CN115627293A - 结直肠癌甲基化基因标志物及其应用 - Google Patents
结直肠癌甲基化基因标志物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115627293A CN115627293A CN202211108637.3A CN202211108637A CN115627293A CN 115627293 A CN115627293 A CN 115627293A CN 202211108637 A CN202211108637 A CN 202211108637A CN 115627293 A CN115627293 A CN 115627293A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- ffar2
- methylation
- septin9
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 36
- 101150042012 SEPTIN9 gene Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 101150050349 FFAR2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 24
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 20
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 10
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 9
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 7
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 5
- 230000006326 desulfonation Effects 0.000 claims description 5
- 238000005869 desulfonation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 4
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AOSFMYBATFLTAQ-UHFFFAOYSA-N 1-amino-3-(benzimidazol-1-yl)propan-2-ol Chemical compound C1=CC=C2N(CC(O)CN)C=NC2=C1 AOSFMYBATFLTAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N Diammonium sulfite Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])=O PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims 1
- 102100040133 Free fatty acid receptor 2 Human genes 0.000 abstract description 6
- 101000890668 Homo sapiens Free fatty acid receptor 2 Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 101000995332 Homo sapiens Protein NDRG4 Proteins 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102100034432 Protein NDRG4 Human genes 0.000 description 2
- 102000012060 Septin 9 Human genes 0.000 description 2
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108070000009 Free fatty acid receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091060592 XDNA Proteins 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 210000001815 ascending colon Anatomy 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 239000000091 biomarker candidate Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000013872 defecation Effects 0.000 description 1
- 210000001731 descending colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940095399 enema Drugs 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 208000035861 hematochezia Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000010879 mucinous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 210000001599 sigmoid colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003384 transverse colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
Abstract
本发明公开了结直肠癌甲基化基因标志物及其应用。所述基因标志物为FFAR2基因和/或Septin9基因。本发明通过对FFAR2和现有Septin9基因甲基化检测的研究，对这两种基因的引物和探针进行探索和优化，能够检测血浆样本中极低浓度的FFAR2和Septin9基因甲基化片段，提高对结肠直肠癌患者诊断的灵敏度，同时还具有高度的特异性。
Description
技术领域
本发明属于结直肠癌检测技术领域，具体涉及一种结直肠癌甲基化基因标志物及其应用。
背景技术
结直肠癌(结肠直肠癌)是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状，其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。结肠直肠癌多发生在中年以上的男性，以40-70岁最为多见，但20世纪末发现30岁以下者亦不少见。男女两性发病比例约为2:1。本病和其他恶性肿瘤一样，发病原因仍不清楚，可以发生在结肠或直肠的任何部位，但以直肠、乙状结肠最为多见，其余依次见于盲肠、升结肠、降结肠及横结肠。癌瘤大多数为腺癌，少数为鳞状上皮癌及粘液癌。本病可以通过淋巴、血液循环及直接蔓延等途径，播散到其他组织和脏器。根据临床表现、X射线钡剂灌肠或纤维结肠镜检查，可以确诊。治疗的关键在于早期发现、及时诊断和手术根治。
专利201810326484.7公开了Septin9及NDRG4基因甲基化的检测试剂盒和应用。该试剂盒包括有针对Septin9基因和NDRG4启动子基因的引物和探针，所述针对Septin9基因的引物和探针的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，以及SEQ ID NO：3所示，所述针对Septin9基因的引物和探针的序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，以及SEQ ID NO：6所示。发明人发现，NDRG4启动子基因的检测结果并不准确，且若启动子与taq酶结合的区域发生甲基化，存在漏检的可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结直肠癌甲基化基因标志物及其应用。
一种结直肠癌甲基化基因标志物，所述基因标志物为FFAR2基因和/或Septin9基因。
一种FFAR2基因和/或Septin9基因甲基化的检测试剂盒，包括针对FFAR2基因和Septin9基因的引物和探针；所述针对FFAR2基因的引物和探针的序列如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述针对Septin9基因的引物和探针的序列如序列表SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
所述试剂盒还包括针对内参基因GAPDH的引物和探针；所述针对FFAR2基因的引物和探针的序列如序列表SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
所述试剂盒还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括核酸裂解吸附液、蛋白酶K溶液、磁珠、洗涤液、洗脱液。
所述核酸裂解吸附液由如下组分构成：2M盐酸胍、15％TritonX-100、30mM Tris-HCl、2％SDS、3M异硫氰酸胍、15％无水乙醇、15％异丙醇、35％甘油、纯化水。
所述蛋白酶K溶液由如下组分构成：30mg/ml蛋白酶K、50mM Tris-HCl、40mM氯化钾、50mM氯化钠、20mM氯化钙、15％TritonX-100、40％甘油、纯化水。
所述试剂盒还包括亚硫酸盐转化试剂；所述亚硫酸盐转化试剂包括转化液、结合液、脱磺液、磁珠、洗涤液、洗脱液。
所述转化液由如下组分构成：50％亚硫酸氢铵、15％亚硫酸铵、20％亚硫酸氢钠、4M氢氧化钠、纯化水。
所述结合液由如下组分构成：15％TritonX-100、30mM Tris-HCl、5M异硫氰酸胍、3M氯化钠、15％无水乙醇、15％异丙醇、40％甘油、纯化水。
所述脱磺液由如下组分构成：1M氢氧化钠、50mMTris-HCl、35％无水乙醇、20％异丙醇、50mM氯化钠、纯化水。
本发明的有益效果：本发明发现了一个新的结直肠癌甲基化基因标志物FFAR2，本发明通过对FFAR2和现有Septin9基因甲基化检测的研究，对这两种基因的引物和探针进行探索和优化，能够检测血浆样本中极低浓度的FFAR2和Septin9基因甲基化片段，提高对结肠直肠癌患者诊断的灵敏度，同时还具有高度的特异性。
附图说明
图1为结直肠癌样本测定结果。
图2为肠镜检测阴性的正常样本测定结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。
实施例1结肠直肠癌特异性甲基化基因FFAR2的发现
将来自2个正常人的基因组DNA和来自8名结肠直肠癌患者的癌组织和相邻正常组织的基因组DNA各500ng进行超声处理，构建约300bp的基因组DNA片段。
将2μg 6×His标记的MBD2bt与500ng大肠杆菌JM110的基因组DNA预先温育，然后结合到Ni-NTA磁珠上。将经超声处理的分离自正常人和结肠直肠癌患者的基因组DNA各500ng，在结合缓冲液(10mMTris-HCl、50mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、3mM MgCl2、0.1％Triton-X100、5％甘油、25mg/ml BSA)存在的条件下与磁珠于4℃反应20分钟。然后，用500μL包含700mM NaCl的结合缓冲液清洗所述磁珠3遍，然后用QiaQuick PCR纯化试剂盒分离与MBD2bt结合的甲基化DNA。
用基因组DNA扩增试剂盒扩增与MBD2bt结合的甲基化DNA，并用BioPrime全基因组标记系统I对4μg经扩增的DNA进行Cy4标记。为了间接比较正常人和结肠直肠癌患者之间的甲基化程度，构建参考DNA，使相同数量的来自8个结肠直肠癌患者的基因组DNA彼此混合，用基因组DNA扩增试剂盒扩增所述基因组DNA混合物，并用BioPrime全基因组标记系统I(Invitrogen公司)对4μg经扩增的基因组DNA进行Cy3标记。将参考DNA与正常人和结肠直肠癌患者的DNA分别混合，然后与244K人CpG微阵列(Agilent公司)杂交。杂交后，将DNA混合物经清洗过程，然后用Agilent扫描仪扫描。利用特征抽取程序v.9.5.3.1(FeatureExtraction program，Agilent)，通过计算正常人和结肠直肠癌患者样品间的信号强度的相对差异，计算来自所述微阵列图像的信号值。
使用GeneSpring 7.3程序(Agilent)，通过交叉基因误差模型筛选了总共22个阵列之中的38420个Cy3信号值超过114.1的探针。将正常人的结肠直肠组织和与结肠直肠癌组织相邻的看似正常的组织作为同一组，实施方差分析(ANOVA test)，从而筛选出3372个探针(p<0.05)。从这些探针中，进一步筛选出1123个在结肠直肠癌组织中高度甲基化的探针，并从这些探针中选定2个生物标志物候选基因(FFAR2基因、Septin9基因)，这2个基因表现出高甲基化，其中Septin9基因甲基化已有文献报道，本实验再次证实。对上述2个基因进行焦磷酸测序，结果证实其在结肠直肠癌细胞系中表现出高度甲基化，表明这些基因适于用作结肠直肠癌诊断的生物标志物。
实施例2FFAR2基因和Septin9基因甲基化检测引物设计
针对FFAR2基因和针对Septin9基因以及内参基因的引物和探针，具体组成如下：
针对FFAR2基因甲基化特异引物、探针：
正向引物：5’-GCTGGCCGACCTCCTCCTGCTG-3’SEQ ID NO:1；
反向引物：5’-GAGCAGCGTCACCACAGCCAGCC-3’SEQ ID NO:2；
探针：5’FAM-TCCAGCCGCACGGGCAGCACC-BHQ1 3’SEQ ID NO:3；
针对Septin9基因甲基化特异引物、探针：
正向引物：5’-CGCGGCGTTTTAGTTAGCGCG-3’SEQ ID NO:4；
反向引物：5’-ACAACGAATCGCGCGAAAAACAA-3’SEQ ID NO:5；
探针：5’FAM-CGGGTTTCGTCGGGGGCGT-BHQ1 3’SEQ ID NO:6；
针对内参基因GAPDH特异引物、探针：
正向引物：5’-CGCGGCGTTTTAGTTAGCGCG-3’SEQ ID NO:7；
反向引物：5’-ACAACGAATCGCGCGAAAAACAA-3’SEQ ID NO:8；
探针：5’FAM-CGGGTTTCGTCGGGGGCGT-BHQ1 3’SEQ ID NO:9。
实施例3FFAR2基因和Septin9基因甲基化检测试剂盒
包括实施例1所述的引物和探针，所述试剂盒还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括核酸裂解吸附液、蛋白酶K溶液、磁珠、洗涤液、洗脱液。
所述核酸裂解吸附液由如下组分构成：2M盐酸胍、15％TritonX-100、30mM Tris-HCl、2％SDS、3M异硫氰酸胍、15％无水乙醇、15％异丙醇、35％甘油、纯化水。
所述蛋白酶K溶液由如下组分构成：30mg/ml蛋白酶K、50mM Tris-HCl、40mM氯化钾、50mM氯化钠、20mM氯化钙、15％TritonX-100、40％甘油、纯化水。
所述洗涤液包括洗液A、洗液B和洗液C，所述洗液A和洗液B组成为5M盐酸胍、30mM氯化钠、15％无水乙醇、15％异丙醇、纯化水；所述洗液C组成为25％无水乙醇、25％异丙醇、40mM氯化钠、纯化水。
所述试剂盒还包括亚硫酸盐转化试剂；所述亚硫酸盐转化试剂包括转化液、结合液、脱磺液、磁珠、洗涤液、洗脱液。
所述转化液由如下组分构成：50％亚硫酸氢铵、15％亚硫酸铵、20％亚硫酸氢钠、4M氢氧化钠、纯化水。
所述结合液由如下组分构成：15％TritonX-100、30mM Tris-HCl、5M异硫氰酸胍、3M氯化钠、15％无水乙醇、15％异丙醇、40％甘油、纯化水。
所述脱磺液由如下组分构成：1M氢氧化钠、50mMTris-HCl、35％无水乙醇、20％异丙醇、50mM氯化钠、纯化水。
所述试剂盒的引物、探针及反应体系用量如表1-3：
表1甲基化预混液(1人份)
表2甲基化预混液(1人份)
| 组分 | 加入体积(μL) |
| Septin9-F(10μM) | 0.5 |
| Septin9-R(10μM) | 0.5 |
| Septin9探针(10μM) | 0.2 |
| GAPDH-F(10μM) | 0.3 |
| GAPDH-R(10μM) | 0.3 |
| GAPDH探针(10μM) | 0.2 |
| 水 | 8 |
表3 25ul反应体系配置(1人份)
| 组分 | 用量(μL) |
| 2×DNA聚合酶Mix | 12.5 |
| 甲基化预混液 | 10.5 |
| DNA模板 | 2 |
实施例4FFAR2基因甲基化检测
在一家三甲肿瘤医院选择3例按临床分期设计组织学确诊的结直肠癌样本和3例肠镜检测阴性的正常样本。
血浆分离：用游离核酸采血管，采血10mL，将采血管放入离心机进行离心12min，然后把血浆转移到15mL离心管中，再次离心12min，收集3mL的血浆加入新的离心管中，收集完成的血浆样本至于-20℃保存。
游离DNA的提取：在15mL离心管中加入3mL血浆样本，然后依次加入350μL蛋白酶K溶液、8.25mL核酸裂解吸附液和40μL磁珠，涡旋混匀，把离心管在56℃中放置10min，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入1mL洗液A，混匀确保磁珠彻底重悬，将悬浮磁珠移至到1.5mL的离心管中，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入0.6mL洗液B，混匀确保磁珠彻底重悬，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入0.6mL洗液C，混匀确保磁珠彻底重悬，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，用50μL枪头除去残余液体，将离心管移至无磁性试管架上，打开管盖，室温干燥2min，加入50μL洗脱液，盖紧管盖涡旋混匀重悬磁珠，把离心管在56℃中孵育3min，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，将全部洗脱液移至新的0.2mL PCR管中。
游离DNA亚硫酸盐转化：50μL DNA的0.2mL PCR管中加入100μL亚硫酸盐溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀后短暂离心，将离心管置于普通PCR仪中进行反应，反应条件设置为95℃，5min、60℃，10min、95℃，5min、60℃，10min，将反应结束后的DNA溶液转移到新的1.5mL离心管中，加入600μL结合液和2μL磁珠涡旋混匀，室温静置5min，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL洗液B，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL脱磺液，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬，室温静置15min，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL洗液B，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL洗液B，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入250μL洗液C，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，用50μL枪头尽量除去残余液体，将离心管移至无磁性试管架上，打开管盖，室温干燥2min，加入50μL洗脱液，盖紧管盖涡旋混匀重悬磁珠，把离心管在56℃中孵育4min，将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，将全部洗脱液移至新的1.5mL PCR管中备用。
荧光定量PCR检测目的基因：从试剂盒中取出PCR反应液，室温解冻，充分融化后，轻轻振荡混匀，并瞬时低时低速离心备用；在准备好试剂的PCR反应管中分别加入待测样本DNA，每管PCR反应液中各加25μL，盖紧管盖后，瞬时低速离心。
设置PCR反应程序，如表4：
表4
信号采集通道为FAM与VIC。
结果判定如表5：
表5
| 单管FFAR2检测结果 | FFAR2的Ct值 | GAPDH的Ct值 |
| 阳性 | Ct<50 | Ct≤38 |
| 阴性 | Ct≥50 | Ct≤38 |
| 无效 | 任何情况 | Ct>38 |
3例肠镜检测阴性的正常样本检测结果全部为阴性，3例结直肠癌样本检测结果全部为阳性，其中结直肠癌样本测定结果见图1，肠镜检测阴性的正常样本测定结果见图2，证明本发明的引物对结直肠癌检测特异性极好。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种结直肠癌甲基化基因标志物，其特征在于，所述基因标志物为FFAR2基因和/或Septin9基因。
2.一种FFAR2基因和/或Septin9基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，包括针对FFAR2基因和Septin9基因的引物和探针；所述针对FFAR2基因的引物和探针的序列如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述针对Septin9基因的引物和探针的序列如序列表SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
3.根据权利要求2所述FFAR2基因和/或Septin9基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对内参基因GAPDH的引物和探针；所述针对FFAR2基因的引物和探针的序列如序列表SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
4.根据权利要求2所述FFAR2基因和/或Septin9基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括核酸裂解吸附液、蛋白酶K溶液、磁珠、洗涤液、洗脱液。
5.根据权利要求4所述FFAR2基因和/或Septin9基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述核酸裂解吸附液由如下组分构成：2M盐酸胍、15％TritonX-100、30mM Tris-HCl、2％SDS、3M异硫氰酸胍、15％无水乙醇、15％异丙醇、35％甘油、纯化水。
6.根据权利要求4所述FFAR2基因和/或Septin9基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K溶液由如下组分构成：30mg/ml蛋白酶K、50mM Tris-HCl、40mM氯化钾、50mM氯化钠、20mM氯化钙、15％TritonX-100、40％甘油、纯化水。
7.根据权利要求4所述FFAR2基因和/或Septin9基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括亚硫酸盐转化试剂；所述亚硫酸盐转化试剂包括转化液、结合液、脱磺液、磁珠、洗涤液、洗脱液。
8.根据权利要求7所述FFAR2基因和/或Septin9基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述转化液由如下组分构成：50％亚硫酸氢铵、15％亚硫酸铵、20％亚硫酸氢钠、4M氢氧化钠、纯化水。
9.根据权利要求7所述FFAR2基因和/或Septin9基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述结合液由如下组分构成：15％TritonX-100、30mM Tris-HCl、5M异硫氰酸胍、3M氯化钠、15％无水乙醇、15％异丙醇、40％甘油、纯化水。
10.根据权利要求7所述FFAR2基因和/或Septin9基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述脱磺液由如下组分构成：1M氢氧化钠、50mMTris-HCl、35％无水乙醇、20％异丙醇、50mM氯化钠、纯化水。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211108637.3A CN115627293A (zh) | 2022-09-13 | 2022-09-13 | 结直肠癌甲基化基因标志物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211108637.3A CN115627293A (zh) | 2022-09-13 | 2022-09-13 | 结直肠癌甲基化基因标志物及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115627293A true CN115627293A (zh) | 2023-01-20 |
Family
ID=84902893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211108637.3A Pending CN115627293A (zh) | 2022-09-13 | 2022-09-13 | 结直肠癌甲基化基因标志物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115627293A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108531591A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-14 | 广州瑞博奥生物科技有限公司 | Septin9及NDRG4基因甲基化的检测试剂盒和应用 |
| CN110129425A (zh) * | 2013-06-28 | 2019-08-16 | 睿智研究实验室私人有限公司 | 脓毒症生物标志物及其应用 |
| CN112195243A (zh) * | 2020-09-22 | 2021-01-08 | 北京华大吉比爱生物技术有限公司 | 一种检测多基因甲基化的试剂盒及其应用 |
| US20230220486A1 (en) * | 2020-05-15 | 2023-07-13 | Timing Biotech Technology Co. Ltd. | Micronuclei DNA From Peripheral Red Blood Cells and Uses Thereof |
-
2022
- 2022-09-13 CN CN202211108637.3A patent/CN115627293A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110129425A (zh) * | 2013-06-28 | 2019-08-16 | 睿智研究实验室私人有限公司 | 脓毒症生物标志物及其应用 |
| CN108531591A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-14 | 广州瑞博奥生物科技有限公司 | Septin9及NDRG4基因甲基化的检测试剂盒和应用 |
| US20230220486A1 (en) * | 2020-05-15 | 2023-07-13 | Timing Biotech Technology Co. Ltd. | Micronuclei DNA From Peripheral Red Blood Cells and Uses Thereof |
| CN112195243A (zh) * | 2020-09-22 | 2021-01-08 | 北京华大吉比爱生物技术有限公司 | 一种检测多基因甲基化的试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PAN PAN等: "Loss of FFAR2 promotes colon cancer by epigenetic dysregulation of inflammation suppressors", INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, vol. 143, no. 4, 15 August 2018 (2018-08-15), pages 1 - 11 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108977543B (zh) | 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂 | |
| WO2014032205A1 (zh) | 一种癌症筛检的方法 | |
| WO2021004215A1 (zh) | 一种多基因联合检测试剂 | |
| WO2010118559A1 (zh) | 一种癌症筛检的方法 | |
| US20210292850A1 (en) | Methylation modification-based tumor marker stamp-ep2 | |
| TWI730429B (zh) | Hoxa7甲基化檢測試劑 | |
| JP6381020B2 (ja) | 大腸癌に関する情報の取得方法、ならびに大腸癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット | |
| CN110373470A (zh) | 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒 | |
| WO2022143396A1 (zh) | 乳腺肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒 | |
| JP2022116131A (ja) | 新生物および癌のリスク決定 | |
| JP6269491B2 (ja) | 大腸癌に関する情報の取得方法、ならびに大腸癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット | |
| CN110229899B (zh) | 用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合 | |
| TW202028473A (zh) | Hoxa9甲基化檢測試劑在製備肺癌診斷試劑中的用途 | |
| JP2024511561A (ja) | 頭頸部癌の診断およびリスク判定 | |
| TWI385252B (zh) | 一種癌症篩檢的方法 | |
| JP2021524750A (ja) | 腫瘍マーカー、メチル化検出試薬、キット及びその使用 | |
| CN115627293A (zh) | 结直肠癌甲基化基因标志物及其应用 | |
| KR101335483B1 (ko) | 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법 | |
| CN114107498A (zh) | 结直肠癌血液检测标记物及其应用 | |
| TWI789550B (zh) | Hoxa9甲基化檢測試劑 | |
| KR20210083100A (ko) | 대장암환자의 rcc 또는 lcc 판별용 마커 | |
| JP2021523730A (ja) | 腫瘍マーカー、メチル化検出試薬、キット及びその使用 | |
| CN115651982A (zh) | 肺癌甲基化基因标志物及其应用 | |
| CN115851959B (zh) | 一种用于食管鳞状细胞癌及癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒 | |
| CN114150065B (zh) | 一种结直肠癌或癌前病变的标记物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |