CN114606308A - 脓毒症ards的预后与治疗标志物 - Google Patents

脓毒症ards的预后与治疗标志物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脓毒症ARDS的预后与治疗标志物。本发明为肺外及肺内脓毒症感染导致的ARDS患者提供一种新的，有效的预后标志物检测方案，此外还提供了一种新型的肺内脓毒症感染导致的ARDS的治疗方案。

Description

脓毒症ARDS的预后与治疗标志物
技术领域
本发明属于生物医学应用领域，具体地涉及脓毒症ARDS的预后与治疗标志物。
背景技术
急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratorydistress syndrome,ARDS)是指发生于严重感染、休克、创伤及烧伤等疾病过程中，由于肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞的损伤，进而引起肺泡毛细血管通透性增加，肺泡腔内含有蛋白的水肿液集聚，引起的弥漫性肺间质水肿，并导致的以进行性低氧血症、呼吸窘迫为特征的临床综合征。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)在众多病因中，以脓毒症最多见，ARDS是急危重症患者死亡的主要原因之一。因其病情进展迅速，病死率高，缺乏有效的治疗手段，己成为当前呼吸危重症领域亟待解决的难题。目前，ARDS的临床及基础研究始终备受关注，探索ARDS的及时有效的治疗方法及预后指标一直是研究的热点。
宏基因二代测序技术(metagenomics next-generation sequencing,mNGS)对重症肺炎导致的ARDS能提高临床诊断效率、指导临床用药后能改善患者预后的作用。目前，对于肺部微生态与呼吸系统疾病关系的研究都是初级阶段，尤其针对肺部微生态与ARDS的研究相知甚少，肺部微生态的变化在ARDS患者的相互作用及其机制尚不明确。有研究提出ARDS与肺部微生物群的改变可以相互影响。第一，ARDS感染或其他常见的病因会直接改变肺部微生物群，包括呼吸机损伤、误吸等。第二个则是相反的关系：肺部微生物群的改变可以促进肺损伤。在ARDS中由于肺部微生物群的改变，影响肺血管通透性增加、stark氧梯度的建立、促进细菌生长的炎症分子的激增和局部宿主防御的损伤，从而彻底改变肺泡生态系统。第三，即一旦肺微生态失衡和肺损伤都建立起来，它们就会在一个正反馈循环中互相作用。综上所述，这些发现表明肺微生物组是临床变异的一个无法解释的来源，是解决ARDS的一个潜在治疗靶点。
因此微生态的变化与呼吸系统疾病和ARDS的关系如何，能否影响疾病的发生发展和预后，值得深入探讨。本发明通过mNGS挖掘测序数据，分析脓毒症导致ARDS患者肺部微生态在脓毒症ARDS疾病转归中的作用，从肺微生物群的变化预测该人群的疾病预后，筛选出与患者预后相关的微生物标志物，寻找新的治疗靶点。
发明内容
发明人经过大量临床样本的宏基因组测序，对测序结果进行创造性地分析和研究论证，挖掘出数个有价值的预后标志物，指导ARDS患者的预后评估和治疗。
因此，在一些实施方案中，本发明提供用于检测微生物标志物的材料在制备肺外脓毒症感染导致的ARDS患者预后评估试剂盒中的用途，其中微生物标志物选自Bifidobacterium、Bilophila、Mediterranea、Anaerostipes、Bacillus、Dorea、Collinsella至少一种。
在一些实施方案中，其中肺外包括血、胃肠道、肝胆胰腺、皮肤、或泌尿系统。
在一些实施方案中，其中来自患者的样品中Bifidobacterium、Bilophila、Mediterranea、Anaerostipes、Bacillus、Dorea、Collinsella至少一种微生物标志物存量超出截断值，判断肺外脓毒症感染导致的ARDS患者预后不良。
在一些实施方案中，本发明提供用于检测微生物标志物的材料在制备肺内脓毒症感染导致的ARDS患者治疗后预后评估试剂盒中的用途，其中微生物标志物选自Cryptococcus、Escherichia、Lachnospiraceae、Hydrobacter至少一种。
在一些实施方案中，其中来自患者的样品中Cryptococcus、Escherichia、Lachnospiraceae至少一种微生物标志物存量超出截断值，判断肺内脓毒症感染导致的ARDS患者治疗后预后不良。
在一些实施方案中，其中来自患者的样品中Hydrobacter存量低于截断值，判断肺内脓毒症感染导致的ARDS患者治疗后预后不良。
在一些实施方案中，其中用于检测微生物标志物的材料包括检测所述微生物标志物存量的方法所用的材料；例如显微镜检测法、培养物检测法、特异性抗体检测法、特异性抗原检测法、DNA检测法、RNA检测法。
在一些实施方案中，其中对来自患者的样品采用所述材料进行微生物标志物检测，所述样品包括支气管肺泡灌洗液。
在一些实施方案中，本发明提供Hydrobacter在制备肺内脓毒症感染导致的ARDS治疗制剂的用途。
在一些实施方案中，所述治疗制剂包括Hydrobacter，以及作为治疗制剂的辅助成分或者其他联用药物。
本发明涉及的所有实施方案具有的技术优点包括：为肺外及肺内脓毒症感染导致的ARDS患者提供一种新的，有效的预后标志物检测方案，此外还提供了一种新型的肺内脓毒症感染导致的ARDS的治疗方案。
附图说明
图1：Control组与ARDSp-Dead组之间的差异病原微生物；
图2：ARDSp-Survival组与ARDSp-Dead组之间的差异病原微生物；
图3：ARDSp-Survival组与ARDSp-Dead组之间的差异背景菌；
图4：Control组与ARDSp-Dead组之间的差异背景菌；
图5：Control组与ARDSexp-Dead组之间的差异病原微生物；
图6：ARDSexp-Survival组与ARDSexp-Dead组之间的差异病原微生物；
图7：ARDSexp-Survival组与ARDSexp-Dead组之间的差异背景菌(由于菌群过多，只展示部分)；
图8：Control组与ARDSexp-Dead组之间的差异背景菌；
图9：ARDSexp-Dead组分别与ARDSexp-Survival组和Control组相比，均增加的菌群；
图10：Bifidobacterium、Bilophila、Mediterranea、Anaerostipes、Bacillus、Dorea、Collinsella与ARDSexp的生存曲线；
图11：Bifidobacterium、Bilophila、Mediterranea、Anaerostipes、Bacillus、Dorea、Collinsella与ARDSexp 90天生存率的单变量分析；
图12：ARDSp-preT组比ARDSp-poT-Survival组减少的菌群；
图13：ARDSp-poT-Dead组比ARDSp-poT-Survival组减少和增加的菌群；
图14：ARDSp-poT-Dead组比Control组减少和增加的菌群；
图15：ARDSp-preT组比ARDSp-poT-Survival组减少、ARDSp-poT-Dead组比ARDSp-poT-Survival组减少、ARDSp-poT-Dead组比Control组减少的共同菌群分析；
图16：Hydrobacter在各组中的阳性率及丰度差异；
图17：ARDSp-poT-Dead组比ARDSp-preT组增加的菌群；
图18：以ARDSp-poT-Dead组比ARDSp-preT组增加、ARDSp-poT-Dead组比ARDSp-poT-Survival组增加、ARDSp-poT-Dead组比Control组增加的共同菌群分析；
图19：Cryptococcus、Escherichia、Lachnospiraceae在各组中的阳性率及丰度差异。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本部分仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
发明人经过大量临床样本的宏基因组测序，对测序结果进行创造性地分析和研究论证，挖掘出数个有价值的预后标志物，指导ARDS患者的预后评估和治疗。
因此，在一些实施方案中，本发明提供用于检测微生物标志物的材料在制备肺外脓毒症感染导致的ARDS患者预后评估试剂盒中的用途，其中微生物标志物选自双歧杆菌群(Bifidobacterium)、嗜胆菌群(Bilophila)、地中海单胞菌群(Mediterranea)、丁酸弧菌群(Anaerostipes)、芽孢杆菌群(Bacillus)、多尔氏菌群(Dorea)、柯林斯菌群(Collinsella)至少一种。
在一些实施方案中，肺外包括除肺意外的其他器官、组织；在一些实施方案中，其中肺外包括血、胃肠道、肝胆胰腺、皮肤、或泌尿系统。
在一些实施方案中，适用本发明定义“截断值”又名cutoff值，在医学诊断领域，一般视为将健康人与特定疾病区分开来的适当值，同一指标，对于不同疾病判断有不同的截断值。例如，对于NT-proBNP，与用于区分健康婴儿和先天性非球形红细胞性贫血婴儿的截断值相比，用于区分健康婴儿和无紫绀性心脏病婴儿的截断值较低。在一些实施方案中，其中来自患者的样品中Bifidobacterium、Bilophila、Mediterranea、Anaerostipes、Bacillus、Dorea、Collinsella至少一种微生物标志物存量超出截断值，判断肺外脓毒症感染导致的ARDS患者预后不良。其中，嗜胆菌群(Bilophila)增多最显著，是最有效的ARDSexp预后标志物。
在一些实施方案中，本发明提供用于检测微生物标志物的材料在制备肺内脓毒症感染导致的ARDS患者治疗后预后评估试剂盒中的用途，其中微生物标志物选自埃希菌群(Escherichia)、毛螺旋菌群(Lachnospiraceae)、隐球菌群(Cryptococcus)、Hydrobacter至少一种。
在一些实施方案中，其中来自患者的样品中Cryptococcus、Escherichia、Lachnospiraceae至少一种微生物标志物存量超出截断值，判断肺内脓毒症感染导致的ARDS患者治疗后预后不良。
在一些实施方案中，其中来自患者的样品中Hydrobacter存量低于截断值，判断肺内脓毒症感染导致的ARDS患者治疗后预后不良。其中，Hydrobacter最早在纯净水中发现，未有相关文献报道Hydrobacter在下呼吸道的作用，这点是出乎意料的。从本发明可见，Hydrobacter无论是阳性率或是丰度差异的比较，在对照组中最高，随着预后转差而减少，预后好转而增加，是有效的肺部益生菌(潜在的ARDSp保护因素)。
在一些实施方案中，其中用于检测微生物标志物的材料包括检测所述微生物标志物存量的方法所用的材料；在一些实施方案中，存量是指所述微生物标志物的含量、相对水平；或者微生物的特异性抗原、特异性抗体、核酸水平/相对水平；在一些实施方案中，可以采用常规的微生物检测方法，检测微生物标志物的存量；例如在一些实施方案中，利用显微镜检测法(如电镜观察)、培养物检测法(如微生物培养)、特异性抗体检测法(如检测特定微生物的抗体)、特异性抗原检测法(如检测特定微生物抗原)、DNA检测法(检测特定微生物的DNA、DNA测序)、RNA检测法(检测特定微生物的RNA，组录组测序)等等，但不限于此。
在一些实施方案中，其中对来自患者的样品采用所述材料进行微生物标志物检测，所述样品包括支气管肺泡灌洗液。
在一些实施方案中，本发明提供Hydrobacter在制备肺内脓毒症感染导致的ARDS治疗制剂的用途。
在一些实施方案中，所述治疗制剂包括Hydrobacter，以及作为治疗制剂的辅助成分或者其他联用药物。其中在一些实施方案中，辅助成分例如可以是益生元，提高益生菌/微生物活性，或者保护微生物的物质，如一些包裹剂。在一些实施方案中，联用药物例如可以是治疗脓毒症的药物，如抗生素，或者治疗ARDS的药物。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
病例及样本
本发明病例与样本来自江门市中心医院，且通过伦理审查委员会审查批准及患者同意。
回顾性分析2018年1月至2021年6月在江门市中心医院ICU收治由脓毒症引起的急性呼吸窘迫综合征病例共156例。脓毒症导致的ARDS根据起始感染部位分为：肺内感染导致的ARDS称为ARDSp组(Acute respiratory distress syndrome ofpulmonary)共111例，肺外感染导致的ARDS称为ARDSexp组(Acute respiratory distress syndromeofextrapulmonary)共45例，其中感染部位7例血、18例胃肠道、9例肝胆胰腺、10例皮肤、1例泌尿系统。。收集在同时期收治ICU存在轻症肺部感染非ARDS的患者作为对照Control组共28例，所有对照组患者均预后良好，转出ICU后90天内未重返ICU。
所有患者均采用纤维支气管镜获取支气管肺泡灌洗液(BALF)标本。收集标本时间在ICU诊断ARDS 24小时以内、当天使用抗生素前留取基线样本。部分病例经治疗7天，留取治疗后标本，基线标本及治疗后标本送检验科进行病原学培养。最后标本统一送检南芯医疗公司进行宏基因组DNA测序，包括：核酸提取、文库构建、高通量测序、生物信息学分析、病原数据判读；。
所有患者按照脓毒症指南治疗，结合临床感染指标及影像学信息，采用经验性抗感染治疗。ARDS患者按照ARDS通气指南进行机械通气治疗，抗感染方案综合患者炎症指标、影像学资料、微生物检测结果作出调整。
病例信息分组分析
1、将ARDSp组111例，ARDSexp组45例，Control组28例，根据不同的预后进行分层，在ICU治疗好转可以顺利脱离呼吸机并转出ICU七天内存活，定义为存活组Survival组；而在ICU治疗失败器官功能衰竭死亡，定义为死亡组Dead组。按照不同病因不同预后分为：ARDSp-Survival组57例，ARDSp-Dead组54例，ARDSexp-Survival组20例，ARDSexp-Dead组25例。通过比较ARDSp-Survival组、ARDSp-Dead组、ARDSexp-Survival组、ARDSexp-Dead组及Control组患者BALF的宏基因组DNA测序结果，分析不同组别之间微生群的异同，寻找与预后相关的微生物标志物。
2、选取ARDSp组治疗前后对照的数据齐全的病例共30例，分为治疗前组ARDSp-preT和治疗后组，其中，治疗后组根据在ICU治疗好转可以顺利脱离呼吸机并转出ICU七天内存活，分为治疗后存活组ARDSp-poT-Survival，共15例。而在ICU治疗失败器官功能衰竭死亡，定义为治疗后死亡组ARDSp-poT-Dead，共15例。Control组28例。通过比较ARDSp-preT组、ARDSp-poT-Survival组、ARDSp-poT-Dead组、Control组患者BALF的宏基因组DNA测序结果，分析不同组别之间微生群的异同。尝试经治疗前后对比，是否可筛选出与ARDSp死亡相关的致病菌(潜在的死亡危险因素)及ARDSp生存相关的益生菌(潜在的生存保护因素)。
统计分析
根据每个菌群的测序结果，分别进行丰度和阳性率的统计比较。其中，分析菌群的丰度时，先将测序结果的RPM值进行log2处理，再进行两两比较的t检验，剔除两组中位值均为0的菌群。分析菌群出现的阳性率则使用卡方检验：将RPM值≥1的病原微生物的定义为阳性，RPM＜1定义为阴性；分析背景菌时，将RPM值＞0定义为阳性，RPM＝0定义为阴性，再进行卡方检验或Fisher检验。所有统计分析使用GraphPad 5.0或R3.4.4软件进行。P<0.05认为有统计学意义。
病例的基本特征
本发明的脓毒症导致的ARDS患者(即ARDS组，156例)与Control组(28例)相比，在年龄与性别上无统计学差异。
ARDSp组(111例)与ARDSexp组(45例)相比，在年龄、性别、基础疾病比例(高血压、冠心病、慢性阻塞性肺疾病、慢性肾功能不全、糖尿病、免疫抑制、肿瘤、吸烟、酗酒)、90天全因死亡率上无统计学差异。
病原微生物和背景菌
本发明测序共测出2728种微生物，由于病原微生物占据大部分的测序信息，背景菌占比少且与病原微生物RPM数量差别太大，因此本发明将病原微生物和背景菌群分别分析。根据2019年Chinet监测数据及测序实验室检测常见的病原微生物，提取常见院内感染病原微生物，包括常见细菌、真菌、病毒及特殊病原体，共57种(见下表1，作为病原微生物)。其余的微生物考虑为背景微生物，整合以属的水平共1040种，后续分析分别从病原微生物和背景菌两方面展开。
表1常见的病原微生物
Figure BDA0003499422960000071
Figure BDA0003499422960000081
Figure BDA0003499422960000091
在ARDSp肺部微生组上寻找预后相关标志物
本发明将上述ARDSp组患者根据不同的预后进行分层，通过比较ARDSp-Survival组、ARDSp-Dead组及Control组患者不同组别之间微生物群的异同，寻找与预后相关的微生物标志物。其中，ARDSp-Dead组对比Control组和ARDSp-Survival组同时增加或减少的病原微生物和背景菌群为与预后相关的标志物。
在病原微生物方面，与Control组对比，ARDSp-Dead组检测出总致病菌(Pathogens)、真菌(Fungus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、大肠埃希菌(Escherichia coli)的阳性率更高，差异有统计学意义(图1)。与ARDSp-Survival组对比，ARDSp-Dead组检测出铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的阳性率更高，差异有统计学意义(图2)。因此，在病原微生物方面未筛选出同时增加或减少的菌群，即未筛选出与预后相关的微生物标志物。
在背景菌方面，将ARDSp-Dead组分别与ARDSp-Survival组(图3)、Control组(图4)的菌群进行对比，我们未筛选出同时增加或减少的背景菌群，因此在背景菌方面未筛选出与预后相关的微生物标志物。
在ARDSexp肺部微生组上寻找预后相关标志物
使用上述的方法，通过比较ARDSexp-Survival组、ARDSexp-Dead组及Control组患者不同组别之间微生物群的异同，寻找与预后相关的微生物标志物。其中，ARDSexp-Dead组对比Control组和ARDSexp-Survival组同时增加或减少的病原微生物和背景菌群为与预后相关的标志物。
在病原微生物方面，与Control组对比，ARDSexp-Dead组检测出大肠埃希菌(Escherichia coli)的阳性率更高，差异有统计学意义(图5)。与ARDSexp-Survival组对比，ARDSexp-Dead组检测出流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的阳性率更高，差异有统计学意义(图6)。因此，在病原微生物方面未筛选出与预后相关的微生物标志物。
在背景菌方面，将ARDSexp-Dead组分别与ARDSexp-Survival组(图7)和Control组(图8)的菌群进行对比，我们筛选出同时增加的菌群(图9)有：Bifidobacterium、Bilophila、Mediterranea、Anaerostipes、Bacillus、Dorea、Collinsella。通过生存曲线分析也说明它们的增多是ARDSexp死亡的危险因素(图10)。进一步的多因素COX回归分析，可见Bilophila的增多用于ARDSexp生存预后分析最显著(图11)，是有效的预后标志物，可用于ARDSexp的预后评估。
ARDSp治疗前后肺部微生物群的变化
由于通过不同预后的比较未能筛选出与ARDSp预后相关的微生物标志物。我们选取30例具有完整治疗前后的病原微生物前后对比的数据进行分析，分析ARDSp组治疗前和治疗后患者肺部微生态的异同，根据不同的预后，寻找ARDSp患者肺部微生态在ARDS疾病转归中的变化规律。尝试经治疗前后对比，是否可筛选出与ARDSp死亡相关的致病菌(潜在的死亡危险因素)及ARDSp生存相关的益生菌(潜在的生存保护因素)。
在ARDSp生存相关的益生菌标志物筛选上，我们以ARDSp-preT组比ARDSp-poT-Survival组减少(图12)、ARDSp-poT-Dead组比ARDSp-poT-Survival组减少(图13)、ARDSp-poT-Dead组比Control组减少(图14)的菌群为肺部益生菌(潜在的ARDSp保护因素)。上述三种比较同时筛选出共同的菌是Hydrobacter(图15)。Hydrobacter无论是阳性率或是丰度差异的比较，在对照组中最高，随着预后转差而减少，预后好转而增加(图16)，可见Hydrobacter是有效的ARDSp生存相关的益生菌，可用于ARDSp治疗后的预后评估，或可以用于治疗。
在ARDSp死亡相关的致病菌标志物筛选上，我们以ARDSp-poT-Dead组比ARDSp-preT组增加(图17)、ARDSp-poT-Dead组比ARDSp-poT-Survival组增加(图13)、ARDSp-poT-Dead组比Control组增加(图14)的菌群为肺部致病菌(潜在的ARDSp死亡危险因素)。上述三种比较同时筛选出共同的菌(图18)是Cryptococcus、Escherichia、Lachnospiraceae。Cryptococcus、Escherichia、Lachnospiraceae无论是阳性率或是丰度差异的比较，在对照组中最少，随着预后转差而增加，预后好转而减少(图19)，可见Cryptococcus、Escherichia、Lachnospiraceae分别是有效的ARDSp死亡相关致病菌，可用于ARDS治疗后的预后评估。

Claims (10)

1.用于检测微生物标志物的材料在制备肺外脓毒症感染导致的ARDS患者预后评估试剂盒中的用途，其中微生物标志物选自Bifidobacterium、Bilophila、Mediterranea、Anaerostipes、Bacillus、Dorea、Collinsella至少一种。
2.根据权利要求1所述的用途，其中肺外包括血、胃肠道、肝胆胰腺、皮肤、或泌尿系统。
3.根据权利要求1所述的用途，其中来自患者的样品中Bifidobacterium、Bilophila、Mediterranea、Anaerostipes、Bacillus、Dorea、Collinsella至少一种微生物标志物存量超出截断值，判断肺外脓毒症感染导致的ARDS患者预后不良。
4.用于检测微生物标志物的材料在制备肺内脓毒症感染导致的ARDS患者治疗后预后评估试剂盒中的用途，其中微生物标志物选自Cryptococcus、Escherichia、Lachnospiraceae、Hydrobacter至少一种。
5.根据权利要求4所述的用途，其中来自患者的样品中Cryptococcus、Escherichia、Lachnospiraceae至少一种微生物标志物存量超出截断值，判断肺内脓毒症感染导致的ARDS患者治疗后预后不良。
6.根据权利要求4所述的用途，其中来自患者的样品中Hydrobacter存量低于截断值，判断肺内脓毒症感染导致的ARDS患者治疗后预后不良。
7.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其中用于检测微生物标志物的材料包括检测所述微生物标志物存量的方法所用的材料；例如显微镜检测法、培养物检测法、特异性抗体检测法、特异性抗原检测法、DNA检测法、RNA检测法。
8.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其中对来自患者的样品采用所述材料进行微生物标志物检测，所述样品包括支气管肺泡灌洗液。
9.Hydrobacter在制备肺内脓毒症感染导致的ARDS治疗制剂的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，所述治疗制剂包括Hydrobacter，以及作为治疗制剂的辅助成分或者其他联用药物。
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