de IL2RG y/o niveles incrementados de polipéptido de IL2RG y/o niveles disminuidos de expresión de LOXLl y/o niveles disminuidos de polipéptido de LOXLl cuando se compara con un control o estándar de referencia, tal como un sujeto que no es afectado por o que tiene una predisposición a endometposis . En un aspecto de la invención, la probabilidad de la presencia de endometriosis es una probabilidad de aproximadamente 50%, una probabilidad de aproximadamente 60%, una probabilidad de aproximadamente 75%, una probabilidad de aproximadamente 90%, y una probabilidad de aproximadamente 95%. El termino "aproximadamente" en este contexto se refiere a ±1%. El técnico experimentado comprenderá que la asociación de un gen particular con una predisposición a endometposis es un análisis estadístico. Adicionalmente, un cambio en la expresión genética y/o nivel de péptido de niveles de referencia puede ser reflejante de prognosis del paciente y el grado de cambio en la expresión genética puede estar relacionado con la severidad de eventos adversos. La significancia estadística es frecuentemente determinada al comparar dos o más poblaciones y determinar un valor p. Los valores de p preferidos son 0.1, 0.05, 0.025, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001 y 0.0001. En un aspecto adicional, la invención es concerniente con equipos para la identificación de endometriosis en un sujeto. Estos equipos comprenden dispositivos y reactivos para medir la expresión genética y/o determinar los niveles de polipéptido en una muestra de un sujeto e instrucciones para efectuar el análisis e interpretar los resultados. Tales equipos contienen preferiblemente reactivos suficientes para efectuar una o más de tales determinaciones. La "sensibilidad" de un análisis de acuerdo con la presente invención es el porcentaje de individuos enfermos (aquellos con endometnosis ) quienes se prueban positivos (por ciento de "positivos verdaderos") . Los individuos enfermos no detectados por el análisis son "negativos falsos". Los sujetos que no están enfermos y que prueban negativos en el análisis son denominados "negativos verdaderos". La "especificidad" de un análisis de diagnóstico es 1 menos la proporción de positivos falsos, en donde la "proporción de positivos falsos" es definida como la proporción de aquellos sin la enfermedad que probaron positivos. En tanto que un método de diagnóstico particular puede no proporcionar una diagnosis definitiva de una condición, es suficiente si el método proporciona una indicación positiva que ayuda en la diagnosis.

Medición de expresión genética Numerosos métodos y dispositivos son bien conocidos para el experimentado en el arte para la detección y análisis de la expresión genética y medición de niveles de polipéptido de la presente invención. El termino "expresión genética" se refiere a la presencia o cantidad de un gen específico en los que se incluyen pero no limitados a, mARN, cADN o el polipéptido, peptido o producto de expresión de proteína de un gen específico. En un aspecto preferido de la invención, la expresión genética de LOXLl, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 y/o PDGF y/o el nivel de polipéptidos correspondientes son determinados. En una modalidad de la invención, la expresión genética es determinada al medir los niveles de ARN. La expresión genética puede ser detectada un análisis a base de PCR. Por ejemplo, PCR de transcpptasa inversa (RT-PCR) es usado para detectar la expresión de ARN. En RT-PCR, el ARN es convertido enzimáticamente a cADN utilizando una enzima de transcriptasa inversa. Luego el cADN es usado como plantilla para una reacción de PCR. Los productos de PCR pueden ser detectados mediante cualquier método apropiado en los que se incluyen pero no limitados a, electroforesis de gel y teñido con un teñido ADN-específico o hibridización a una sonda marcada. En todavía otro aspecto de la invención, la RT-PCR cuantitativa con mezclas estándar de plantillas competitivas puede ser utilizado. En otra modalidad de la presente invención, la expresión genética es detectada utilizando un análisis de hibridización . En un análisis de hibridización, la presencia o ausencia de biomarcador es determinada en base a la habilidad del ácido nucleico de la muestra para hibridizarse a una molécula de ácido nucleico complementaria, por ejemplo una sonda de oligonucleótido. Una variedad de análisis de hibridización están disponibles. En algunas modalidades de la invención, la hibridización de una sonda a la secuencia de interés es detectada directamente mediante visualización de una sonda enlazada, por ejemplo un análisis de Northern o Southern. En estos análisis, el ADN (Southern) o ARN (Northern) es aislado. Luego el ADN o ARN es escindido con una serie de enzimas de restricción que escinden infrecuentemente en el genoma y no cerca de ninguno de los marcadores que son analizados. Luego el ADN o ARN es separado, por ejemplo sobre un gel de agarosa y transferido a una membrana. Una sonda o sondas marcadas, por ejemplo al incorporar un radionucleótido, se permite que se ponga en contacto con la membrana bajo condiciones de severidad baja, media o alta. La sonda sin enlazar es removida y la presencia de enlace es detectada al visualizar la sonda marcada. En la presente invención, la expresión genética es determinada para LOXLl, IL2RG, LPR5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 y/o PDGF.

Arreglos de ácido nucleico Un agente de ácido nucleico comprende cualquier combinación de las secuencias de ácido nucleico generadas de o complementarias a transcriptos de ácido nucleico o regiones del mismo, en los que se incluyen la especie de transcriptos de ácido nucleico presentes en la sangre. Un microarreglo de acuerdo con la presente invención comprende preferiblemente entre 10, 100, 500, 1000, 5000, 10,000 o 15,000 miembros de ácido nucleico y más preferiblemente comprende por lo menos 5000 miembros de ácido nucleico. Los miembros de ácido nucleico son secuencias de ácido nucleico conocidas o nuevas descritas en la presente o cualquier combinación de los mismos. Un microarreglo de acuerdo con la invención es usado para realizar en cuanto a niveles diferenciales de especies de transcriptos de perfiles de expresión ARN presentes en muestras de sangre de pacientes saludables en comparación con pacientes con una enfermedad. Los microarreglos incluyen aquellos arreglos que abarcan transcriptos que son expresados en un individuo. En una modalidad, un microarreglo abarca transcriptos que son expresados en humanos. En otra modalidad, los microarreglos de la invención pueden ser ya sea arreglos a base de cADN o arreglos a base de oligonucleótidos.

RT-PCR en tiempo real cuantitativa En otro aspecto de la invención, el nivel de una o más especies de transcritos de la invención puede ser determinado utilizando métodos cuantitativos en los que se incluyen QRT-PCR, ARN de la sangre utilizando transcripción inversa cuantitativa (RT) en combinación con la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . El ARN total o mARN de la sangre es usado como plantilla y un cebador específico a la porción transcrita de un gen de la invención es usado para iniciar la transcripción inversa. El diseño del cebador se puede llevar a cabo utilizando elementos de programación disponibles comercialmente (por ejemplo, Primer Designer 1.0, Scientific Software etc.). El producto de la transcripción inversa es usado subsecuentemente como plantilla para PCR. La PCR proporciona un método para amplificar rápidamente una secuencia de ácido nucleico particular al utilizar múltiples ciclos de replicación de ADN catalizados por una polimerasa de ADN ADN-dependiente, termoestable, para amplificar la secuencia objetivo de interés. La PCR requiere la presencia de un ácido nucleico a ser amplificado, dos cebadores de oligonucleótidos de una sola hebra que flanquean la secuencia a ser amplificada, una ADN polimerasa, trifosfatos de desoxiribonucleósido, una solución reguladora del pH y sales. El método de PCR es bien conocido en el arte. PCR, es efectuado como se describe en Mullís y Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155:335. PCR es efectuada utilizando ADN de plantilla o cADN (por lo menos fg; más usualmente, 1-1000 ng) y por lo menos 25 pmol de cebadores de oligonucleótidos. Una mezcla de reacción típica incluye: 100 ng de ADN, 25 pmol de cebador de oligonucleótido, 2.5 µl de solución reguladora del pH 10X PCR (Perkin-Elmer, Foster City, CA) , 0.4 µl de dNTP 1.25 µM, 0.15 µl (o 2.5 unidades) de ADN polimerasa Taq (Perkin Elmer, Foster City, CA) y agua desionizada a un volumen total de 25 µl . Opcionalmente se supertiende aceite mineral y la PCR es efectuada utilizando un aparato ciclizador térmico programable. La duración y temperatura de cada etapa de un ciclo de PCR, también como el número de ciclos, son ajustados de acuerdo con los requerimientos de severidad en efecto. La temperatura y temporización de recocido son determinados tanto por la eficiencia con la cual se espera que un cebador se recoza a una plantilla y el grado de desadaptación que va a ser tolerado. La habilidad de optimizar la severidad de las condiciones de recocido del cebador está dentro del conocimiento de aquel de habilidad moderada en el arte. Se usa una temperatura de recocido de entre 30°C y 72°C. La desnaturalización inicial de las moléculas de plantilla ocurre normalmente a una temperatura de entre 92 °C y 99°C durante 4 minutos, seguida por 20-40 ciclos que consisten de desnaturalización (94°C-99°C durante 15 segundos a 1 minuto), recocido (temperatura determinada como se discute anteriormente; 1-2 minutos) y extensión (72°C por 1 minuto). La etapa de extensión final se lleva a cabo en general durante 4 minutos a 72°C y puede ser seguida por una etapa indefinida (0-24 horas) a 4°C. QRT-PCR que es cuantitativa por naturaleza puede también ser efectuado, utilizando ya sea transcripción inversa y PCR en un procedimiento de dos etapas o transcripción inversa combinada con PCR en un protocolo de una sola etapa para proporcionar una medida cuantitativa de un nivel de una o más especies de transcriptos de ARN en la sangre. Una de estas técnicas, para las cuales hay equipos disponibles comercialmente tales como Taqman©) (Perkin Elmer, Foster City, CA) , es efectuada con una sonda antisentido transcripto-específica. Esta sonda es específica para el producto de PCR (por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico derivado de un gen) y es preparada con una sonda apagadora y reportero fluorescente acomplejada al extremo 5' del oligonucleótido. Diferentes marcadores fluorescentes son anexados a diferentes reporteros, que permiten la medición de dos productos en una reacción. Cuando la Taq ADN polimerasa es activada, escinde los reporteros fluorescentes de la sonda enlazados a la plantilla en virtud de su actividad 5' a 3' exonucleasa. En ausencia de los apagadores, los reporteros ahora fluorescen. El cambio de color en los reporteros es proporcionar a la cantidad de cada producto específico y es medida mediante un fluorómetro; por consiguiente, la cantidad de cada color es medida y el producto de PCR es cuantificada. Las reacciones de PCR son efectuadas en cajas de 96 cavidades de tal manera que las muestras derivadas de muchos individuos son procesadas y medidas simultáneamente. El sistema de Taqman tiene la ventaja adicional de no requerir electroforesis de gel y permite cuantificación cuando es usada con una curva estándar. Una segunda técnica útil para detectar productos de PCR cuantitativa sin electroforesis es usar un tinte intercalador al como el PCR verde QuantiTec™ SYBR® (Qiagen, Valencia California). La RT-PCR es efectuada utilizando verde SYBR® como un marcador fluorescente que es incorporado al producto de PCR durante la etapa de PCR y produce una fluorescencia proporcional a la cantidad del producto de PCR. Ambos sistemas de Taqman® y AuantiTect™ SYBR® pueden ser usados subsecuentes a la transcripción inversa de ARN. Adicionalmente, otros sistemas para medir cuantitativamente el nivel de una o más especies de transcriptos son conocidos en los que se incluyen molécula Beacons que utiliza una sonda que tiene una molécula fluorescente y una molécula apagadora, la sonda capaz de formar una estructura de horquilla de tal manera que cuando está en la forma de horquilla, la molécula de fluorescencia es apagada y cuando es hibridizada, la fluorescencia se incrementa dando una medición cuantitativa de una o más especies de transcriptos de ARN.

Varios otras técnicas para detectar productos de PCR cuantitativamente sin electroforesis pueden también ser usadas de acuerdo con la invención (véase por ejemplo, PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y. , (1990) ) .

Medición de Expresión de Proteína En todavía otra modalidad de la invención, la expresión genética es determinada mediante medición de producto de expresión genética de polipéptidos. En un aspecto preferido de la invención, la expresión genética es medida al identificar la cantidad de uno o más polipéptidos codificados por los genes por LOXLl, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 y/o PDGF. La presente invención no está limitada por el método en el cual la expresión genética es detectada o medida. Una proteína o polipéptido o producto de expresión de péptido codificado por los genes para LOXLl, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 y/o PDGF puede ser detectado mediante un método apropiado. Con respecto a péptidos, polipéptidos o proteínas en muestras, se usa frecuentemente dispositivos y métodos de inmunoanálisis o prueba inmunológica. Estos dispositivos y métodos pueden utilizar moléculas marcadas en varios formatos de análisis emparedado, competitivos o no competitivos, para generar una señal que es relacionada con la presente o cantidad de un analito de interés. Adicionalmente, ciertos métodos o dispositivos, tales como biodetectores e inmunoanálisis ópticos pueden ser usados para determinar la presencia o cantidad de analitos sin la necesidad de una molécula marcada. La presencia o cantidad de una proteína o polipéptido o péptido se determinar en general utilizando anticuerpos específicos y detección de enlace específico. Cualquier inmunoanálisis o prueba inmunológica apropiada puede ser utilizada, por ejemplo inmunonálisis enzima-enlazados (ELISA) radioinmunoanálisis (RÍA), análisis de enlace competitivos y los semejantes. El enlace inmunológico específico del anticuerpo a la proteína o polipéptido puede ser detectado directa o indirectamente. Los marcadores directos incluyen etiquetas fluorescentes o luminiscentes, metales, tintes, radionúclidos y los semejantes anexados al anticuerpo. Los marcadores indirectos incluyen varias enzimas bien conocidas en el arte, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y los semejantes. El uso de anticuerpos inmovilizados específicos para las proteínas o polipéptidos es también contemplado por la presente invención. Los anticuerpos pueden ser inmovilizados sobre una variedad de soportes sólidos, tales como partículas de matriz magnéticas o cromatográficas, las superficie de una caja de análisis (tales como cavidades de microtitulación) , piezas de un material de sustrato sólido (tal como plástico, nylon, papel), y los semejantes. Una banda de análisis puede ser preparada mediante recubrimiento del anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos en un arreglo sobre soporte sólido. Luego esta banda puede ser sumergida a la muestra de prueba y luego procesada rápidamente por medio de etapas de lavado y detección para generar una señal mensurable, tal como un punto coloreado . El análisis de una pluralidad de genes y/o polipéptidos de la presente invención puede ser llevado a cabo separada o simultáneamente con una muestra de prueba. Además, aquel de habilidad en el arte reconocería el valor de probar múltiples muestras (por ejemplo, en puntos en el tiempo sucesivos) del mismo individuo. Tales pruebas de muestras en serie permite la identificación de cambios en la expresión genética y/o niveles de polipéptido con el paso del tiempo, incrementos o disminuciones en niveles de expresión genética, también como la ausencia de cambio en expresión genética y/o niveles de polipéptido, puede proporcionar información útil acerca del estatus de la enfermedad que incluye pero no está limitado a identificación del tiempo aproximadamente desde el inicio del evento, la presencia y cantidad de muestra salvable, la conveniencia de terapias de fármacos, la efectividad de varias terapias tal como se indica por la resolución de síntomas, diferenciación de los varios tipos de endometriosis, identificación de la severidad del evento, identificación de la severidad de la enfermedad e identificación del resultado del paciente, en los que se incluyen riesgo de eventos futuros. Un panel que comprende los genes a los que se hace referencia anteriormente puede ser construido para proporcionar información relevante concerniente con la diagnosis o prognosis de endometriosis y manejo de sujetos con endometriosis. Tal panel puede ser construido preferiblemente utilizando las secuencias de LOXLl, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 y/o PDGF. El análisis de un solo gen o subconjunto de genes que comprenden un panel más grande de genes solos o en combinación con el análisis de un solo polipéptido o un subconjunto de polipéptidos se puede llevar a cabo por aquel de habilidad en el arte para optimizar la sensibilidad o especificidad. El análisis de expresión genética y/o determinación de niveles de polipéptido se puede llevar a cabo en una variedad de formatos físicos también. Por ejemplo, el uso de cajas de microtitulación o automatización se podría usar para facilitar el procesamiento de números grandes de muestras de prueba de una manera de alto rendimiento. En otro aspecto de la invención, se proporciona un arreglo al cual sondas gue corresponden a secuencia a productos genéticos, por ejemplo cADN, mARN, cARN, polipéptidos y fragmentos de los mismos, pueden ser hibridizados específicamente o enlazados en una posición conocida. En una modalidad de la invención, el arreglo es una matriz en la cual cada posición representa un sitio de enlace discreto para un producto codificado por un gen por LOXLl, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2 y/o PDGF. En otro aspecto de la invención, el "sitio de enlace", de aquí en adelante en la presente "sitio", es un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico al cual un cADN cognato particular se puede hibridizar específicamente. El ácido nucleico o análogo del sitio de enlace puede ser, por ejemplo, un oligómero sintético, un cADN de plena longitud, un cADN menor de plena longitud o un fragmento de gen. • En otro aspecto, la presente invención proporciona un equipo para el análisis de expresión genética y/o niveles de polipéptido. Tal equipo comprende preferiblemente dispositivos y reactivos para el análisis de por lo menos una muestra de prueba e instrucciones para efectuar el análisis. Opcionalmente, los equipos pueden contener uno o más medios para convertir la expresión genética y/o cantidades de polipéptidos a una diagnosis o prognosis de endometriosis en un sujeto. La comparación del patrón de expresión genética del sujeto, con los controles o estándares de referencia, indicaría si el sujeto tiene endometriosis. En una modalidad de la invención, los equipos contienen anticuerpos específicos para por lo menos uno de LOXLl, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 y/o PDGF. En otras modalidades, los equipos contienen reactivos específicos para la detección de ácido nucleico, por ejemplo sondas de oligonucleótidos o cebadores. En algunas modalidades, los equipos contienen todos los componentes necesarios para efectuar un análisis de detección, en los que se incluyen todos los controles e instrucciones para efectuar análisis y para el análisis de los resultados. En una modalidad de la invención, los equipos contienen instrucciones en los que se incluyen una declaración del uso propuesto tal como se estipula por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos de América (FDA) o contraparte extranjera para la etiqueta de análisis de diagnóstico in vitro y/o productos farmacéuticos o alimenticios . En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para seleccionar agentes para uso en el tratamiento de endometriosis. En particular, los agentes que pueden inducir una disminución en el nivel de expresión genética, síntesis o actividad de IL2RG y/o inducir un incremento en el nivel de expresión genética, síntesis o actividad de LOXLl son contemplados. Por ejemplo, en una modalidad se podría primero tratar un sujeto de prueba que se sabe que tiene endometriosis con un agente de prueba y luego analizar una muestra representativa del sujeto en cuanto al nivel de expresión de los genes o secuencias que cambian en expresión en respuesta a la endometriosis y/o en cuanto al nivel de polipéptidos. Luego se compara el análisis de la muestra con un control que se sabe que tiene endometriosis pero al que no se le ha dado el componente de prueba e identifica mediante esto los compuestos de prueba que son capaces de modificar la expresión genética. En otra modalidad de la presente invención, se podría basar una terapia en las secuencias de LOXLl, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 y/o PDGF. Por ejemplo, se podría intentar disminuir la expresión de IL2RG e inducir un incremento en el nivel de LOXLl. Métodos para incrementar o disminuir la expresión de los genes serían conocidos para aquel de habilidad en el arte. Ejemplos para complementación de expresión incluirían suministrar al sujeto con copias adicionales del gen. Un ejemplo de disminuir la expresión incluiría tecnologías antisentido de ARN o intervención farmacéutica.

Identificación de Marcadores Moleculares para Endometriosis en Linfocitos de Sangre Utilizando Microarreglos de ADN Análisis de datos de microarreglo Los fueron analizados como se describe en el ejemplo 1. La diferencia de veces considerada como sobreexpresión fue ajustada a =2, como se usa en general en análisis de datos de microarreglos de ADN. Se analizaron un total de 15,097 clones de cADN (14,185 genes conocidos y 912 sitios de etiqueta de secuencia expresada) utilizando ARN total de linfocito de sangre periférica de pacientes y controles. Cada capacidad discriminadora del gen para separar los dos grupos fue determinada mediante estadística t {peso, véase Tabla 1). Los genes más discriminadores, tanto regulados ascendentemente como descendentemente, fueron enlistados. De aquellos genes que se encontraron que son sobreexpresados en pacientes contra controles, se seleccionaron nueve que tenían un peso mayor de 4 y una diferencia de proporción media mayor de 2.0 para análisis adicional (figura 1) . Estos son: el receptor de partícula de reconocimiento de señal, subunidad B (SRPRB); procolágeno-prolina, 2-oxoglutarato 4-dioxigenasa (prolina 4-hidroxilasa) polipéptido alfa 1 (P4HA1); semejante a lisis oxidasa 1 (LOXLl); receptor de interleucina 2, gamma (inmunodeficiencia combinada severa) (IL2RG); proteína 5 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP5); proteína básica de mielina (MBP) ; factor de necrosis de tumor (superfamilia TNF, miembro 2; TNF); manosidasa, alfa, Clase 2A, miembro 2 (MAN2A2); y factor de crecimiento derivado de plaquetas D/proteína 1 inducible de daños de ADN (PDGFD) (Tabla 1) . La expresión de todos los nueve genes fue =2 veces incrementada en linfocitos de sangre periférica de pacientes en comparación con los controles . Tabla 1: Microarreglo y análisis de RT-PCR en tiempo real relativo de genes en pacientes con endometriosis y controles .

" Los resultados mostrados son para seis pacientes contra cinco controles b Los resultados mostrados son para 15 pacientes contia 15 controles Los valores de peso discpminadores fueron determinados como se descpbe en el Ejemplo 1 Los valores p para los datos de RT-PCR en tiempo real fueron determinados utilizando pruebas t sin aparear de dos colas, la significancia fue ajustada a 0 05 Validación de datos de microarreglo utilizando RT-PCR en tiempo real La expresión de los nueve genes más discriminatorios fue evaluada adicionalmente en linfocitos de sangre de pacientes adicionales (N = 15) y controles (N = 15) utilizando RT-PCR en tiempo real. Los resultados son resumidos en la Tabla 1. Dos de los nueve genes identificados fueron confirmados que son expresados diferencialmente mediante RT-PCR en tiempo real: IL2RG fue regulado ascendentemente (6.49 veces; p = 0.0037) y LOXLl fue regulado descendentemente (0.06 veces; p = 0.0002) en pacientes contra controles (figura 2). Aunque LRP5, MBP, TNF, MAN2A2 y PDGFD fueron regulados ascendentemente más de 2 veces como se muestra mediante RT-PCR, la diferencia en niveles de expresión genética entre casos y controles no alcanzó significancia estadística.

Discusión En los pasados años el número de estudios dedicados a encontrar biomarcadores se ha incrementado extensamente (Colburn, W.A. 2003 J Clin Pharmacol 43:329-341; Frank, R. y Hargreaves, R. 2003 Nat Rev Drug Discov 2:566-580) . De acuerdo con mas mediciones del grupo de trabajo de biomarcadores, un biomarcador es "una característica que es medida y evaluada objetivamente como indicador de procesos biológicos normales, procesos patogénicos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica" (B omarkers Definitions Working Group 2001 Clin Pharmacol Ther 69:89-95). Sin embargo, el número de biomarcadores de diagnóstico potenciales es mucho mas pequeño que aquellos considerados objetivos potenciales para el desarrollo de fármacos (Levenson, V.V. 2004 Pharmacogenomics 5:459-461). El análisis global de expresión genética podría acelerar el hallazgo de nuevos biomarcadores de diagnóstico o prognóstico que a su vez necesitaría ser validada en una población más amplia. De aquí, se emprendió este estudio con la premisa de que la caracterización del patrón de expresión genética en linfocitos de sangre periférica, un tejido muy accesible, puede acelerar la identificación de genes que podrían servir como biomarcadores de diagnóstico o prognóstico para endometriosis. Se tiene la hipótesis de que el análisis de microarreglo del perfil de transcripto de linfocitos de sangre podría servir mejor para el propósito de hallar un marcador no invasivo para esta enfermedad. En contraposición a estudiar implantes de endometriosis, endometriomas y fluido peritoneal. Se basó esta hipótesis en estudios recientes que muestran diferencias significativas en los niveles de varias moléculas inflamatorias/factores de crecimiento tanto en suero como fluido peritoneal de mujeres con endometriosis contra mujeres sin endometriosis (Bedaiwy, M.A. et al. 2002 Hum Reprod 17:426-431; Navarro, J. 2003 Obstet Gynecol Clin North Am 30:181-192; Iwabe, T. et al. 2002 Gynecol Obstet Invest 53 Suppl 1:19-25). También, hay una amplia evidencia de diferencias genéticas entre pacientes con endometriosis e individuos sin afectar y tales diferencias podrían ser evidentes en linfocitos de sangre (Taylor, R.N. et al. 2002 Fértil Steril 78:694-698; Nakago, S. et al. 2001 Mol Hum Reprod 7:1079-1083). Finalmente, está ampliamente aceptado que el sistema inmune juega un factor importante en la endometriosis y así, el análisis de las respuestas inmunes sistémicas podrían reflejar las locales (esto es, cavidad peritoneal) (Gagne, D. et al. 2003 Fértil Steril 80:43-53; Gagne, D. et al. 2003 Fértil Steril 80:876-885) .

Hasta ahora, solamente unos pocos marcadores potenciales para endometriosis principalmente citocinas, factores de crecimiento, moléculas de adición y hormonas han sido detectados en suero o linfocitos de sangre. Bedai y y colaboradores (2002) mostraron que IL-6 del suero y TNF-a de fluido peritoneal podrían ser usados para discriminar entre pacientes con y sin endometriosis con un alto grado de sensibilidad y especificidad (Bedaiwy, M.A. et al. 2002 Hum Reprod 17:426-431; Bedaiwy, M.A. y Falcone, T. 2004 Clin Chim Acta 340:41-56) . Sin embargo, la medición de TNF-a de fluido peritoneal todavía requeriría un procedimiento invasivo y por consiguiente no constituiría la base de una prueba simplificada para endometriosis. Barrier y Sharpe-Timms (2002) reportaron que mujeres con endometriosis de etapa avanzada tuvieron niveles en el suero más altos de VCAM-I y niveles en el suero más bajos de ICAM-1 (Barrier, B.F. y Sharpe-Timms, KX. 2002 J Soc Gynecol Investig 9:98-101). Concluyeron que los niveles aberrantes de moléculas de adhesión solubles no solamente ayudan a explicar la patogénesis de la endometriosis, sino que también pueden ser usados como marcadores bioquímicos para estratificar la enfermedad. Pizzo y colaboradores (2002) mostraron que los pacientes con endometriosis tuvieron niveles en el suero más altos de TNF-a, IL-8 y MCP-1, todos los cuales disminuyeron con la severidad de enfermedad - en tanto que los niveles de TGF-ß en el suero, por otra parte, se incrementaron con la severidad (Pizzo, A. et al. 2002 Gynecol Obstet Invest 54:82-87). Además, los niveles solubles de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) fueron también incrementados significativamente en pacientes en comparación con controles, aunque esta observación no podría ser replicada por otro estudio (Matalliotakis, I.M. et al. 2004 Int Immunopharmacol 4:159-160; Gagne, D. et al. 2003 Hum Reprod 18:1674-1680). Otras proteínas que son incrementadas significativamente en el suero de pacientes con endometriosis son la hormona luteinizante (LH) , ligando de Fas, receptores de factor de necrosis de tumor solubles y ICAM-1- aunque los últimos dos fueron significativamente más altos en pacientes solamente en una fase particular del ciclo menstrual (Hiera, LC. et al. 2001 Reproduction 121:761-769; Garcia-Velasco, J.A. et al. 2002 Fértil Steril 78:855-859; Koga, K. et al. 2000 Mol Hum Reprod 6:929-933; Steff, A.M. et al. 2004 Hum Reprod 19:172-178). Tomados conjuntamente, todos los estudios anteriores han fracasado para identificar marcadores no invasivos de endometriosis que podrían ser útiles para diagnosticar pacientes de todas las etapas de la enfermedad y cuya expresión no dependa de la fase de ciclo menstrual del paciente al tiempo de la prueba. A la fecha, hay solamente cinco reportes en cuanto al uso de la tecnología de microarreglo de ADN para identificar patrones específicos de endometriosis de expresión genética (Hughes, T.R. y Shoemaker, D.D. 2001 Curr Opin Chem Biol 5:21-25; Albertson, D.G. y Pinkel, D. 2003 Hum Mol Genet 12:R145-52; Eyster, K.M. et al. 2002 Fértil Steril 77:38-42; Arimoto, T. et al. 2003 Int J Oncol 22:551-560; Lebovic, D.l. et al. 2002 Fértil Steril 78:849-854; Kao, L.C. et al. 2003 Endocrinology 144:2870-2881; Matsuzaki, S. et al. 2004 Mol Hum Reprod 10:719-728; Giudíce, L.C. et al. 2002 Ann NY Acad Sci 955:252-264; Discusión 293-295, 396-406) . Sin embargo, ninguno de estos estudios ha tratado específicamente el hecho de que no hay ninguna prueba de diagnóstico a base de suero o a base de sangre específica para esta enfermedad debilitante. Por consiguiente, aunque se han recolectado datos importantes que ciertamente ayudarán a disectar los mecanismos moleculares involucrados en la patofisiología de endometriosis, estos estudios han fracasado de identificar un marcador específico común que pueda facilitar la diagnosis y verificación de tratamiento mediante pruebas de sangre o suero. Además, puesto que estos estudios han contemplado diferentes subtipos de enfermedad (esto es, infertilidad contra endometriosis aguda contra endometriosis de ovario) , gue podría en efecto ser caracterizada mediante perfiles de expresión genética distintos, los datos reportados son divergentes y no podrían ser aplicados ampliamente. Con el fin de identificador biomarcadores moleculares para endometriosis en sangre, se comparó la expresión genética de ~15,000 genes/EST en linfocitos de sangre aislados de seis pacientes y cinco controles. Los genes regulados ascendentemente y los genes regulados descendentemente son enlistados y cada capacidad discriminadora del gen para separar los dos grupos de estudio fue determinada mediante estadística de t como se describe en el ejemplo 1. Entre los genes sobreexpresados, se analizaron adicionalmente los nueve con un peso mayor de 4.0 y un cambio de veces de promedio por grupo mayor de 2. Estos fueron clasificados en los siguientes grupos: (i) proteínas involucradas en la respuesta inmune: TNF, una citocina pro-inflamatopa previamente mostrada para estar presente a niveles incrementados en el fluido peptoneal de pacientes con endometposis (Eisermann, J. et al. 1988 Fértil Steril 50:573-579) y la cadena gamma de IL-2 R (IL2RG), también conocida como una cadena gamma común, un componente importante de receptores de IL-2, IL-4 e IL-7 funcionales (Nakajima, H. et al. 1997 Exp Med 185:189-195); (n) enzimas involucradas en metabolismo de colágeno: prol?l-4 hidroxilasa (P4HA1) cataliza la formación de 4-h?drox?prol?na en colágenos (Annunen, P. et al. 1997 J Biol Chem 272:17342-17348) y semejante a lisil oxidasa 1 (LOXLl) modera la formación de colágeno insoluole en la matriz extracelular (Molnar, J. et al. 2003 Biochim Biophys Acta 1647:220-224); (m) genes involucrados en la promoción de proliferación celular/tumorigenesis : a-manosidasa (MAN2A2), una glicosil hidrolasa que procesa glicanas N-enlazadas y cuyo niveles de expresión ha sido correlacionado con el comportamiento maligno in vitro (Misago, M. et al. 1995 Proc Nati Acad Sci USA 92:11766-11770; Yue, W. et al. 2004 Int J Cáncer 108:189- 195); el receptor 5 de lipoproteína de baja densidad (LRP5), que funciona como co-receptor del oncógeno Wnt y que ha mostrado regular positivamente la proliferación celular e invasividad de células de cáncer de pecho (Li, Y. et al. 1998 Invasión Metstasis 18:240-251); la subunidad B de partículas de reconocimiento de señal (SRPRB), que es regulada ascendentemente en células apoptóticas y malignas (Yan, W. et al. 2003 World J Gastroenterol 9:1719-1724); y factor de crecimiento derivado de plaquetas D/proteína 1 inducible de daños de ADN (PDGFD) caracterizada por su efecto mitogénico en células de origen mesenquimal (Hamada, T. et al. 2000 FEBS Lett 475:97-102); y (iv) proteína básica de mielina (MBP), la proteína mayor de la envolvente de mielina, que es expresada en el sistema nervioso central y en células hematopoyéticas y la expresión de la cual se ha mostrado que es incrementada mediante TNF (Marty, M. C. et al. 2002 Proc Nati Acad Sci USA 99:8856-8861; Huang, C.J. et al. 2002 Int J Dev Neurosci 20:289-296). Cuando muestras adicionales de pacientes y controles fueron analizadas utilizando RT-PCR en tiempo real, se demostró que las diferencias en expresión de mARN relativa de IL2RG y LOXLl eran significativas.

IL-2RG o cadena gamma común, es parte de todos los receptores del factor de crecimiento de célula T conocidos (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21) (Habib, T. et al. 2003 J Allergy Clin Immunol 112:1033-1045). Como tal, esta cadena de receptor está involucrada críticamente en la generación de señales que moderan el desarrollo de respuestas inmunes Thl. Es bien conocido que los pacientes con endometposis muestran niveles incrementados de células inmunes activadas y citocinas solubles en las que se incluyen IL-2 e IL-4 (Iwabe, T. et al. 2002 Gynecol Obstet Invest 53 Suppl 1:19-25; Szyllo, K. et al. 2003 Mediators Inflamm 12:131-138; Wu, M.Y. y Ho, H.N. 2003 Am J Reprod Immunol 49:285-296). Además, se ha demostrado que babuinos con endometriosis de etapa II a IV tienen niveles incrementados de células IL-2R+ en sangre periférica (D'Hooge, T.M. et al. 1996 Human Reprod 11:1736-1740). Se muestra que la expresión de este gen es incrementada en pacientes con endometriosis . Por otra parte, LOXLl ha estado implicado como gen supresor de tumor, aunque este papel no ha sido elucidado plenamente (Contente, S. et al. 1990 Science 249:796-798; Hamalamen, E.R. et al. 1995 J Biol Chem 270:21590-21593) . LOXLl está involucrado en la ruta de transducción de señal TGF-beta y ha mostrado ser regulado descendentemente en carcinoma de célula escamosa de cabeza y cuello y cáncer de próstata (Dairkee, S.H. et al. 2004 BMC Genomics 5:47; Rost, T. et al. 2003 Anticancer Res 23:1565- 1573; Ren, C. et al. 1998 Cáncer Res 58:1285-1290). Aunque no se pueden explicar las discrepancias entre datos de RT-PCR en tiempo real y datos de microarreglos para for LOXLl, el hecho de que este gen supresor de tumor supuesto es regulado descendentemente de manera espectacular en todos los pacientes con endometriosis estudiados utilizando RT-PCR es intrigante y merece investigación adicional. Las discrepancias entre resultados de microarreglos y PCR en tiempo real tanto en dirección como nivel de expresión se han reportado antes (Orr, W.E. et al. 2003 Mol Vis 9:482-496; Jenson, S.D. et al. 2003 Mol Pathol 56:307-312; Gmestier, C. et al. 2002 Am J Pathol 161:1223-1233; Mutch, D.M. et al. Nov 2001 Genoma Biol 2: PREPRINT0009 (publicación electrónica); Goodsaid, F.M. et al. 2004 Environ Health Perspect 112:456-460). Puesto que se considera que RT-PCR es el estándar dorado en la determinación de nivel de expresión genética (Goodsaid, F.M. et al. 2004 Environ Health Perspect 112:456-460) y en vista del hecho de que LOXLl fue reducido espectacularmente en todos los pacientes analizados mediante RT-PCR, los últimos resultados posiblemente reflejan mejor lo que está en marcha en el paciente . El análisis de RT-PCR de muestras adicionales fue apto de confirmar los datos de microarreglo para LRP5, MBP, TNF, MAN2A2 y PDGFD, aunque las diferencias en expresión de mARN relativa entre pacientes y controles no alcanzo significado estadístico. Esto puede ser debido a diferencias individuales y el tamaño de muestra pequeño analizado. Aunque la expresión de MAN2A2 fue 12.93 veces más alta en pacientes que en controles, un error estándar grande (7.4) podría explicar el hecho de que esta diferencia no alcanzó significado estadístico. De nota, TNF ha sido implicado fuertemente en la patofisiología de endometriosis. Su expresión, sin embargo, ha mostrado variar de acuerdo con la fase del ciclo menstrual (Hunt, J.S. et al. 1997 J Reprod Immunol 35:87-99) y niveles más altos han sido demostrados en pacientes con enfermedad moderada contra severa (Pizzo, A. et al. 2002 Gynecol Obstet Invest 54:82-87), que can explicar la carencia de significado para este gen particular. El presente estudio también mostró gue la expresión de PDGFD fue regulada ascendentemente en muestras de pacientes como se muestra mediante análisis de microarreglo de ADN. Esta observación junto con datos reportados por Matsuzaki et al. (2004) soportan un papel clave para el sistema de factor de crecimiento derivado de plaguetas en esta enfermedad: reportaron la expresión incrementada del receptor de PDGF en lesiones de endometriosis profundas, en tanto que se demostró que su ligando es regulado ascendentemente en linfocitos de sangre de pacientes con endometriosis. Se ha demostrado que PDGFD estimula la proliferación y transformación celular y que juega un papel en la angiogénesis (Ustach, C.V. et al. 2004 Cáncer Res 64:1722- 1729; Li, H. et al. 2003 Oncogen 22:1501-1510); por consiguiente, es tentador especular que la actividad del sistema de PDGF puede ayudar aparato promover el crecimiento de células endometriales en sitios ectópicos. Este es el primer reporte de genes que son expresados diferencialmente en linfocitos de sangre periférica de pacientes con endometriosis, que puede proporcionar pistas importantes con respecto a la patogénesis de esta enfermedad. Los análisis han conducido a la identificación de genes cuya segregación con enfermedad, alteraciones estructurales o perfiles de expresión son contemplados al ser estudiados adicionalmente, con el fin de definir mejor su uso como marcadores de enfermedad. En otra modalidad, se propone que el análisis de niveles de expresión genética de una combinación de genes incrementaría la especificidad y sensibilidad de un método de detección mínimamente invasivo en cuanto a endometriosis. También, estudios de validación llevados a cabo en una población más grande mediante análisis de microarreglo y RT-PCR son contemplados al ser contemplados mediante mediciones de niveles de proteína en el suero de los genes candidato y mediante análisis de microarreglo de tejido de alta densidad de muestras de endometríosis . Los pacientes que fueron analizados en el presente estudio podrían ser agrupados en varias categorías clínicas diferentes de acuerdo con la severidad de la enfermedad (por ejemplo, severa, moderada; suave, mínima) o síntomas (por ejemplo, infertilidad contra dismenorrea contra ambos); este análisis, a su vez, podría reflejar diferentes clases genéticas. También, sería importante considerar factores que pueden afectar los patrones de expresión genética de linfocitos tales como fase de ciclo menstrual, infecciones concurrentes y medicaciones actuales (Willis, C. et al. 2003 Hum Reprod 18:1173- 1178; Dosiou, C. et al. 2004 J Clin Endocrinol Metab 89:2501-2504) . Debido al número pequeño de pacientes en cada categoría no fue posible comparar la diferencia entre estas clases. Por consiguiente, en base a los datos presentes, el análisis de expresión que compara los pacientes con endometriosis con los controles fue solamente apto de detectar diferencias en la expresión genética que son comunes para todas las categorías de pacientes estudiados. Aquí radica el valor de estas diferencias de hallazgos en la expresión genética para IL-2RG y LOXLl fueron significativas sin consideración del subtipo de enfermedad, medicaciones actuales o etapa de ciclo menstrual del paciente. Estudios prospectivos en marcha en los laboratorios están diseñados específicamente para elucidar el patrón de expresión de los genes de interés; esto es, si las diferencias en niveles de expresión genética varían de acuerdo con la fase del ciclo menstrual y si tales diferencias pueden estar relacionadas con la presentación clínica o características de la enfermedad (por ejemplo, enfermedad severa contra moderada; dismenorrea contra infertilidad) . En resumen, este estudio ha revelado nuevos sitios genéticos objetivos en endometriosis, que son contemplados para servir como la base para el desarrollo de análisis de diagnóstico específicos no invasivos, también como nuevas terapias para esta enfermedad crónica debilitante.

Ejemplo 1 Población de estudio Sujetos de estudio (pacientes y controles) fueron reclutados mediante referencias directas de OB-GYN colaboradores que practican en todo Puerto Rico. La población de pacientes bajo estudio consistió de mujeres pre-menopáusicas que hablan sido diagnosticadas con endometriosis mediante un especialista de OB-GYN durante la cirugía e incluían pacientes con todas las etapas de la enfermedad: severa (11), moderada (6), suave (3), mínima (1). Las muestras de pacientes usadas para los microarreglos (N = 6; intervalo de 32-3 años; promedio = 35.5 años) y experimentos de validación de RT-PCR en tiempo real (N = 15, intervalo de edad 26-39 años; promedio = 31.2 años) fueron seleccionadas aleatoriamente del banco de ácido nucleico. Trece de 21 pacientes (62%) no estaban tomando ninguna medicación cuando las muestras fueron obtenidas. Aquellos que estaban con medicaciones fueron tratados con agonistas de GnRH (6), anticonceptivos orales (1), y danócrino (1) . Los controles (N = 4 para los microarreglos; N = 15 para RT-PCR) fueron mujeres que sufrieron laparoscopia o laparotomía en cuanto a condiciones ginecológicas no relacionadas (por ejemplo fibroides uterina, DUB, esterilización) y que no tenían endometriosis tal como se confirma mediante cirugía. Una muestra obtenida de un voluntario varón fue incluida como control en los experimentos de microarreglo. Las muestras de control fueron completamente anónimas y por consiguiente no relacionadas con la información demográfica. Las muestras de pacientes y controles usados para los microarreglos y los experimentos de RT-PCR no se traslapan. Antes de cualquier experimentación este protocolo de investigación fue evaluado y aprobado por los Comités de IRB y tanto la Escuela Ponce de Medicina y NHGRI-NIH. Todos los participantes leyeron y firmaron una forma de consentimiento por escrito antes de su entrada al estudio.

Muestras de sangre Después que se obtuvo el consentimiento por escrito, muestras de sangre fueron recolectadas mediante venipunctura por una enfermera de investigación, utilizando procedimientos asépticos estándar. Una vez en el laboratorio, los linfocitos fueron aislados primero de sangre entera mediante centrifugación a 2000 rpm durante 40 minutos en Histopaque (Sigma, St . Louis, MO) . El ARN total fue aislado de los linfocitos utilizando Trizol LS y siguiendo las especificaciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) . El análisis de expresión mediante microarreglos de ADN: Se analizaron seis muestras de sangre de mujeres afectadas y cinco controles utilizando un programa de selección genética (véase posteriormente en la presente). Los arreglos usados tenían 15097 clones de cADN que fueron preparados e impresos sobre portaobjetos de vidrio como se describe previamente (DeRisi, J. et al. 1996 Nat Genet 14:457-460; Shalon, D. et al. 1996 Genoma Res 6:639-645; Mousses, S. et al. en Gene expression analysis by cDNA microarrays, in Functional Genomics, F.J. Livesey y S.P. Hunt (Eds)., 2000, Oxford University Press, Oxford, pp . 113-137). De estos clones, 912 fueron etiquetas de secuencias expresadas y los 14,185 clones restantes fueron genes conocidos. Se llevaron a cabo lavado de hibridización y post-hibridización como se describe anteriormente (Mousses, S. et al. en Gene expression analysis by cDNA microarrays, in Functional Genomics F.J. Livesey y S.P. Hunt (Eds.), 2000, Oxford University Press, Oxford, pp. 113-137; Monni, O. et al. 2001 Proc Nati Acad Sci USA 98:5711-5716; Pollack, J.R. et al. 2002 Proc Nati Acad Sci USA 99:12963-12968). En breve, aproximadamente 15 a 20 µg de ARN total de los linfocitos de sangre del sujeto y misma cantidad de una referencia estándar (Universal Human Reference RNA, Stratagene, La Jolla, CA) fueron marcados mediante transcripción inversa utilizando transcriptasa inversa Superscript (Invitrogen, Carlsbad, CA) y ya sea con Cy3-dUTP o Cy5-dUTP (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) , respectivamente. Las sondas marcadas fueron sometidas a hidrólisis alcalina, purificadas y concentradas utilizando Microcon 30 (Millipore, Billerica, CA) . Las hibridizaciones fueron llevadas a cabo durante toda la noche (16-24 horas) en una solución acuosa a 65°C en una cámara humidificada sellada.

Análisis estadísticos de datos de microarreglo de cADN Para identificar genes con expresión diferencial significativa entre los dos grupos (con y sin endometriosis), un programa de selección de genes (arrayanalysis.nih.gov) fue usado como se describe previamente (Bittner, M. et al. 2000 Nature 406:536-540; Hedenfalk, I. et al. 2001 N Engl J Med 344:539-548). Los datos de expresión genética fueron filtrados primero con determinación de calidad de medición y se calcularon estadísticas t como valores de peso discriminativos . Después de remover los puntos de datos sin ninguna información biológica significativa y redundancia, se enlistaron los genes más discriminatorios (esto es, aquellos genes que satisfacen un peso molecular de 4.0 y un cambio promediado por grupos (diferencia de proporción media entre los dos grupos) mayor de 2.0). Las proporciones de expresión genética fueron primero transformadas logarítmicamente y luego codificadas por color de acuerdo con su desviación estándar (s) del nivel de expresión media a través de todos los experimentos, con sobre-expresión coloreada a rojo (gris oscuro) y sub-expresion a verde (verde claro) (figura 1 ) .

Validación de datos de expresión genética mediante RT-PCR en tiempo real Para validar los datos de expresión genética obtenidos con microarreglos de ADN, se llevó a cabo RT-PCR en tiempo real relativa utilizando ARN total de linfocitos de sangre periférica de pacientes adicionales (N = 15) y controles hembra (N = 15) . Todos los experimentos se realizaron por triplicado. El breve, ARN total fue aislado de linfocitos de sangre periférica utilizando el reactivo Tpzol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Para remover el ADN contaminante, las muestras fueron tratadas con ADNasa I (libre de ADN, A bion, Austin, TX) . La transcripción inversa fue efectuada sobre el aparato de ciclos térmicos PTC-200 (MJ Research, Waltham, MA) utilizando el equipo de síntesis de cADN iScript (Bio-Rad, Hercules, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Después de la síntesis del cADN, se llevaron a cabo reacciones de PCR con pares de oligo-cebador específicos utilizando el equipo Green Super Mix íQ SYBR de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (BioRad, Hercules, CA) . El perfil de amplificación de PCR fue como sigue: 94 °C durante 4 minutos seguido por 50 ciclos de desnaturalización a 94°C/30 segundos, temperatura de recocido específica del gen/30 segundos y extensión a 72°C/40 segundos. Una curva de fusión fue generada después de cada corrida para verificar la especificidad de los cebadores. El análisis en tiempo real de amplificación de PCR se llevó a cabo utilizando elementos de programación iCycler iQ Optical, versión 3.0a (Bio-Rad, Hercules, CA) . Pares de oligo-cebadores específicos fueron obtenidos de bases de datos públicas y sintetizados en la instalación Molecular Resource en la Escuela Médica de Nueva Jersey. Los niveles de expresión relativa fueron calculadas para cada muestra después de normalización contra el gen de mantenimiento GAPDH (Livak, KJ. 2001 Methods 25:402-408). El análisis estadístico fue llevado a cabo utilizando pruebas de t de dos colas sin aparear para comparar los niveles de expresión de mARN relativos en pacientes y controles (GraphPad InStat 3) . El significado estadístico fue definido como un valor de p de <0.05.

Ejemplo 2 Se completó el análisis de datos de 14 pacientes adicionales. Se incluyen gráficas de dispersión de los datos originales (Conjunto 1) que permiten una mejor representación de la variación individual de estos marcadores (figura 3). De nota, las gráficas de dispersión muestran que el bajo nivel de expresión de LOXLl ocurre en todos los pacientes probados hasta ahora . También, se incluyen datos adicionales en cuanto a otro subconjunto de 14 pacientes (Conjunto 2) que confirma los hallazgos originales. Las figuras a continuación presentan un resumen de los resultados del segundo conjunto de pacientes estudiados. La figura 4 consiste de gráficas de dispersión que muestran la variación individual de cada gen para el conjunto 2. La figura 5 presenta los resultados de expresión de veces promediada del conjunto de pacientes 1 (panel superior) y conjunto 2 (pone inferior) , mientras que la figura 6 muestra una comparación de los resultados de los dos grupos. La figura 7 gráfica los datos de los 39 pacientes probados hasta ahora. En tanto que la presente invención ha sido descrita en algún detalle por propósitos de claridad y entendimiento, aquel de habilidad en el arte apreciará que varios cambios en forma y detalles se pueden realizar sin desviarse del verdadero alcance de la invención. Todas las figuras, tablas y apéndices, también como patentes, solicitudes y publicaciones, a los que se hace referencia anteriormente, son mediante esto incorporadas por referencia.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar o predecir la predisposición a endometriosis en un sujeto hembra, caracterizado porque comprende: (a) determinar el nivel de expresión genética de por lo menos un gen expresado diferencialmente de leucocitos de sangre periférica en un muestra de leucocitos de sangre periférica o sangre periférica en un sujeto para proporcionar un primer valor, (b) determinar el nivel de expresión genética del por lo menos un gen expresado diferencialmente de los leucocitos en un control o estándar de referencia para proporcionar un segundo valor, y (c) comparar si hay una diferencia entre el primer valor y el segundo valor.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el control o estándar de referencia es determinado de un sujeto o grupo de sujetos sin endometriosis.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el primer valor es mayor que el segundo valor es indicador de la presencia o predicción de endometriosis.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el primer valor es más bajo que el segundo valor es indicador de la presencia o predicción de endometriosis .
5. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la predicción de la presencia de endometposis tiene una probabilidad de por lo menos 50%.
6. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el primer valor es por lo menos 20% mayor o más ba o que el segundo valor.
7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la determinación del nivel de expresión genética comprende medir la expresión genética de un polinucleotido transcrito del gen.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el polinucleótido transcrito es mARN o cADN.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado que el nivel de expresión es detectado mediante análisis de microarreglo, análisis de Northern blot, PCR de transcripción inversa o RT-PCR.
10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque se determina el nivel de expresión genética de un miembro de grupo que consiste de LOXLl, IL2RG, LRP5, MPB, TNF, MAN2A2, P4HA1 y PDGF.
11. 11. Un método para identificar o predecir la predisposición a endometriosis en un sujeto hembra, caracterizado porque comprende: (a) determinar el nivel de por lo menos una proteína o péptido expresado diferencialmente de leucocitos de sangre periférica en una muestra de leucocitos de sangre periférica o sangre periférica en un sujeto para proporcionar un primer valor, (b) determinar el nivel de la por lo menos una proteína o péptido expresado diferencialmente de los leucocitos en un control o estándar de referencia para proporcionar un segundo valor, y (c) comparar si hay una diferencia entre el primer valor y el segundo valor.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el primer valor es mayor que el segundo valor es indicador de la presencia o predicción de endometriosis .
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el primer valor es más bajo que el segundo valor es indicador de la presencia o predicción de endometriosis .
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la determinación del nivel de expresión genética comprende medir el producto de expresión de proteína.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la cantidad de proteína o péptido es detectada utilizando un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se enlaza específicamente a la proteína.
16. 16. Un método para monitorear un sujeto identificado que tiene endometriosis antes y después del tratamiento, caracterizado porque comprende: (a) determinar el nivel de expresión genética de por lo menos un gen expresado diferencialmente de leucocitos de sangre periférica en un muestra de leucocitos de sangre periférica o sangre periférica en el sujeto antes del tratamiento que proporciona un primer valor, (b) determinar el nivel de expresión genética de por lo menos un gen expresado diferencialmente de los leucocitos después de tratamiento que proporciona un segundo valor, y (c) comparar la diferencia en el nivel de expresión genética del sujeto antes del tratamiento y después del tratamiento .
17. 17. Un método para seleccionar agentes candidatos para uso en el tratamiento de endometriosis, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una célula capaz de expresar por lo menos un gen expresado diferencialmente con un agente candidato ex vivo, (b) determinar el nivel de expresión genética del por lo menos un gen expresado diferencialmente en la célula para proporcionar un primer valor, (c) determinar el nivel de expresión genética del mismo por lo menos un gen expresado diferencialmente en una célula en ausencia del agente candidato para proporcionar un segundo valor, y (d) comparar el primer valor con el segundo valor, en donde la diferencia en el nivel de expresión genética es indicadora de un agente potencialmente capaz de ser usado para el tratamiento de endometriosis.
18. 18. Un método de tratamiento o prevención de endometriosis caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un agente que puede inducir una disminución o incremento en el nivel de expresión genética, síntesis o actividad de por lo menos un gen expresado diferencialmente o producto de expresión genética.
19. 19. Un método de manufactura de un medicamento para el tratamiento o prevención de endometriosis, caracterizado porque comprende una cantidad efectiva de un agente que puede inducir una disminución o incremento en el nivel de expresión genética, síntesis o actividad de por lo menos un gen expresado diferencialmente o producto de expresión genética.
20. 20. Un equipo para identificar o predecir la predisposición a endometriosis en un sujeto hembra, caracterizado porque comprende medios para: (a) determinar el nivel de expresión genética de por lo menos un gen expresado diferencialmente de leucocitos de sangre periférica en un muestra de leucocitos de sangre periférica o sangre periférica en un sujeto para proporcionar un primer valor, (b) determinar el nivel de expresión genética del por lo menos un gen expresado diferencialmente de los leucocitos en un control o estándar de referencia para proporcionar un segundo valor, y (c) determinar si hay diferencia entre el primer valor y el segundo valor.