CN105473743A - 脓毒症生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

世界范围内脓毒症发生率持续增加，由于快速的老年化而越来越关注老年患者。需要有效的生物标志物以诊断和/或预后脓毒症。本发明涉及诊断性和/或预后性生物标志物以检测和/或预测脓毒症。本发明揭示了预定的一组基因，其是用于检测和/或预后对象中的脓毒症包括脓毒症连续体的状态或状况的生物标志物。

Description

脓毒症生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及检测和/或预测脓毒症的诊断性和/或预后性生物标志物。
背景技术
下文关于本发明背景的描述是为了便于理解本发明。然而，应理解所述讨论不是承认所引用的任何材料在本申请优先权日在任何司法管辖地是公开的、已知的或者是公知常识的一部分。
脓毒症是宿主对于细菌或其它感染物质如病毒、真菌或寄生虫所致感染的应答而产生的。这种应答称作全身性炎性反应综合征(SIRS)。脓毒症的结果通过入侵的病原体的毒性及宿主应答而确定，其可以是过度生长，导致器官和组织的连带损害。典型地，当脓毒症发生时，宿主机体不能降解在损伤的血管内壁形成的凝块，限制血液流向器官，随后导致器官衰竭或坏死。
脓毒症是一种异质性(heterogeneous)疾病过程的连续体(continuum)，通常起自感染，随后是SIRS，然后脓毒症，随后是重度脓毒症及最后的脓毒性休克，导致多个器官功能障碍及死亡。由于快速的老龄化所致老年患者的增加，世界范围内的脓毒症的发病率持续上升。大约三分之一至一半的重度脓毒症患者死于其疾病。在怀疑有感染的患者中在进展为脓毒症之前的早期诊断和及时干预对于世界范围内的医生仍是关键的临床挑战，因为脓毒症通常在太晚的阶段被诊断。
脓毒症的早期诊断是困难的，因为SIRS的临床症状晚于生物化学和免疫学反应。另外，SIRS标准是非常泛泛的，其中界线结果导致诊断不清。此外，感染只是可导致SIRS的众多不同状况之一，其余的是无菌炎症。目前可利用的标准实验室指标如白细胞、乳酸盐、血葡萄糖和血小板计数是非特异性的。在大约三分之一的脓毒症患者中，不能鉴别出致病生物体，进一步阻碍了抗微生物治疗的早期实施或者甚至恶化病情，广谱抗生素的大量使用导致对于抗微生物药物的抗性。
先前关于鉴别脓毒症生物标志物如细胞因子、趋化因子、急性期蛋白、可溶受体及细胞表面标志物的研究不能可靠地区分炎症的感染与非感染因素。难以获得精确的生物标志物以诊断脓毒症，因为宿主对于SIRS和感染的应答是由多个途径调节的，使得获得精确的生物标志物的尝试复杂化。此外，可用的预后性生物标志物的数目也非常少。
因此，需要强效的有效生物标志物以诊断和/或预后脓毒症，以及脓毒症连续体(sepsiscontinuum)中的状态，其克服或者至少减轻上述问题。
发明概述
本发明寻求提供新的方法以检测和/或预后对象中的脓毒症，以及脓毒症连续体中的状态，以改善检测和/或预测脓毒症的现有方法的一些难点并加以补充。本发明进一步寻求提供检测和/或预后对象中脓毒症，以及脓毒症连续体中的状态的试剂盒。
本发明也寻求提供评估和/或预测经检测脓毒症阳性的对象中脓毒症的严重性的新方法。优选地，所述方法是评估对象是否具有或处于发生选自感染、轻度脓毒症和重度脓毒症的多个状况之一和/或选自脓毒症连续体中的状态的多个状况之一的危险中。本发明进一步寻求提供评估和/或预测经检测脓毒症阳性的对象中脓毒症的严重性的试剂盒。
本发明基于多基因标记(signature)方法，诊断性生物标志物衍生自分离自患者血液样品的白细胞中的基因表达谱，其提供了较现有方法明显更精确和预测性诊断方法。包含一组基因的诊断性生物标志物共同地反映炎症应答、激素信号、内皮功能失调发生、血液凝固、器官损伤等广泛和趋同效应(convergenteffects)。
本发明涉及一组基因，其衍生自微阵列全基因组表达谱，通过qPCR测定验证。令人惊奇地，微阵列基因表达谱的层次聚类(hierarchicalclustering)结果表明在脓毒症连续体的不同持续阶段白细胞的基因表达模式的显著不同，所述脓毒症连续体的不同阶段即对照、感染、非感染性全身性炎性反应综合征(SIRS)或者也称作无感染的SIRS、脓毒症、重度脓毒症、隐匿性休克和脓毒性休克患者。在脓毒症期间差异表达的基因衍生自微阵列基因谱，从最初的33,000个基因中选出一组基因。此外及令人惊奇地，使用qPCR分析性确认表明这组基因或生物标志物在脓毒症连续体对象中逐步失调，如上调或下调，其与微阵列结果相关。可明显观测到白细胞中的基因表达改变，用于诊断和/或预后脓毒症及脓毒症连续体中的状态。
除了上述之外，令人惊奇地，可以使用任何数目及以任何组合的预定的基因或生物标志物组，以诊断和/或预后脓毒症及脓毒症连续体中的状态。
根据本发明的第一方面，提供了一种检测或预测对象中脓毒症的方法，所述方法包括：
i.测量分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的水平；及
ii.将测量的水平与相应生物标志物的参考水平进行比较，
其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸；
其中在所述第一个样品中测量的水平与参考水平之间的差异是第一个样品中存在脓毒症的指征。
优选地，脓毒症的存在是通过在对象中检测到在所述第一个样品中测量的至少一个生物标志物水平与相应生物标志物的参考水平相比增加而确定的，所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸。
优选地，脓毒症的存在是通过在对象中检测到在所述第一个样品中测量的至少一个生物标志物的水平与相应生物标志物的参考水平相比减少而确定的，所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸。
优选地，所述参考水平是相应生物标志物在分离自无脓毒症的至少一个对象的第二个样品中的水平。
优选地，比较步骤包括应用判定规则以确定或预测对象中脓毒症的存在与否。
根据本发明的第二方面，提供了一种检测或预测对象是否具有选自如下多种状况之一的方法：对照、感染、非感染性全身性炎性反应综合征(SIRS)、轻度脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克和隐匿性休克，所述方法包括：
i.测量分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的水平；及
ii.将测量的水平与相应生物标志物的参考水平比较，
其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，
其中在所述第一个样品中测量的水平与参考水平统计学基本相似是该对象是否具有所述状况之一的指征。
优选地，所述参考水平是相应生物标志物在分离自选自如下的至少一个对象的第二个样品中的水平：对照对象、感染阳性对象、非感染性SIRS阳性对象、轻度脓毒症阳性对象、重度脓毒症阳性对象和隐匿性休克阳性对象。
优选地，所述比较步骤包括应用判定规则确定或预测对象是否具有所述状况之一。
根据本发明的第三方面，提供了执行第一方面的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
i.能特异性结合所述至少一个生物标志物以量化对象的第一个样品中的生物标志物水平的至少一种试剂；及
ii.表示相应生物标志物的参考水平的参考标准。
优选地，所述至少一种试剂包含能特异性结合所述至少一种生物标志物的至少一种抗体。
优选地，所述试剂盒进一步包含能特异性结合第一个样品中至少一个另外的生物标志物的至少一种另外的试剂，以及表示相应的至少一个另外的生物标志物的参考水平的参考标准。
根据本发明的第四方面，提供了执行第二方面的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
i.能特异性结合所述至少一个生物标志物以量化对象的第一个样品中的生物标志物水平的至少一种试剂；及
ii.表示相应生物标志物的参考水平的参考标准。
优选地，所述至少一种试剂包含能特异性结合所述至少一个生物标志物的至少一种抗体。
优选地，试剂盒进一步包含能特异性结合第一个样品中至少一个另外的生物标志物的至少一种另外的试剂，以及表示相应的至少一个另外的生物标志物的参考水平的参考标准。
根据本发明的第五方面，提供了检测或预测对象中脓毒症的试剂盒，包含能选择性结合分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的抗体，以及检测在抗体与至少一个生物标志物的补体成分之间形成的复合物的试剂，其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，以及表示相应生物标志物的参考水平的参考标准，其中在所述第一个样品中测量的至少一个生物标志物的水平与参考水平之间的差异是第一个样品中存在脓毒症的指征。
优选地，参考水平是相应生物标志物在分离自无脓毒症的至少一个对象的第二个样品中的水平。
根据本发明的第六方面，提供了检测或预测对象是否具有选自如下多种状况之一的试剂盒：对照、感染、非感染性全身性炎性反应综合征(SIRS)、轻度脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克及隐匿性休克，所述试剂盒包含能选择性结合分离自对象的第一个样品中的至少一个生物标志物的抗体，以及检测在抗体与至少一个生物标志物的补体成分之间形成的复合物的试剂，其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，以及表示相应生物标志物的参考水平的参考标准，其中在所述第一个样品中测量的至少一个生物标志物的水平与参考水平统计学基本相似是所述对象是否具有所述状况之一的指征。
优选地，参考水平是相应生物标志物在分离自选自如下的至少一个对象的第二个样品中的水平：对照对象、感染阳性对象、非感染性SIRS阳性对象、轻度脓毒症阳性对象、重度脓毒症阳性对象及隐匿性休克阳性对象。
根据本发明的第七方面，提供了检测或预测对象中脓毒症的方法，所述方法包括：
i.测量分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的水平；及
ii.将测量的水平与相应生物标志物的参考水平进行比较，
其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一或多个及任何组合所示的核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一或多个及任何组合的序列所示的核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中任一或多个序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，
其中在所述第一个样品中测量的水平与参考水平之间的差异是第一个样品中存在脓毒症的指征。
根据本发明的第八方面，提供了一种检测或预测对象是否具有选自如下多种状况之一的方法：对照、感染、非感染性全身性炎性反应综合征(SIRS)、轻度脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克和隐匿性休克，所述方法包括：
i.测量分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的水平；及
ii.将测量的水平与相应生物标志物的参考水平进行比较，
其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一或多个及任何组合所示的核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一或多个及任何组合所示的核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中任一或多个序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，
其中在所述第一个样品中测量的水平与参考水平统计学基本相似是所述对象是否具有所述状况之一的指征。
根据本发明的另一方面，提供了选自用于诊断对象中的脓毒症的预定的一组基因的至少一个基因。
本发明的另一方面提供了选自用于预后对象中的脓毒症的预定的一组基因的至少一个基因。
本发明的另一方面提供了一种检测或预测对象中的脓毒症的方法。所述方法通常包括测量在得自对象的合适液体样品中选自预定的一组基因的至少一个基因的至少一个脓毒症连续体标志物表达产物的水平，并将测量的水平与至少一个对照对象中的相应脓毒症连续体标志物表达产物的水平进行对比，所述对照对象是正常对象，其中至少一个脓毒症连续体标志物表达产物的水平与相应脓毒症连续体标志物表达产物的水平之间的差异表示对象中存在脓毒症。
本发明另一方面提供了一种评估对象是否具有选自感染、轻度脓毒症和重度脓毒症的多种状况之一的方法。所述方法通常包括以下步骤：测量在得自对象的合适液体样品中选自预定的一组基因的至少一个基因的至少一个脓毒症连续体标志物表达产物的水平，并将测量的水平与在多个对照对象中相应脓毒症连续体标志物表达产物的水平进行比较，所述对照对象是至少一个感染阳性对象、至少一个轻度脓毒症阳性对象及至少一个重度脓毒症阳性对象，其中当至少一个表达产物的水平与任一对照对象的相应脓毒症连续体标志物表达产物的水平统计学基本相似时，是所述对象是否具有所述状况之一的指征。
本发明另一方面提供了检测和/或预后对象中脓毒症的试剂盒，其包含能在得自对象的合适液体样品中选择性结合选自预定的一组基因的至少一个基因的至少一个脓毒症连续体标志物表达产物的抗体，及用于检测抗体与至少一个表达产物补体成分之间形成的复合物的试剂。
本发明另一方面提供了评估和/或预测对象中脓毒症的严重性的试剂盒，其包含能在得自对象的合适液体样品中选择性结合选自预定的一组基因的至少一个基因的至少一个脓毒症连续体标志物表达产物的抗体，及用于检测抗体与至少一个表达产物的补体成分之间形成的复合物的试剂。
优选地，试剂盒是用于评估对象是否具有或处于发生选自感染、轻度脓毒症和重度脓毒症的多种状况之一的风险。
有利地，至少一个基因选自预定的一组基因，其包含：人酰基-CoA合成酶长链家族成员1(ACSL1)基因、人膜联蛋白A3(ANXA3)基因、人半胱氨酸富集的跨膜模块1(CYSTM1)基因、人染色体19开放读框59(C19orf59)基因、人集落刺激因子2受体β低亲和性(粒细胞-巨噬细胞)(CSF2RB)基因、人DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)盒多肽60-样(DDX60L)基因、人IgG的Fc片段高亲和性Ib受体(CD64)(FCGR1B)基因、人游离脂肪酸受体2(FFAR2)基因、人甲酰肽受体2(FPR2)基因、人热激70kDa蛋白1B(HSPA1B)基因、人干扰素诱导的跨膜蛋白1(IFITM1)基因、人干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)基因、人白细胞介素1β(IL1B)基因、人干扰素1受体拮抗剂(IL1RN)基因、人白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A(具有TM结构域)成员5(LILRA5)基因、人亮氨酸富集的α-2-糖蛋白1(LRG1)基因、人髓细胞白血病序列1(BCL2-相关)(MCL1)基因、人NLR家族细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)基因、人核因子白细胞介素3调节的(NFIL3)基因、人5'-核苷酸酶细胞溶质III(NT5C3)基因、人6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)基因、人磷脂促翻转酶1(PLSCR1)基因、人前动力蛋白2(PROK2)基因、人RAB24成员RAS致癌基因家族(RAB24)基因、人S100钙结合蛋白A12(S100A12)基因、人选择蛋白L(SELL)基因、人溶质转运家族22(有机阳离子/麦角硫因转运蛋白)成员4(SLC22A4)基因、人线粒体超氧化物歧化酶2(SOD2)基因、人SP100核抗原(SP100)基因、人toll-样受体4(TLR4)基因、人趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)基因、人趋化因子(C-C基序)受体7(CCR7)基因、人CD3d分子δ(CD3-TCR复合物)(CD3D)基因、人CD6分子(CD6)基因、人Fas细胞凋亡抑制分子3(FAIM3)基因、人IgE的Fc片段高亲和性I受体α多肽(FCER1A)基因、人颗粒酶K(颗粒酶3；类胰蛋白酶II)(GZMK)基因、人白细胞介素7受体(IL7R)基因、人杀伤细胞凝集素样受体亚家族B成员1(KLRB1)基因、人malT-细胞分化蛋白(MAL)基因。
有利地，选自预定的一组基因的至少一个基因在脓毒症对象中是上调或下调的。
有利地，选自预定的一组基因的至少一个基因从对照和无感染SIRS至无SIRS的感染、至轻度脓毒症至重度脓毒症是逐渐上调或下调的。
有利地，可以选择或使用任何数目的预定的一组基因及任何组合以诊断和/或预后脓毒症。
有利地，可以选择或使用任何数目的预定的一组基因及任何组合以评估和/或预测经检测脓毒症阳性的对象中脓毒症的严重性。
优选地，至少一个脓毒症连续体标志物转录物选自：(a)包含列表1中列出的任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)包含列表1中列出的任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽。
有利地，本发明可用于区分有无脓毒症的患者。本发明也可用于区分具有脓毒症及具有重度脓毒症的患者。
有利地，本发明可用于早期检测和诊断脓毒症，也用于监测患者以改良这种患者的治疗和结果。
有利地，本发明可用于鉴别和/或分类对象或患者作为脓毒症治疗的候选者。
本发明的其它方面和特征对于本领域技术人员在回顾如下本发明特定实施方案的描述结合附图将显而易见。
附图简述
如下图中仅以举例方式例证了本发明的实施方案。
图1：通过qPCR获得的感染(无SIRS)、轻度和重度脓毒症样品与对照组相比的相对平均变化倍数。(A)30个上调基因；及(B)10个下调基因。
图2：从四种不同基因分类方法中鉴别的重叠基因。
图3：在脓毒症连续体中具有上调或下调表达水平的基因的无监督分级聚类热图(unsupervisedhierarchicalclusteringheatmap)。
图4：基于6个模型(A-F)的箱线图，其使得可以对脓毒症/非脓毒症患者进行分层。以各自的水平线表示的脓毒症/非脓毒症之间的预定截止值(cutoff)基于可达到的最高总精准度的判定规则。对于每个模型，产生基于100个样品的训练集合(左侧)，使用61个样品的盲试(右侧)以验证模型。所述模型是：
(A)使用40个基因及作为标准化管家基因的HPRT1。
(B)使用8个基因及作为标准化管家基因的HPRT1。
(C)使用40个基因及作为标准化管家基因的GAPDH。
(D)使用8个基因及作为标准化管家基因的GAPDH。
(E)使用40个基因及作为标准化管家基因的HPRT1和GAPDH。
(F)使用11个基因及作为标准化管家基因的HPRT1和GAPDH。
图5：基于37个基因(A)或14个基因(B)的表示85个脓毒症患者的箱线图。应用加权得分系统，使用2个模型，其使得可以划分重度脓毒症与轻度脓毒症。
图6：选自对照、感染、轻度脓毒症和重度脓毒症/脓毒性休克患者的平均血浆蛋白质浓度(S100A12)，表示脓毒症严重性与蛋白质浓度之间的相关性。
发明详述
本发明使用多基因标记方法作为衍生自在分离自对象血液样品的白细胞中基因表达谱的诊断性生物标志物，其提供了与现有方法相比明显更精确和更快速的诊断方法。有利地，基因表达谱克服了或者至少减少了脓毒症延迟诊断的问题，因为基因的上调或下调发生在功能性基因产物如促炎蛋白的合成之前。有利地，本发明可以可靠地及精确地分类具有脓毒症的个体，或者提供该综合征进展的预后线索，从而可以更有效地进行治疗性干预。
进行队列研究(cohortstudy)。关于急诊脓毒症患者的队列研究的目的包括：(i)获得并确认在有和无脓毒症的患者白细胞中差异表达的基因表达组，以增强脓毒症的早期诊断；及(ii)研究基因表达组的预后值以通过在脓毒症发作时预测其严重性而指导脓毒症的治疗。
有利地，本发明提供了一种检测或预测对象中脓毒症的方法，所述方法包括：
i.测量分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的水平；及
ii.将测量的水平与相应生物标志物的参考水平进行比较，
其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，
其中在所述第一个样品中测量的水平与参考水平之间的差异是第一个样品中存在脓毒症的指征。
有利地，本发明还提供了一种检测或预测对象是否具有选自如下多种状况之一的方法：对照、感染、非感染性全身性炎性反应综合征(SIRS)、轻度脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克和隐匿性休克，所述方法包括：
i.测量分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的水平；及
ii.将测量的水平与相应生物标志物的参考水平比较，
其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，
其中在所述第一个样品中测量的水平与参考水平统计学基本相似是该对象是否具有所述状况之一的指征。
如本文所用，除非特别指出，则单数形式“一个”包括所指物的复数形式。
除非特别指出，使用的术语“或者”、“/”是指“和/或”。此外，术语“包括”和“具有”以及其它形式是无限制的。
如本文所用，“样品”、“检测样品”、“标本”、“来自对象的使用样品”和“患者样品”可以互换使用，可以是血液、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或者组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞。样品可以得自患者或对象直接使用，或者进行预处理，如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、失活干扰成分、加入试剂等方式处理，以如本文所述或者本领域已知的一些方式修饰样品的特性。
任何细胞类型、组织或体液均可用于获得样品。这种细胞类型、组织和液体可包括组织切片如活检组织和尸检组织样品、进行组织学检测的冷冻的切片、血液(如全血)、血浆、血清、痰液、粪便、泪液、粘液、唾液、支气管肺泡灌洗液(BAL)、头发、皮肤、红细胞、血小板、小肠液、眼房水、脑脊液、汗液、鼻液、滑液、月经、羊水、精液等。细胞类型和组织也可以包括淋巴液、腹水液(asceticfluid)、妇科液(gynaecologicalfluid)、尿液、腹膜液(peritonealfluid)、脑脊液、通过阴道清洗(rinsing)收集的液体，或者通过阴道冲洗(flushing)收集的液体。组织或细胞类型可以是从动物中取出样品而提供，但是也可以通过使用预先分离的细胞而实现(例如通过另一人在另一时间和/或微粒另一目的而分离)。也可以使用存档组织，如具有治疗或结果历史的那些组织。可以需要或不需要蛋白质或核苷酸分离和/或纯化。
如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。
或者，当核酸或其片段与另一核酸(或其互补链)、一条链或其互补序列在选择性杂交条件下杂交时，则其间存在基本同源或(相同性)。当杂交比特异性整体丧失发生更具选择性时，存在杂交选择性。典型地，当在至少大约14个核苷酸的一段序列存在至少大约55％相同性、优选至少大约65％、更优选至少大约75％及最优选至少大约90％相同性时，发生选择性杂交。如本文所述，同源对比的长度可以是较长的序列节段，在某些实施方案中通常为至少大约20个核苷酸，更通常为至少大约24个核苷酸，典型为至少大约28个核苷酸，更典型为至少大约32个核苷酸，及优选至少大约36或更多个核苷酸。
因此，本发明的多核苷酸与列表1或本文序列表中示出的序列优选具有至少75％、更优选至少85％、更优选至少90％同源性。更优选地，存在至少95％、更优选至少98％同源性。可以如下文关于多肽所述进行核苷酸同源性对比。优选的序列对比程序是下文描述的GCGWisconsinBestfit程序。默认得分矩阵是每个相同核苷酸匹配值是10，每个错配是-9。对于每个核苷酸，默认空位产生罚分是-50，默认空位延伸罚分是-3。
在本发明中，同源物或同源序列是包含与下文序列表或列表1中示出的核苷酸序列在至少20、50、100、200、300、500或1000个核苷酸长度在氨基酸水平是至少60、70、80或90％相同的、优选至少95或98％相同的核苷酸序列。特别地，同源应特别考虑的是编码已知为蛋白质功能必需的连续氨基酸序列而不是非必需的邻近序列的那些序列区域。优选的本发明多肽包含一个连续序列，其与序列表中的示出的一或多个核苷酸序列具有高于50、60或70％同源性，更优选高于80、90、95或97％同源性。优选的多核苷酸可或者或另外包含一个连续序列，其与下文序列表或列表1中示出的编码包含相应氨基酸序列的多肽的序列具有高于80、90、95或97％同源性。
其它优选的多核苷酸包含一个连续序列，其与编码包含相应氨基酸序列的多肽的序列具有高于40、50、60或70％同源性，更优选高于80、90、95或97％同源性。
核苷酸序列优选长度为至少15个核苷酸，更优选长度为至少20、30、40、50、100或200个核苷酸。
通常地，多核苷酸的长度越短，则要求的同源性越高以获得选择性杂交。因此，在本发明的多核苷酸由少于大约30个核苷酸组成的情况中，与本文序列表或列表1中示出的核苷酸序列相比优选相同性百分比高于75％，优选高于90％或95％。相反，在本发明的多核苷酸由例如多于50或100个核苷酸组成的情况中，与本文序列表或列表1中示出的序列相比相同性百分比可以较低，例如高于50％，优选高于60或75％。
本发明的“多核苷酸”组合物包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式及混合的聚合物，有义链和反义链，及可以是化学或生物化学修饰的，或者可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基，这易为本领域技术人员所意识到。这种修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一或多个天然发生的核苷酸、核苷酸间修饰如无电荷的键连(例如甲基磷酸酯，磷酸三酯，磷酸酰胺，氨基甲酸酯等)、带电荷的键连(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)、悬垂部分(pendentmoieties)(例如多肽)、嵌入物(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂，及修饰的键连(例如α端基异构核酸等)。也包括合成分子，其具有模拟多核苷酸通过氢键及其它化学相互作用结合指定序列的能力。这种分子为本领域已知，包括例如其中在分子主链中肽键取代磷酸键。
术语“多肽”是指氨基酸聚合物及其等价物，不涉及产物的特定长度；因此，肽、寡肽和蛋白质均包含在多肽的定义中。这个术语也不涉及或排除多肽的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。包含在该定义中的是例如含有一或多个氨基酸类似物的多肽(包括例如天然氨基酸等)、具有取代的键连以及本领域已知其它的天然和非天然发生的修饰的多肽。
在本发明中，同源序列包括与下文序列表或列表1中示出的编码包含相应氨基酸序列的多肽的序列在至少20、50、100、200、300或400个氨基酸长度在氨基酸水平至少60、70、80或90％相同、优选至少95％或98％相同的氨基酸序列。特别地，同源应典型关于序列的已知为蛋白质功能所必需的那些区域而不是非必需的邻近序列。优选的本发明多肽包含一个连续序列，其与一或多个相应氨基酸具有高于50、60或70％同源性，更优选高于80％或90％同源性。
其它优选的多肽包含一个连续序列，其与序列表或列表1中示出的编码包含相应氨基酸序列的多肽的序列具有高于40、50、60或70％同源性。尽管同源也可以认为关于相似性方面(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但是在本发明中优选以序列相同性表示同源性。术语“基本同源”或者“基本相同”当用于描述多肽时，表示所述多肽或蛋白质与整个天然发生的蛋白质或其一部分呈现至少大约70％相同性，通常至少大约80％相同性，优选至少大约90或95％相同性。
同源对比可以通过目测或者更通常借助于易获得的序列对比程序进行。这些可商购的计算机程序可计算两或多个序列之间的同源性百分比。
同源性百分比(％)可以在连续序列计算，即将一个序列与另一序列排列，一个序列中的每个氨基酸均与另一序列中的相应氨基酸直接对比，一次一个残基。这称作“无空位的”比对。典型地，这种无空位的比对仅在相对较短残基数进行(例如少于50个连续氨基酸)。
尽管这是非常简便和一致的方法，但是其未考虑到例如在另外的相同的成对序列中，一个插入或缺失将导致随后的氨基酸残基脱离排列，因此在进行整体比对时潜在地导致同源性百分比显著降低。因此，大多数序列对比方法设计为产生最佳比对，其考虑到可能的插入和缺失而对整体同源性不过度罚分。这是通过在序列比对中插入“空位”以试图获得局部同源最大化。
然而，这些更复杂的方法为在比对中出现的每个空位指定“空位罚分”，由此对于相同数目的相同氨基酸而言，尽可能少的空位的序列比对-反映两个对比序列之间较高的相关性-与具有许多空位的序列比对相比将获得较高的分值。典型使用“仿射空位成本(Affinegapcosts)”，其对于空位的存在负担相对高成本，及对空位中每个随后的残基较小罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然产生具有较少空位的最佳比对。大多数序列比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用这种软件进行序列对比时，优选使用默认值。例如，当使用GCGWisconsinBestfit程序包(见下文)时，对于氨基酸序列的默认空位罚分是一个空位是-12，每个延伸是-4。
计算最大同源性百分比％因此首先需要考虑到空位罚分产生最佳比对。进行这种比对的合适计算机程序是GCGWisconsinBestfit程序包(UniversityofWisconsin,U.S.A.；Devereuxetal.,1984,NucleicAcidsResearch12:387)。可以进行序列对比的其它软件例如包括但不限于BLAST程序包(见Ausubeletal.,1999ibid–Chapter18)、FASTA(Atschuletal.,1990,J.Mol.Biol.,403-410)及GENEWORKS对比工具套。BLAST和FASTA均可离线和在线获得(见Ausubeletal.,1999ibid,pages7-58to7-60)。然而，优选使用GCGBestfit程序。
尽管最终的同源性百分比％可以根据相同性测量，但是排列过程自身典型非基于全有或全无配对对比。代之，通常使用成比例的相似性评分矩阵，其基于化学相似性或进化距离为每个成对对比赋分。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。GCGWisconsin程序通常使用公开的默认值或者如果提供的自定义符号对比表(见用户手册进一步详述)。优选使用GCG程序包的公开的默认值，或者在其它软件的情况中使用默认矩阵，如BLOSUM62。
一旦软件已经产生最佳比对，则可以计算同源性百分比％，优选序列相同性百分比％。软件典型进行此项作为序列对比一部分并产生数字结果。
多肽“片段”、“一部分”或“节段”是至少大约5-7个连续氨基酸的一段氨基酸残基序列，通常至少大约7-9个连续氨基酸，典型为至少大约9-13个连续氨基酸，更优选至少大约20-30个或更多个连续氨基酸。
优选的本发明多肽与下文序列表或列表1中所示序列具有基本相似功能。优选的本发明多核苷酸编码与下文序列表或列表1中所示序列具有基本相似功能的多肽。“基本相似的功能”是指关于下文序列表或列表1中所示序列或者下文序列表或列表1中所示编码包含相应氨基酸序列的多肽的序列，下文序列表或列表1中示出的序列的核酸或多肽同系物、变体、衍生物或片段的功能。
核酸杂交除了受碱基成分、互补链的长度及杂交核酸之间的核苷酸碱基错配数目影响之外，还受例如盐浓度、温度或有机溶剂等这样的条件影响，这些为本领域技术人员已知。严格温度条件通常包括超过30℃、典型超过37℃，及优选超过45℃。严格盐条件通常是低于1000mM，典型低于500mM，及优选低于200mM。然而，参数的组合比任何单一参数的测量更重要。严格杂交条件的一个实例是在65℃和0.1xSSC(1xSSC＝0.15MNaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)。
如本文所用，“对象”、“患者”和“个体”可以互换使用，是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物。在一些实施方案中，对象可以是人或非人。对象或患者可以是经历或者未经历其它形式治疗。
如本文所用，“对照”是指与任何感染因素不相关的任何状况；无潜在慢性炎症状况、自身免疫疾病或免疫失调，例如哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病、系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病等。
如本文所用，“无感染的全身性炎性反应综合征(后文称作SIRS)”或者“非感染性SIRS”满足四项SIRS标准的至少两项(见下表2)，无临床/放射学感染迹象。
如本文所用，“无SIRS的感染”与“感染”可互换使用，其不满足下表2中四项SIRS标准的至少两项。也存在对感染的临床/放射学怀疑或证实。具有这种状况的患者可存在上呼吸道感染/胸部感染/肺炎(包括排痰性咳嗽、流鼻涕、咽喉痛、胸部X线片有侵润)、尿道感染(包括混浊尿、排尿困难、尿分析亚硝酸盐阳性)、胃肠炎(包括腹泻、呕吐、腹部绞痛)、蜂窝组织炎/脓肿(包括皮肤发红、肿胀、疼痛、红斑)的症状和迹象。
如本文所用，“轻度脓毒症”满足下表2中四项SIRS标准的至少两项，存在对感染的临床/放射学怀疑或证实。该术语也是指具有感染的SIRS。
如本文所用，“重度脓毒症”是指血清乳酸盐>2mmol/L或者>1个器官功能障碍迹象的脓毒症(见下表3)。
如本文所用，“隐匿性休克”是指血清乳酸盐>4mmol/L而无低血压的脓毒症。
如本文所用，“脓毒性休克”是指尽管1升的静脉内晶体液灌注仍具有低血压的脓毒症。
如本文所用，脓毒症连续体(sepsiscontinuum)“状态”或“状况”是指对照、感染(无SIRS)、无感染SIRS、轻度脓毒症、重度脓毒症、隐匿性休克和脓毒性休克。如本文所用，“脓毒症”是指包括轻度脓毒症、重度脓毒症、隐匿性休克和脓毒性休克的一或多个状态或状况。例如，如果对象称之具有脓毒症或者预测具有脓毒症，则该对象可以具有轻度脓毒症或重度脓毒症，或者隐匿性休克或脓毒性休克。如本文所用，“非脓毒症”或“无脓毒症”是指包括对照、感染以及无感染SIRS的一或多个状态或状况。例如，如果对象称之无脓毒症，则该对象可以是对照或者具有感染或者具有无感染的SIRS。
如本文所用，包括多个参照对象的“预定截止值”或者“截止值”，是指测定截止值，通过将测定结果与预定截止值/截止值对比而用于评估诊断、预后或治疗效力结果，其中预定截止值/截止值已经与各种临床指标关连或相关(例如疾病/状况的存在、疾病/状况的阶段、疾病/状况的严重性、疾病/状况的进展、无进展或改善等)。本发明提供了举例的预定截止值/截止值。然而，应意识到截止值可以根据测定性质(例如应用的抗体，反应条件，样品纯度等)而改变。此外，应意识到本发明针对其它测定如免疫测定可以基于本文提供的描述加以调适以获得针对其他测定的免疫测定特异性截止值。而预定截止值/截止值的精确数值可以在测定之间变化，本文描述的相关性通常应是可用的。
除非特别定义，与本发明相关使用的科技术语应具有本领域技术人员通常了解的那些含义。例如，本文描述的关于细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、生物技术、统计学及蛋白质和核酸化学及杂交的任何术语和技术为本领域技术人员熟知且是本领域常用的。术语的含义和范围应是明确的；然而在任何潜在的含糊不清的情况中，本文提供的定义优先于任何词典或非固有定义。进一步地，除非特别要求，单数术语应包括复数形式，复数术语应包括单数形式。
1.材料与方法
1.1.患者队列
在新加坡国立大学医院(NUH)急诊室(ED)进行全部脓毒症连续体患者队列研究。招募的患者在住院单位中随访。也征募健康对照及具有SIRS但无感染迹象的那些患者以证实生物标志物在早期诊断中的差异。
经鉴别满足征募入选标准的对象参与这项研究中。在从对象获得知情同意书之后，抽取12mL血液置于EDTA试管中，在冰上转运至AcumenResearchLaboratories(ARL)。在收集血液后30分钟内，处理样品进行RNA分离。直接从ED出院的患者在30天内追踪其疾病的任何临床复发情况，以保证提取的生物标志物样品的诊断精确性。登记进入研究的所有患者在30天后随访以最终审查，以保证在征募时的诊断精确性。
下表1示出进行队列研究的对象征募入选标准。
表1：将患者纳入脓毒症连续体类别的入选标准(成人21岁及以上)
队列研究的对象征募的排除标准包括如下：年龄低于21岁，已知妊娠，囚犯，不尝试复苏状态(do-not-attemptresuscitationstatus)，需要立即手术，主动化疗，血液系统恶性肿瘤，主治医生认为积极治疗不适合，
不能提供知情同意书或者不能遵守研究要求。
SIRS的四项标准在下表2中示出。
表2：SIRS的四项标准
器官功能障碍的指征在下表3中示出。
表3：器官功能障碍的指征
1.2从患者中收集血液样品
从每个患者中抽取共12mL全血，置于EDTA包被的血液收集管中。将全血在冰上转运，在样品收集的30分钟内进行RNA分离。
1.3RNA样品制备
1.3.1从白细胞中提取RNA
根据厂商指导使用白细胞RNA纯化试剂盒(NorgenBiotekCorporation)进行白细胞RNA提取。
1.3.2RNA质量控制与贮存
RNA浓度和质量使用Nanodrop2000(ThermoFisherScientific)确定。记录RNA浓度、260/280和260/230比率。然后将RNA在无RNase和DNAse的低温保存管(cryotube)中在液氮中储存。
除了Nanodrop之外，还使用生物分析仪(Agilent)检测用于微阵列研究中的样品的RNA质量。获得每个样品的RNA分子完整数(RIN)，分析在每次电泳后由生物分析仪产生的图像。
1.4基因表达微阵列的预处理和分析
在HumanHT-12v4BeadChip上进行全基因组基因表达微阵列。每个阵列覆盖人转录组的超过47,000个转录物和已知剪接变体(NCBIRefSeqRelease38)。
简而言之，扩增及标记从患者血液样品中纯化的500ng总RNA，使用IlluminaTotalPrepRNA扩增试剂盒(Ambion)根据厂商指导进行。然后制备总共750ng标记的cRNA以杂交IlluminaHumanHT-12v4ExpressionBeadChip。在杂交后，在BeadArrayReader上使用BeadScan软件v3.2扫描BeadChips，数据上传至GenomeStudioGeneExpressionModule软件v1.6进一步分析。
进行预处理和随后的生物信息分析，其中使用R软件和lumi程序包调节原始基因表达数据的背景信号、分位数标准化及方差稳定化变换。
在生物信息分析之前，进行在微阵列上的质量检测。评估所有样品具有良好的RIN质量。使用Euclidean距离和平均链接法的无监督分级聚类表明高度相似的生物复制(见图3)。如图3所示，在除去潜在离群值之后(n＝5)，使用微阵列显著性分析(SAM)选择在脓毒症与非脓毒症之间具有显著差异表达的基因(差异倍数>2.0或者<0.5，假发现率＝0)。
通过生物信息和途径分析鉴别在感染、轻度脓毒症和重度脓毒症中的一组显著差异表达的基因。最后，使用JavaTreeview产生热图，使得每个患者组的基因表达谱可视化。
1.5通过qPCR分析性校验筛选后的生物标志物
1.5.1cDNA转化和储存
使用iScriptTMcDNA合成试剂盒(Bio-Rad)根据厂商指导进行RNA样品的cDNA转化。
1.5.2引物设计和校验
使用Primer-BLAST(NCBI，NIH)和Oligo7设计引物对。所有引物对均通过qPCR确认以进行标准曲线分析及在三个不同RNA样品中进行溶解曲线分析，之后筛选在患者样品中进行另外的检测。
引物对通过基于SYBRGreen的qPCR检测。选择特异性(在qPCR溶解曲线分析中一致复制及单峰)在感染与轻度脓毒症对象之间具有强倍数变化的引物对(倍数变化<1.5)。入选总共40个候选脓毒症生物标志物(30个上调基因，10个下调基因)。
使用标准曲线方法检测引物对，以确定qPCR测定的效率(见表14)。PCR效率使用模板稀释系列的线性回归斜率指标确定。入选的生物标志物需要在线性Ct范围(r2>0.99)内的80-120％效率。所有42个引物对(40个入选的脓毒症生物标志物和2个管家基因)的qPCR效率高于80％，这表明针对数据分析的标准ddCt方法是可用的。
1.5.3通过qPCR分析入选的生物标志物在患者样品中的表达
使用三个系统扩增和检测生物标志物：LightCycler1.5(Roche)、LightCycler480InstrumentI(Roche)和LightCycler480InstrumentII(Roche)。LightCyclerFastStartDNAMasterPlusSYBRGreenIKit(Roche)与LightCycler1.5一起使用，而LightCycler480SYBRGreenIMasterKit(Roche)与LightCycler480InstrumentI和II(Roche)一起使用。对于这两种SYBRGreen试剂盒，使用的最终反应体积是10μl及1μM工作引物浓度及4.17μgcDNA模板。
所有反应均在如下循环条件进行：95℃进行10分钟(初始变性)；40-45次如下循环：95℃进行10秒(变性)，60℃进行5秒(变性)及72℃进行25秒(延伸)，随后进行溶解曲线分析和冷却。
入选的生物标志物的Ct值根据管家基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)标准化，以产生每个基因的ΔCt值。也计算脓毒症连续体类别之间的相对表达差异(ΔΔCt值)。然后将ΔΔCt用于计算每个基因的基因表达倍数变化。使用的公式如下所示：
ΔCt＝Ct生物标志物-Ct管家基因
ΔΔCt＝Ct脓毒症类别1–Ct脓毒症类别2
倍数变化＝2-ΔΔCt
1.6用于脓毒症诊断的预测模型的建立和验证
建立能对脓毒症患者与健康对照者进行分类的预测模型，随后预测脓毒症的严重性。这是通过使用46个样品(9个对照样品，14个SIRS样品，14个轻度脓毒症样品及9个重度脓毒症样品)的基因表达(来自qPCR的ΔCt值)基于40个显著差异表达的基因训练预测模型而进行的。预测的模型使用分类模型和回归模型两个成分建立，用于诊断脓毒症患者，及随后分别预测脓毒症的严重性。
采用10倍交叉验证建立和评估5个分类模型(随机森林、决策树、k-最近邻法、支持向量机及逻辑回归)。选择具有最高10倍交叉验证精确性的模型(逻辑回归)(见表4)。相似地，为了预测脓毒症的严重性，应用10倍交叉验证训练和评估不同的回归模型(线性回归、支持向量回归、多层感知器、套索回归、弹性网络回归)。另外，在10倍交叉验证结果方面选择最佳表现回归模型(支持向量回归)(见表5)。
下表4示出了5个数据挖掘模型的10倍交叉验证。
表4：5个数据挖掘模型的10倍交叉验证
索引 方法 灵敏性(％) 特异性(％) 精确性(％)
1. 随机森林 66.7 91.9 86.96
2. J48(决策树) 55.6 89.2 82.61
3. k-最近邻法(k＝2) 88.9 89.2 89.13
4. 支持向量机(poly kernel) 77.8 86.5 84.78
5. 逻辑回归 77.8 91.9 89.13
表5示出5个回归模型的10倍交叉验证。
表5：5个回归模型的10倍交叉验证
索引 方法 Spearman Rho
1. 线性回归 0.8555
2. 支持向量回归 0.8656
3. 多层感知器 0.8029
4. 套索回归 0.8494
5. 弹性网络回归 0.8094
预测模型进行盲法验证。使用25个盲法样品。使用确定的模型进行患者脓毒症预测。结果发至NUH以与临床指定的分类对比。
1.7检测脓毒症的qPCR多元测定的建立与验证
1.7.1测定形式
使用LightCycler480InstrumentI(Roche)andLightCycler480InstrumentII(Roche)进行生物标志物的扩增与检测。使用QuantifastRT-PCR试剂盒(Qiagen)和480ProbesMaster(Roche)。最终反应体积是10μL，使用4.17μg的RNA或cDNA模板。
对于QuantifastRT-PCR试剂盒，使用如下循环条件进行反应：50℃进行20分钟(逆转录)，95℃进行5分钟(初始变性)；40-45次如下循环：95℃进行15秒(变性)，60℃进行30秒(退火与延伸)，随后冷却。对于480ProbesMaster，使用如下循环条件进行反应：95℃进行5分钟(初始变性)；40-45次如下循环：95℃进行10秒(变性)，60℃进行30秒(退火和延伸)及72℃进行1秒(量化)，随后冷却。
1.7.2Taqman探针设计与验证
使用Primer3web网站(www.primer.wi.mit.edu)和Oligo7设计Taqman探针。使用Autodimer检测所有引物和探针组合的二聚体化[1]。所有探针均在标准曲线测定中验证。也进行引物滴定以确定具有一致Ct值可能性的最低引物浓度。
1.7.3引物-探针组合的验证
在多元测定中使用QuantifastRT-PCR+R试剂盒检测引物-探针的不同组合。对于三元测定，对于生物标志物使用0.2μM引物和0.2μM探针，对于管家基因使用0.4μM引物和0.2μM探针。在8个患者样品中检测总共21个三元组合。对比三元和单元测定中的Ct值。仅选择最佳的5个三元组合(对于所有成分基因及所有脓毒症连续体状态类别的平均ΔCt差异<1.0)进行进一步验证。
1.7.4初期三元原型
最佳的5个三元组合在Acumen研究实验室在16个患者样品中验证两次。
2.结果
2.1患者队列
这项研究中包含114个对象：18个健康对照，3个无感染SIRS对象，30个感染对象，45个轻度脓毒症对象，15个重度脓毒症对象，及3个隐匿性休克或脓毒性休克对象。对象的人口统计资料和临床数据在表6中示出。在所有组中年龄、性别和种族的分布是相似的，除了无感染SIRS和隐匿性/脓毒性休克类别组，这两组均具有较少的对象数。在征募的对象中男性占多数。
患者的进展情况在其住院期间及从最初入院30天追踪以监测再次入ED及再住院情况。有6个患者在30天内被送回。2个是与初次入院相似的感染。
下表6示出根据脓毒症连续体分组的对象详细情况。
2.2基因表达谱揭示脓毒症诊断的潜在标志物
为了鉴别能区分健康对照者与感染对象及轻度脓毒症对象的潜在生物标志物，进行全基因组表达微阵列试验(见上文材料与方法章节)。进行与对照组的基因表达倍数变化的微阵列显著性分析(SAM)，以在微阵列上从最初的～33,000个基因中筛选候选基因。使用严格阈值，假发现率＝0，倍数变化>2.0或<0.5，选择在脓毒症中444个显著上调的基因和462个显著下调的基因。许多这些鉴别的基因如ILR1N、IL1B、TLR1、TNFAIP6包含在炎症反应(p＝1.41x10-5)、免疫反应(p＝1.41x10-5)和创伤反应(p＝1.41x10-5)中。这与脓毒症是对感染的炎症反应的结果的事实一致。
2.3选择作为脓毒症生物标志物的一组40个基因
为了将通过SAM鉴别的906个基因减少至临床可行的数目以建立预测模型，仅选择具有最大倍数变化的基因进行进一步检测。总共检测了85个基因，其中11个是下调基因，74个是上调基因。在qPCR验证后，入选40个基因。这组由30个上调的基因和10个下调的基因组成(见下文列表1)。
由于其在白细胞中的稳定表达而选择HRPT1和GAPDH作为管家基因[2]。
列表1列出了30个上调基因和10个下调基因的基因编码序列。列表2示出两个管家基因。
列表1:30个上调基因和10个下调基因的基因编码序列
30个上调基因
1.ACSL1:人乙酰-CoA合成酶长链家族成员1(ACSL1)，mRNA。NCBI参考序列:NM_001995.2(SEQIDNO:1)
2.ANXA3:人膜联蛋白A3(ANXA3)，mRNA。NCBI参考序列:NM_005139.2(SEQIDNO:2)
3.CYSTM1:人半胱氨酸富集的跨膜模块1(CYSTM1)，mRNA。NCBI参考序列:NM_032412.3(SEQIDNO:3)
4.C19orf59:人染色体19开放读框59(C19orf59)，mRNA。NCBI参考序列:NM_174918.2(SEQIDNO:4)
5.CSF2RB:人集落刺激因子2受体，β，低亲和性(粒细胞-巨噬细胞)(CSF2RB)，mRNA。NCBI参考序列:NM_000395.2(SEQIDNO:5)
6.DDX60L:人DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)盒多肽60-样(DDX60L)，mRNA。NCBI参考序列:NM_001012967.1(SEQIDNO:6)
7.FCGR1B:人IgG的Fc片段，高亲和性Ib，受体(CD64)(FCGR1B)，转录变体2，mRNA。NCBI参考序列:NM_001004340.3(SEQIDNO:7)
8.FFAR2:人游离脂肪酸受体2(FFAR2)，mRNA。NCBI参考序列:NM_005306.2(SEQIDNO:8)
9.FPR2:人甲酰肽受体2(FPR2)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_001462.3(SEQIDNO:9)
10.HSPA1B:人热激70kDa蛋白1B(HSPA1B)，mRNA。NCBI参考序列:NM_005346.4(SEQIDNO:10)
11.IFITM1:人干扰素诱导的跨膜蛋白1(IFITM1)，mRNA。NCBI参考序列:NM_003641.3(SEQIDNO:11)
12.IFITM3:人干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_021034.2(SEQIDNO:12)
13.IL1B:人白细胞介素1，β(IL1B)，mRNA。NCBI参考序列:NM_000576.2(SEQIDNO:13)
14.IL1RN:人白细胞介素1受体拮抗剂(IL1RN)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_173842.2(SEQIDNO:14)
15.LILRA5:人白细胞免疫球蛋白样受体，亚家族A(具有TM结构域)，成员5(LILRA5)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_021250.2(SEQIDNO:15)
16.LRG1:人亮氨酸富集的α-2-糖蛋白1(LRG1)，mRNA。NCBI参考序列:NM_052972.2(SEQIDNO:16)
17.MCL1:人髓细胞白血病序列1(BCL2-相关)(MCL1)，编码线粒体蛋白的核基因，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_021960.4(SEQIDNO:17)
18.NAIP:人NLR家族，细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_004536.2(SEQIDNO:18)
19.NFIL3:人核因子，白细胞介素3调节的(NFIL3)，mRNA。NCBI参考序列:NM_005384.2(SEQIDNO:19)
20.NT5C3:人5'-核苷酸酶，细胞溶质III(NT5C3)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_001002010.2(SEQIDNO:20)
21.PFKFB3:人6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_004566.3(SEQIDNO:21)
22.PLSCR1:人磷脂促翻转酶1(PLSCR1)，mRNA。NCBI参考序列:NM_021105.2(SEQIDNO:22)
23.PROK2:人前动力蛋白2(PROK2)，转录变体2，mRNA。NCBI参考序列:NM_021935.3(SEQIDNO:23)
24.RAB24:人RAB24，成员RAS致癌基因家族(RAB24)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_001031677.2(SEQIDNO:24)
25.S100A12:人S100钙结合蛋白A12(S100A12)，mRNA。NCBI参考序列:NM_005621.1(SEQIDNO:25)
26.SELL:人选择蛋白L(SELL)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_000655.4(SEQIDNO:26)
27.SLC22A4:人溶质转运蛋白家族22(有机阳离子/麦角硫因转运蛋白)，成员4(SLC22A4)，mRNA。NCBI参考序列:NM_003059.2(SEQIDNO:27)
28.SOD2:人线粒体超氧化物歧化酶2(SOD2)，编码线粒体蛋白的核基因，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_000636.2(SEQIDNO:28)
29.SP100:人SP100核抗原(SP100)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_001080391.1(SEQIDNO:29)
30.TLR4:人toll-样受体4(TLR4)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_138554.4(SEQIDNO:30)
10个下调基因
1.CCL5:人趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)，mRNA。NCBI参考序列:NM_002985.2(SEQIDNO:31)
2.CCR7:人趋化因子(C-C基序)受体7(CCR7)，mRNA。NCBI参考序列:NM_001838.3(SEQIDNO:32)
3.CD3D:人CD3d分子，δ(CD3-TCR复合物)(CD3D)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_000732.4(SEQIDNO:33)
4.CD6:人CD6分子(CD6)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_006725.4(SEQIDNO:34)
5.FAIM3:人Fas细胞凋亡抑制分子3(FAIM3)，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列:NM_005449.4(SEQIDNO:35)
6.FCER1A:人IgE的Fc片段，高亲和性I受体；α多肽(FCER1A)，mRNA。NCBI参考序列:NM_002001.3(SEQIDNO:36)
7.GZMK:人颗粒酶K(颗粒酶3；类胰蛋白酶II)(GZMK)，mRNA。NCBI参考序列:NM_002104.2(SEQIDNO:37)
8.IL7R:人白细胞介素7受体(IL7R)，mRNA。NCBI参考序列:NM_002185.3(SEQIDNO:38)
9.KLRB1:人杀伤细胞凝集素样受体亚家族B，成员1(KLRB1)，mRNA。NCBI参考序列:NM_002258.2(SEQIDNO:39)
10.MAL:人mal，T-细胞分化蛋白(MAL)，转录变体d，mRNA。NCBI参考序列:NM_022440.2(SEQIDNO:40)
列表2:两个管家基因的基因编码序列
2个管家基因(HKG)
1.HPRT1:人次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)，mRNA。NCBI参考序列:NM_000194.2(SEQIDNO:41)
2.GAPDH:人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，mRNA，NCBI参考序列:NM_002046.5(SEQIDNO:42)
2.440个候选脓毒症生物标志物均具有诊断脓毒症的高灵敏性和特异性
通过qPCR对比感染、轻度脓毒症和重度脓毒症样品与对照样品的相对倍数变化。观测基因表达随着脓毒症连续体的进展性上调或下调(见图1)。这示出选择的一组40个基因具有用于精确性区分脓毒症连续体的对象样品的潜力。
临床上重要的是区分健康对象(对照)与感染患者(感染、轻度脓毒症、重度脓毒症)。特别检测这组基因区分对照组与感染/轻度脓毒症/重度脓毒症的能力，以及区分对照组/感染与轻度脓毒症/重度脓毒症的能力。
脓毒症连续体的基因表达倍数变化高于1.5，该变化足够大而能用于区分(见表15)。
每个脓毒症生物标志物的预测值使用受者作用特征曲线(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)计算，以区分对照组与感染/轻度脓毒症/重度脓毒症以及区分对照/感染与轻度脓毒症/重度脓毒症，以保证入选的生物标志物具有早期区分脓毒症的高预测值(见表16)。对于当区分对照组与感染/轻度/重度脓毒症的预测值，3个生物标志物>95％，18个生物标志物为90-95％以及16个生物标志物为85-90％。对于当区分对照组/感染与轻度/重度脓毒症的预测值，10个生物标志物>95％，20个生物标志物为90-95％及10个生物标志物为85-90％。这两种区分的所有生物标志物的p值均<0.01。
2.5预测模型在脓毒症诊断中达到89％以上的精确性
建立能区分对照组与具有感染、轻度脓毒症和重度脓毒症的对象的预测模型。该模型是两种成分的聚集。第一种成分(分类模型)区分脓毒症患者与对照者。如果样品经鉴别为感染或脓毒症，则第二种成分(回归模型)预测脓毒症的严重性。
从46个样品(9个对照，14个感染样品，14个轻度脓毒症样品及9个重度脓毒症样品)中较早鉴别的40个不同表达的基因的qPCR基因表达数据用于训练预测模型的第一种和第二种成分，使用10倍交叉验证进行。在每种成分中，检测不同的模型，针对特定成分选择最佳性能模型。选择逻辑回归模型，因为其性能优于其它检测模型。在10倍交叉验证评估中，其在脓毒症与对照组分类中达到89.13％的较高整体精确率(灵敏性77.8％，特异性91.9)。
对于第二种成分，选择支持向量回归法预测在第一种成分中发现的脓毒症的严重性。该回归模型在87％的样品中能精确预测脓毒症的严重性。
2.6盲法验证中的预测模型实现在脓毒症诊断中直至88％的精确性
为了进一步验证模型的可用性，进行盲法评估，使用在建立预测模型中未使用的独立数据集。24个样品的独立数据集经临床评估为3个对象是无感染SIRS，4个对照者，2个感染对象，12个轻度脓毒症对象，2个重度脓毒症对象及1个脓毒性休克对象。为了进行评估，将脓毒性休克对象与重度脓毒症对象分在一起。
所述预测模型包含两种目的的两种成分：第一种成分分类脓毒症与对照者；选择的模型具有较高的总体精确率88％，准确地诊断了18个脓毒症对象中的16个对象(敏感度为94％)及精确鉴别出7个对照者中的5个对象(特异性为71％)。更重要地，无感染SIRS对象精确分类为对照，示出候选生物标志物能有效地区分无菌SIRS与脓毒症。
第二种成分是回归模型。尽管由于感染与轻度脓毒症之间的高度相似性而难以预测脓毒症的严重性，但是该模型在区分感染与轻度脓毒症或重度脓毒症的精确性为82％。这个相对较低的精确性表明描述感染与在脓毒症连续体中轻度脓毒症之间的任意阈值，用于指导临床医生对由于感染性病原学而呈现疾病的患者进行风险分层。感染、轻度脓毒症和重度脓毒症以不同程度诱导相似的炎症反应，进一步增加了使用这个模型进行精确预测的难度。
总之，这些结果(见表7和8)表明本发明的方法不仅是可行的，而且可以在早期阶段良好地精确诊断脓毒症。这些结果还表明需要对回归模型再细化以更好地预测脓毒症患者的严重性。
下表7示出分类脓毒症与对照组的一组生物标志物的性能。
表7：分类脓毒症与对照组的一组生物标志物的性能
下表8示出对脓毒症严重性分期的一组生物标志物的性能。
表8：对脓毒症严重性分期的一组生物标志物的性能
2.7检测脓毒症的qPCR多元测定的建立和验证
2.7.1多元测定的建立
为了选择最具预测性的基因以建立多元测定，进行10倍交叉验证。从4个不同的10倍交叉验证分类方法中，鉴别8个重现/重叠基因(见图2)。选择重叠方法，因为其可以降低不同分类模型的内在偏差，根据不同假设对数据集分类。同时，选择另外8个基因，使用来自通过ROC曲线获得的对照与感染/轻度脓毒症/重度脓毒症对比的预测值。选择的基因在下表19中示出。
从最具预测性的基因中设计三元组合。通过对比8个不同患者样品的多元与单元测定中的Ct值筛选共21个组合的三元测定(见表22)。在21个组合中，5个三元测定具有相似的Ct值(ΔCt<1.0)，入选进行进一步验证。
2.7.2使用患者样品验证多元测定
将入选的5个三元测定在另外的8个患者样品中检测。在多元与单元测定中进行成分基因的Ct值对比(见表23)以确定该测定的有效性。观测到仅S100A12/FFAR2/HPRT1在来自不同脓毒症分类的患者样品中给出一致结果。MCL1/CYSTM1/HPRT1不太一致。在其它三个组合中，在对照样品中结果一致，而在脓毒症样品中不一致。管家基因HPRT1的ΔCt在脓毒症样品中较高。这可能是由于扩增被在脓毒症期间高度表达的生物标志物抑制所致。
3.讨论
3.1来自白细胞的生物标志物可用于脓毒症诊断
本发明的微阵列基因表达谱的层次聚类结果表明在具有及不具有感染和脓毒症的患者之间白细胞的基因表达模式中的显著差异。在脓毒症期间差异表达的基因衍生自微阵列基因谱，及一组基因或生物标志物-在这种情况中是40个基因-是从最初33,000个基因中入选的。入选的基因在qPCR测定中验证。使用qPCR的分析性验证示出这些入选的生物标志物在脓毒症连续体对象中进展性失调。这些结果与得自微阵列的那些结果相关。白细胞中基因表达变化可以明显观测到，潜在地用于诊断和/或预后脓毒症及用于评估和/或预测对象中脓毒症的严重性。
使用ROC曲线的AUC获得的每个基因的预测值是令人鼓舞的，每个基因的分值均在85％以上。每个基因的较高的预测值提示选择的基因能用作早期诊断标志物。为了充分利用来自这40个基因的信息，使用所有40个基因的qPCRΔΔCT值建立预测模型。这个预测模型能精确地诊断88％的盲法样品。衍生的基因表达示出在脓毒症连续体中的显著不同，使得可以基于临床表型对脓毒症连续体的对象进行免疫学分离。
3.2利用生物标志物进行脓毒症诊断
通过微阵列分析检验超过33,000个基因。使用SAM，鉴别了在脓毒症连续体差异表达的906个基因，随后进一步减少为40个基因。通过qPCR验证性分析这40个基因在所有对象中的表达，其中倍数变化差异用于建立预测模型。
将通过模型进行的预测与临床分类对比，发现共7个错误的预测。在这7个错误预测中，4个不影响患者管理，3个可导致不利结果。尽管无感染SIRS对象的数目较少，但是该模型在盲样检测中能准确地分类对象。然而，需要进行在随后的临床验证期对模型进一步再细化，以增加其特异性和灵敏性。这组基因可潜在地进一步减少而不牺牲其精确性，以改良成本效率和再现性。对于此，使用较大数据集训练预测模型是最重要的。其它系统改良，如使用新的管家基因以保证用于对比的基线是稳定的并能说明个体的年龄和性别中的差异。
3.3诊断试剂盒的原型设计
获得的定性基因表达数据可用于多种应用，包括通过使用不同的预测模型区分感染与非感染患者、区分脓毒症与非脓毒症患者，及对脓毒症严重性分期。现有数据可以与未来研究的新数据合并以用于新的预测模型的建立。应可取的是新基因可选自微阵列数据。如果可以获得关于患者疾病进展的足够信息及鉴别出特异性用于分类患者疾病进展的新基因，这可以是有益的。因此，采用得自这项研究的数据具有无比的灵活性。
目前，白细胞的RNA用作模板以建立原型。然而，最终的原型的起始材料可以通过多个因素确定，如加工时间和复杂性、测定的灵敏性及稳定性、在医院中可用设备及样品制备的时间均应考虑。
3.4诊断试剂盒的临床用途
目前，尚未有诊断脓毒症的良好标准。大多数初始检测依赖于阳性血液培养物。依赖于血液培养物存在几个主要问题，包括获得最后结果需要的时间长度(24-72小时)、需要较大体积的血液(通常为20ml-40ml)及假阳性率(0.6％-10％)[3,4]。一些基于病原体的分子诊断试剂盒已经可商购以避免这个问题，例如BloodCultureIdentificationpanel(BioFireDiagnosticsInc.)。然而，这种方法仅鉴别刺激宿主炎症反应的病原体(及其副产物，例如内毒素)，使得可以开始靶向的抗微生物治疗，但是未表明由于过度旺盛的宿主炎症反应或者脓毒症严重性导致的附带损害。
血液培养方法的限制也在于由血液中较低细菌浓度、从培养瓶中提取的血液不足、存在在合成培养基上不易生长的微生物或者在样品收集之前抗生素的使用等所致的假阴性结果。来自NUHED在2007-2012年间的数据示出对于65岁以上的患者真正阳性的血液培养物比率仅为21.4％。
利用qPCR测定由于感染/脓毒症所致基因表达变化形式的宿主反应的本发明的诊断试剂盒补充了上述基于病原体的分子技术。确定宿主反应以早期诊断的能力优于利用病原体鉴别，使得可以更快速和精确地管理最初未出现脓毒症临床表现但是随后也许恶化的患者。然后可以早期组建脓毒症管理的支柱包括来源控制、早期血液动力学复苏及支持以及呼吸机支持，以改善患者的结局。基因表达诊断试剂盒需要大约3个小时，为一线医生如急诊医生提供机会以作出快速决定以在医院中分诊及正确的定点护理(right-sitingofcare)。
4.补充方法
4.1基因表达谱
4.1.1可比的微阵列分析的质量控制
进行微阵列杂交的质量控制(QC)。使用的控制指标是杂交方法的杂交控制、针对洗涤温度的低严格检测、针对Cy3结合的高严格检测、针对非特异性杂交的阴性对照、针对样品完整性及杂交量的基因强度检测及最终信号分布分析以检测异常值。
4.2通过qPCR对入选的生物标志物的分析性验证
4.2.1引物设计和验证
使用国家生物技术信息中心(NCBI)的核苷酸数据库获得每个选择的基因的编码序列。然后运行Primer-BLAST以获得每个基因20个不同的引物对。使用的参数是：200bp最大PCR产物大小；20个引物对返回；引物溶解温度最小59℃、最大61℃及最大差异为2℃。然后使用Oligo7经计算机预测(insilico)检测每个引物对的稳定性和用法。选择分值大于700点的最高两个引物对用于qPCR。
在开始试验之前，检测每个引物对以核查其性质。新的引物使用三个不同样品通过qPCR检测。核查溶解曲线以证实无副产物或引物二聚体。另外，进行标准曲线分析以计算引物对的相关系数(r2)和效率(E)。用于计算效率的公式如下：
E＝[-1+10(1/斜率)]x100％
斜率是从标准曲线中计算。然后将验证的引物对用于分析性验证(见表9)。
下表9示出使用的引物列表。
表9：使用的引物列表
4.3检测脓毒症的qPCR多元测定的建立与验证
4.3.1Taqman探针设计与验证
Taqman探针使用Primer3web网站(www.primer.wi.mit.edu)以如下参数设计：探针大小为18-27bp，探针溶解温度为(Tm)65-73℃，GC含量为30-80％。然后使用Oligo7经计算机预测检测每个探针的稳定性与用法。使用Autodimer针对所有引物和探针组合检测引物-探针和探针-探针及引物-引物二聚体化[1](见表10)。
下表10示出引物-探针组合列表。
表10：引物-探针组合列表
引物-探针混合物首先在标准曲线测定中检测，使用系列稀释的模板RNA在两个不同试剂盒进行：MultiplexRT-PCRKit(Qiagen)和480ProbesMaster(Roche)。验证该系列探针以保证探针与引物对相容：扩增效率在80-120％范围，在检测的Ct范围内倍数变化是线性的。
接着，以0.05μM梯度从0.4-0.05μM进行引物滴定，以确定最低引物浓度同时保持在推荐的引物浓度0.4μM的Ct值。
5.补充结果
5.1RNA样品制备
5.1.1RNA质量和数量
建立针对所有RNA样品获得的平均RNA浓度及260/280和260/230比率。获得的RNA质量和数量是浓度>50ng/uL，280/260比率>2.0以及260/230比率>1.7，示出从RNA提取中获得良好产量以及使用的RNA样品未污染蛋白质和碳水化合物。
5.2基因表达谱
5.2.1针对微阵列的RNA质量和浓度
RNA质量和完整性在用于微阵列试验之前用Bioanalyzer检测。用于微阵列中所有样品的RNA完整指数(RIN)均>7。电泳示出存在RNA的锐化带(sharpbands)。结果证实微阵列中使用的RNA样品具有高度完整性及不被降解。
5.2.2微阵列杂交的质量控制
也进行微阵列杂交的质量控制(QC)。试验性(pilot)微阵列(见表12)和第二个微阵列(见表13)的运行均通过所有质量控制检测。
下表12示出试验性微阵列的阵列质量控制的概述。
表12：第一批次微阵列的阵列质量控制概述
下表13示出第二批次微阵列的阵列质量控制概述。
表13：第二次微阵列的阵列质量控制概述
5.3通过qPCR对入选的基因进行分析性验证
5.3.1引物检测与验证
也使用标准曲线方法检测引物对，以确定qPCR测定的效率(见表14)。PCR效率使用模板稀释系列的线性回归斜率指标确定。入选的生物标志物需要在线性Ct范围效率为80-120％(r2>0.99)。在41个引物对中(40个入选的脓毒症生物标志物和1个管家基因)，无一具有qPCR效率<80％。然而，11个引物对的效率>120％。尽管具有>120％效率，但是这些引物对仍用于研究在脓毒症期间基因表达变化，因为在溶解曲线中未检测到假产物。
下表14示出入选的脓毒症生物标志物的引物对的效率及线性Ct范围。
表14：入选的生物标志物的引物对的效率和线性Ct范围
5.3.2入选的基因的诊断性能
图1示出通过qPCR检测的感染、轻度和重度脓毒症样品与对照相比的相对倍数变化。(A)30个上调基因；及(B)10个下调基因。
下表15示出对照与感染及感染与轻度脓毒症之间的倍数变化。C–对照，I–感染，M-轻度脓毒症。
表15：对照与感染及感染与轻度脓毒症之间的倍数变化。C–对照，I–感染，M-轻度脓毒症
下表16示出对照与感染/轻度脓毒症/重度脓毒症及对照/感染与轻度脓毒症/重度脓毒症的生物标志物组的预测值(曲线下面积，AUC)、标准误差及p-值。
表16：对照与感染/轻度脓毒症/重度脓毒症及对照/感染与轻度脓毒症/重度脓毒症的生物标志物组的预测值(曲线下面积，AUC)、标准误差及p-值。
5.3.3区分脓毒症类别的预测模型的衍生
对每个基因加权以产生逻辑回归指数(见表17)。在临床验证期间用于分类盲试患者样品的算法是：
逻辑回归指数＝∑(dCt·w)+I
dCt-根据管家基因标准化的基因循环阈值
w-权重(weight)
I-截距
对于健康对照样品，逻辑回归指数≥0
对于感染/脓毒症样品，逻辑回归指数<0
下表17示出每个基因的权重及逻辑回归模型的截距。
表17：每个基因的权重和逻辑回归模型的截距
No. 基因名称 权重 No. 基因名称 权重
1. IL1RN 2.9035 21. NFIL3 -5.9539
2. SLC22A4 -1.9025 22. IL1B -0.9397
3. PLSCR1 6.3155 23. CYSTM1 8.7944
4. ANXA3 -2.1455 24. CSF2RB -0.6782
5. LRG1 -0.4864 25. IFITM3 12.506
6. C19ORF59 0.5169 26. SOD2 11.0719
7. ACSL1 -2.2421 27. FCGR1B 9.6114
8. PFKFB3 -4.0446 28. S100A12 9.3856
9. FFAR2 -1.5183 29. SP100 7.6691
10. FPR2 -7.6375 30. NAIP -0.0011
11. HSPA1B -1.4681 31. MAL 1.7855
12. NT5C3 -2.9469 32. CCR7 -6.1928
13. DDX60L -5.1756 33. GZMK -1.4079
14. SELL -3.2046 34. FCER1A -7.0497
15. IFITM1 6.8869 35. FAIM3 -11.3155
16. RAB24 -1.6036 36. CD3D 8.0665
17. MCL1-V1 -16.5876 37. CD6 15.9739
18. PROK2 3.3069 38. KLRB1 -1.2603
19. LILRA5 -9.2405 39. IL7R 0.8408
20. TLR4 -1.2054 40. CCL5 3.4355
截距 109.3536
对每个基因加权以产生支持向量回归指数(见表18)。在临床验证期间用于分类盲试患者样品的算法是：
支持向量回归指数＝∑(dCt·w)+I
dCt-根据管家基因标准化的基因循环阈值
w-权重
I-截距
对于感染样品，支持向量回归指数≥1.41
对于轻度脓毒症样品，支持向量回归指数1.41≥x<3.52
对于重度脓毒症样品，支持向量回归指数<3.52
下表18示出每个基因权重及支持向量回归模型截距。
表18：每个基因权重及支持向量回归模型截距
5.4检测脓毒症的qPCR多元测定的建立与验证
图2示出从四种不同分类方法的重叠中鉴别的最具预测性的基因。
下表19示出从两种不同选择方法中鉴别的前8个预测基因列表。
表19：从两种不同选择方法中鉴别的前8个预测基因列表
引物-探针使用标准曲线方法检测，以证实引物-探针可以产生扩增曲线及确定qPCR测定的效率。PCR效率使用模板稀释系列的线性回归斜率确定。与使用SYBRGreen形式的qPCR相似，引物-探针需要在线性Ct范围效率为80-120％(r2>0.99)。
设计12个生物标志物和1个管家基因的引物-探针。两个基因的引物-探针不能产生扩增曲线。在4个管家基因引物探针中，根据最一致的结果选择其中一个。所有工作的探针均具有可接受的效率(80-120％)及在检测的Ct范围是线性的(见表20)。
下表20示出检测的脓毒症生物标志物的引物-探针的效率和线性Ct范围。
表20：检测的脓毒症生物标志物的引物-探针的效率和线性Ct范围
进行引物滴定以降低用于高丰度基因所用的引物浓度(见表21)。降低的引物浓度与推荐的起始工作浓度0.4μM相比应不影响Ct值。降低引物浓度通过qPCR反应物竞争与耗竭而将限制高丰度基因对低丰度基因的扩增抑制作用。因为可能的最小终引物浓度范围为0.20-0.05μM，因此选择0.2μM作为所有生物标志物的终引物浓度。低丰度管家基因的终引物浓度保持在0.4μM。
下表21示出检测的脓毒症生物标志物的引物-探针效率和线性Ct范围。
表21：检测的脓毒症生物标志物的引物-探针的效率和线性Ct范围
下表22示出检测的三元组合。
表22：检测的三元组合
No. 组合
1. CYSTM1/SP100/HPRT1
2. CYSTM1/SOD2/HPRT1
3. CYSTM1/IFITM3/HPRT1
4. FFAR2/SP100/HPRT1
5. FFAR2/SOD2/HPRT135 -->
6. FFAR2/IFITM3/HPRT1
7. IFITM1/SP100/HPRT1
8. IFITM1/SOD2/HPRT1
9. IFITM1/IFITM3/HPRT1
10. MCL1/CYSTM1/HPRT1
11. MCL1/FFAR2/HPRT1
12. MCL1/IFITM1/HPRT1
13. MCL1/SP100/HPRT1
14. MCL1/SOD2/HPRT1
15. MCL1/IFITM3/HPRT1
16. S100A12/CYSTM1/HPRT1
17. S100A12/FFAR2/HPRT1
18. S100A12/IFITM1/HPRT1
19. S100A12/SP100/HPRT1
20. S100A12/SOD2/HPRT1
21. S100A12/IFITM3/HPRT1
表23示出入选的三元组合在多元与单元测定之间具有Ct差异大于1.0的样品数。
表23：入选的三元组合在多元与单元测定之间具有Ct差异大于1.0的样品数
图3示出脓毒症数据面板的无监督分级聚类热图(红色＝高表达，绿色＝低表达)。行是基因，列是脓毒症/对照样品。突出显示的样品是潜在异常值。
6.进一步的实施例
为了进一步证实生物标志物集合或生物标志物组的用途，使用151个患者样品的后续队列。这151个样品如下再分类：36个对照样品，6个无感染SIRS样品，24个无SIRS感染样品，67个轻度脓毒症样品，12个重度脓毒症样品及6个脓毒性休克/隐匿性休克样品。如下段落中的实施例基于这个样品集合。
下表24示出列表1中列出的40个生物标志物或基因的生物标志物组的每个生物标志物针对对照与脓毒症的预测值(曲线下面积(AUC))。在一些实施方案中，本文分别描述的方法或试剂盒使用表24中列出的任一生物标志物或基因。
表24：生物标志物组的每个生物标志物(单个基因)针对对照与脓毒症的预测值(AUC)，HPRT1作为管家基因。
在一些实施方案中，在本文分别描述的方法和试剂盒使用列表1中列出的40个生物标志物或基因中的一或多个及任何组合。
下表25示出列表1中列出的40个生物标志物或基因的生物标志物组的举例的两个生物标志物集合针对对照与脓毒症的预测值(曲线下面积(AUC))，HPRT1/GAPDH作为管家基因。
下表26示出针对对照/无SIRS的感染/无感染SIRS与轻度脓毒症/重度脓毒症/脓毒性休克给予列表1中列出的40个生物标志物或基因的生物标志物组中每个生物标志物的权重。
表26：给予生物标志物组的每个生物标志物或基因权重使得计分算法可以分开对照/无SIRS感染/无感染SIRS与轻度脓毒症/重度脓毒症/脓毒性休克(图4)，HPRT1/GAPDH作为管家基因(n＝151，其中n是样品数目)。
下表27示出针对轻度脓毒症与重度脓毒症/脓毒性休克给予列表1中列出的40个生物标志物的生物标志物组的每个生物标志物权重。
表27：针对轻度脓毒症与重度脓毒症/脓毒性休克给予生物标志物组的每个生物标志物或基因权重(图5)，HPRT1/GAPDH作为管家基因(n＝85，其中n是样品数目)
在一些实施方案中，在本文分别描述的方法或试剂盒使用列表1中列出的40个生物标志物或基因的任意5个。
下表28示出列表1中列出的40个生物标志物或基因的生物标志物组中举例的5个生物标志物集合针对对照组与脓毒症组的预测值(曲线下面积(AUC))，HPRT1/GAPDH作为管家基因。
表28：生物标志物组的举例的5个生物标志物集合或基因针对对照与脓毒症的预测值(AUC)，HPRT1/GAPDH作为管家基因。
在一些实施方案中，本文分别描述的方法或试剂盒使用列表1中列出的40个生物标志物或基因中的任意10个。
下表29示出列表1中列出的40个生物标志物或基因的生物标志物组的举例的10个生物标志物集合针对对照组与脓毒症的预测值(曲线下面积(AUC))，HPRT1/GAPDH作为管家基因。
在一些实施方案中，本文分别描述的方法或试剂盒使用列表1中列出的40个生物标志物或基因中的任意20个。
下表30示出列表1中列出的40个生物标志物或基因的生物标志物组的举例的20个生物标志物集合针对对照与脓毒症的预测值(曲线下面积(AUC))，HPRT1/GAPDH作为管家基因。
在一些实施方案中，在本文分别描述的方法或试剂盒使用列表1中列出的40个生物标志物或基因的任意30个。
下表31示出列表1中列出的40个生物标志物或基因的生物标志物组的举例的30个生物标志物集合针对对照与脓毒症的预测值(曲线下面积(AUC))，HPRT1/GAPDH作为管家基因。
表31：生物标志物组的举例的30个生物标志物或基因集合针对对照与脓毒症的预测值(AUC)，HPRT1/GAPDH作为管家基因。
基因1 ACSL1 ANXA3 C19ORF59 CCL5 CCR7 CD3D CD6 CSF2RB
基因2 KLRB1 LRG1 NAIP TLR4 CD3D ANXA3 SOD2 C19ORF59
基因3 PFKFB3 SLC22A4 S100A12 CYSTM1 SP100 TLR4 IL1B CD3D
基因4 SLC22A4 ACSL1 TLR4 LILRA5 LRG1 C19ORF59 C19ORF59 FFAR2
基因5 LRG1 NFIL3 PFKFB3 C19ORF59 LILRA5 MAL1 CYSTM1 IFITM1
基因6 IL1B CD6 LRG1 PFKFB3 RAB24 RAB24 KLRB1 DDX60L
基因7 C19ORF59 PROK2 IL1B MAL1 ACSL1 FFAR2 MAL1 SP100
基因8 RAB24 CCL5 SOD2 FCER1A S100A12 KLRB1 SELL TLR4
基因9 CYSTM1 SP100 LILRA5 HSPA1B FFAR2 IFITM3 GZMK CYSTM1
基因10 IFITM3 GZMK IL7R SLC22A4 IL7R IL7R RAB24 HSPA1B
基因11 HSPA1B DDX60L PROK2 CD6 IFITM3 CYSTM1 S100A12 NFIL3
基因12 SOD2 MCL1 CYSTM1 IL7R CSF2RB NFIL3 CCL5 S100A12
基因13 IL1RN SELL MAL1 PLSCR1 IL1B ACSL1 PLSCR1 ACSL1
基因14 NAIP LILRA5 KLRB1 PROK2 PROK2 SOD2 CD3D FPR2
基因15 CCR7 S100A12 RAB24 ACSL1 FCER1A SLC22A4 ACSL1 FCER1A
基因16 CCL5 HSPA1B HSPA1B KLRB1 FAIM3 LILRA5 ANXA3 RAB24
基因17 FCGR1B CSF2RB CD3D CSF2RB PFKFB3 SP100 SP100 SLC22A4
基因18 PROK2 IFITM3 ACSL1 ANXA3 FPR2 DDX60L LRG1 LILRA5
基因19 FFAR2 CD3D FPR2 FPR2 C19ORF59 HSPA1B NT5C3 NAIP
基因20 NFIL3 TLR4 CCL5 IL1B MAL1 IFITM1 PROK2 KLRB1
基因21 SP100 FFAR2 SP100 SOD2 KLRB1 GZMK IFITM1 SOD2
基因22 S100A12 FAIM3 FFAR2 MCL1 NFIL3 NAIP HSPA1B IL7R
基因23 CD3D SOD2 IFITM3 FFAR2 DDX60L CCL5 SLC22A4 IL1B
基因24 SELL FCER1A CSF2RB SP100 HSPA1B S100A12 FPR2 SELL
基因25 TLR4 PFKFB3 SLC22A4 NAIP SELL CCR7 IFITM3 ANXA3
基因26 IL7R IL1B SELL RAB24 SLC22A4 IL1B FCER1A PROK2
基因27 CSF2RB IFITM1 IFITM1 IFITM3 TLR4 FPR2 PFKFB3 GZMK
基因28 IFITM1 CCR7 FAIM3 DDX60L NAIP PFKFB3 NAIP PFKFB3
基因29 DDX60L C19ORF59 CCR7 S100A12 SOD2 FCER1A TLR4 IFITM3
基因30 ANXA3 KLRB1 DDX60L IFITM1 CCL5 FAIM3 FFAR2 LRG1
特异性 0.78 0.78 0.74 0.78 0.77 0.78 0.80 0.75
灵敏性 0.90 0.93 0.94 0.90 0.91 0.91 0.90 0.91
AUC 0.91 0.90 0.91 0.91 0.91 0.91 0.90 0.91
表31-续
基因1 CYSTM1 DDX60L FAIM3 FCER1A FCGR1B FFAR2 FPR2 GZMK
基因2 PFKFB3 RAB24 FPR2 SOD2 ACSL1 IFITM3 CCR7 IL1RN61 -->
基因3 IL1B TLR4 PFKFB3 ACSL1 MAL1 IL1RN SP100 SLC22A4
基因4 PROK2 FFAR2 LILRA5 FCGR1B CCR7 CCR7 C19ORF59 LRG1
基因5 FCER1A IFITM1 HSPA1B CYSTM1 LRG1 C19ORF59 NAIP IFITM1
基因6 HSPA1B MCL1 FFAR2 PFKFB3 C19ORF59 RAB24 IL1B DDX60L
基因7 SLC22A4 HSPA1B C19ORF59 HSPA1B IFITM1 FCGR1B TLR4 CD3D
基因8 FFAR2 ANXA3 GZMK ANXA3 CCL5 ACSL1 SOD2 ACSL1
基因9 CCL5 NFIL3 IL7R RAB24 HSPA1B S100A12 ANXA3 CSF2RB
基因10 NAIP LILRA5 ACSL1 LRG1 IL7R KLRB1 S100A12 CCL5
基因11 ACSL1 CCR7 CCL5 NAIP PFKFB3 LILRA5 PFKFB3 CD6
基因12 PLSCR1 CCL5 MAL1 CCL5 CSF2RB IFITM1 IFITM3 C19ORF59
基因13 KLRB1 NAIP LRG1 TLR4 IL1RN CCL5 RAB24 KLRB1
基因14 IFITM1 SOD2 DDX60L C19ORF59 SP100 SOD2 KLRB1 FCER1A
基因15 NT5C3 ACSL1 SLC22A4 FFAR2 S100A12 NAIP FCGR1B SELL
基因16 SOD2 KLRB1 IL1RN CCR7 GZMK PROK2 SLC22A4 CYSTM1
基因17 SP100 IL1B ANXA3 IL1B NAIP HSPA1B IL7R CCR7
基因18 SELL SP100 SP100 PROK2 CYSTM1 ANXA3 IL1RN IFITM3
基因19 CD6 PFKFB3 FCGR1B NT5C3 SLC22A4 IL1B FCER1A LILRA5
基因20 FPR2 LRG1 TLR4 MAL1 SOD2 DDX60L PROK2 IL1B
基因21 IFITM3 PROK2 IL1B DDX60L RAB24 SLC22A4 LILRA5 NAIP
基因22 FCGR1B GZMK FCER1A KLRB1 DDX60L TLR4 CCL5 PROK2
基因23 DDX60L FCER1A NAIP PLSCR1 IL1B NT5C3 MCL1 MAL1
基因24 MAL1 IFITM3 IFITM1 LILRA5 IFITM3 IL7R FFAR2 IL7R
基因25 GZMK MAL1 RAB24 CD6 FAIM3 MAL1 CYSTM1 FFAR2
基因26 ANXA3 FCGR1B SOD2 IFITM1 FPR2 SP100 PLSCR1 TLR4
基因27 FAIM3 SLC22A4 S100A12 IFITM3 FFAR2 FCER1A FAIM3 PFKFB3
基因28 TLR4 CD6 PROK2 MCL1 LILRA5 PFKFB3 IFITM1 RAB24
基因29 LRG1 CD3D IFITM3 FAIM3 TLR4 FPR2 HSPA1B HSPA1B
基因30 C19ORF59 C19ORF59 CYSTM1 SP100 PROK2 CYSTM1 DDX60L SP100
特异性 0.79 0.78 0.79 0.79 0.78 0.79 0.73 0.79
灵敏性 0.90 0.91 0.90 0.90 0.90 0.90 0.94 0.94
AUC 0.90 0.91 0.91 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90
表31–续
基因1 HSPA1B IFITM1 IFITM3 IL1B IL1RN IL7R KLRB1 LILRA5
基因2 CCL5 SLC22A4 PFKFB3 MAL1 NAIP LRG1 IL1RN IFITM1
基因3 SLC22A4 FAIM3 IL7R CCL5 FCGR1B IL1B IL7R CYSTM1
基因4 SELL NAIP IL1B DDX60L RAB24 MCL1 C19ORF59 PFKFB3
基因5 CCR7 SOD2 NAIP NAIP CD3D CCL5 CYSTM1 S100A12
基因6 IFITM1 RAB24 C19ORF59 CSF2RB IL1B TLR4 SELL MCL1
基因7 CD3D C19ORF59 DDX60L FFAR2 LILRA5 CSF2RB GZMK IL1RN
基因8 NAIP KLRB1 SOD2 LILRA5 SP100 SLC22A4 FCER1A FPR2
基因9 LRG1 IL1B ANXA3 CD6 SLC22A4 S100A12 DDX60L C19ORF59
基因10 NFIL3 HSPA1B LRG1 TLR4 IFITM3 KLRB1 IFITM1 FAIM3
基因11 DDX60L CCR7 S100A12 KLRB1 KLRB1 RAB24 NFIL3 MAL162 -->
基因12 IL7R LILRA5 NFIL3 CCR7 LRG1 IFITM3 SLC22A4 SOD2
基因13 ANXA3 PLSCR1 MCL1 PFKFB3 FAIM3 SOD2 S100A12 KLRB1
基因14 FAIM3 NFIL3 FCER1A CYSTM1 PFKFB3 PFKFB3 TLR4 NAIP
基因15 IL1B CYSTM1 LILRA5 IFITM3 C19ORF59 HSPA1B SP100 NT5C3
基因16 SOD2 PFKFB3 SP100 IFITM1 GZMK CCR7 CCR7 ACSL1
基因17 PFKFB3 NT5C3 CCL5 FCGR1B CSF2RB ANXA3 ANXA3 CD3D
基因18 IFITM3 S100A12 CYSTM1 SP100 FCER1A DDX60L IL1B SP100
基因19 GZMK FCER1A RAB24 FAIM3 SELL FAIM3 FAIM3 PLSCR1
基因20 TLR4 TLR4 SELL RAB24 PLSCR1 FCER1A PFKFB3 CCL5
基因21 ACSL1 SP100 ACSL1 SELL CYSTM1 SP100 CCL5 IL1B
基因22 SP100 CSF2RB PROK2 SLC22A4 FPR2 LILRA5 NAIP CD6
基因23 FFAR2 IL7R FFAR2 S100A12 DDX60L PROK2 HSPA1B IL7R
基因24 PLSCR1 ANXA3 TLR4 IL1RN IFITM1 C19ORF59 RAB24 SELL
基因25 C19ORF59 CCL5 PLSCR1 IL7R IL7R FCGR1B FCGR1B RAB24
基因26 LILRA5 FPR2 SLC22A4 LRG1 HSPA1B CD3D ACSL1 IFITM3
基因27 PROK2 MAL1 HSPA1B PROK2 ANXA3 IFITM1 PROK2 TLR4
基因28 CYSTM1 IFITM3 IL1RN HSPA1B ACSL1 FPR2 IFITM3 LRG1
基因29 S100A12 ACSL1 IFITM1 SOD2 CCL5 NAIP LILRA5 SLC22A4
基因30 FCER1A PROK2 CCR7 C19ORF59 TLR4 CYSTM1 LRG1 HSPA1B
特异性 0.72 0.79 0.77 0.79 0.75 0.77 0.75 0.75
灵敏性 0.96 0.93 0.91 0.91 0.94 0.90 0.96 0.94
AUC 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.91 0.90 0.90
表31–续
基因1 LRG1 MAL1 MCL1 NAIP NFIL3 NT5C3 PFKFB3 PLSCR1
基因2 KLRB1 ACSL1 PFKFB3 SLC22A4 DDX60L IFITM3 CYSTM1 S100A12
基因3 IL7R MCL1 C19ORF59 IL7R MAL1 FCER1A NT5C3 NT5C3
基因4 CYSTM1 CSF2RB DDX60L LRG1 CCL5 SELL ACSL1 C19ORF59
基因5 SOD2 S100A12 SOD2 CYSTM1 CSF2RB KLRB1 IL1B FCER1A
基因6 FAIM3 NAIP S100A12 CD3D ACSL1 LILRA5 IL1RN SLC22A4
基因7 S100A12 FCER1A CCL5 FCER1A IFITM3 LRG1 C19ORF59 IFITM3
基因8 FCER1A LILRA5 FFAR2 IL1B CD6 ACSL1 SP100 RAB24
基因9 CD6 HSPA1B CD6 IL1RN SLC22A4 IFITM1 S100A12 CD6
基因10 GZMK DDX60L FPR2 PFKFB3 IFITM1 IL7R TLR4 SELL
基因11 IL1B KLRB1 IFITM3 SP100 FCGR1B RAB24 PROK2 IFITM1
基因12 TLR4 CYSTM1 NT5C3 KLRB1 MCL1 TLR4 FFAR2 GZMK
基因13 C19ORF59 IL7R CCR7 CCR7 LRG1 C19ORF59 CCL5 SOD2
基因14 SLC22A4 SLC22A4 PLSCR1 CCL5 SP100 ANXA3 DDX60L PROK2
基因15 ACSL1 C19ORF59 LRG1 GZMK RAB24 SLC22A4 SELL NAIP
基因16 CCL5 TLR4 IL1RN SOD2 SOD2 FFAR2 FPR2 CCL5
基因17 IFITM1 LRG1 RAB24 DDX60L TLR4 PFKFB3 SOD2 LRG1
基因18 PFKFB3 IFITM1 HSPA1B ANXA3 PROK2 PROK2 HSPA1B FPR2
基因19 NT5C3 SOD2 FCER1A PROK2 FFAR2 FPR2 GZMK CCR7
基因20 SELL FPR2 CD3D IFITM3 HSPA1B FAIM3 LILRA5 IL1B63 -->
基因21 SP100 PFKFB3 KLRB1 PLSCR1 C19ORF59 FCGR1B MCL1 IL7R
基因22 DDX60L IL1B FCGR1B C19ORF59 PFKFB3 HSPA1B IL7R TLR4
基因23 FPR2 CCL5 TLR4 HSPA1B ANXA3 CD3D NAIP FFAR2
基因24 HSPA1B IFITM3 PROK2 SELL FAIM3 CCL5 CCR7 PFKFB3
基因25 FFAR2 FCGR1B SP100 S100A12 NAIP SOD2 PLSCR1 KLRB1
基因26 IFITM3 SP100 IFITM1 TLR4 FCER1A DDX60L SLC22A4 HSPA1B
基因27 CD3D CCR7 LILRA5 FFAR2 S100A12 S100A12 IFITM3 ACSL1
基因28 NAIP GZMK IL1B IFITM1 IL1B SP100 KLRB1 IL1RN
基因29 MCL1 CD6 SLC22A4 FPR2 KLRB1 NAIP LRG1 SP100
基因30 PROK2 FFAR2 NAIP ACSL1 CCR7 IL1B IFITM1 DDX60L
特异性 0.78 0.73 0.80 0.75 0.80 0.77 0.74 0.78
灵敏性 0.91 0.94 0.90 0.93 0.87 0.93 0.94 0.93
AUC 0.91 0.91 0.90 0.91 0.91 0.91 0.91 0.91
表31–续
基因1 PROK2 RAB24 S100A12 SELL SLC22A4 SOD2 SP100 TLR4
基因2 CCL5 CCR7 FFAR2 PLSCR1 LRG1 CYSTM1 CD6 MAL1
基因3 LILRA5 C19ORF59 ANXA3 GZMK IL1B HSPA1B C19ORF59 CYSTM1
基因4 PFKFB3 IFITM1 IFITM3 IFITM1 NAIP IL7R TLR4 MCL1
基因5 ACSL1 HSPA1B IL1B CCL5 HSPA1B ANXA3 FAIM3 ANXA3
基因6 SLC22A4 FPR2 IFITM1 NAIP S100A12 S100A12 HSPA1B CSF2RB
基因7 HSPA1B LILRA5 C19ORF59 DDX60L FCGR1B LILRA5 IL7R PFKFB3
基因8 C19ORF59 FCGR1B SOD2 SP100 IFITM3 CCL5 MAL1 ACSL1
基因9 IL1B KLRB1 FCGR1B IL1RN SP100 MAL1 ANXA3 DDX60L
基因10 GZMK CYSTM1 MCL1 TLR4 PFKFB3 C19ORF59 MCL1 IL1B
基因11 ANXA3 FCER1A LRG1 FFAR2 SELL IFITM3 PFKFB3 FCER1A
基因12 KLRB1 PROK2 TLR4 PROK2 NT5C3 FAIM3 LRG1 CD3D
基因13 FCGR1B FAIM3 KLRB1 PFKFB3 CD3D TLR4 CD3D LRG1
基因14 LRG1 SP100 HSPA1B FAIM3 C19ORF59 KLRB1 KLRB1 SLC22A4
基因15 FCER1A IL7R PLSCR1 LRG1 ACSL1 IFITM1 RAB24 SOD2
基因16 CYSTM1 PFKFB3 CCR7 C19ORF59 ANXA3 NT5C3 IFITM1 IFITM1
基因17 SP100 IL1RN GZMK NFIL3 PLSCR1 PFKFB3 FCER1A HSPA1B
基因18 NAIP SLC22A4 NAIP HSPA1B IFITM1 SP100 FCGR1B CCL5
基因19 CCR7 FFAR2 CD3D ACSL1 KLRB1 FPR2 SOD2 NFIL3
基因20 CD6 PLSCR1 ACSL1 SOD2 MAL1 NFIL3 LILRA5 IL1RN
基因21 FFAR2 ANXA3 CYSTM1 S100A12 NFIL3 RAB24 CCR7 SP100
基因22 SOD2 SOD2 SP100 CD3D FPR2 PROK2 DDX60L C19ORF59
基因23 S100A12 IL1B SLC22A4 SLC22A4 TLR4 CSF2RB PLSCR1 NAIP
基因24 DDX60L IFITM3 RAB24 KLRB1 CCL5 DDX60L IFITM3 IFITM3
基因25 SELL TLR4 DDX60L FPR2 FCER1A ACSL1 CYSTM1 PROK2
基因26 TLR4 MCL1 PFKFB3 FCGR1B FFAR2 IL1RN SLC22A4 RAB24
基因27 IFITM1 CCL5 CCL5 FCER1A FAIM3 FCER1A CCL5 CD6
基因28 RAB24 LRG1 IL7R IFITM3 SOD2 SLC22A4 FFAR2 FFAR2
基因29 IFITM3 DDX60L NFIL3 LILRA5 CYSTM1 FCGR1B NAIP SELL64 -->
基因30 IL7R SELL NT5C3 IL1B GZMK FFAR2 S100A12 KLRB1
特异性 0.78 0.74 0.79 0.80 0.80 0.77 0.74 0.79
灵敏性 0.91 0.94 0.89 0.89 0.89 0.93 0.96 0.91
AUC 0.91 0.91 0.90 0.90 0.90 0.91 0.91 0.90
图4示出表示6个模型(A-F)的箱形图，可以对脓毒症/非脓毒症患者分层。由各个水平线表示的脓毒症/非脓毒症之间预定的截止值基于可达到的最高总精确性的判定规则。对于每个模型，产生基于100个样品的训练集合(左侧)，61个样品的盲试用于验证该模型。所述模型是：
(A)使用40个基因，及作为标准化管家基因的HPRT1。
(B)使用8个基因，及作为标准化管家基因的HPRT1。
(C)使用40个基因，及作为标准化管家基因的GAPDH。
(D)使用8个基因，及作为标准化管家基因的GAPDH。
(E)使用40个基因，及作为标准化管家基因的HPRT1与GAPDH。
(F)使用11个基因，及作为标准化管家基因的HPRT1与GAPDH。
下表32示出上述6个模型针对各自数量的基因(即40个基因，8个基因，40个基因，8个基因，40个基因，11个基因)的预测值(AUC)，HPRT1/GAPDH作为管家基因。
表32：6个模型针对各自数量基因的预测值(AUC)。组合的管家基因表示HPRT1和GAPDH。
基因数 模型 曲线下面积
40 HPRT1管家基因 0.928
8 HPRT1管家基因 0.94
40 GAPDH管家基因 0.927
8 GAPDH管家基因 0.94
40 组合的管家基因 0.927
11 组合的管家基因 0.941
图5示出基于37个基因(A)或14个基因(B)的表示85个脓毒症患者的箱形图。使用可以分开重度脓毒症与轻度脓毒症的2个模型执行权重赋分系统。
图6示出选自对照、感染、轻度脓毒症和重度脓毒症/脓毒性休克的患者中的平均血浆蛋白浓度(S100A12)，表示脓毒症严重性与蛋白质浓度之间的相关性。
有利地，本发明描述的方法、生物标志物和试剂盒可用于早期检测和诊断脓毒症，也用于监测患者以改良这种患者的治疗和结果。
7.有利地，本文描述的方法、生物标志物和试剂盒可用于鉴别和/或分类对象或患者为脓毒症治疗的候选者。
诊断试剂盒
检测试剂盒可含有抗体、适体、扩增系统、检测试剂(生色团、荧光团等)、稀释缓冲液、洗涤溶液、复染剂或者其任意组合。试剂盒成分可以人工包装或者根据先前的方法部分或全部自动化包装。在包含试剂盒的其它实施方案中，本发明涵盖一种试剂盒，其包含本发明的组成成分及任选其使用说明书。这种试剂盒可具有多种用途，包括例如对患者群分层、诊断、预后、指导治疗决策及其它应用。
本领域技术人员意识到本文描述的本发明除了特别描述的之外容许进行改变和修改。本发明包括所有这种改变和修改。本发明还包括在本说明书中提及或指示的单独或全部的所有步骤、特征、配方和化合物，以及任何及所有组合或者任两或多个步骤或特征。
本文中每个文献、参考资料、专利申请或专利均以其全部内容并入参考，这意味着其应被阅读及被读者认为是本文的一部分。本文中引用的文献、参考资料、专利申请或专利在本文中只是由于简洁的原因而不再重复。
针对本文提及的任何产品或者并入本文作参考的任何文献的任何厂商指导、描述、产品说明书和产品表均并入本文作参考，并且可用于本发明的实施中。
本发明不限于由本文描述的任何特定实施方案的范围。这些实施方案只是用于举例说明本发明。功能等价的产品、配方和方法无疑地包含在本发明的范围内。
在此描述的本发明可包括一或多个值的范围(例如大小、浓度等)。值的范围应理解为包括在这个范围内的所有值，包括定义该范围的值，以及与该范围相邻的值，该值与定义范围边界的值导致相同或基本相同的结果。
在本说明书中，除非另外要求，单词“包含”应理解为意味着包含指定的整体或一组整体，但是不除外任何其它整体或一组整体。也应注意的是在本说明书及特别在权利要求书和/或段落中，术语如“包含”等可具有美国专利法定义的含义，例如其可以意味着“包括”等；及术语如“基本由…组成”具有美国专利法定义的含义，例如其顾及到未明确叙述的元素，但是除外在现有领域发现的或者影响本发明基本特征或新特性的元素。
本文所用的选择的术语的其它定义可见于本发明的详细描述中及全文应用。除非特别指出，本文所用所有其它学术和技术术语均具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。
本领域技术人员从本文描述中可以了解上文未明确提及本发明的其它特征、益处和优势。
尽管为了清晰地理解，所述发明已经通过举例和实施例及结合一或多个实施方案详细描述，但是本领域技术人员鉴于本发明的新技术和优势显而易见在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对本发明进行一些变化、改变和修改。
应进一步意识到尽管本发明涉及到单独的实施方案，但是其也包括所述实施方案的组合。例如，在一个实施方案中描述的特征与在另一个实施方案中描述的特征不互相排斥，可以组合形成本发明进一步的实施方案。
参考文献
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2)VandesompeleJ.,DePreterK.,PattynF.,PoppeB.,VanRoyN.,DePaepeA.andSpelemanF.(2002).Accuratenormalizationofreal-timequantitativeRT-PCRdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenes.GenomeBiology3(7):research0034-research0034.11.
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4)SegalAW.Howneutrophilskillmicrobes.AnnuRevImmunol.2005；23:197-223.

Claims (20)

1.一种检测或预测对象中脓毒症的方法，所述方法包括：
i.测量分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的水平；及
ii.将测量的水平与相应生物标志物的参考水平进行比较，
其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，
其中在所述第一个样品中测量的水平与参考水平之间的差异是第一个样品中存在脓毒症的指征。
2.权利要求1的方法，其中脓毒症的存在是通过在对象中检测到在所述第一个样品中测量的至少一个生物标志物的水平与相应生物标志物的参考水平相比增加而确定的，所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸。
3.权利要求1或2的方法，其中脓毒症的存在是通过在对象中检测到在所述第一个样品中测量的至少一个生物标志物的水平与相应生物标志物的参考水平相比减少而确定的，所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸。
4.任意前述权利要求的方法，其中所述参考水平是相应生物标志物在分离自无脓毒症的至少一个对象的第二个样品中的水平。
5.任意前述权利要求的方法，其中比较步骤包括应用判定规则以确定或预测对象中脓毒症的存在与否。
6.检测或预测对象是否具有选自如下多种状况之一的方法：对照、感染、非感染性全身性炎性反应综合征(SIRS)、轻度脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克和隐匿性休克，所述方法包括：
i.测量分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的水平；及
ii.将测量的水平与相应生物标志物的参考水平比较，
其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，
其中在所述第一个样品中测量的水平与参考水平统计学基本相似是该对象是否具有所述状况之一的指征。
7.权利要求6的方法，其中所述参考水平是相应生物标志物在分离自选自如下的至少一个对象的第二个样品中的水平：对照对象、感染阳性对象、非感染性SIRS阳性对象、轻度脓毒症阳性对象、重度脓毒症阳性对象和隐匿性休克阳性对象。
8.权利要求6或7的方法，其中比较步骤包括应用判定规则确定或预测对象是否具有所述状况之一。
9.执行权利要求1-5任一项的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
i.能特异性结合所述至少一个生物标志物以量化对象的第一个样品中的生物标志物水平的至少一种试剂；及
ii.表示相应生物标志物的参考水平的参考标准。
10.权利要求9的试剂盒，其中所述至少一种试剂包含能特异性结合所述至少一种生物标志物的至少一种抗体。
11.权利要求9或10的试剂盒，进一步包含能特异性结合第一个样品中至少一个另外的生物标志物的至少一种另外的试剂，以及表示相应的至少一个另外的生物标志物的参考水平的参考标准。
12.执行权利要求6-8任一项的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
i.能特异性结合所述至少一个生物标志物以量化对象的第一个样品中的生物标志物水平的至少一种试剂；及
ii.表示相应生物标志物的参考水平的参考标准。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述至少一种试剂包含能特异性结合所述至少一个生物标志物的至少一种抗体。
14.权利要求12或13的试剂盒，进一步包含能特异性结合第一个样品中至少一个另外的生物标志物的至少一种另外的试剂，以及表示相应的至少一个另外的生物标志物的参考水平的参考标准。
15.检测或预测对象中脓毒症的试剂盒，包含能选择性结合分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的抗体，以及检测在抗体与至少一个生物标志物的补体成分之间形成的复合物的试剂，其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，以及表示相应生物标志物的参考水平的参考标准，其中在所述第一个样品中测量的至少一个生物标志物的水平与参考水平之间的差异是第一个样品中存在脓毒症的指征。
16.权利要求15的试剂盒，其中参考水平是相应生物标志物在分离自无脓毒症的至少一个对象的第二个样品中的水平。
17.检测或预测对象是否具有选自如下多种状况之一的试剂盒：对照、感染、非感染性全身性炎性反应综合征(SIRS)、轻度脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克及隐匿性休克，所述试剂盒包含能选择性结合分离自对象的第一个样品中的至少一个生物标志物的抗体，以及检测在抗体与至少一个生物标志物的补体成分之间形成的复合物的试剂，其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一序列所示核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中的任一序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，以及表示相应生物标志物的参考水平的参考标准，其中在所述第一个样品中测量的至少一个生物标志物的水平与参考水平统计学基本相似是所述对象是否具有所述状况之一的指征。
18.权利要求17的试剂盒，其中参考水平是相应生物标志物在分离自选自如下的至少一个对象的第二个样品中的水平：对照对象、感染阳性对象、非感染性SIRS阳性对象、轻度脓毒症阳性对象、重度脓毒症阳性对象及隐匿性休克阳性对象。
19.检测或预测对象中脓毒症的方法，所述方法包括：
i.测量分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的水平；及
ii.将测量的水平与相应生物标志物的参考水平进行比较，
其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一或多个及任何组合所示的核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一或多个及任何组合的序列所示的核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中任一或多个序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，
其中在所述第一个样品中测量的水平与参考水平之间的差异是第一个样品中存在脓毒症的指征。
20.检测或预测对象是否具有选自如下多种状况之一的方法：对照、感染、非感染性全身性炎性反应综合征(SIRS)、轻度脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克和隐匿性休克，所述方法包括：
i.测量分离自对象的第一个样品中至少一个生物标志物的水平；及
ii.将测量的水平与相应生物标志物的参考水平进行比较，
其中所述至少一个生物标志物选自：(a)包含如下任一或多个及任何组合所示的核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40；(b)包含(a)中任一或多个及任何组合所示的核苷酸序列的多核苷酸，其编码包含相应氨基酸序列的多肽；及(c)包含能与(a)、(b)中任一或多个序列或其互补序列选择性杂交的核苷酸序列的多核苷酸，
其中在所述第一个样品中测量的水平与参考水平统计学基本相似是所述对象是否具有所述状况之一的指征。
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